Summary
Het doel van dit manuscript en protocol is uit te leggen en in detail de chirurgische ingreep van orthotopic nier transplantatie bij ratten te tonen. Deze methode is vereenvoudigd om de juiste doorbloeding van de donor nier te bereiken en de reperfusie tijd te verkorten met behulp van de veneuze en urineleider manchet anastomosis techniek.
Abstract
Nier transplantatie biedt verhoogde overlevingskansen en een betere kwaliteit van leven voor patiënten met een eindstadium nierziekte, in vergelijking met elk type van renale substitutietherapie. In de afgelopen decennia, de rat nier transplantatie model is gebruikt om de immunologische verschijnselen van afwijzing en tolerantie studie. Dit model is uitgegroeid tot een onmisbaar instrument om nieuwe immunomodulerende geneesmiddelen en regimes te testen voorafgaand aan de procedure met dure preklinische grote dierlijke studies.
Dit protocol biedt een gedetailleerd overzicht van hoe op betrouwbare wijze uit te voeren orthotopic nier transplantatie bij ratten. Dit protocol omvat drie onderscheidende stappen die de kans op succes te vergroten: doorbloeding van de donor nier door blozen door de poortader en het gebruik van een manchet systeem om de renale aderen en urineleiders te anastomose, waardoor afnemende koude en warme ischemie keer. Gebruikend deze techniek, hebben wij overlevingstarieven voorbij 6 maanden met normaal serumcreatinine bij dieren met syngeneic of verdraagzaam nier transplantaties bereikt. Afhankelijk van het doel van de studie, kan dit model door pre-of posttransplant behandelingen worden gewijzigd om de scherpe, chronische, cellulaire, of antilichaam-bemiddelde afwijzing te bestuderen. Het is een reproduceerbaar, betrouwbaar en kosteneffectief diermodel om verschillende aspecten van de nier transplantatie te bestuderen.
Introduction
Historisch, de eerste transplantatie afwijzing studies werden uitgevoerd door Brent en Medawar met behulp van huidtransplantaties in knaagdieren1. Het werd al snel duidelijk dat de huid heeft verschillende immunologische kenmerken, waardoor het een zeer immunogeen orgaan dat anders is in afwijzing van andere vasculaire vaste organen2. Rat studies van Solid orgaantransplantatie afwijzing zijn gewoonlijk beperkt tot hart-, lever-en nier transplantaties. Hoewel elk van deze organen geschikt is om afwijzing te bestuderen, zijn er voordelen en nadelen aan elk van hen. Harttransplantaties worden vaak geplant in de buik en geanastomoseerd aan de aorta en vena cava, met inheemse hart van de ontvanger in plaats3. Dit is niet recreëren menselijke klinische, anatomische en fysiologische omstandigheden. Bovendien, zijn de harten zeer gevoelig voor koude ischemie en moeten bij voorkeur binnen 1 h worden reperfused om hun functie4te kunnen terugkrijgen. Lever transplantaties worden over het algemeen beschouwd als chirurgisch meer uitdagend en tijd-gevoelig te presteren. Na het verwijderen van de inheemse lever, de donorlever moet worden geïmplanteerd en reperfused binnen 30 min als de ontvangers niet langer kan duren zonder een functionerende lever5. De Leverslagader, poortader, en vooral de galwegen reconstructie vereist geraffineerde chirurgische vaardigheden. Naast de chirurgische uitdagingen, is de lever gekend om tolerogenic eigenschappen te bezitten en de knaagdieren en de mensen kunnen operationeel verdraagzaam6,7,8worden. De nier, in tegenstelling tot de bovengenoemde organen, kan worden geplant in een orthotopic mode, is bekend dat een immunogeen orgaan met consistente, reproduceerbare afwijzing episodes (indien niet immuungecompromitteerde), en zorgt voor langdurige koude ischemie tijden van verschillende Uur. Dit maakt de rat nier transplantatie een ideaal model voor het bestuderen van Allograft afwijzing en tolerantie.
Nier transplantatie (KT) is de beste keuze van de behandeling voor patiënten met een eindstadium nierziekte. In de afgelopen decennia, op korte termijn overlevingsresultaten na KT drastisch zijn verbeterd, maar op lange termijn Overleving uitkomsten zijn stagnerende9. Conventionele immunosuppressieve regimes blijven de standaard anti-afwijzing therapie. Nochtans, veroorzaakt het chronische gebruik van immunosuppressieve therapie significante morbiditeit en mortaliteit, zoals nefrotoxiciteit, diabetes, en secundaire maligniteiten10,11,12. Op de lange termijn, chronische antilichaam-en cellulaire-gemedieerde afwijzing bedreigen transplantaat overleving, met beperkte therapeutische opties beschikbaar.
