Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Ortotopic rotte nyre transplantation: en roman og forenklet kirurgisk tilgang

Published: May 7, 2019 doi: 10.3791/59403
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Formålet med dette manuskript og protokol er at forklare og demonstrere i detaljer den kirurgiske procedure af ortotopic nyretransplantation i rotter. Denne metode er forenklet for at opnå den korrekte perfusion af donor nyre og forkorte reperfusion tid ved hjælp af venøs og urinveje manchet anastomose teknik.

Abstract

Nyretransplantation giver øget overlevelsesrater og forbedret livskvalitet for patienter med nyresygdom i slutstadiet, sammenlignet med enhver form for renal substitutionsterapi. I løbet af de sidste par årtier, er rotte nyretransplantation model blevet brugt til at studere de immunologiske fænomener af afvisning og tolerance. Denne model er blevet et uundværligt redskab til at teste nye immunmodulerende lægemidler og regimer forud for at fortsætte med dyre prækliniske store dyreforsøg.

Denne protokol giver en detaljeret oversigt over, hvordan man pålideligt udføre ortotopic nyretransplantation i rotter. Denne protokol indeholder tre karakteristiske trin, der øger sandsynligheden for succes: perfusion af donor nyre ved skylning gennem portalen vene og brugen af et manchet system til anastomose de renale vener og ureters, derved faldende kolde og varme iskæmi gange. Ved hjælp af denne teknik har vi opnået overlevelsesrater ud over 6 måneder med normal serum-kreatinin hos dyr med murinsynogene eller tolerante nyretransplantationer. Afhængigt af undersøgelsens formål kan denne model modificeres ved præ-eller post transplantations behandlinger for at studere akut, kronisk, cellulær eller antistof-medieret afvisning. Det er en reproducerbar, pålidelig og omkostningseffektiv dyremodel til at studere forskellige aspekter af nyretransplantation.

Introduction

Historisk set blev de første transplantations afstødnings undersøgelser udført af Brent og Medawar ved hjælp af hudtransplantationer i gnavere1. Det blev hurtigt klart, at huden har forskellige immunologiske egenskaber, hvilket gør det til et meget immunogent organ, der er forskelligt i afvisning fra andre vaskulariserede solide organer2. Rotteundersøgelser af massiv organtransplantation afvisning er sædvanligvis begrænset til hjerte, lever, og nyretransplantationer. Selv om hver af disse organer er egnet til at studere afvisning, der er fordele og ulemper for hver af dem. Hjertetransplantationer er ofte transplanteret ind i maven og anastomosed til aorta og Vena cava, med modtagerens indfødte hjerte på plads3. Dette genopretter ikke humane kliniske, anatomiske og fysiologiske tilstande. Derudover er hjerter meget følsomme over for kold iskæmi og skal reperfanvendes fortrinsvis inden for 1 time for at være i stand til at inddrive deres funktion4. Levertransplantationer er generelt anses for at være kirurgisk mere udfordrende og tidsfølsomme til at udføre. Efter fjernelse af den indfødte lever, donor leveren skal implanteres og reperfanvendes inden for 30 min da modtagerne ikke kan vare længere uden en fungerende leveren5. Den hepatiske arterie, portal vene, og især galde kanalen rekonstruktion kræver raffinerede kirurgiske færdigheder. Ud over de kirurgiske udfordringer, leveren er kendt for at besidde tolerogene egenskaber og gnavere og mennesker kan blive operationelt tolerant6,7,8. Nyrerne, i modsætning til de førnævnte organer, kan transplanteret i en ortotopic mode, er kendt for at være et immunogent organ med konsekvente, reproducerbare afvisning episoder (hvis ikke immun supprimeret), og giver mulighed for langvarig kold iskæmi gange af flere Timer. Dette gør rotte nyretransplantation en ideel model for at studere allograft afvisning og tolerance.

Nyretransplantation (KT) er det foretrukne Behandlingsvalg for patienter med nyresygdom i slutstadiet. I løbet af de sidste par årtier, kortsigtede overlevelse resultater efter KT har forbedret dramatisk, men langsigtede overlevelse resultater er stagnerende9. Konventionelle Immunsuppressive regimer forbliver standard anti-afvisning terapi. Kronisk brug af immunosuppressive terapier forårsager imidlertid signifikant sygelighed og dødelighed, såsom nefrotoksicitet, diabetes og sekundære maligniteter10,11,12. På lang sigt, kronisk antistof-og cellulær-medieret afvisning truer transplantat overlevelse, med begrænsede terapeutiske muligheder til rådighed.

