Summary
Der Zweck dieses Manuskripts und Protokolls ist es, den chirurgischen Eingriff der orthotopischen Nierentransplantation bei Ratten im Detail zu erklären und zu demonstrieren. Diese Methode wird vereinfacht, um die korrekte Durchblutung der Spenderniere zu erreichen und die Reperfusionszeit durch die venöse und urterische Manschette Anastomose-Technik zu verkürzen.
Abstract
Die Nierentransplantation bietet eine höhere Überlebensrate und eine verbesserte Lebensqualität für Patienten mit Nierenerkrankungen im Endstadium im Vergleich zu jeder Art von Nierenersatztherapie. In den vergangenen Jahrzehnten wurde das Ratten-Nierentransplantationsmodell eingesetzt, um die immunologischen Phänomene der Abstoßung und Toleranz zu untersuchen. Dieses Modell ist zu einem unverzichtbaren Werkzeug geworden, um neue immunmodulatorische Arzneimittel und Therapien zu testen, bevor es mit teuren präklinischen großen Tierstudien fortfahren kann.
Dieses Protokoll bietet einen detaillierten Überblick darüber, wie man eine orthotopische Nierentransplantation bei Ratten zuverlässig durchführt. Dieses Protokoll enthält drei markante Schritte, die die Erfolgswahrscheinlichkeit erhöhen: Durchblutung der Spenderniere durch Spülung durch die Portalvene und die Verwendung eines Manschettensystems, um die Nierenvenen und Harnleiter zu anastomosieren, wodurch Kälte und Wärme abnehmen Ischiema-Zeiten. Mit dieser Technik haben wir Überlebensraten über 6 Monate hinweg mit normalem Serumcreatinin bei Tieren mit syngeneischen oder toleranten Nierentransplantationen erreicht. Je nach Studienziel kann dieses Modell durch Vor-oder Nachtransplantationsbehandlungen modifiziert werden, um die akute, chronische, zelluläre oder antikörpervermittelte Abstoßung zu untersuchen. Es ist ein reproduzierbares, zuverlässiges und kostengünstiges Tiermodell, um verschiedene Aspekte der Nierentransplantation zu untersuchen.
Introduction
Historisch gesehen wurden die ersten Transplantationsabstoßungsstudien von Brent und Medawar mit Hauttransplantationen inNagetieren 1 durchgeführt. Es wurde schnell klar, dass die Haut ausgeprägte immunologische Eigenschaften hat, was sie zu einem hochimmunogenen Organ macht, das sich in der Abstoßung von anderen vaskularisierten Festorganen 2 unterscheidet. Die Rattenstudien über die Abstoßung fester Organtransplantationen beschränken sich gewohnheitsmäßig auf Herz-, Leber-und Nierentransplantationen. Obwohl jedes dieser Organe geeignet ist, die Ablehnung zu studieren, gibt es für jedes dieser Organe Vor-und Nachteile. Herztransplantationen werden oft in den Bauch transplantiert und in die Aorta und Vena cava vergiftet, wobei das heimische Herz des Empfängers auf Platz3liegt. Dies stellt keine klinischen, anatomischen und physiologischen Bedingungen des Menschen dar. Darüber hinaus sind die Herzen sehr empfindlich gegen kalte Ischämie und müssen bevorzugt innerhalb von 1 Stunde neu verwendet werden, um ihre Funktion 4 wiederherstellenzukönnen. Lebertransplantationen gelten in der Regel als chirurgisch anspruchsvoller und zeitsensibler. Nach dem Entfernen der einheimischen Leber muss die Spenderleber innerhalb von 30 Minuten implantiert und neu verwendet werden, da die Empfänger ohne eine funktionierendeLeber nicht länger halten können. Die Leberarterie, die Portalvene und vor allem die Rekonstruktion des Gallengangs erfordern raffinierte chirurgische Fähigkeiten. Neben den chirurgischen Herausforderungen ist bekannt, dass die Leber tolerogene Eigenschaften besitzt und Nagetiere und Menschen operativ tolerant werdenkönnen6,7,8. Die Niere, im Gegensatz zu den oben genannten Organen, kann in einer orthotopischen Weise transplantiert werden, ist bekannt, dass ein immunogenes Organ mit konsistenten, reproduzierbaren Abstoßungsepisoden (wenn nicht immunsupprimiert), und ermöglicht für längere kalte Ischämie Zeiten von mehreren Stunden. Damit ist die Ratten-Knierentransplantation ein ideales Modell für das Studium der allograften Abstoßung und-toleranz.
Die Nierentransplantation (KT) ist die bevorzugte Wahl der Behandlung von Patienten mit Nierenerkrankungen im Endstadium. In den letzten Jahrzehnten haben sich die kurzfristigen Überlebensergebnisse nach KT dramatisch verbessert, aber die langfristigen Überlebensergebnisse stagnieren 9. Konventionelle immunsuppressive Therapien bleiben die Standard-Anti-Abstoßungstherapie. Der chronische Einsatz von immunsuppressiven Therapien führt jedoch zu einer signifikanten MorbiditätundMortalität, wie Nephrotoxizität, Diabetes und sekundären bösartigen Erkrankungen 10, 11,12. Auf lange Sicht bedrohen chronisch antibody-und zellmedizinisch vermittelte Abstoßungen das Überleben der Transplantation, wobei nur begrenzte therapeutische Möglichkeiten zur Verfügung stehen.