Een belangrijk doel in transplantatie is de inductie van transplantatie tolerantie om de behoefte aan chronische immunosuppressie te ondervangen. De rat KT model is een robuust instrument om de immunologische afwijzing proces te onderzoeken en om nieuwe benaderingen van Immunomodulatie en transplantatie tolerantie te evalueren. De rat dient ook als geschikt model om scherpe en chronische cel-en antilichaam-gemedieerde verwerping13,14,15,16,17te bestuderen. Dit chirurgische model heeft bewezen een betrouwbaar, reproduceerbaar, en kosteneffectieve instrument om verschillende aspecten van Allograft afwijzing en tolerantie studie. Het wordt vaak gebruikt om nieuwe tolerantie-inducerende protocollen te testen voorafgaand aan de onderneming dure en omslachtige studies met grote dieren. Het uitvoeren van KT in ratten vereist uitgebreide chirurgische opleiding en deskundigheid om overlevingspercentages van > 90% te bereiken. In dit manuscript en in de bijbehorende educatieve video, bieden wij een stap-voor-stap schets voor orthotopic KT in de rat, zoals met succes uitgevoerd voor vele jaren bij onze instelling.
Voorafgaand aan het starten van een procedure, donor en ontvanger selectie is kritisch en hangt af van de aard van het experiment. Idealiter, donoren en ontvangers moeten wegen tussen 220-260 g en tussen de 8 tot 12 weken oud. Dieren onder 220 g hebben kleine diameter slagaders, aders en urineleiders, waardoor de anastomosis in de ontvanger bijzonder uitdagend. Minor bloedverlies kan leiden tot hypovolemie en leiden tot de dood in kleinere dieren. Dieren zwaarder dan 260 g display meer vet rond hun schepen, en schip isolatie zal meer operatieve tijd en verhoging van de koude ischemie tijd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Lewis (RT11) en Dark AGOUTI (da) (RT1Aa) ratten werden gekocht bij commerciële leveranciers (Zie de tabel van de materialen). Deze volledig MHC-niet-gematchte stammen worden vaak gebruikt om acute renale Allograft afwijzing te bestuderen. Alle dieren werden gehuisvest en onderhouden volgens de nationale instituten van gezondheid (NIH) richtlijnen in een specifieke ziekteverwekker-vrije faciliteit aan de Johns Hopkins University. Alle procedures werden goedgekeurd door de institutionele Commissie van het dierzorg en gebruik.
1. donor procedure
- Bereid en autoclaaf alle chirurgische instrumenten om te worden gebruikt in deze procedure als een middel van sterilisatie en het gebruik wegwerp steriele handschoenen om besmettelijke complicaties te voorkomen.
- Verdoven de donor rat door Isofluraan inhalatie (inductie bij 3% – 4% en onderhoud bij 1% – 2%) voor de rest van de procedure. Geef alle donor en de ontvangende dieren preventieve buprenorfine onderhuids op 0,1 mg/kg lichaamsgewicht voor analgesie.
- Nu, plaats de rat in een liggende positie en immobiliseren de ledematen met steriele masking tape.
- Gebruik een mechanische Clipper om haar te verwijderen uit de buikstreek.
- Breng een oog smeermiddel en gebruik steriele gaas gedrenkt in Povidon-jodium, gevolgd door gaas gedrenkt in isopropylalcohol alcohol, om de chirurgische veld te steriliseren.
- Voorafgaand aan de eerste incisie, zorg ervoor dat de rat adequaat is verdoofd door het controleren van de afwezigheid van de teen pinch intrekking reflex.
- Met behulp van een schaar, beginnen met het maken van een grote longitudinale middellijn huid en spier incisie van de symphysis pubis aan de xiphoid, en voer de buikholte.
- Plaats twee OPROLMECHANISMEN aan beide zijden van de buikwand om de intra-abdominale holte bloot te leggen.
- Bedek de darm met een vochtig steriele gaas en verschuiven naar de rechterzijde van de buik, bloot de aorta, vena cava, en linker nier. Breng 1 mL van de voorverwarmde zoutoplossing met een 1 cc spuit om de darmen en de buikorganen vochtig en bij een normale temperatuur te houden.
- Breng een tweede vochtig gaas te dekken en te mobiliseren van de maag en milt craniale aan de nieren en een klein vochtig gaasje om de blootgestelde nieren te dekken (Figuur 1a).
- Gebruik microchirurgische ontleden Tang te isoleren en te mobiliseren van de linker renale slagader en ader van het bindweefsel en elkaar. Isoleer de linker renale ader door cauterizing de linker gonadale ader en isoleren van de linker renale slagader door cauterizing de bijnier slagader. Na dat, mobiliseren van de aorta en Vena Cava superieur en inferieur aan de linker renale pedicle door het ontleden van het bindweefsel met ontleden Tang (Figuur 1B).