Et vigtigt mål i transplantation er induktion af transplantations tolerance for at undgå behovet for kronisk immunsuppression. Rotte KT-modellen er et robust værktøj til at undersøge den immunologiske afstødnings proces og til at evaluere nye tilgange til immun moduleringen og transplantations tolerancen. Rotten fungerer også som en egnet model til at studere akut og kronisk celle-og antistof-medieret afvisning13,14,15,16,17. Denne kirurgiske model har vist sig at være et pålideligt, reproducerbart og omkostningseffektivt værktøj til at studere forskellige aspekter af allograft afvisning og tolerance. Det er ofte bruges til at teste nye tolerance-inducerende protokoller forud for gennemføre dyre og besværlige store dyreforsøg. Udførelse af KT i rotter kræver omfattende kirurgisk træning og ekspertise for at nå overlevelsesrater på > 90%. I dette manuskript og i den ledsagende instruktionsvideo giver vi en trinvis skitse for ortotopic KT i rotter, som det med succes er udført i mange år på vores institution.

Før påbegyndelse af enhver procedure, donor og modtager udvælgelse er kritisk og afhænger af karakteren af eksperimentet. Ideelt set bør donorer og recipienter veje mellem 220 – 260 g og være mellem 8 – 12 ugers alderen. Dyr under 220 g har arterier med lille diameter, vener og ureters, hvilket gør anastomose i recipienten særlig udfordrende. Mindre blodtab kan forårsage hypovolæmi og føre til døden hos mindre dyr. Dyr tungere end 260 g viser mere fedt omkring deres fartøjer, og fartøjs isolation vil kræve mere operative tid og øge den kolde iskæmi tid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Lewis (RT11) og Dark agouti (da) (RT1Aa) rotter blev købt fra kommercielle leverandører (Se tabellen over materialer). Disse fuldt MHC-mismatchede stammer bruges ofte til at studere akut renal allograft afvisning. Alle dyr blev opstaldet og vedligeholdt i henhold til National Institutes of Health (NIH) retningslinjer i en specifik patogen-fri facilitet på Johns Hopkins University. Alle procedurer blev godkendt af det institutionelle udvalg for dyrepasning og-brug.

1. donor procedure

  1. Forbered og autoklave alle kirurgiske instrumenter, der skal anvendes i denne procedure som et middel til sterilisation og bruge engangs sterile handsker for at forhindre smitsomme komplikationer.
  2. Anæstetize donor rotten ved isofluran indånding (induktion ved 3% – 4% og vedligeholdelse ved 1% – 2%) resten af proceduren. Giv alle donor-og recipient dyrs forebyggende buprenorphin subkutant ved 0,1 mg/kg legemsvægt for analgesi.
  3. Nu skal du placere rotten i en liggende position og immobilisere lemmerne med steril afmaskning tape.
  4. Brug en mekanisk klipper til at fjerne håret fra maveområdet.
    1. Påfør et øje smøremiddel og brug steril gaze gennemblødt i povidon-jod, efterfulgt af gaze dyppet i isopropylalkohol, at sterilisere det kirurgiske felt.
    2. Forud for den første Incision, Sørg for, at rotten er tilstrækkeligt bedøvet ved at kontrollere fraværet af tå knivspids tilbagetrækning refleks.
  5. Brug en saks, start ved at lave en stor langsgående midterlinje hud og muskel indsnit fra over låsen pubis til xiphoid, og Indtast peritonealhulrummet.
  6. Indsæt to retraktorer på hver side af bugvæggen for at eksponere den intraabdominale hulrum.
  7. Dæk tarmen med en fugtig steril gaze og Skift den til højre side af maven, udsætter aorta, Vena cava, og venstre nyre. Påfør 1 mL forvarmet saltvand med en 1 CC sprøjte for at holde tarmene og abdominalorganerne fugtige og ved normal temperatur.
    1. Påfør en anden fugtig gaze til at dække og mobilisere maven og milt kraniet til nyrerne og en lille fugtig gaze til at dække den eksponerede nyre (figur 1a).
  8. Brug mikrokirurgiske dissekerende pincet til at isolere og mobilisere venstre nyrearterie og vene fra bindevæv og hinanden. Isoler den venstre renale vene ved at advare den venstre gonadale vene og isolere den venstre nyrearterie ved at advare binyrerne. Derefter mobilisere aorta og Vena cava Superior og ringere af den venstre renale pedikelskruefikseringssystem ved at dissekere bindevæv med dissekerende pincet (figur 1B).
  9. Dividerer og mobiliserer ureter fra bindevæv ved hjælp af dissekerende tang, og foretag en diagonal indsnit i en længde på 2 cm målt fra det renale bækken ved hjælp af en mikrosaks. Indsæt en polyamid manchet (Se tabel over materialer) halvvejs ind i ureter og fastgør manchetten ved at placere en knude med 8-0 silke sutur (figur 1C).
    Bemærk: det er vigtigt ikke at fjerne alt fedt og bindevæv fra ureter, da de giver beskyttelse mod obstruktion forårsaget af klæbestoffer, og deres fjernelse kan forårsage urinveje nekrose. Vær ekstra opmærksom på at bevare det fartøj, der leverer ilt til ureter.
  10. Mobiliser den venstre nyre ved at adskille den fra perirenal fedt ved hjælp af dissekere tang eller mikrosaks. Efterlad den fedtkapsel af nyrerne fastgjort og bruge dette sted til håndtering af nyrerne.
    1. Udsæt den ringere Vena cava.
  11. Administrer 200 enheder af heparin ved hjælp af en sprøjte med en 27 G kanyle gennem penis vene. Tryk injektionsstedet med en vatpind i mindst 1 min. for at undgå blødning.
  12. Identificer Portal vene (PV) og ringere Vena cava (IVC) (figur 1D). Skyl nyrerne ved at injicere 50 mL koldt saltvand blandet med 500 enheder af heparin i Portal vene ved hjælp af en 16 G nål (figur 1E). Før skylning skæres den ringere Vena cava på det infrahepatiske niveau og portalen vene hale på nålen indsættelse stedet for at tillade blodet at forlade cirkulation. Begynd at skylle nyrerne ved gradvist at inbruge saltvands opløsningen. Overhold en ændring i farven på nyrerne fra mørk rød til en ensartet grå og bleg farve (figur 1F).
  13. Efter skylning, fast nyrearterie og vene proksimal til aorta og Vena cava og placere den skylles nyre i en Petri skål i koldt saltvand på is. Figur 2 A repræsenterer den skematiske oversigt af donor proceduren.
  14. Når nyrerne er i koldt saltvand, fastgøre og immobilisere håndtaget af vene manchet (Se tabellen af materialer) og forsigtigt trække den renale vene gennem manchetten. Derefter fastgøre den renale vene over manchetten ved at placere tre knob ved hjælp af otte-nul silke sutur (figur 2b).
    Bemærk: Vær særlig opmærksom på vendens retning, mens den sikres på plads. Roterede vener forårsager en obstruktion af blodgennemstrømningen og fører til trombose.