Ein wichtiges Ziel bei der Transplantation ist die Induktion von Transplantationstoleranz, um chronische Immunsuppression zu vermeiden. Das Ratten-KT-Modell ist ein robustes Werkzeug, um den immunologischen Abstoßungsprozess zu untersuchen und neue Ansätze zur Immunomodulation und Transplantationstoleranz zu evaluieren. Die Ratte dient auch als geeignetes Modell, um akute und chronische Zell-und Antikörper-vermittelte Abstoßung13,14, 15,16, 17zuuntersuchen. Dieses chirurgische Modell hat sich als zuverlässiges, reproduzierbares und kostengünstiges Werkzeug erwiesen, um verschiedene Aspekte der allograften Abstoßung und-toleranz zu untersuchen. Es wird oft verwendet, um neuartige toleranzinduzierende Protokolle zu testen, bevor teure und schwerfällige Großtierstudien durchgeführt werden. Die Durchführung von KT bei Ratten erfordert eine umfassende chirurgische Ausbildung und Expertise, um Überlebensraten von & gt;90% zu erreichen. In diesem Manuskript und in dem begleitenden Lehrvideo bieten wir einen schrittweisen Umriss für orthotopische KT in der Ratte, wie sie seit vielen Jahren in unserer Einrichtung erfolgreich durchgeführt wird.
Vor Beginn eines Verfahrens ist die Auswahl des Spenders und des Empfängers von entscheidender Bedeutung und hängt von der Art des Experiments ab. Idealerweise sollten Spender und Empfänger zwischen 220 – 260 g wiegen und zwischen 8 – 12 Wochen alt sein. Tiere unter 220 g haben kleinformatige Arterien, Venen und Harnleiter, was die Anastomose beim Empfänger besonders herausfordernd macht. Geringfügige Blutverluste können zu Hypovolämie führen und bei kleineren Tieren zum Tod führen. Tiere, die schwerer als 260 g sind, zeigen mehr Fett um ihre Gefäße herum, und die Isolierung der Gefäße wird mehr Betriebszeit erfordern und die kalte Ischämie erhöhen.
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Protocol
Lewis (RT11)und Dark Agouti (DA) (RT1Aa) Ratten wurden von kommerziellen Anbietern gekauft (siehe Materialliste). Diese vollständig MHC-falsch abgestimmten Stämme werden oft verwendet, um eine akute Nierenallograft-Abstoßung zu untersuchen. Alle Tiere wurden nach den Richtlinien der National Institutes of Health (NIH) in einer speziellen pathogenfreien Einrichtung an der Johns Hopkins University untergebracht und gepflegt. Alle Verfahren wurden vom Ausschuss für Tierpflege und-nutzung genehmigt.
1. Geberverfahren
- Bereiten Sie alle chirurgischen Instrumente, die in diesem Verfahren als Sterilisation verwendet werden, und Autoklaven, um infektiöse Komplikationen zu verhindern.
- Die Spenderratte durch die Isoofluran-Inhalation anästhetisieren (Induktion bei 3% – 4% und Wartung bei 1% – 2%) Für den Rest des Verfahrens. Geben Sie allen Spender-und Empfängertieren präventives Buprenorphin subkutan bei 0,1 mg/kg Körpergewicht für Schmerzmittel.
- Nun die Ratte in eine untere Position legen und die Gliedmaßen mit sterilen Maskenband immobilisieren.
- Verwenden Sie einen mechanischen Clipper, um Haare aus dem Bauchbereich zu entfernen.
- Tragen Sie ein Augenschmiermittel auf und verwenden Sie sterile Gaze, die in Povidon-Jod getränkt sind, gefolgt von Gazze, die in Isopropylalkohol eingeweicht ist, um das chirurgische Feld zu sterilisieren.
- Achten Sie vor dem ersten Schnitt darauf, dass die Ratte adäquat betäubt wird, indem Sie das Fehlen des Zehenpinken-Entnahmereflexes überprüfen.
- Beginnen Sie mit der Schere, indem Sie eine große längliche Mittellinie und Muskelschnitt von der Symphysis pubis bis zum Xiphoid herstellen, und geben Sie die Peritonealhöhle ein.
- Zwei Widerrufsbeläge auf beiden Seiten der Bauchwand einlegen, um die Innentwallhöhle zu entlarven.
- Bedecken Sie den Darm mit einer feuchten sterilen Gaze und verschieben Sie ihn auf die rechte Seite des Bauches, indem Sie die Aorta, Vena Cava und linke Niere. 1 mL vorgeheizter Salz mit einer 1 ccm-Spritze auftragen, um den Darm und die Bauchorgane feucht und bei normaler Temperatur zu halten.
- Tragen Sie eine zweite feuchte Gaze auf, um den Magen-und Milzkranz auf die Niere zu bedecken und zu mobilisieren, und eine kleine feuchte Gaze, um die exponierte Niere zu bedecken (Abbildung1A).
- Verwenden Sie mikrochirurgische Trennungs-Zangen, um die linke Nierenarterie und Vene aus dem Bindegewebe und einander zu isolieren und zu mobilisieren. Isolieren Sie die linke Nierenvene, indem Sie die linke Gonadalvene abkauern und isolieren Sie die linke Nierenarterie, indem Sie die Nebennierenarterie abbauen. Danach mobilisieren Sie die Aorta und die Vena cava überlegen und minderwertig der linken Nierenpediküre,indem Sie das Bindegewebe mit zertrinkenden Zangen trennen (Abbildung 1B).