- Verdeel en mobiliseren van de urineleider van het bindweefsel met behulp van ontleden Tang, en maak een diagonale incisie op een lengte van 2 cm gemeten van het nier bekken, met behulp van microschaar. Plaats een polyamide manchet (Zie tabel van materialen) halverwege in de urineleider en zet de manchet door het plaatsen van een knoop met 8-0 zijden hechting (Figuur 1C).
Opmerking: het is belangrijk om niet alle vet en bindweefsel te verwijderen uit de urineleider, omdat ze bescherming bieden tegen obstructie veroorzaakt door hechtingen, en hun verwijdering kan leiden tot urine-necrose. Extra aandacht besteden aan het behoud van het schip leveren zuurstof aan de urineleider. - Mobiliseren van de linker nier door het scheiden van het perinephric vet met behulp van ontleden Tang of microschaar. Laat de vet capsule van de nieren bevestigd en gebruik die site voor de behandeling van de nier.
- Stel de inferieure Vena Cava bloot.
- Beheer 200 eenheden van heparine met behulp van een spuit met een 27 G naald door de penis ader. Druk op de site van de injectie met een wattenstaafje voor ten minste 1 minuut om bloeden te voorkomen.
- Identificeer de poortader (PV) en inferieure vena cava (IVC) (Figuur 1D). Spoel de nier door het injecteren van 50 mL koude zoutoplossing gemengd met 500 eenheden van heparine in de poortader met behulp van een 16 G naald (Figuur 1E). Voor het spoelen, snijd de inferieure vena cava op de infrahepatic niveau en de poortader caudale op de naald insertie site om het bloed om de circulatie te verlaten. Start het spoelen van de nier door geleidelijk infusie van de zoutoplossing. Observeer een verandering van kleur van de nier van donkerrood naar een uniform grijs en bleke kleur (Figuur 1F).
- Na het spoelen, binden de renale slagader en de ader proximaal van de aorta en Vena Cava en plaats de gespoelde nier in een Petri schaaltje in koude zoutoplossing op ijs. Figuur 2 A vertegenwoordigt het schematische overzicht van de donor procedure.
- Zodra de nier is in koude zoutoplossing, vast te stellen en immobiliseren het handvat van de ader manchet (Zie de tabel van materialen) en voorzichtig Trek de renale ader door de manchet. Dan, bevestig de renale ader over de manchet door het plaatsen van drie knopen met behulp van acht-Zero zijde hechting (Figuur 2b).
Opmerking: besteed speciale aandacht aan de oriëntatie van de ader, terwijl het veiligstellen van het op zijn plaats. Geroteerde aders veroorzaken een obstructie van de bloedtoevoer en leiden tot trombose.
2. ontvangstprocedure
- Herhaal stap 1.1-1.11 van de donor procedure.
- Plaats twee atraumatische micro-vessel klemmen op de linker renale slagader en de ader proximaal van de aorta en vena cava (Figuur 3a).
- Binden de ontvanger renale ader proximale aan de inlaat van de nier. Spoel de renale ader met heparinized Saline om alle resterende bloed te verwijderen uit het vat.
- Schuif de afgebonden renale ader over de geboeide renale ader eerder gepositioneerd in de donor nieren en veilig met een 8-0 zijden hechting (Figuur 3B). Behoud dezelfde positionele oriëntatie bij het veiligstellen van de renale ader over de manchet.
- Binden de urineleider op het niveau van de onderste pool van de linker nier. Mobiliseer de nieren van de perinephric vet.
- Binden de renale slagader proximaal aan de inlaat van de ontvanger nier. Spoel het met heparinized zoute om overtollig bloed te verwijderen in het vat. Voer een end-to-end anastomosis van de renale slagader met 8 tot 10 onderbroken hechtingen met behulp van een 10-0 nylon hechting (Figuur 3C). Manoeuvre de slagader met behulp van de adventitial laag.
- Verwijder de scheeps klemmen om de reperfusie van de nieren te herinitialiseren. Begin met het verwijderen van de klem op de ader, gevolgd door de klem op de slagader (Figuur 3D). Gebruik een steriele wattenstaafje om licht te druk alle sijpelende gebieden rond de anastomosis regio. Een paar minuten moet voldoende zijn om een octrooi anastomosis te bereiken.
- In het kort observeren de nieren te beoordelen voor een adequate doorbloeding. Onmiddellijk na reperfusie, moet de nier van kleur veranderen en geleidelijk weer zijn natuurlijke donkerrode kleur na een paar minuten (Figuur 3E). Zichtbare Peristalsis van de urineleider en on-site urineproductie worden soms waargenomen.
- Eindig door het plaatsen van de blootgestelde uiteinde van de urineleider manchet in de ontvanger urineleider en beveilig de ontvanger urineleider met een 8-0 zijden hechting (Figuur 2C en Figuur 3F).
- Om de donor en de ontvanger urineleiders in positie te houden, das de uiteinden van elke urineleider kant aan elkaar.