2. modtager procedure

  1. Gentag trin 1.1 – 1.11 fra donor proceduren.
  2. Anbring to atraumatiske mikro-karpe klemmer på venstre nyrearterie og vene proksimal til aorta og Vena cava (figur 3A).
  3. Ligate den modtagende nyre vene proksimal til indløbet af nyrerne. Skyl den renale vene med hepariniseret saltvand for at fjerne alt det resterende blod ud af beholderen.
  4. Skub den ligerede renale vene over den cuffed renal vene, der tidligere var placeret i donor nyrerne, og fastgør den med en 8-0 silke sutur (figur 3B). Bevar den samme positionelle orientering, når du fastgør den renale vene over manchetten.
  5. Ligate ureter på niveau med den nedre pol af den venstre nyre. Mobilisere nyrerne fra perirenal fedt.
  6. Ligate nyrearterie proksimal til indtag af recipient nyrerne. Skyl det med hepariniseret saltvand for at fjerne overskydende blod i beholderen. Udfør en end-to-end anastomose af nyrearterie med 8 til 10 afbrød suturer ved hjælp af en 10-0 nylon sutur (figur 3C). Manøvrere arterien ved hjælp af adventitial lag.
  7. Fjern fartøjet klemmer at reinitiere reperfusion af nyrerne. Start med at fjerne klemmen på venen efterfulgt af klemmen på arterien (figur 3D). Brug en steril vatpind til let at trykke eventuelle oser områder omkring anastomose regionen. Et par minutter bør være tilstrækkeligt til at opnå en patent anastomose.
  8. Overhold kort nyrerne for at vurdere, om der er tilstrækkelig perfusion. Umiddelbart efter reperfusion, nyrerne bør ændre farve og gradvist genvinde sin naturlige mørkerøde farve efter et par minutter (figur 3E). Synlig peristaltik af ureter og on-site urinproduktion er undertiden observeret.
  9. ved at indsætte den eksponerede spids af urinveje manchet i recipient ureter og fastgør recipient ureter med en 8-0 silke sutur (figur 2C og figur 3F).
  10. For at holde donor og recipient urinlederne i position, binde enderne af hver ureter side til hinanden.
  11. Valgfrit kan den rigtige nyre være nerectomized ved at binde den rigtige nyrearterie og vene med en 4-0 silke sutur og fjerne nyrerne.
  12. Fjern alle gaze fra bughulen, returnere alle organer til deres naturlige position, sprøjte 1 mL saltvand over tarmene for at holde dem fugtige, og lukke maven ved hjælp af en 4-0 absorberbare sutur på rectus musklen og en 4-0 silke sutur at lukke huden lå på en afbrudt måde.