- Teilen und mobilisieren Sie den Harnleiter aus dem Bindegewebe mit sich abgetrennten Zangen und machen Sie einen diagonalen Schnitt in einer Länge von 2 cm, der vom Nierenbecken mit Mikroscheren gemessen wird. Eine Polyamid-Manschette (siehe Materialtabelle) halbwegs in die Harnröhre einlegen und die Manschette durch einen Knoten mit 8-0 sichern Seidennaht (Abbildung 1C).
Hinweis: Es ist wichtig, nicht alle Fett-und Bindegewebe aus dem Harnleiter zu entfernen, da sie Schutz vor Behinderung durch Klebstoffe bieten, und ihre Entfernung kann zu Harnnekrosen führen. Achten Sie besonders darauf, dass das Schiff, das Sauerstoff an den Harnleiter liefert, erhalten bleibt. - Mobilisieren Sie die linke Niere, indem Sie sie mit Hilfe von Zangen oder Mikroscheren vom perinephrischen Fett trennen. Lassen Sie die Fettkapsel der Niere befestigt und verwenden Sie diese Stelle für den Umgang mit der Niere.
- Die minderwertige vena cava.
- Minister 200 Einheiten Heparin mit einer Spritze mit einer 27 G-Nadel durch die Penisvene. Den Spritplatz mit einem Wattestäbchen mindestens 1 min unter Druck setzen, um Blutungen vorzubeugen.
- Identifizieren Sie die Portalvene (pv) und die minderwertige vena cava (ivc) (Abbildung 1D). Spülen Sie die Niere, indem Sie 50 ml Kaltsalz mit 500 Einheiten Heparin in die Portalvene mit einer 16 G-Nadel (Abbildung1E) mischen. Vor dem Spülen die minderwertige vena cava auf der infrahepatischen Ebene und die Portalvene Caudal an der Nadeleinsetzstelle abschneiden, damit das Blut aus dem Kreislauf austreten kann. Beginnen Sie mit der Spülung der Niere, indem Sie nach und nach die Salzlösung einschleppen. Beobachten Sie einen Farbwechsel der Niere von dunkelrot zu einer gleichmäßigen grauen und blassen Farbe (Abbildung 1F).
- Nach dem Spülen die Nierenarterie und die Vene in der Nähe der Aorta und der Vena Cava anrichten und die gespülte Niere in eine Petrischale in kalte Saline auf Eis legen. Bild 2 A stellt den schematischen Überblick über das Spenderverfahren dar.
- Sobald die Niere in kalter Saline ist, fixieren und immobilisieren Sie den Griff der Venenkuppe ( siehe Materialtafel) und ziehen Sie die Nierenvene sanft durch die Manschette. Dann fixieren Sie die Nierenvene über die Manschette, indem Sie drei Knoten mit einer 8-Null-Seidense (Abbildung 2B) platzieren.
Achtung: Achten Sie besonders auf die Ausrichtung der Vene bei der Sicherung. Rotierte Venen führen zu einer Behinderung des Blutflusses und führen zu Thrombosen.
2. Rezeptverfahren
- Wiederholen Sie die Schritte 1.1 – 1.11 aus dem Spenderverfahren.
- Auf der linken Nierenarterie zwei atraumatische Mikrogefäßklemmen und in der Nähe der Aorta und der Vena cava platzieren (Abbildung3 A).
- Ligieren Sie die Wiederennungsvene des Empfängers in der Nähe des Einlaufs der Niere. Spülen Sie die Nierenvene mit hepariniertem Salz, um das restliche Blut aus dem Gefäß zu entfernen.
- Schieben Sie die ligierte Nierenvene über die gefesselte Nierenvene, die zuvor in der Spenderniere positioniert war, und sichern Sie sie mit einem 8-0 Seidennaht (Abbildung 3B). Halten Sie die gleiche Positionsorientierung bei der Sicherung der Nierenvene über der Manschette.
- Ligieren Sie den Harnleiter auf dem Niveau des unteren Pols der linken Niere. Mobilisieren Sie die Niere aus dem perinephrischen Fett.
- Ligieren Sie die Nierenarterie proximal an der Einmündung der Empfängerniere. Spülen Sie es mit heparinisiertem Salz, um überschüssiges Blut im Gefäß zu entfernen. Führen Sie eine Ende-zu-Ende-Anastomose der Nierenarterie mit 8 bis 10 unterbrochenen Nähten mit einer 10-0 Nylonnaht (Abbildung3 C). Die Arterie mit Hilfe der Adventsschicht verwalten.
- Entfernen Sie die Gefäßklemmen, um die Reperfusion der Niere wieder einzuleiten. Beginnen Sie mit dem Entfernen der Klemme auf der Vene, gefolgt von der Klemme auf der Arterie(Abbildung3D). Verwenden Sie einen sterilen Baumwollschwab, um alle verströmten Bereiche rund um die Anastomose-Region leicht zu unter Druck zu setzen. Ein paar Minuten sollten ausreichen, um eine Patentanastomose zu erreichen.
- Beachten Sie kurz die Niere, um für eine angemessene Perfusion zu beurteilen. Unmittelbar nach der Wiederdurchblutung sollte die Niere die Farbe wechseln und nach wenigen Minuten ihre natürliche dunkelrote Farbe wiedererlangen (Abbildung3E). Manchmal werden sichtbare Peristalse der Harnleiter und Urin-Produktion vor Ort beobachtet.