- Optioneel, de juiste nier kan worden nephrectomized door koppelverkoop uit de juiste renale slagader en ader met een 4-0 zijden hechting en het verwijderen van de nieren.
- Verwijder alle gaasjes uit de buikholte, alle organen terug te keren naar hun natuurlijke positie, spuiten 1 mL zout over de darmen te houden vochtig, en sluit de buik met behulp van een 4-0 absorbeerbare hechtdraad op de rectus spier en een 4-0 zijde hechting aan de huid te sluiten lag er in een onderbroken mode.
3. postoperatieve zorg
- Plaats het dier in een schone kooi met toegang tot ad libitum water en voedsel en laat voor herstel op een 37 °C verwarming pad.
- Injecteren 0,1 mg/kg buprenorfine onderhuids voor analgesie en toezicht op het dier voor herstel. Extra pijnstillers toediening kan nodig zijn in de komende dagen, afhankelijk van tekenen van ongemak of pijn. Antibiotica worden niet routinematig toegediend, zoals besmettelijke complicaties zijn zeldzaam.
- Let op het herstel voor 1 – 2 uur voordat het dier terug naar de dieren faciliteit terugkeert. Inspecteer het dier 2x – 3x per dag voor de eerste 24 uur, gevolgd door een dagelijkse inspectie. Besteed aandacht aan tekenen van pijn en nood, orale inname, en urine-uitgang.
- Verwijder de steken 7 – 10 dagen na de operatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We voerden syngeneic (n = 5) en allogene nier transplantaties (n = 5). De dieren met een syngeneic transplantatie bereikten lange termijn Overleving zonder enige immunosuppressieve behandeling. Dieren die een allogene transplantatie kregen zonder immunosuppressie verwierpen hun Graft en bezweken aan nierfalen met een mediane overleving van 8 dagen (Figuur 4a). Gemiddelde serumcreatinine steeg bescheiden in de syngeneic groep, terwijl het steeg met 14-voudige in de allogene groep (0,5 mg/dL versus 7,0 mg/dL, p < 0,01) (Figuur 4B). Op explantatie, de macroscopische uitzicht op de syngeneic nier Allograft toonde geen afwijkingen. De nier kleur en de interne structuren bleven intact. In tegenstelling, nier allografts van afgewezen dieren gepresenteerd rode hemorragische vlekken met de vernietiging van de interne structuren (Figuur 4C). Hematoxyline en eosine vlekken van syngeneic enten toonden dunne glomerulaire capillaire lussen met normale nummers van endothelial en mesangiale cellen. Afgewezen allografts weergegeven vernietigd glomerulaire structuren met tekenen van ontsteking en Tubulitis (Figuur 4D). Om te bevestigen T-cel-gemedieerde afwijzing, hebben we uitgevoerd CD8 + kleuring. Terwijl syngeneic allografts toonde zeer weinig positieve CD8 + T cellen, de afgewezen allografts toonde een significant hoger aantal CD8 + cellen in en rond de glomeruli en tubuli (Figuur 4E), bevestiging van T-cel-gemedieerde afwijzing.
Figuur 1 : Donor Nefrectomie. (A) bij het openen van de buik, de linker nier is geïsoleerd met vochtige gaasjes. (B) de linker renale slagader en ader zijn geïsoleerd en gemobiliseerd uit de omliggende vet. (C) de urineleider is afgebonden, geboeid, en beveiligd met een enkele zijde hechting. (D) de poortader (PV) en inferieure vena cava (IVC) worden geïdentificeerd en de nier wordt doorbloede door de poortader. (E) doorbloeding wordt met succes uitgevoerd als de juiste nier en de lever worden steeds bleke door het spoelen van het dier Portal ader. (F) succesvolle doorbloeding toont een bleke nier en schepen klaar voor transplantatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Schematisch overzicht van de procedure van de niertransplantatie. Aschematisch overzicht van de donor procedure. (B) schematisch overzicht van een geboorde donor ader. (C) schematisch overzicht van de anastomosis van de ontvanger en de geboorde donor ader en anastomosis van de urineleiders. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Nier transplantatie in de ontvanger. (A) de slagader en de ader van de ontvanger worden gemobiliseerd van het omringende vet en vastgeklemd na scheiding. (B) de donor nier wordt ingevoerd, en de aderen zijn aangesloten via de manchet techniek en beveiligd met een 8-0 hechting. (C) de slagaders zijn gehecht in een end-to-end mode. Dde klemmen worden verwijderd. (E) de nier is reperfused en herstelt zijn natuurlijke kleur zonder bloeden. (F) ten slotte, de urineleiders zijn geanastomoseerd met behulp van de eerder geplaatste manchet en beveiligd met een 8-0 hechting. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Nier transplantatie overleven. (A) de Kaplan-Meyer figuur toont het voortbestaan van ratten met syngeneic of allogene nier transplantaties in de tijd. Bmeting en vergelijking van serumcreatinine bij ratten met syngeneic of allogene nier transplantaties ten opzichte van niet-transplantatie dieren. (C) macroscopische overzicht van explanted nieren van syngeneic (boven) en allogene (bodem) nier transplantatie op dag 8. Dieren werden doorbloede met een zoutoplossing voorafgaand aan explanting. De laatste twee panelen tonen een microscopisch overzicht van (D) hematoxyline en eosine kleuring en (E) CD8 + van syngeneic (boven) en allogene (bodem) nier Explants. De beelden worden genomen onder 200 x vergroting. * Resultaten werden beschouwd als statistisch significant als p < 0,05. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5 : Vereiste chirurgische instrumenten . (1) rechte schaar. (2) fijne schaar. (3) micro-veer schaar 1 (urineleider afbinding). (4) micro-veer schaar 2. (5) micro-veer schaar 3. (6) kleine chirurgische OPROLMECHANISMEN. (7) Tang. (8) Microforceps, rechte, glad. (9) ontleden Tang, gebogen. (10) micro-naaldhouder. (11) naaldhouder. (12) 8-0 gevlochten zijden hechting zonder naald. (13) 4-0 zijden hechting. (14) micro-Vatenklemmen (één paar). (15) micro-vessel klem aanvrager. (16) Fine-Tip klem. (17) heparine. (18) schip klem (middelgrote maat). (19) de klem van het schip (groot). (20) steriele wattenstaafjes. (21) 10-0 micro-hechting met naald. (22) steriel gaas. (23) Heparinized zoute spoel spuit. (24) 60 cc spuit met naald. (25) 10 CC spuit. (26) 1 cc spuit. (27) 25 G 5/8 inch naalden. (28) 19 G naalden. (29) trimmer. (30) bipolair cauterisatie systeem. (31) tape. (32) Petri schaaltje met 0,9% normale zoutoplossing. (33) 60 cc spuit met 50 cc heparinized zoutoplossing voor doorbloeding. (34) 10 CC spuit met 5 CC heparinized Saline flush. (35) urineleider manchet. (36) ader manchet. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit manuscript beschrijven we de chirurgische methode voor orthotopic KT in ratten in detail, met inbegrip van alle benodigde apparatuur die nodig is om deze procedure uit te voeren (Figuur 5). In 1965, Fisher en Lee publiceerde het eerste rapport over KT in ratten, die werd het begin van een spannend onderzoek veld18. Sindsdien zijn er veel wijzigingen aangebracht om de reproduceerbaarheid van dit model te verbeteren. Het heeft gediend als een effectief diermodel voor het bestuderen van ischemie-reperfusie letsel en renale transplantatie afwijzing en tolerantie, dankzij de beschikbaarheid van verschillende ingeteelde en overgefokte stammen met gedeeltelijke en volledige MHC mismatch combinaties19. De rat KT model kan dienen als een instrument om hypothesen te testen voorafgaand aan de uitbreiding van onderzoeken naar varkens en niet-menselijke primaat modellen van KT. opties om te studeren nier transplantatie afwijzing of tolerantie bij knaagdieren zijn beperkt. De nier transplantatie model in muizen is technisch zeer uitdagend en vereist een lange trainingsperiode om de overlevingscijfers van > 80%20te bereiken. Een andere beperking van de muismodel is de spontane renale Allograft acceptatie zonder de noodzaak voor immunosuppressie in ongeveer 30% van de ontvangers. Echter, andere orgaantransplantaties in muizen, zoals huid en hart, worden afgewezen binnen 10 dagen, wat suggereert dat de verwerping van de nier allografts in volledig MHC-mismatch muizen is zwak en niet representatief voor de klinische situatie21. Echter, als de technische uitdaging kan worden overwonnen, muizenmodellen hebben de voorkeur voor mechanisme studies van Allograft afwijzing vanwege de beschikbaarheid van genetisch gemodificeerde knock-in of knock-out muizen.
KT in ratten kan worden uitgevoerd op een aantal manieren. We zullen een paar voor-en nadelen van deze verschillende methoden bespreken. Ongeacht de aangewezen techniek, is het altijd kritiek om warme tijd te verminderen ischemie en onomkeerbare verwonding aan het ent en de ontvanger te vermijden.
Rechts versus linker nier
De abdominale anatomie van ratten is zeer vergelijkbaar met die van de mens. De linker nier ligt superieur ten opzichte van de rechter nier vanwege de anatomische positie van de lever. Een van de voordelen van het gebruik van de linker nier is de lengte van de schepen. In het algemeen, de linker renale slagader en ader zijn tweemaal de lengte van de juiste renale schepen. Dit is vooral gunstig bij het uitvoeren van anastomosis waar de lengte van de schepen is niet een beperkende factor. Echter, rapporten bestaan van rechts-zijdige donor nier ophalen en transplantatie22,23. Benaderingen met behulp van beide nieren voor transplantatie zijn ook beschreven24.