3. postoperativ pleje

  1. Dyret anbringes i et rent bur med adgang til ad libitum vand og mad og giver mulighed for genvinding på en 37 °C varmepude.
  2. Injicer 0,1 mg/kg buprenorphin subkutant for analgetika og Overvåg dyret til nyttiggørelse. Yderligere analgetika administration kan være nødvendig i de næste par dage, afhængigt af tegn på ubehag eller smerte. Antibiotika administreres ikke rutinemæssigt, da smitsomme komplikationer er sjældne.
  3. Overhold restitueringen i 1 – 2 timer før dyret returneres til dyreanlægget. Inspicer dyret 2x-3x om dagen for de første 24 timer, efterfulgt af en daglig inspektion. Vær opmærksom på tegn på smerte og angst, oral indtagelse, og urin output.
  4. Fjern stingene 7 – 10 dage efter operationen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi udførte murinsynogene (n = 5) og allogene nyretransplantationer (n = 5). Dyr med en syngen transplantation opnåede langvarig overlevelse uden immunsuppressiv behandling. Dyr, der fik en allogen transplantation uden immunsuppression, afviste deres transplantat og bukkede under for nyresvigt med en Median overlevelse på 8 dage (figur 4a). Det gennemsnitlige serum-kreatinin steg beskedent i den syngeneatiske gruppe, mens det steg med 14 gange i den allogene gruppe (0,5 mg/dL versus 7,0 mg/dL, p < 0,01) (figur 4B). Efter at være blevet undervist viste det makroskopiske syn på det syngeneske nyre-allograft ingen abnormiteter. Nyre farve og interne strukturer forblev intakt. I modsætning, nyretransplantater af afviste dyr præsenteret røde hæmoragiske pletter med ødelæggelse af de interne strukturer (figur 4C). Hematoxylin og eosin pletter af murinsynogene grafts viste tynde glomerulære kapillar sløjfer med normale antal endotel og mesangiale celler. Afviste allografter viste ødelagte glomerulære strukturer med tegn på inflammation og tubulitis (figur 4D). For at bekræfte T-celle-medieret afvisning, vi udførte CD8 + farvning. Mens murinsynogene transplantater viste meget få positive CD8 + T celler, viste de afviste transplantater et signifikant højere antal CD8 + celler i og omkring glomeruli og tubuli (figur 4E), bekræfter t-celle-medieret afvisning.