- Beenden Sie, indem Sie die exponierte Spitze der Harnkuppe in die Rezipiental-Ureter einlegen und sichern Sie den Empfängerureter mit einem 8-0 Seidennaht (Abbildung 2C und Abbildung3F).
- Um die Spender-und EmpfängerdURals in Position zu halten, binden Sie die Enden der einzelnen Harnröhren aneinander.
- Optional kann die richtige Niere nephrectomisiert werden, indem man die richtige Nierenarterie und die Vene mit einer 4-0 Seidennaht abbindet und die Niere entfernt.
- Entfernen Sie alle Magergrößen aus der Bauchhöhle, bringen Sie alle Organe in ihre natürliche Position zurück, drücken Sie 1 ml Salz über den Darm, um sie feucht zu halten, und schließen Sie den Bauch mit einer 4-0 absorbierbaren Naht auf dem Rektusmuskel und eine 4-0 Seidennaht, um die Haut zu schließen er in unterbrochener Manier.
3. Postoperative Betreuung
- Legen Sie das Tier in einen sauberen Käfig mit Zugang zu ad libitum Wasser und Nahrung und ermöglichen Sie die Erholung auf einem 37 ° C Heizkissen.
- Für die Schmerzlinderung 0,1 mg/kg Buprenorphin subkutan injizieren und das Tier zur Genesung überwachen. Je nach Beschwerden oder Schmerzen kann in den nächsten Tagen eine zusätzliche Schmerzstillstand erforderlich sein. Antibiotika werden nicht routinemäßig verabreicht, da infektiöse Komplikationen selten sind.
- Beobachten Sie die Genesung für 1 – 2 Stunden, bevor Sie das Tier zurück in die Tieranlage. Prüfeln Sie das Tier 2x–3x Tag für die ersten 24 Stunden, gefolgt von einer täglichen Inspektion. Achten Sie auf Anzeichen von Schmerzen und Not, orale Aufnahme und Harnleistung.
- Entfernen Sie die Nähte 7 – 10 Tage nach der Operation.
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Representative Results
Wir haben syngeneic (N = 5) und allogeneic Nierentransplantationen (N = 5) durchgeführt. Tiere mit einer synthetischen Transplantation erreichten ein langfristiges Überleben ohne immunsuppressive Behandlung. Tiere, die eine allogene Transplantation ohne Immunsuppression erhielten, lehnten ihre Transplantation ab und erlagen einem Nierenversagen mit einem medianen Überleben von 8 Tagen (Abbildung4 A). Das mittlere Serum Creatinin hat sich in der Syngeneic-Gruppe bescheiden erhöht, während es sich in der allogeneischen Gruppe um das 14-fache erhöhte (0,5 mg/dL versus 7,0 mg/dL, p & lt;0.01) (Abbildung4B). Bei der Erkundung zeigte die makroskopische Sicht auf die syngenische Nierenallograft keine Anomalien. Die Nierenfarbe und die inneren Strukturen blieben intakt. Im Gegensatz dazu präsentierten Nierenallograden von abgelehnten Tieren rote hämorrhagische Flecken mit der Zerstörung der inneren Strukturen (Abbildung4C). Hematoxylin und Eosinflecken synthetischer Transplantationen zeigten dünne glomeruläre Kapillarschleifen mit einer normalen Anzahl von endothelialen und mesangialen Zellen. Abgelehnte allografte zeigten zerstörte glomerulare Strukturen mit Anzeichen von Entzündungen und Tulitis(Abbildung4D). Um die T-Zell-vermittelte Ablehnung zu bestätigen, haben wir CD8+-Färbung durchgeführt. Während syngeneische Legierungen nur sehr wenige positive CD8+ T-Zellen zeigten, zeigten die abgelehnten Allografts eine signifikant höhere Anzahl von CD8+-Zellen in und um die Glomeruli und Tubuli (Abbildung4 E), was die T-Zell-vermittelte Abstoßung bestätigte.