Spoelen donor nier via de poortader
Een van de belangrijkste stappen van deze procedure is de donor nieren doorbloeding. Het is noodzakelijk om alle donorbloed uit de vaten en de nieren te verwijderen en het orgel af te koelen tot een langzame biologische achteruitgang. Er zijn verschillende methoden beschreven voor perfusing de nier. We hebben geëxperimenteerd met het spoelen van de nieren op verschillende manieren en concludeerde dat het spoelen van de nieren via de poortader biedt voordelen en consequent leidt tot volledige doorbloeding van de nieren en schepen. De conventionele benaderingen beschreven in de literatuur leiden tot het spoelen van de donor nier na ligating de renale slagader en ader of retrograde door de infrarenal aorta24,25,26,27 , 28. deze benaderingen kunnen leiden tot endothelial schade en renale vasoconstrictie als gevolg van verhoogde lokale druk of tot onvolledige doorbloeding door een lage bloeddruk van29,30.
Door het spoelen van de nieren door de poortader, de druk wordt beheerd door het hart. Tijdens de doorbloeding, het hart is nog steeds actief en pompen de transcirculatie vloeistof op een normale manier om de aorta en nieren met Pulsatiele flow, het voorkomen van schade aan haarvaten en glomeruli als gevolg van afschuif druk stroom. Bij het transplanteren van de nieren en bloc of het gebruik van de juiste nier voor transplantatie, deze methode is geschikt om uniforme doorbloeding te bereiken en om beide nieren te oogsten op hetzelfde moment.
Arteriële en veneuze anastomosis
Een van de meest kritieke stappen in de rat KT model is het uitvoeren van een betrouwbare microvasculaire anastomosis in een tijd-efficiënte manier. De donor renale slagader kan worden geanastomoseerd aan nieren van de ontvanger slagader of de aorta. Anastomose de donor vaten naar de aorta en inferieure Vena Cava veroorzaakt ischemische schade aan de organen van de ontvanger. In dit protocol, demonstreren we de end-to-end anastomosis van de renale slagaders, omdat het voorkomt ischemische schade aan andere organen. Tijdens de arteriële anastomosis is het belangrijk om het endothelial oppervlak van het lumen niet te beschadigen bij het hanteren van het schip. Voor de ader anastomosis, gebruiken we een manchet techniek om de warme ischemie tijd te verminderen en de operatieve procedure te verkorten. Dit heeft bewezen een zeer betrouwbare en duurzame methode te zijn om adequate veneuze stroom te verzekeren. Om te zorgen voor een adequate veneuze stroom, is het noodzakelijk voor de aderen niet te worden geknikt of verdraaid wanneer deze samen worden beveiligd. Alternatief, is een eind-aan-eind of een eind-aan-kant ader anastomosis mogelijk, afhankelijk van de voorkeur van de chirurg. Idealiter, de arteriële en veneuze schip anastomosis moet nemen tussen de 20 tot 30 min.
Pieterse et al. samengevat de complicaties van elk type van techniek die op een literatuuronderzoek wordt gebaseerd31. Een van de belangrijkste complicaties die kunnen optreden na een microchirurgische schip anastomosis is trombose. Afbinding en adequate blozen van de ontvangende schepen aanzienlijk verminderen trombose vorming, en het is zeker niet een complicatie vaak waargenomen. Andere complicaties zijn lekkage of breuk van de anastomosis na reperfusie. Dit is gerelateerd aan ontoereikende microchirurgische techniek of onvoldoende behandeling van de schepen.
Urineleider anastomosis
De urineleider moet worden behandeld met de grootst mogelijke zorg, vooral tijdens de isolatie van de urineleider in de donor. Letsel aan de periureteric structuren kan leiden tot urine-ischemie leidt tot stricturen en obstructie en, in het ergste geval, urineleider necrose. De literatuur rapporteert verschillende methodes voor urineleider anastomosis. End-to-end, manchet-bijgestaan end-to-end, blaas patch, en blaas inbrengen zijn de meest gebruikte19,32,33. In eerdere studies, hebben we gebruik gemaakt van een manchet met schuine randen aan beide uiteinden om de binnenkomst te vergemakkelijken in de urineleider aan beide uiteinden. We hebben niet observeren geen urine lekkage of bloedstolsel formaties. Echter, op lange termijn complicaties (> 30 dagen) van deze techniek zijn hydronefrose en af en toe nefrolithiasis, die kan worden verklaard door strictuur vorming, dislocatie, of obstructie van de manchet als gevolg van de urineleider stenen. Deze bevinding is in overeenstemming met andere rapporten en onze eigen bevindingen van het uitvoeren van de urineleider anastomosis met een manchet. Urineleider complicaties worden vaak opgemerkt postoperatief na aanzienlijke schade aan de nieren, zijn onbergbaar, en vereisen het dier te worden euthanized.
Postoperatieve zorg en overleving
De postoperatieve verzorging van geplante dieren vereist voldoende pijnbeheersing en gedetailleerde observaties van de totale activiteit van de dieren, gewichts waarnemingen en urineproductie. Gemeenschappelijke vroege postoperatieve complicaties zijn bloeden van de arteriële of veneuze anastomosis, urine lekkage, urineleider obstructie, of vertraagde ent functie als gevolg van langdurige ischemie tijd. De dieren met deze complicaties tonen bescheiden activiteit en blijven gewoonlijk in een gebogen-achterpositie zonder urine output en voedende opname. In het algemeen is het gunstig om te beheren tot 1-5 mL van de zoutoplossing voor de dieren postoperatief te versnellen hun herstel en uitdroging te voorkomen. De dieren die geen immunosuppressie ontvangen kunnen tussen 7 tot 10 dagen overleven, die voor een voldoende therapeutisch venster toestaat om nieuwe drugs of andere methodes te testen. Als dieren voldoende immuungecompromitteerde (1,0 mg/kg/dag FK506 onderhuids) of tolerant, kunnen ze worden gecontroleerd op lange termijn afgelopen 6 maanden zoals eerder gemeld13. De rat nier transplantatie model toegestaan de definitie van de mechanismen van tolerantie geïnduceerde door het gebruik van een unieke aanpak van stamcelmobilisatie voorafgaand aan de bevestiging van dit fenomeen in grote dieren34. Rat KT heeft cruciale informatie verstrekt aan onderzoekers voor tientallen jaren, en het zal blijven doen in de toekomst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door een gulle gift van het Bombeck familielandgoed.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buprenorphine HCL | Reckitt Benckiser Healthcare UK | NDC12496-0757-5 | |
| Dissecting forceps, curved | Zhenbang, China | 11cm Flat handle | |
| Heparin sodium injection USP | Sagent Pharmaceuticals | NDC25021-400-10 | |
| Micro-forceps, straight, smooth | Jingzhong, China | WA3010 | |
| Micro needle holder | Jingzhong, China | WA2010 | |
| Micro vessel clamps | Jingzhong, China | WA40120 | |
| Micro spring sciccor 1 | ROBOZ | RS-5620 | |
| Micro spring sciccor 2 | F.S.T. | 91501-09 | |
| Micro spring sciccor 3 | Zhenbang, China | 8.5cm Vannas,curved | |
| Prograf (Tacrolimus/FK506) | Astellas | ||
| Rats | Charles River & Taconic Biosciences | LEW/Crl & DA-M | |
| Shaver | Wahl | 79600-2101 | |
| Suture 4-0 | Ethicon | J304H | |
| Suture, 4-0 | Ethicon | 683G | |
| Suture, 10-0 | Ethicon | 2820G | |
| Syringes & Needles | BD | ||
| Thread, 8-0 | Ashaway | 75290 | |
| Ureteral cuff | Microlumen | 160-1 | Polymide Tubing, Diameter 0.41 mm |
| Venous cuff | Intramedic BD | 7441 | PE-200 Non-radiopaque polyethylene tubing ID: 1.4 mm, OD: 1.9 mm |
References
- Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B. Actively acquired tolerance of foreign cells. Nature. 172 (4379), 603-606 (1953).
- Murray, J. E. Organ transplantation (skin, kidney, heart) and the plastic surgeon. Plastic and Reconstructive Surgery. 47 (5), 425-431 (1971).
- Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic heart transplantation in mice. Journal of Visualized Experiments. (6), e238 (2007).
- Ruzza, A., et al. Heterotopic heart transplantation in rats: improved anesthetic and surgical technique. Transplant Proceedings. 42 (9), 3828-3832 (2010).
- Oldani, G., Lacotte, S., Morel, P., Mentha, G., Toso, C. Orthotopic liver transplantation in rats. Journal of Visualized Experiments. (65), e4143 (2012).
- Lang, K. S., et al. Immunoprivileged status of the liver is controlled by Toll-like receptor 3 signaling. Journal of Clinical Investigation. 116 (9), 2456-2463 (2006).
- Sun, Z., et al. Recruitment of host progenitor cells in rat liver transplants. Hepatology. 49 (2), 587-597 (2009).
- Orlando, G., Soker, S., Wood, K. Operational tolerance after liver transplantation. Journal of Hepatolgy. 50 (6), 1247-1257 (2009).
- Lodhi, S. A., Lamb, K. E., Meier-Kriesche, H. U. Solid organ allograft survival improvement in the United States: the long-term does not mirror the dramatic short-term success. American Journal of Transplantation. 11 (6), 1226-1235 (2011).
- Engels, E. A., et al. Spectrum of cancer risk among US solid organ transplant recipients. Journal of the American Medical Association. 306 (17), 1891-1901 (2011).
- Kasiske, B. L., Snyder, J. J., Gilbertson, D., Matas, A. J. Diabetes mellitus after kidney transplantation in the United States. American Journal of Transplantation. 3 (2), 178-185 (2003).
- de Mattos, A. M., Olyaei, A. J., Bennett, W. M. Nephrotoxicity of immunosuppressive drugs: long-term consequences and challenges for the future. American Journal of Kidney Diseases. 35 (2), 333-346 (2000).
- Hu, X., et al. Chimeric Allografts Induced by Short-Term Treatment With Stem Cell-Mobilizing Agents Result in Long-Term Kidney Transplant Survival Without Immunosuppression: A Study in Rats. American Journal of Transplantation. 16 (7), 2055-2065 (2016).
- Shrestha, B., Haylor, J. Experimental rat models of chronic allograft nephropathy: a review. International Journal of Nephrology and Renovascular Disease. 7, 315-322 (2014).
- Fu, Y., et al. Successful transplantation of kidney allografts in sensitized rats after syngeneic hematopoietic stem cell transplantation and fludarabine. American Journal of Transplantation. 14 (10), 2375-2383 (2014).
- Grau, V., et al. Immune Complex-Type Deposits in the Fischer-344 to Lewis Rat Model of Renal Transplantation and a Subset of Human Transplant Glomerulopathy. Transplantation. 100 (5), 1004-1014 (2016).
- Vogelbacher, R., et al. Bortezomib and sirolimus inhibit the chronic active antibody-mediated rejection in experimental renal transplantation in the rat. Nephrology Dialysis Transplantation. 25 (11), 3764-3773 (2010).
- Fisher, B., Lee, S. Microvascular surgical techniques in research, with special reference to renal transplantation in the rat. Surgery. 58 (5), 904-914 (1965).
- Mahabir, R. N., Guttmann, R. D., Lindquist, R. R. Renal transplantation in the inbred rat. X. A model of "weak histoincompatibility" by major locus matching. Transplantation. 8 (4), 369-378 (1969).
- Wang, J. J., Hockenheimer, S., Bickerstaff, A. A., Hadley, G. A. Murine renal transplantation procedure. Journal of Visualized Experiments. (29), e1150 (2009).
- Bickerstaff, A. A., Wang, J. J., Pelletier, R. P., Orosz, C. G. Murine renal allografts: spontaneous acceptance is associated with regulated T cell-mediated immunity. Journal of Immunology. 167 (9), 4821-4827 (2001).
- Silber, S. J., Crudop, J. Kidney transplantation in inbred rats. American Journal of Surgery. 125 (5), 551-553 (1973).
- D'Silva, M., et al. Rat kidney transplantation update with special reference to vesical calculi. Microsurgery. 11 (2), 169-176 (1990).
- Yin, M., Booster, M. H., Bogaard, A. E. J. M., Kootstra, G. A simple technique to harvest two kidneys from one donor rat for transplantation. Lab Animal. 28 (4), 387-390 (1994).
- Lopez-Neblina, F., Toledo-Pereyra, L. H., Suzuki, S. Ultrarapid orthotopic technique for renal transplantation in the rat. Microsurgery. 15 (4), 274-278 (1994).
- Blom, D., Orloff, M. S. A more versatile and reliable method for renal transplantation in the rat. Microsurgery. 18 (4), 267-269 (1998).
- Engelbrecht, G., Kahn, D., Duminy, F., Hickman, R. New rapid technique for renal transplantation in the rat. Microsurgery. 13 (6), 340-344 (1992).
- Kline, R., Churchill, M., Churchill, P., Bidani, A., Schwartz, M. High osmolality-low pH flush solutions improve renal transplant function in rats. Urology Research. 19 (2), 81-86 (1991).
- Fray, J. C. Mechanism by which renin secretion from perfused rat kidneys is stimulated by isoprenaline and inhibited by high perfusion pressure. The Journal of Physiology. 308, 1-13 (1980).
- Fry, D. L. Acute vascular endothelial changes associated with increased blood velocity gradients. Circulation Research. 22 (2), 165-197 (1968).
- Pahlavan, P. S., Smallegange, C., Adams, M. A., Schumacher, M. Kidney transplantation procedures in rats: assessments, complications, and management. Microsurgery. 26 (5), 404-411 (2006).
- Savas, C. P., et al. Renal transplantation in the rat--a new simple, non-suture technique. Urology Research. 13 (2), 91-93 (1985).
- Fabre, J., Lim, S. H., Morris, P. J. Renal transplantation in the rat: details of a technique. The Austalian and New Zealand Journal of Surgery. 41 (1), 69-75 (1971).
- Cameron, A. M., et al. Chimeric Allografts Induced by Short-Term Treatment With Stem Cell Mobilizing Agents Result in Long-Term Kidney Transplant Survival Without Immunosuppression: II, Study in Miniature Swine. American Journal of Transplantation. 16 (7), 2066-2076 (2016).