Figure 1
Figur 1 : Donor-nerectomi. (A) ved åbning af maven isoleres den venstre nyre med fugtige gaze. B) den venstre nyrearterie og vene isoleres og tilvejebringes fra det omgivende fedtstof. (C) ureter er ligeret, cuffed, og sikret med en enkelt silke sutur. (D) Portal vene (PV) og ringere Vena cava (IVC) er identificeret, og nyrerne er perfekperet gennem portalen vene. (E) perfusion udføres med succes, da den rigtige nyre og lever bliver bleg ved at skylle dyrets Portal vene. F) vellykket perfusion viser en bleg nyre og fartøjer, der er klar til transplantation. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Skematisk overblik over nyre transplantations proceduren. (A) skematisk overblik over donor proceduren. (B) skematisk overblik over en donor vene i en cuffed. (C) skematisk oversigt over støttemodtagerens anastomose og den cuffed donor vene og anastomose af ureters. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Nyretransplantation i recipienten. A) modtagerens arterier og vene tilvejebringes fra det omgivende fedtstof og fastspændt efter adskillelse. (B) donor nyrerne introduceres, og venerne forbindes via manchet teknikken og sikres med en 8-0 Sutur. (C) arterierne er suteret i en ende-til-ende mode. (D) klemmerne fjernes. (E) nyrerne reperfanvendes og genopretter sin naturlige farve uden blødning. (F) Endelig, urinlederne er anastomosed ved hjælp af tidligere placerede manchet og sikret med en 8-0 Sutur. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Nyretransplantation overlevelse. (A) Kaplan-Meyer-figuren viser overlevelsen af rotter med murinsynogene eller allogen nyretransplantation over tid. B) måling og sammenligning af serumkreatinin hos rotter med murinsynogene eller allogen nyretransplantation sammenlignet med ikke-transplanterede dyr. (C) makroskopisk overblik over de forklarende nyrer af murinsynogene (top) og allogen (bunden) nyretransplantation på dag 8. Dyrene blev perfekperet med saltvand før forklaring. De sidste to paneler viser en mikroskopisk oversigt over (D) hematoxylinlegemer og eosin farvning og (E) CD8 + af murinsynogene (top) og allogen (bund) nyre explants. Billederne er taget under 200x forstørrelse. * Resultaterne blev betragtet som statistisk signifikante, hvis p < 0,05. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Nødvendige kirurgiske instrumenter . (1) lige saks. (2) fint saks. (3) mikro-fjeder saks 1 (ureter ligation). (4) mikro-fjeder saks 2. (5) mikro-fjeder saks 3. 6) kirurgiske retraktorer til små dyr. (7) pincet. (8) mikroforceps, lige, glat. (9) dissekere pincet, buet. (10) indehaveren af mikronålen. (11) nåle holder. (12) 8-0 flettet silke sutur uden nål. (13) 4-0 silke sutur. (14) klemmer med mikro-kar (et par). (15) mikrofartøjs klemme applikation. (16) fintipklemme. (17) heparin. (18) fartøjs klemme (medium størrelse). (19) fartøjs klemme (stor). (20) sterile vatpinde. (21) 10-0 mikro-sutur med nål. (22) sterilt gaze. (23) en hepariniseret salt skylle sprøjte. (24) 60 CC sprøjte med nål. (25) 10 CC sprøjte. (26) 1 CC sprøjte. (27) 25 G 5/8 tommer nåle. (28) 19 G nåle. (29) trimmer. (30) bipolar kauteri system. (31) tape. (32) Petri skål med 0,9% normalt saltvand. (33) 60 CC sprøjte med 50 cc hepariniseret saltvand til perfusion. (34) 10 CC sprøjte med 5 cc hepariniseret saltvands skylle. (35) ureter manchet. (36) vene manchet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette manuskript beskriver vi den kirurgiske metode for ortotopic KT i rotter i detaljer, herunder alt det nødvendige udstyr, der er nødvendigt for at udføre denne procedure (figur 5). I 1965 udgav Fisher og Lee den første rapport om KT i rotter, som blev starten på et spændende efterforsknings felt18. Siden da er der blevet indført mange ændringer for at forbedre denne models reproducerbarhed. Det har fungeret som en effektiv dyremodel for at studere iskæmi-reperfusion skade og renal transplantation afvisning og tolerance, takket være tilgængeligheden af flere indavlede og udavlede stammer med delvis og fuld MHC mismatch kombinationer19. Rotte kt model kan tjene som et redskab til at teste hypoteser forud for at udvide undersøgelserne til svin og humane primat modeller af kt. muligheder for at studere nyretransplantation afvisning eller tolerance i gnavere er begrænset. Nyre transplantations modellen hos mus er teknisk set meget udfordrende og kræver en lang træningsperiode for at opnå overlevelsesrater på > 80%20. En anden begrænsning af musemodellen er den spontane renal allograft accept uden behov for immunsuppression hos omkring 30% af modtagerne. Men, andre organtransplantationer i mus, såsom hud og hjerte, afvises inden for 10 dage, tyder på, at afvisningen af nyretransplantater i fuldt MHC-mismatchede mus er svag og ikke repræsentativ for den kliniske situation21. Men hvis den tekniske udfordring kan overvindes, foretrækkes mus modeller for mekanisme undersøgelser af allograft afvisning på grund af tilgængeligheden af genetisk modificerede Knock-in eller knock-out mus.

KT i rotter kan udføres på en række måder. Vi vil diskutere et par fordele og ulemper ved disse forskellige metoder. Uanset den foretrukne teknik, det er altid afgørende at reducere varm iskæmi tid og for at undgå uoprettelige skader på transplantat og recipient.

Højre versus venstre nyre
Den abdominale anatomi af rotter er meget lig den af mennesker. Den venstre nyre er placeret overlegen i forhold til den rigtige nyre på grund af den anatomiske position af leveren. En af fordelene ved at bruge den venstre nyre er længden af skibene. Generelt er den venstre nyrearterie og vene to gange længden af de rigtige renale kar. Dette er især gavnligt ved udførelse af anastomose, hvor fartøjernes længde ikke er en begrænsende faktor. Der findes dog rapporter om den højre sidede donor nyfinding og transplantationen22,23. Tilgange, der anvender begge nyrer til transplantation, er også beskrevet24.

Rødmen donor nyre via portalen vene
Et af de vigtigste trin i denne procedure er donor nyre perfusion. Perfusion er nødvendig for at fjerne al donorblod fra fartøjerne og nyrerne og for at afkøle orglet ned til langsom biologisk nedbrydning. Der er forskellige metoder, der er beskrevet for perfusing nyrerne. Vi har eksperimenteret med rødmen nyrerne på forskellige måder og konkluderede, at skylle nyrerne gennem portalen vene tilbyder fordele og konsekvent fører til komplet perfusion af nyrerne og fartøjerne. De konventionelle metoder, der er beskrevet i litteraturen, indebærer rødmen af donor nyrerne efter ligerende af nyre pulsåren og vene eller tilbage gennem infrarenal aorta24,25,26,27 , 28. disse tilgange kan føre til endotel skade og renal vasokonstriktion på grund af øget lokalt pres eller ufuldstændig perfusion på grund af lavt perfusions Tryk29,30.