Bild 1 : Spender nephrectomy. (A) Beim Öffnen des Bauches wird die linke Niere mit feuchten Spurweiten isoliert. (B) Die linke Nierenarterie und die Vene werden isoliert und aus dem umgebenden Fett mobilisiert. (C) Der Harnleiter wird mit einer einzigen Seidennaht befestigt, gefesselt und gesichert. (D) Die Portalvene (pv) und die minderwertige vena cava (ivc) werden identifiziert und die Niere wird durch die Portalvene perfussiert. E) Die Perfusion wird erfolgreich durchgeführt, da die richtige Niere und die Leber durch das Spülen der Portalvene des Tieres blass werden. F) Die erfolgreiche Perfusion zeigt eine blasse Niere und Gefäße, die für die Transplantation bereit sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Bild 2 : Schematische Übersicht über das Nierentransplantationsverfahren. (A) Schematische Übersicht über das Spenderverfahren. (B) Schematische Übersicht über eine gefesselte Spendervene. (C) Schematische Übersicht über die Anastomose des Empfängers und die gefesselte Spendervene und die Anastomose der Harnleiter. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Bild 3 : Nierentransplantation im Empfänger. (A) Die Arterie und die Vene des Empfängers werden aus dem umgebenden Fett mobilisiert und nach der Trennung geklemmt. (B) Die Spenderniere wird eingeführt, und die Venen werden über die Manschettentechnik verbunden und mit einem 8-0 gesichert. Naht. (C) Die Arterien werden Ende-zu-Ende-Naht genäht. D) Die Klemmen werden entfernt. (E) Die Niere wird neu verwendet und gewinnt ihre natürliche Farbe ohne Blutungen wieder an. F) Schließlich werden die Harnleiter mit der zuvor platzierten Manschette verfälschen und mit einem 8-0 gesichert. Naht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Bild 4 : Nierentransplantation Überleben. (A) Die Kaplan-Meyer-Figur demonstriert das Überleben von Ratten mit syngeneischen oder allogenen Nierentransplantationen im Laufe der Zeit. B) Messung und Vergleich von Serum-Kreatinin bei Ratten mit syngeneiischen oder allogenen Nierentransplantationen im Vergleich zu nicht transplantierten Tieren. (C) Makroskopischer Überblick über die ermittelten Nieren von Syngeneic (oben) und allogeneic (unten) Nierentransplantation am 8. Tag. Die Tiere wurden vor dem Zuckern mit Salz verfeinert. Die letzten beiden Panels zeigen einen mikroskopischen Überblick über (D) Hämatoxylin und Eosin-Färbung und (E) CD8+ von Syngeneic (oben) und allogeneic (unten) Nierenforscher. Die Bilder werden unter 200x Vergrößerung aufgenommen. * Die Ergebnisse wurden als statistisch signifikant angesehen, wenn p < 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Bild 5 : Erforderliche chirurgische Instrumente . (1) Gerade Schere. (2) Feine Schere. (3) Mikrofederschere 1 (Harneter Ligation). (4) Mikrofederschere 2. (5) Mikrofederschere 3. (6) Kleintierchirurgie. (7) Forceps. (8) Mikroforzepe, gerade, glatt. (9) Zange absechen, gekrümmt. (10) Mikronadelhalter. (11) Nadelhalter. (12) 8-0 Geflechtene Seidennaht ohne Nadel. (13) 4-0 Seidennaht. (14) Mikro-Gefäßklemmen (ein Paar). (15) Mikro-Gefäßklemme. (16) Fine-Tip-Klemme. (17) Heparin. (18) Vesselklemme (mittelgroß). (19) Vesselklemme (groß). (20) Sterile Baumwollschwaben. (21) 10-0 Mikro-Naht mit Nadel. (22) Sterile Gaze. (23) Heparinisierte Salzspülspritze. (24) 60 ccm Spritze mit Nadel. (25) 10 ccm Spritze. (26) 1 ccm Spritze. (27) 25 G 5/8 Zoll Nadeln. (28) 19 G Nadeln. (29) Trimmer. (30) Bipolare Keuchheit System. (31) Tape. (32) Petrischale mit 0,9% Normalsalz. (33) 60 ccm Spritze mit 50 ccm heelisierter Saline für die Perfusion. (34) 10 ccm Spritze mit 5 ccm heelisierter Salzspülung. (35) Ureter cuff. (36) Vein cuff. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
In diesem Manuskript beschreiben wir die chirurgische Methode des orthotopischen KT in Ratten im Detail, einschließlich aller notwendigen Geräte, um diese Prozedur durchzuführen (Abbildung5). 1965 veröffentlichten Fisher und Lee den ersten Bericht über KT in Ratten, der zum Auftakt eines spannenden Untersuchungsfeldes 18 wurde. Seitdem wurden viele Modifikationen eingeführt, um die Reproduzierbarkeit dieses Modells zu verbessern. Es diente als effektives Tiermodell für das Studium der Schädel-Reperfusionsverletzung und Nierentransplantation Ablehnung und Toleranz, dank der Verfügbarkeit von mehreren inbred und überzüchteten Stämmen mit partiellen und vollen MHC-Misswider-Kombinationen 19. Das Ratten-KT-Modell kann als Werkzeug dienen, um Hypothesen zu testen, bevor die Untersuchungen auf Schweine-und nicht-menschliche Primatenmodelle von KT ausgeweitet werden. Optionen zur Untersuchung der Ablehnung oder Toleranz von Nierentransplantationen bei Nagetieren sind begrenzt. Das Nierentransplantationsmodell bei Mäusen ist technisch sehr anspruchsvoll und erfordert eine lange Trainingsphase, um Überlebensraten von >80% 20 zu erreichen. Eine weitere Einschränkung des Mausmodells ist die spontane Nierenallografen-Akzeptanz ohne Immunsuppression bei etwa 30% der Empfänger. Andere Organtransplantationen bei Mäusen, wie Haut und Herz, werden jedoch innerhalb von 10 Tagen abgelehnt, was darauf hindeutet, dass die Ablehnung von Nierenalloftstoffen bei vollständig MHC-Fehlpass-Mäusen schwach und nicht repräsentativ für die klinische Situation21ist. Wenn jedoch die technische Herausforderung bewältigt werden kann, werden Mäusemodelle bevorzugt, um Mechanikstudien zur allografizierten Abstoßung zu untersuchen, weil gentechnisch veränderte Knock-in oder Knock-out-Mäuse zur Verfügung stehen.
KT in Ratten kann auf verschiedene Weise durchgeführt werden. Wir werden einige Vor-und Nachteile dieser verschiedenen Methoden diskutieren. Unabhängig von der bevorzugten Technik ist es immer entscheidend, die warme Ischämie zu verkürzen und irreversible Verletzungen der Transplantation und des Empfängers zu vermeiden.