Ved at skylle nyrerne gennem portalen vene, er presset styres af hjertet. Under perfusionen, hjertet er stadig aktiv og pumper perfusion væske på en normal måde til aorta og nyre med pulsatile flow, forhindre skader på kapillærer og glomeruli på grund af forskydnings tryk flow. Ved Trans plantering af nyrerne en bloc eller ved brug af den rigtige nyre til transplantation, er denne metode velegnet til at opnå ensartet perfusion og til at høste begge nyrer på samme tid.

Arteriel og venøs anastomose
Et af de mest kritiske trin i rotte KT-modellen er at udføre en pålidelig mikrovaskulær anastomose på en tidseffektiv måde. Donor nyrearterie kan anastomoseres til modtagerens nyrearterie eller aorta. Anastomosing af donor skibene til aorta og ringere Vena cava forårsager iskæmisk skade på modtagerens organer. I denne protokol, vi demonstrere end-to-end anastomose af de renale arterier, da det undgår iskæmisk skade til andre organer. Under arteriel anastomose er det vigtigt ikke at beskadige den endotheliale overflade af lumen ved håndtering af beholderen. For vene anastomose, bruger vi en manchet teknik til at reducere den varme iskæmi tid og forkorte den operative procedure. Dette har vist sig at være en meget pålidelig og holdbar metode til at sikre tilstrækkelig venøs flow. For at sikre tilstrækkelig venøs strømning, er det bydende nødvendigt for vener ikke at være bøjet eller snoet, når disse er sikret sammen. Alternativt, en end-to-end eller en end-to-side vene anastomose er muligt, afhængigt af kirurgens præference. Ideelt set bør den arterielle og venøse beholder anastomose tage mellem 20 – 30 min.

Pahlavan et al. opsummerede komplikationerne for hver type teknik baseret på en litteratur screening31. En af de vigtigste komplikationer, der kan opstå efter ethvert mikrokirurgisk fartøj anastomose er trombose. Ligation og tilstrækkelig skylning af modtager beholderne reducerer i væsentlig grad trombose dannelsen, og det er bestemt ikke en komplikation, der hyppigt observeres. Andre komplikationer er lækage eller ruptur af anastomose efter reperfusion. Dette er relateret til utilstrækkelig mikrokirurgisk teknik eller utilstrækkelig håndtering af beholderne.

Ureteral anastomose
Ureter skal håndteres med yderste omhu, især under isolation af ureter i donor. Skader på de periureteriske strukturer kan forårsage urinveje iskæmi fører til strikturer og obstruktion og i værste fald scenario, urinveje nekrose. Litteraturen rapporterer forskellige metoder til urinveje anastomose. End-to-end, cuff-assisteret end-to-end, blære patch, og blære indsættelse er de mest almindeligt anvendte19,32,33. I tidligere undersøgelser har vi brugt en manchet med skrå kanter i begge ender for at lette indgangen til ureter i begge ender. Vi har ikke observere nogen urin lækage eller blodprop formationer. Men, langsigtede komplikationer (> 30 dage) af denne teknik omfatter hydronefrose og lejlighedsvis nefrolithiasis, som kan forklares ved striktur dannelse, dislokation, eller obstruktion af manchetten på grund af urinveje sten. Denne konstatering er i overensstemmelse med andre rapporter og vores egne resultater af at udføre urinveje anastomose med en manchet. Ureteral komplikationer er ofte bemærket postoperativt efter betydelig skade på nyrerne, er uredelig, og kræver, at dyret skal euthanized.