Rechts gegen linke Niere
Die Bauchanatomie von Ratten ist der des Menschen sehr ähnlich. Die linke Niere ist aufgrund der anatomischen Lage der Leber im Vergleich zur rechten Niere überlegen. Einer der Vorteile der Verwendung der linken Niere ist die Länge der Gefäße. In der Regel sind die linke Nierenarterie und die Vene doppelt so lang wie die rechten Nierengefäße. Dies ist besonders vorteilhaft bei der Anastomose, bei der die Länge der Gefäße kein begrenzender Faktor ist. Es gibt jedoch Berichte über die rechtsgerichtete Spenderniersuche und Transplantation22,23. Ansätze, die beide Nieren für die Transplantation verwenden, wurden ebenfalls24beschrieben.
Spülspender-Niere über die Portalvene
Einer der wichtigsten Schritte dieses Verfahrens ist die Nierendurchblutung der Spender. Durchblutung ist notwendig, um das gesamte Spenderblut aus den Gefäßen und Niere zu entfernen und das Organ abzukühlen, um die biologische Verschlechterung zu verlangsamen. Es gibt verschiedene Methoden zur Perfektionierung der Niere beschrieben. Wir haben versucht, die Niere auf verschiedene Weise zu spülen und sind zu dem Schluss gekommen, dass das Spülen der Niere durch die Portalvene Vorteile bietet und konsequent zu einer vollständigen Durchblutung der Niere und Gefäße führt. Die in der Literatur beschriebenen konventionellen Ansätze beinhalten die Spenneere nach der Ligaeinigung der Nierenarterie und der Vene oder rückwärts durch die Infrarenaorta24,25,26, 27 , 28. Diese Ansätze können aufgrund erhöhter lokaler Belastungen zu Endothelschäden und Nierenvasokonstriktionführenoder aufgrund des geringen Perfusionsdrucks 29,30 zu unvollständiger Perfusion.
Durch das Spülen der Niere durch die Portalvene wird der Druck vom Herzen gesteuert. Während der Perfusion ist das Herz noch aktiv und pumpt die Perfusionsflüssigkeit in normaler Weise zur Aorta und Niere mit pulsativer Strömung und verhindert Schäden an Kapillaren und Glomeruli durch Scherdruckfluss. Bei der Transplantation von Nieren in Block oder mit der richtigen Niere für die Transplantation ist diese Methode geeignet, um eine gleichmäßige Perfusion zu erreichen und beide Nieren gleichzeitig zu ernten.
Arteriale und zündliche Anastomose
Einer der kritischsten Schritte im Ratten-KT-Modell ist die zeiteffiziente mikrovaskuläre Anastomose. Die Nierenarterie des Spenders kann mit der Nierenarterie des Empfängers oder der Aorta verfälschen. Die Anastomose der Spendergefäße an die Aorta und die minderwertige Vena Cava führt zu ischämischen Verletzungen der Organe des Empfängers. In diesem Protokoll zeigen wir die Ende-zu-Ende-Anastomose der Nierenarterien, da sie ischämische Verletzungen anderer Organe vermeidet. Bei der arteriellen Anastomose ist es wichtig, die endotheliale Oberfläche des Lumen beim Umgang mit dem Gefäß nicht zu beschädigen. Für die Venen-Anastomose verwenden wir eine Manschettentechnik, um die warme Ischämie zu verkürzen und den operativen Eingriff zu verkürzen. Dies hat sich als eine sehr zuverlässige und langlebige Methode erwiesen, um einen angemessenen Venenfluss zu gewährleisten. Um einen ausreichenden Venenfluss zu gewährleisten, ist es zwingend erforderlich, dass die Venen nicht geknickt oder verdreht werden, wenn diese zusammen gesichert sind. Alternativ ist je nach Vorliebe des Chirurgen eine Ende-zu-Ende-oder eine End-to-side-Venenanastomose möglich. Idealerweise sollte die arterielle und venöse Gefäßanastomose zwischen 20 – 30 min dauern.
Pahlavan et al. fasste die Komplikationen jeder Technik auf der Grundlage einer Literaturvorführung 31 zusammen. Eine der Hauptkomplikationen, die nach jeder mikrochirurgischen Gefäßanastomose auftreten können, ist die Thrombose. Die Ligation und die adäquate Spülung der Empfängergefäße reduzieren die Thrombosebildung signifikant, und es ist sicherlich keine häufig beobachtete Komplikation. Andere Komplikationen sind Leckagen oder Bruch der Anastomose nach der Reperfusion. Das hängt mit einer unzureichenden mikrochirurgischen Technik oder einem unzureichenden Umgang mit den Gefäßen zusammen.
Ureterale Anastomose
Der Harnleiter muss mit größter Sorgfalt behandelt werden, insbesondere bei der Isolierung des Harnleiters im Spender. Eine Verletzung der periureterischen Strukturen kann zu einer Harnschiischämie führen, die zu Strengen und Verstopfung führt, und im schlimmsten Fall zu einer Harnnekrose. Die Literatur berichtet über verschiedene Methoden der Harnröteranastomose. Ende-zu-Ende-zu-Ende-Ende-Patch, Blasenfleck und Blaseneinlage sind die am häufigsten verwendeten19,32,33. In früheren Studien haben wir an beiden Enden eine Manschette mit schrägen Kanten verwendet, um den Einstieg in das Harnleiter an beiden Enden zu erleichtern. Wir beobachteten keine Urinleckage oder Blutgerinnsel. Zu den langfristigen Komplikationen (& gt;30 Tagen) dieser Technik gehören jedoch die Hydronephrose und gelegentlich die Nephrolithiasis, die durch die Strenge, die Verlegung oder die Behinderung der Manschette durch Harnsteine erklärt werden kann. Dieser Befund steht im Einklang mit anderen Berichten und unseren eigenen Erkenntnissen über die Durchführung von Utherranikomosis mit einer Manschette. Ureterale Komplikationen werden oft postoperativ nach einer erheblichen Verletzung der Niere bemerkt, sind unveräußerbar und erfordern, dass das Tier euthaniert wird.
Postoperative Pflege und Überleben
Die postoperative Versorgung von transplantierten Tieren erfordert ein angemessenes Schmerzmanagement und detaillierte Beobachtungen der Gesamtaktivität der Tiere, der Gewichtsbeobachtungen und der Urinproduktion. Häufige frühe postoperative Komplikationen sind Blutungen aus der arteriellen oder venösen Anastomose, Urinleckage, Harnröbsenverstopfung oder verzögerte Transplantationsfunktion wegen längerer Ischemizeit. Tiere mit diesen Komplikationen zeigen eine bescheidene Aktivität und bleiben in der Regel in einer Buckelhaltung ohne Harnleistung und Nährstoffaufnahme. Generell ist es vorteilhaft, den Tieren bis zu 1 – 5 mL Salz postoperativ zu verabreichen, um ihre Genesung zu beschleunigen und Austrocknung zu verhindern. Tiere, die keine Immunsuppression erhalten, können zwischen 7 und 10 Tagen überleben, was ein ausreichendes therapeutisches Fenster ermöglicht, um neuartige Medikamente oder andere Methoden zu testen. Sind Tiere ausreichend immunsuppmiert (1,0 mg//kg/Tag FK506 subkutan) oder tolerant, können sie langfristig nach 6 Monaten überwacht werden, wiebereits berichtet 13. Das Ratten-Nierentransplantationsmodell erlaubte die Definition der Toleranzmechanismen, die durch die Verwendung eines einzigartigen Ansatzes der Stammzellmobilisierung ausgelöst wurden, bevor es diesesPhänomen bei großen Tieren 34 bestätigte. Ratte KT hat den Ermittlern seit Jahrzehnten entscheidende Informationen zur Verfügung gestellt, und das wird er auch in Zukunft tun.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Finanziert wurde diese Arbeit durch ein großzügiges Geschenk der Familie Bombeck.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buprenorphine HCL | Reckitt Benckiser Healthcare UK | NDC12496-0757-5 | |
| Dissecting forceps, curved | Zhenbang, China | 11cm Flat handle | |
| Heparin sodium injection USP | Sagent Pharmaceuticals | NDC25021-400-10 | |
| Micro-forceps, straight, smooth | Jingzhong, China | WA3010 | |
| Micro needle holder | Jingzhong, China | WA2010 | |
| Micro vessel clamps | Jingzhong, China | WA40120 | |
| Micro spring sciccor 1 | ROBOZ | RS-5620 | |
| Micro spring sciccor 2 | F.S.T. | 91501-09 | |
| Micro spring sciccor 3 | Zhenbang, China | 8.5cm Vannas,curved | |
| Prograf (Tacrolimus/FK506) | Astellas | ||
| Rats | Charles River & Taconic Biosciences | LEW/Crl & DA-M | |
| Shaver | Wahl | 79600-2101 | |
| Suture 4-0 | Ethicon | J304H | |
| Suture, 4-0 | Ethicon | 683G | |
| Suture, 10-0 | Ethicon | 2820G | |
| Syringes & Needles | BD | ||
| Thread, 8-0 | Ashaway | 75290 | |
| Ureteral cuff | Microlumen | 160-1 | Polymide Tubing, Diameter 0.41 mm |
| Venous cuff | Intramedic BD | 7441 | PE-200 Non-radiopaque polyethylene tubing ID: 1.4 mm, OD: 1.9 mm |
References
- Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B. Actively acquired tolerance of foreign cells. Nature. 172 (4379), 603-606 (1953).
- Murray, J. E. Organ transplantation (skin, kidney, heart) and the plastic surgeon. Plastic and Reconstructive Surgery. 47 (5), 425-431 (1971).
- Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic heart transplantation in mice. Journal of Visualized Experiments. (6), e238 (2007).
- Ruzza, A., et al. Heterotopic heart transplantation in rats: improved anesthetic and surgical technique. Transplant Proceedings. 42 (9), 3828-3832 (2010).
- Oldani, G., Lacotte, S., Morel, P., Mentha, G., Toso, C. Orthotopic liver transplantation in rats. Journal of Visualized Experiments. (65), e4143 (2012).
- Lang, K. S., et al. Immunoprivileged status of the liver is controlled by Toll-like receptor 3 signaling. Journal of Clinical Investigation. 116 (9), 2456-2463 (2006).
- Sun, Z., et al. Recruitment of host progenitor cells in rat liver transplants. Hepatology. 49 (2), 587-597 (2009).
- Orlando, G., Soker, S., Wood, K. Operational tolerance after liver transplantation. Journal of Hepatolgy. 50 (6), 1247-1257 (2009).