Postoperativ pleje og overlevelse
Den postoperative pleje af transplanterede dyr kræver tilstrækkelig smertebehandling og detaljerede observationer af dyrenes samlede aktivitet, vægt observationer og urinproduktion. Almindelige tidlige postoperative komplikationer omfatter blødning fra arteriel eller venøs anastomose, urin lækage, urinveje obstruktion eller forsinket transplantat funktion på grund af forlænget iskæmi tid. Dyr med disse komplikationer viser en beskeden aktivitet og forbliver normalt i en hundens position uden urinproduktion og indtag af næringsstoffer. Generelt, det er gunstigt at administrere op til 1 – 5 mL saltvand til dyrene postoperativt at fremskynde deres nyttiggørelse og forhindre dehydrering. Dyr, der ikke får immunsuppression, kan overleve mellem 7 og 10 dage, hvilket giver mulighed for et tilstrækkeligt terapeutisk vindue til at teste nye lægemidler eller andre metoder. Hvis dyrene er tilstrækkeligt immunsupprimerede (1,0 mg/kg/dag FK506 subkutant) eller tolerante, kan de overvåges langsigtede sidste 6 måneder som tidligere rapporteret13. Den rotte nyre transplantations model tillod definitionen af mekanismerne for tolerance induceret ved hjælp af en unik tilgang af stamcellemobilisering forud for at bekræfte dette fænomen i store dyr34. Rat KT har givet vigtige oplysninger til efterforskerne i årtier, og det vil fortsætte med at gøre det i fremtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af en generøs gave fra Bombeck Family Estate.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Buprenorphine HCL Reckitt Benckiser Healthcare UK NDC12496-0757-5
Dissecting forceps, curved Zhenbang, China 11cm Flat handle 
Heparin sodium injection USP Sagent Pharmaceuticals  NDC25021-400-10
Micro-forceps, straight, smooth Jingzhong, China WA3010
Micro needle holder Jingzhong, China WA2010
Micro vessel clamps Jingzhong, China WA40120
Micro spring sciccor 1 ROBOZ RS-5620
Micro spring sciccor 2 F.S.T. 91501-09
Micro spring sciccor 3 Zhenbang, China 8.5cm Vannas,curved
Prograf (Tacrolimus/FK506) Astellas
Rats Charles River & Taconic Biosciences  LEW/Crl & DA-M 
Shaver Wahl 79600-2101
Suture 4-0 Ethicon J304H
Suture, 4-0  Ethicon 683G
Suture, 10-0  Ethicon 2820G
Syringes & Needles BD
Thread, 8-0 Ashaway 75290
Ureteral cuff Microlumen 160-1 Polymide Tubing, Diameter 0.41 mm 
Venous cuff Intramedic BD 7441 PE-200 Non-radiopaque polyethylene tubing ID: 1.4 mm, OD: 1.9 mm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B. Actively acquired tolerance of foreign cells. Nature. 172 (4379), 603-606 (1953).
  2. Murray, J. E. Organ transplantation (skin, kidney, heart) and the plastic surgeon. Plastic and Reconstructive Surgery. 47 (5), 425-431 (1971).
  3. Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic heart transplantation in mice. Journal of Visualized Experiments. (6), e238 (2007).
  4. Ruzza, A., et al. Heterotopic heart transplantation in rats: improved anesthetic and surgical technique. Transplant Proceedings. 42 (9), 3828-3832 (2010).
  5. Oldani, G., Lacotte, S., Morel, P., Mentha, G., Toso, C. Orthotopic liver transplantation in rats. Journal of Visualized Experiments. (65), e4143 (2012).
  6. Lang, K. S., et al. Immunoprivileged status of the liver is controlled by Toll-like receptor 3 signaling. Journal of Clinical Investigation. 116 (9), 2456-2463 (2006).
  7. Sun, Z., et al. Recruitment of host progenitor cells in rat liver transplants. Hepatology. 49 (2), 587-597 (2009).
  8. Orlando, G., Soker, S., Wood, K. Operational tolerance after liver transplantation. Journal of Hepatolgy. 50 (6), 1247-1257 (2009).
  9. Lodhi, S. A., Lamb, K. E., Meier-Kriesche, H. U. Solid organ allograft survival improvement in the United States: the long-term does not mirror the dramatic short-term success. American Journal of Transplantation. 11 (6), 1226-1235 (2011).
  10. Engels, E. A., et al. Spectrum of cancer risk among US solid organ transplant recipients. Journal of the American Medical Association. 306 (17), 1891-1901 (2011).
  11. Kasiske, B. L., Snyder, J. J., Gilbertson, D., Matas, A. J. Diabetes mellitus after kidney transplantation in the United States. American Journal of Transplantation. 3 (2), 178-185 (2003).
  12. de Mattos, A. M., Olyaei, A. J., Bennett, W. M. Nephrotoxicity of immunosuppressive drugs: long-term consequences and challenges for the future. American Journal of Kidney Diseases. 35 (2), 333-346 (2000).