- Lodhi, S. A., Lamb, K. E., Meier-Kriesche, H. U. Solid organ allograft survival improvement in the United States: the long-term does not mirror the dramatic short-term success. American Journal of Transplantation. 11 (6), 1226-1235 (2011).
- Engels, E. A., et al. Spectrum of cancer risk among US solid organ transplant recipients. Journal of the American Medical Association. 306 (17), 1891-1901 (2011).
- Kasiske, B. L., Snyder, J. J., Gilbertson, D., Matas, A. J. Diabetes mellitus after kidney transplantation in the United States. American Journal of Transplantation. 3 (2), 178-185 (2003).
- de Mattos, A. M., Olyaei, A. J., Bennett, W. M. Nephrotoxicity of immunosuppressive drugs: long-term consequences and challenges for the future. American Journal of Kidney Diseases. 35 (2), 333-346 (2000).
- Hu, X., et al. Chimeric Allografts Induced by Short-Term Treatment With Stem Cell-Mobilizing Agents Result in Long-Term Kidney Transplant Survival Without Immunosuppression: A Study in Rats. American Journal of Transplantation. 16 (7), 2055-2065 (2016).
- Shrestha, B., Haylor, J. Experimental rat models of chronic allograft nephropathy: a review. International Journal of Nephrology and Renovascular Disease. 7, 315-322 (2014).
- Fu, Y., et al. Successful transplantation of kidney allografts in sensitized rats after syngeneic hematopoietic stem cell transplantation and fludarabine. American Journal of Transplantation. 14 (10), 2375-2383 (2014).
- Grau, V., et al. Immune Complex-Type Deposits in the Fischer-344 to Lewis Rat Model of Renal Transplantation and a Subset of Human Transplant Glomerulopathy. Transplantation. 100 (5), 1004-1014 (2016).
- Vogelbacher, R., et al. Bortezomib and sirolimus inhibit the chronic active antibody-mediated rejection in experimental renal transplantation in the rat. Nephrology Dialysis Transplantation. 25 (11), 3764-3773 (2010).
- Fisher, B., Lee, S. Microvascular surgical techniques in research, with special reference to renal transplantation in the rat. Surgery. 58 (5), 904-914 (1965).
- Mahabir, R. N., Guttmann, R. D., Lindquist, R. R. Renal transplantation in the inbred rat. X. A model of "weak histoincompatibility" by major locus matching. Transplantation. 8 (4), 369-378 (1969).
- Wang, J. J., Hockenheimer, S., Bickerstaff, A. A., Hadley, G. A. Murine renal transplantation procedure. Journal of Visualized Experiments. (29), e1150 (2009).
- Bickerstaff, A. A., Wang, J. J., Pelletier, R. P., Orosz, C. G. Murine renal allografts: spontaneous acceptance is associated with regulated T cell-mediated immunity. Journal of Immunology. 167 (9), 4821-4827 (2001).
- Silber, S. J., Crudop, J. Kidney transplantation in inbred rats. American Journal of Surgery. 125 (5), 551-553 (1973).
- D'Silva, M., et al. Rat kidney transplantation update with special reference to vesical calculi. Microsurgery. 11 (2), 169-176 (1990).
- Yin, M., Booster, M. H., Bogaard, A. E. J. M., Kootstra, G. A simple technique to harvest two kidneys from one donor rat for transplantation. Lab Animal. 28 (4), 387-390 (1994).
- Lopez-Neblina, F., Toledo-Pereyra, L. H., Suzuki, S. Ultrarapid orthotopic technique for renal transplantation in the rat. Microsurgery. 15 (4), 274-278 (1994).
- Blom, D., Orloff, M. S. A more versatile and reliable method for renal transplantation in the rat. Microsurgery. 18 (4), 267-269 (1998).
- Engelbrecht, G., Kahn, D., Duminy, F., Hickman, R. New rapid technique for renal transplantation in the rat. Microsurgery. 13 (6), 340-344 (1992).
- Kline, R., Churchill, M., Churchill, P., Bidani, A., Schwartz, M. High osmolality-low pH flush solutions improve renal transplant function in rats. Urology Research. 19 (2), 81-86 (1991).
- Fray, J. C. Mechanism by which renin secretion from perfused rat kidneys is stimulated by isoprenaline and inhibited by high perfusion pressure. The Journal of Physiology. 308, 1-13 (1980).
- Fry, D. L. Acute vascular endothelial changes associated with increased blood velocity gradients. Circulation Research. 22 (2), 165-197 (1968).
- Pahlavan, P. S., Smallegange, C., Adams, M. A., Schumacher, M. Kidney transplantation procedures in rats: assessments, complications, and management. Microsurgery. 26 (5), 404-411 (2006).
- Savas, C. P., et al. Renal transplantation in the rat--a new simple, non-suture technique. Urology Research. 13 (2), 91-93 (1985).
- Fabre, J., Lim, S. H., Morris, P. J. Renal transplantation in the rat: details of a technique. The Austalian and New Zealand Journal of Surgery. 41 (1), 69-75 (1971).
- Cameron, A. M., et al. Chimeric Allografts Induced by Short-Term Treatment With Stem Cell Mobilizing Agents Result in Long-Term Kidney Transplant Survival Without Immunosuppression: II, Study in Miniature Swine. American Journal of Transplantation. 16 (7), 2066-2076 (2016).