  13. Hu, X., et al. Chimeric Allografts Induced by Short-Term Treatment With Stem Cell-Mobilizing Agents Result in Long-Term Kidney Transplant Survival Without Immunosuppression: A Study in Rats. American Journal of Transplantation. 16 (7), 2055-2065 (2016).
  14. Shrestha, B., Haylor, J. Experimental rat models of chronic allograft nephropathy: a review. International Journal of Nephrology and Renovascular Disease. 7, 315-322 (2014).
  15. Fu, Y., et al. Successful transplantation of kidney allografts in sensitized rats after syngeneic hematopoietic stem cell transplantation and fludarabine. American Journal of Transplantation. 14 (10), 2375-2383 (2014).
  16. Grau, V., et al. Immune Complex-Type Deposits in the Fischer-344 to Lewis Rat Model of Renal Transplantation and a Subset of Human Transplant Glomerulopathy. Transplantation. 100 (5), 1004-1014 (2016).
  17. Vogelbacher, R., et al. Bortezomib and sirolimus inhibit the chronic active antibody-mediated rejection in experimental renal transplantation in the rat. Nephrology Dialysis Transplantation. 25 (11), 3764-3773 (2010).
  18. Fisher, B., Lee, S. Microvascular surgical techniques in research, with special reference to renal transplantation in the rat. Surgery. 58 (5), 904-914 (1965).
  19. Mahabir, R. N., Guttmann, R. D., Lindquist, R. R. Renal transplantation in the inbred rat. X. A model of "weak histoincompatibility" by major locus matching. Transplantation. 8 (4), 369-378 (1969).
  20. Wang, J. J., Hockenheimer, S., Bickerstaff, A. A., Hadley, G. A. Murine renal transplantation procedure. Journal of Visualized Experiments. (29), e1150 (2009).
  21. Bickerstaff, A. A., Wang, J. J., Pelletier, R. P., Orosz, C. G. Murine renal allografts: spontaneous acceptance is associated with regulated T cell-mediated immunity. Journal of Immunology. 167 (9), 4821-4827 (2001).
  22. Silber, S. J., Crudop, J. Kidney transplantation in inbred rats. American Journal of Surgery. 125 (5), 551-553 (1973).
  23. D'Silva, M., et al. Rat kidney transplantation update with special reference to vesical calculi. Microsurgery. 11 (2), 169-176 (1990).
  24. Yin, M., Booster, M. H., Bogaard, A. E. J. M., Kootstra, G. A simple technique to harvest two kidneys from one donor rat for transplantation. Lab Animal. 28 (4), 387-390 (1994).
  25. Lopez-Neblina, F., Toledo-Pereyra, L. H., Suzuki, S. Ultrarapid orthotopic technique for renal transplantation in the rat. Microsurgery. 15 (4), 274-278 (1994).
  26. Blom, D., Orloff, M. S. A more versatile and reliable method for renal transplantation in the rat. Microsurgery. 18 (4), 267-269 (1998).
  27. Engelbrecht, G., Kahn, D., Duminy, F., Hickman, R. New rapid technique for renal transplantation in the rat. Microsurgery. 13 (6), 340-344 (1992).
  28. Kline, R., Churchill, M., Churchill, P., Bidani, A., Schwartz, M. High osmolality-low pH flush solutions improve renal transplant function in rats. Urology Research. 19 (2), 81-86 (1991).
  29. Fray, J. C. Mechanism by which renin secretion from perfused rat kidneys is stimulated by isoprenaline and inhibited by high perfusion pressure. The Journal of Physiology. 308, 1-13 (1980).
  30. Fry, D. L. Acute vascular endothelial changes associated with increased blood velocity gradients. Circulation Research. 22 (2), 165-197 (1968).
  31. Pahlavan, P. S., Smallegange, C., Adams, M. A., Schumacher, M. Kidney transplantation procedures in rats: assessments, complications, and management. Microsurgery. 26 (5), 404-411 (2006).
  32. Savas, C. P., et al. Renal transplantation in the rat--a new simple, non-suture technique. Urology Research. 13 (2), 91-93 (1985).
  33. Fabre, J., Lim, S. H., Morris, P. J. Renal transplantation in the rat: details of a technique. The Austalian and New Zealand Journal of Surgery. 41 (1), 69-75 (1971).
  34. Cameron, A. M., et al. Chimeric Allografts Induced by Short-Term Treatment With Stem Cell Mobilizing Agents Result in Long-Term Kidney Transplant Survival Without Immunosuppression: II, Study in Miniature Swine. American Journal of Transplantation. 16 (7), 2066-2076 (2016).

Tags

Medicin nyre transplantation ortotopic rotte overlevelse afvisning tolerance
Ortotopic rotte nyre transplantation: en roman og forenklet kirurgisk tilgang
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahmadi, A. R., Qi, L., Iwasaki, K.,… More

Ahmadi, A. R., Qi, L., Iwasaki, K., Wang, W., Wesson, R. N., Cameron, A. M., Sun, Z. Orthotopic Rat Kidney Transplantation: A Novel and Simplified Surgical Approach. J. Vis. Exp. (147), e59403, doi:10.3791/59403 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter