Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

التبادل الأيوني اللوني (المستوى) بالإضافة إلى تشتت الضوء زاوية المتعددة (مالس) لفصل البروتين وتوصيف

Published: April 5, 2019 doi: 10.3791/59408
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Wolfson Centre for Applied Structural Biology, The Alexander Silberman Institute of Life Science, The Hebrew University of Jerusalem, 2Wyatt Technology Corporation, 3Danyel Biotech Ltd

Summary

ويصف هذا البروتوكول استخدام كروماتوغرافيا التبادل الأيوني عالية الدقة مع تشتت الضوء زاوية المتعددة من أجل تحديد كتلة مولى دقيق من البروتينات والبروتين المجمعات الببتيدات في عينة غير متجانسة. هذا الأسلوب قيمة لتقييم الجودة، وكذلك فيما يتعلق بتوصيف ليغومرات الأصلية، ومتغيرات التهمة، وعينات مختلطة من البروتين.

Abstract

التبادل الأيوني اللوني مع تشتت الضوء زاوية المتعددة (المستوى-مالس) وسيلة قوية لفصل البروتين وتحديد خصائصها. الجمع بين تقنية فصل خصوصية عالية المستوى مع التحليل الشامل المولى دقيقة حققها مالس يسمح توصيف عينات البروتين غير متجانسة، بما في ذلك مخاليط من أشكال أوليجوميريك أو البروتين بالسكان، حتى مع جداً الجماهير المولى مماثلة. ولذلك، مالس المستوى يوفر مستوى إضافي من توصيف البروتين ويكمل اللوني استبعاد حجم قياسي مع تقنية تشتت الضوء زاوية المتعددة (SEC-مالس).

هنا يمكننا وصف بروتوكول التجربة المستوى أساسي-مالس وإثبات هذا الأسلوب في ألبومين المصل البقري (BSA). المستوى يفصل بين جيش صرب البوسنة بأشكاله أوليجوميريك، مما يتيح إجراء تحليل شامل مولى حسب مالس لكل شكل من أشكال الفردية. كما قدم الأمثل لتجربة مالس المستوى وبرهنت على جيش صرب البوسنة، تحقيق الانفصال ممتازة بين جيش صرب البوسنة مونومرات وليغومرات أكبر. مالس المستوى هو تقنية قيمة لتقييم نوعية البروتين نظراً لأنه يوفر الفصل غرامة والعزم الجماعي المولى متعددة الأنواع البروتين الموجودة في عينة.

Introduction

الوصف الكمي لمنتجات البروتين الضروري متزايدة كوسيلة لمراقبة النوعية (QC)، سواء لأغراض تنظيمية في الصناعة الصيدلانية البيولوجية، وضمان موثوقية وسلامة علوم الحياة البحث1 , 2-كما هو موضح في مواقع ويب الخاصة بالبروتين شبكات إنتاج البروتين، وتنقية الشراكة في أوروبا (P4EU) ورابطة للموارد للبحوث الفيزيائية الحيوية في أوروبا والفيزياء الحيوية الجزيئية في أوروبا (أربر-مبايو) (https://p4eu.org/protein-quality-standard-pqs و https://arbre-mobieu.eu/guidelines-on-protein-quality-control، على التوالي)، البروتين ومراقبة الجودة يجب أن يتسم بها ليس فقط نقاء المنتج النهائي، ولكن أيضا حالته oligomeric والتجانس والهوية، تكيف والهيكل وتعديلات بوستترانسلاشونال والأخرى3،خصائص4.

أحد أساليب توصيف QC الأكثر شيوعاً هو مالس ثانية. في هذا الأسلوب، يقترن عمود ثانية تحليلية إلى مالس والكشف عن سبيكتروفوتوميتريك وريفراكتوميتريك وتمكين قياسات دقيقة من البروتين كتلة المولى كل ذروة5. تحدد كتلة المولى من قمم الوتيد مستقلة عن حجم شطف ثانية مالس ويتغلب على عدم دقة تحليلية في الثانية باستخدام معايرة العمود. إضافة وحدة نمطية (DLS) نثر الضوء الديناميكي يضيف قدرة قياس حجم يسمح تصميم هيدرودينامية دائرة نصف قطرها. في البحوث الأكاديمية، مالس ثانية يستخدم عادة لتحديد حالة oligomeric بروتين، المطابقة، ومستوى النقاء، مستوى التجميع، وتعديل البروتينات، مثل جليكوبروتينس أو بروتينات الغشاء solubilized الدهن (تحديد كتلة المولى من البروتين ومترافق المكونات منفردة)6،،من78.

في كثير من الحالات، ليست أنواع جزيئية جيدا-defined البروتين النهائي لعملية تنقية لكن بدلاً من ذلك وتضم بعض التباين. يمكن أن تختلف البروتينات في خليط من هذا القبيل فيما يتعلق بهيكل (على سبيل المثال، مختلف أشكال oligomeric) أو والتشكلات isoforms البروتين. يمكن أيضا أن عدم تجانس البروتين نتيجة للاختلافات الطفيفة الكيميائية الناجمة عن تجهيز يسين ج--المحطة الطرفية أو deamination الهليونين/الجلوتامين، مما أدى إلى اتهام تباين9،10. الاختلافات في التعديلات بوستترانسلاشونال مثل جليكوسيليشن يؤدي أيضا إلى عينات متجانسة مع اختلافات مقابل9. هذه الأنواع المختلفة من عدم التجانس وتنعكس في الخصائص الفيزيائية للبروتين ويمكن أن تؤثر على الاستقرار والنشاط البيولوجي ل البروتين الهدف11.

تتطلب فحوصات مراقبة الجودة يمكن الاعتماد عليها لمثل هذه العينات غير متجانسة تقنية فصل تحليلي فبدرجة عالية. وهناك حالات حيث يمكن الطعن في فصل جيدة لتحقيق مع أعمدة ثانية التحليلية، سبب بهم محدودة القرار وفصل قدرات12، أسفر معيبة مالس ثانية تحليل. الجمع بين تقنية فصل خصوصية عالية مثل المستوى مع مالس يمكن التغلب على الحد مالس ثانية في عينات غير متجانسة وتوفير وسيلة تكميلية لتوصيف البروتين (الجدول 1 في أمارتيلي et al.12). خلافا للبورصة، التي تفصل بين الجزيئات الكبيرة الحجم الهيدروديناميكي13، يفصل المستوى الجزيئات الكبيرة بهذه التهمة السطحية14. تبادل شاردة (عيش) وربط مصفوفات تبادل الأيونات الموجبة (سي) سلبا وايجابا اتهم المتغيرات، على التوالي. مع غرامة فصل بين السكان البروتينات التي تشترك في كتلة قريبة نسبيا أو الشكل، يحدد المستوى-مالس بنجاح كتلة المولى لكل دولة فردية البروتين في عينة خليط12.

وهنا يقدم بروتوكول قياسي لتشغيل تجربة المستوى-مالس لفصل وتحليل أشكال oligomeric جيش صرب البوسنة التي توجد في نفس العينة. اختيار عمود المستوى لبروتين محددة المهم ومناقشته، فضلا عن ظروف الأس الهيدروجيني والتوصيل من المخازن المؤقتة. كما يتم وصف تحليل البيانات التجريبية المستوى مالس خطوة بخطوة. على الرغم من أن الفصل بين جيش صرب البوسنة ليغومرات جيدة وكافية في ثانية-مالس، جيش صرب البوسنة مثال جيد لإظهار قدرات المستوى-مالس وإثبات الاستغلال الأمثل للتجربة. وتجري مناقشة الأمثلة الفقراء العزل حققتها ثانية مالس والفصل السليم والتحليل مكن من المستوى-مالس في دراسة سابقة12.

Protocol

1-إعداد النظام

  1. تثبيت النظام اللوني السائل (فبلك) البروتين سريعة ومالس/الانكسار كاشفات index (RI) (انظر الجدول للمواد) جنبا إلى جنب مع حزم البرمجيات الخاصة بكل منها للتحكم والحصول على البيانات، وتحليل كل الشركات المصنعة تعليمات.
  2. قم بتوصيل كاشفات مالس ومنظمة الروتاري الدولية اتجاه مجرى النهر من كاشفات الأشعة فوق البنفسجية والتوصيل فبلك. تجاوز درجة الحموضة للكشف عن ما لم تكن ضرورية حتما للتدرجات درجة الحموضة، التقليل من حجم إينتيرديتيكتور بين كاشفات الأشعة فوق البنفسجية ومالس. استخدام الأنابيب الشعرية من 0.25 – 0.5 القطر الداخلي مم (معرف) بين العمود وكاشفات و 0.75 ملم معرف الأنابيب الشعرية في إخراج كاشف ري لجمع النفايات أو الكسر.
  3. تأكد من أنه تم إنشاء اتصالات الإشارات الضرورية بين فبلك وكشف، بما في ذلك إخراج تناظرية الأشعة فوق البنفسجية من كاشف فبلك إلى مدخل Aux مالس والإخراج الرقمي من فبلك إلى مالس أوتوينجيكت، عن طريق "مربع الإدخال/الإخراج".

2-إعداد العينة والمخزن المؤقت

  1. تصفية جميع المواد الكاشفة، بما في ذلك غسل وشطف المخازن المؤقتة، مع عامل تصفية 0.1 ميكرومتر. تصفية أول 50 – 100 مل من المخزن المؤقت إلى زجاجة نفايات بغية إزالة الجسيمات من المرشحات الجافة، والحفاظ على ما تبقى من المخزن المؤقت في زجاجة نظيفة ومعقمة تم غسلها جيدا مع الماء المصفى وتوج لمنع دخول الغبار.
  2. ضبط عينة جيش صرب البوسنة إلى درجة الحموضة وقوة الأيونية (مثل درجة الحموضة = 8، 50 مم كلوريد الصوديوم) التي تسمح ملزم على عمود المستوى خلال تمييع أو أولترافيلتريشن أو إجراءات تبادل المخزن المؤقت.
    ملاحظة: من المستحسن لتصفية العينة البروتين إلى أصغر حجم المسام التي لا تقوم بإزالة المواد التي تهم (0.02-0.1 ميكرومتر). بدلاً من ذلك، يمكن فصل العينة بسرعة عالية (13,000 – 16,000 س ز) لمدة 10 دقيقة لتمكين ترسيب الجزيئات الكبيرة.
  3. إعداد على الأقل 0.3-0.5 ملغ من جيش صرب البوسنة (انظر الجدول للمواد) لحقن في عمود 1 مل (5/50 مم) لتحقيق تحليل مالس ذات نوعية جيدة. علما بأن حجم الحقن غير محدود.

3-اختيار وتطوير أسلوب المستوى للبروتين

  1. حساب نقطة isoelectric (pI) البروتين استناداً إلى تسلسل الأولية، للخوادم التي مثل أداة بروتبارام على اكسباسي موقع على شبكة الإنترنت يمكن أن تستخدم15. علما بأن بي من جيش صرب البوسنة هو 5.8.
  2. حدد المعلمات المخزن المؤقت لنوع العمود.
    1. تستخدم مخازن مختلفة لعيش وسي، اعتماداً على pK المخزن المؤقت والطبيعة الأيونية للمخزن المؤقت. استخدام المخازن المؤقتة الموجبة عند تشغيل العمود عيش ومخازن أنيونى عند تشغيل العمود سي مع كونتيريونس الصغيرة. في هذا المثال، استخدم 20 مم تريس-HCl المخزن المؤقت، ودرجة الحموضة 8، لتحليل جيش صرب البوسنة على عمود بعيش.
    2. لبروتين بي أقل من 7، مثل جيش صرب البوسنة، مع استخدام عمود عيش والمخزن المؤقت مع الرقم الهيدروجيني أعلى من pI بوحدتين على الأقل. لبروتين مع بي أعلى من 7، استخدام العمود سي والمخزن المؤقت مع الرقم الهيدروجيني أقل من البروتين بي بوحدتين على الأقل.
    3. تحسين درجة الحموضة العازلة وفقا لقوة الربط بين البروتين ومصفوفة العمود. في حالة عدم ربط بروتين جيدا للعمود، استخدم الرقم الهيدروجيني أبعد عن بي. تأكد من أن البروتين مستقر في درجة الحموضة المستخدمة.
    4. استخدام انخفاض تركيز ملح في التوثيق وتغسل المخازن المؤقتة للسماح ربط البروتين للمصفوفة، منذ ملزمة البروتين يعتمد على القوة الأيونية من العينة التي تم تحميلها. البروتينات وعادة ما يتطلب بعض الملح لاستقرارها؛ ولذلك، استخدام كلوريد الصوديوم 50 ملم (أو الملح البديلة) خلال الخطوات التي يتم تحميلها من البروتين والعمود والغسل.
    5. شطف من المخزن المؤقت، استخدام أقصى قدر من 0.5 م كلوريد الصوديوم لفصل البروتين من العمود.
      ملاحظة: لا ينصح أعلى تركيزات الملح عند العمل مع إنكسار ري نموذج قياسي نظراً لضيق نطاق الصك. ومع ذلك، نموذج تركيزات عالية من يمكن استخدامها وسوف تستوعب 2 م كلوريد الصوديوم.
  3. تنفيذ أسلوب أولية على النحو التالي.
    1. تحميل 1 مغ من جيش صرب البوسنة (170 ميليلتر من 6 مغ/مل) في مل ~0.5 المخزن المؤقت تحميل المخزن المؤقت 20 مم تريس-HCl، درجة الحموضة 8، التي تتضمن 50 مم كلوريد الصوديوم. أغسل العمود مع المخزن المؤقت نفس حجم عمود 10 – 15 (CV) للسماح شطف كاملة من الجزيئات غير منضم وجزيئات من النظام حتى تشتت الضوء (LS)، الأشعة فوق البنفسجية، وإشارات ري استقرت تماما.
    2. إجراء تدرج ملح قصيرة والخطية من 20 – 30 السيرة الذاتية، واستخدام المخزن المؤقت شطف من عيار 20 ملم تريس-HCl، درجة الحموضة 8، تحتوي على كلوريد الصوديوم M 0.5 لفصل البروتين من العمود. تؤدي تدرج من 0-100% (أو التدرج البديلة على نطاق واسع) من المخزن المؤقت شطف أو تقسيمه إلى اثنين التدرجات: 0% – 50% من المخزن المؤقت شطف متبوعاً تدرج إضافية من 50%-100% من شطف المخزن المؤقت، كل التدرج للسيرة الذاتية 10 – 20. لجيش صرب البوسنة، استخدام تدرج على نطاق واسع من 15% – 70% 30 السيرة الذاتية للطريقة الأولى.
      ملاحظة: في بعض الحالات، الطريقة الأولى قد توفر فصل لتحليل مالس موثوق بها، وتشغيل إضافية غير ضرورية. في كثير من الحالات، يوفر الطريقة الأولى فقط من التوجيه لمواصلة الأسلوب الأمثل.
  4. تحسين الأسلوب المستوى لزيادة الدقة وتحسين فصل الذروة عن طريق تغيير معلمات مختلفة.
    1. تغيير التدرج المنحدر والطول. تدرجات قصيرة مع منحدرات عالية توفر قمم مكثفة مع فصل أقل، بينما توفر التدرجات طويلة مع منحدرات خفيفة قمم أقل مع فصل أفضل. إيجاد التوازن بين ذروة كثافة القرار وإشارة لتحليل مالس الأمثل.
      ملاحظة: تحميل كمية أكبر من البروتين يمكن زيادة LS، الأشعة فوق البنفسجية، وإشارات ري إنما يفعل ذلك على حساب القرار.
    2. استخدام ملف تعريف تركيز ملح التدرجي شطف. تذكر أن يستخدم عادة مجموعة من الخطوات والتدرج الخطي.
    3. انخفاض معدل التدفق لتحسين فصل الذروة.
      ملاحظة: لمصفوفات مع جزيئات صغيرة جداً، وهذا ليست كبيرة جداً.
    4. تغيير درجة الحموضة العازلة زيادة تهمة التفاوت بين السكان البروتين في العينة وتحسين الفصل بين تلك المتغيرات. لاحظ أنه يمكن فصل البروتينات التي لا يفصل بشكل صحيح على درجة الحموضة واحد في الرقم الهيدروجيني مختلفة.
    5. استخدم الرقم الهيدروجيني التدرج أو خطي أو تدريجي، لفصل البروتينات من عمود المستوى. استخدام التدرجات شطف التي تجمع بين كل من الأس الهيدروجيني وتغيرات تركيز الملح إذا لزم الأمر.
    6. استخدام أقوى الأملاح، مثل مجكل2، أو أملاح الأضعف، مثل خلات الصوديوم، زيادة الحساسية والقرار16.
    7. استخدام أطول المستوى الأعمدة أو مصفوفة عمود مختلفة مع جسيمات أصغر لتحسين قدرات الانفصال.
    8. تغيير نوع العمود (عيش/سي) لتوفير نمط مختلف من الانفصال. علما بأن مصفوفات مع يغاندس (مختلط) قوية أو ضعيفة، أو مجتمعة وتتوفر أيضا، ويمكن تحسين دقة بعض العينات.
    9. استخدام عمود من مورد مختلف مع يجند نفسه متصل راتنجات مصفوفة مختلفة. الراتنج نفسها، مستقلة عن يجند، يمكن أن تتفاعل بشكل مختلف مع البروتينات ويؤثر على التشكيل الجانبي للانفصال.
    10. وتشمل إضافات (جزيئات البروتين في الحل إلى استقرار) في المخازن المؤقتة لتحسين الاستقرار البروتين وتجنب تراكم البروتين، لتحسين التجربة المستوى.
      ملاحظة: أمثلة من هذه المضافات السكريات، الكحول، اليوريا، والمنظفات النطاق أو زويتيريونيك، وتشاوتروبيك وكوسموتروبيك الأملاح17،18.

4-المستوى-مالس التجربة

  1. فتح New\Experiment من الأسلوب في البرامج مالس وحدد الأسلوب على الإنترنت من المجلد أساليب نظام تشتت الضوء . إذا كانت الوحدة النمطية DLS المتاحة وبيانات دائرة الأراضي والمساحة الحصول على، حدد الأسلوب على الإنترنت من المجلد الفرعي قيلس Scattering\With الضوء .
  2. تعيين المعلمات للتشغيل تحت مقطع التكوين .
    1. تعيين معدل التدفق للتشغيل في المقطع المضخة عامة لمعدل التدفق المستخدمة في فبلك (1.5 مل/دقيقة)، وأدخل أو التحقق من معلمات العازلة تحت المقطع المذيبات .
    2. أدخل اسم البروتين (BSA)، زيادة الانكسار (dn/العاصمة؛ والمعيار القيمة للبروتينات هو مل 0.185/g)، معامل الانقراض الأشعة فوق البنفسجية في طول موجه 280 نانومتر (0.66 غرام/لتر-1·cm-1)، وتركيز العينة البروتين (6 مغ/مل) في علامة التبويب عينة تحت المقطع حاقن . أدخل حجم العينة للحقن (170 ميليلتر)، وكذلك في الباب نفسه.
    3. في علامة التبويب مجموعة أساسية ، تحت القسم الداخلي ، حدد خانة الاختيار تحريك الدعوى في أوتوينجيكت وتعيين مدة التشغيل بحيث جمع البيانات سوف تستمر لمدة 5 دقائق على الأقل بعد أن وصلت إلى التدرج في القيمة النهائية.
  3. تعيين معلمات التجربة في برنامج فبلك.
    1. قم بإنشاء تجربة جديدة في علامة التبويب محرر أسلوب . وستكون التجربة الأولى تدرج خطي من الملح أو الأس الهيدروجيني (راجع الخطوة 3، 3). بالنسبة للأسلوب الأمثل، إنشاء تدرج أكثر تحديداً أو برنامج تدريجي وفقا لنتائج شطف خلال الطريقة الأولى (راجع الخطوة 3، 4 و الشكل 1). وتشمل إشارة نبض في الأسلوب الذي سوف يؤدي جمع البيانات في البرنامج مالس.
    2. أغسل بالعمود والصمامات مع المخازن المؤقتة ذات الصلة: 20 مم تريس-HCl، درجة الحموضة 8، مع 50 ملم كلوريد الصوديوم للغسيل المخزن المؤقت (صمام) ونفس المخزن المؤقت مع 500 ملم كلوريد الصوديوم شطف المخزن المؤقت (صمام ب). تأكد من أن يغسل العمود الأخير يستخدم المخزن المؤقت الملزمة، التي تحتوي على تركيز منخفض ملح، لتمكين ربط البروتين إلى مصفوفة العمود. ليغسل ضخمة من الشوائب مقيدة بشدة، استخدام 0.5 M هيدروكسيد الصوديوم قبل الغسيل مع المخازن المؤقتة ذات الصلة، تليها يغسل تحييد المخزن مؤقت.
    3. ضع العينة البروتين في حلقة استخدام المحاقن. إذا تم تحميل أكثر من 10 مل العينة، استخدم سوبيرلوب أو المضخة صمام الصك فبلك حين تجاوز مضخة التصفية والخلاط فبلك.
  4. بدء التجربة الأولى في البرنامج مالس بالنقر على زر تشغيل ، ومن ثم في برنامج فبلك. وسيتم جمع البيانات بعد تلقي إشارة النبض من الصك فبلك عبر كاشف مالس.
  5. وتنطبق نفس المعلمات للتشغيل والإرشادات المبينة في الخطوات 4.1 – 4.4 إذا أجرى المستوى-مالس يدوياً مع وضع التدفق المستمر بدلاً من أسلوب قائم بذاته.
  6. بمجرد تم التحقق من الأسلوب النهائي وتشغيلها، نفذ بالضبط نفس طريقة استخدام حقنه فارغة (تحميل المخزن المؤقت بدلاً من العينة). من المهم أن التوقيت بين نبض أوتوينجيكت والتدرج من تشغيل فارغ مطابق لتشغيل العينة.

5-تحليل البيانات التجريبية المستوى-مالس

  1. إجراء تحليل خطوة خطوة تحت القسم الداخلي في البرنامج مالس. تعرض طريقة عرض المجموعة الأساسية جمع البيانات الخام للتجربة.
    1. استخدم علامة التبويب ديسبيكينج لضمان سلاسة في تشروماتوجرامس إذا هم يعرضون الكثير من الضجيج. عادة، استخدام المستوى العادي .
    2. تحديد خط الأساس لجميع إشارات (جميع LS والأشعة فوق البنفسجية، ومنظمة الروتاري الدولية للكشف عن) في طريقة العرض الأساسية .
    3. تعريف القمم للتحليل في رأي قمم . تحقق من القيم الصحيحة dn/dc ومعامل الانقراض الأشعة فوق البنفسجية للبروتين في كل الذروة.
      ملاحظة: للبروتينات، ومن الشائع استخدام قيمة زيادة قياسية ري مل 0.185/غ، ولكن للجزيئات الكبيرة الأخرى، ينبغي استخدام قيم مختلفة dn/dc، وفقا لطبيعة الجزيء. متوسط dn/dc من بولينوكليوتيديس (DNA/RNA) هو 0.17 مل/ز19، بينما السكريات، مثل السكروز، قيمة متوسط dn/dc 0.145 مل/غ20 وقيم dn/dc للدهون والمنظفات تتراوح ما بين 0.1 – 0.16 مل/ز21.
    4. تحليل الكتلة المولى وفي دائرة نصف قطرها باستخدام المعلمات تركيب ووظيفة الارتباط تحت آراء الجماهيري المولى & دائرة نصف قطرها من LS صح من قيلس .
  2. تشغيل التغييرات إشارة ري إلى حد كبير خلال المستوى-مالس نظراً لزيادة تركيز الملح. ولذلك، طرح إشارة خط الأساس من حقن فارغة للحسابات الجماعية التي تتطلب بيانات ري.
    1. قم بفتح كل من البروتين وتجارب المستوى مالس فارغة. انقر بالزر الأيمن على اسم التجربة البروتين وتحديد أسلوب تطبيقواختر المجلد الطرح الأساس من مربع حوار الملف. حدد النوع الصحيح من أسلوب (مثل الإنترنت) للتحليل الشامل المولى القياسية. علما بأن سيتم حفظ معلمات والإعدادات المعرفة في التجربة البروتين على طريقة فتح جديدة.
    2. تحت عرض الطرح الأساس ، انقر فوق استيراد فارغة لاستيراد إشارات تشغيل فارغة. إطار الصكوك (بجوار زر الاستيراد فارغة )، تحقق من كل من كاشفات للطرح.
    3. قمم ويرى أن ضبط قيم dn/dc (إذا لزم الأمر) بسبب الموصلية للحل في منطقة الذروة البروتين، منذ ري بأن الحل هو تغيير أثناء تشغيل12.
  3. معايرة نظام المستوى-مالس مع مونومر جيش صرب البوسنة.
    ملاحظة: عادة، نظام المستوى مالس دورياً معايرة لمحاذاة الذروة وتوسيع الفرقة وتطبيع كاشفات الزاوي لكاشف 90° استخدام بروتين مونوديسبيرسي مع دائرة نصف قطرها gyration (صز) < 10 شمال البحر الأبيض المتوسط، مثل مونومر جيش صرب البوسنة. في هذا المثال، يخدم على حد سواء كجزيء المعايرة جيش صرب البوسنة وهو في حد ذاته موضوع التحليل الشامل المولى.
    1. محاذاة على قمم، وبموجب الإجراءات > عرض التكوين .
    2. إجراء التطبيع تحت عرض التطبيع ، دخول 3.0 شمال البحر الأبيض المتوسط كقيمةg R.
    3. إطار توسيع الفرقة في علامة التبويب تكوين نفسه، اختر الذروة وتطابق إشارات الأشعة فوق البنفسجية وليرة سورية إلى إشارة منظمة الروتاري الدولية، باستخدام زر إجراء مناسباً .
  4. ويبين الرسم البياني للنتائج عرض النتائج من المناسب . تغيير جداول المحور وأخرى معلمات الرسم البياني بالنقر بالزر الأيمن على الرسم البياني، وتحديد تحرير، ثم النقر فوق الزر خيارات متقدمة . هو رقم الرسم بياني مع المزيد من خيارات عرض متاحة أيضا في علامة التبويب EASI الرسم البياني : حدد كتلة المولى من القائمة المنسدلة عرض في الجزء العلوي من الإطار.
  5. لاحظ أن كافة النتائج، بما في ذلك الكتلة المولى، دائرة نصف قطرها، ومستوى النقاء، وغيرها، تتوفر في عرض التقرير (موجزة أو مفصلة) تحت القسم النتائج . استخدم الزر "مصمم تقرير" إضافة أكثر النتائج أو معلمات، فضلا عن الأرقام، إلى التقرير.

Representative Results

جيش صرب البوسنة هو بروتين شائعة التي تستخدم في الفصل اللوني لمعايرة نظام تجريبي22 ، وهي مناسبة جداً لممارسة المستوى-مالس، فضلا عن مالس ثانية. هو أحادي أساسا مع كتلة مونومر نظرية من 66.7 كاتشين وعادة ما يتضمن عدد صغير من dimers واعلي ليغومرات23.

وقد تم تحليل جيش صرب البوسنة على المستوى-مالس استخدام عمود شاردة تبادل التحليل (انظر الجدول للمواد). خطي واسعة متدرجة تتكون من 30 فصل السيرة الذاتية من 75 مم إلى 350 مم كلوريد الصوديوم مونومرات جيش صرب البوسنة من ليغومرات أعلى. المصب مالس تحليل أسفرت عن كتلة مولى مونومر محسوبة من 66.8 ± 0.7 كاتشين وكتلة مولى ديمر محسوبة من 130 ± 5 كاتشين (الشكل 1أ).

استناداً إلى الموصلية المخزن المؤقت في قمم التيد، تم تغيير التدرج إلى برنامج آخر: خطوة طويلة من عيار 175 ملم كلوريد الصوديوم يتبعه تدرج خطي من عيار 175 ملم إلى 500 ملم كلوريد الصوديوم. التدرج الجديد تحسنت كثيرا بالقرار والفصل ممتازة بين جيش صرب البوسنة مونومر (مع كتلة مولى محسوب من 66.1 ± 0.7 كاتشين) والأنواع oligomeric أعلى (مع كتلة متوسط محسوب من 132 ± 2 كاتشين) (الشكل 1ب). بغية التركيز أيضا على الأنواع أوليجوميريك عالية وحساب الجماهير المولى لكل نموذج oligomeric الفردية لجيش صرب البوسنة، تم تطبيق برنامج متدرج من 200 و 250 ملم كلوريد الصوديوم. أسفرت هذه التجربة فصل ممتازة بين جيش صرب البوسنة مونومر (مع كتلة محسوب من 62.4 ± 0.4 كاتشين)، ديمر (مع كتلة محسوب من 130 ± 10 كاتشين)، وتريمير (مع كتلة محسوب من 170 ± 10 كاتشين) (الشكل 1ج). جميع المستوى مالس التجارب تظهر أن جيش صرب البوسنة الوتيس غالباً ما مركب بدرجة نقاء 80%، باﻻتفاق مع نتائج مالس ثانية حيث الوتي مونومرات جيش صرب البوسنة بدرجة نقاء 85%12.

Figure 1
الشكل 1 : التحسين من المستوى-مالس التجربة لجيش صرب البوسنة- (أ) المستوى-مالس التجربة من جيش صرب البوسنة مع برنامج تدرج من 75 – 350 مم كلوريد الصوديوم. (ب) المستوى-مالس التجربة من جيش صرب البوسنة مع برنامج خطوة كلوريد الصوديوم 175 ملم يليه برنامج تدرج خطي من 175-500 ملم كلوريد الصوديوم. (ج) المستوى-مالس التجربة من جيش صرب البوسنة مع برنامج خطوة من 200 و 250 ملم كلوريد الصوديوم. عرض تشروماتوجرامس الأشعة فوق البنفسجية في ضوء نانومتر (الأزرق)، 280 التشتت في زاوية 90 درجة (أحمر)، والانكسار (الوردي) والمنحنيات الموصلية (رمادي) جنبا إلى جنب مع كتلة المولى من ذروة كل حساب بواسطة مالس (أسود). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

مالس المستوى هو وسيلة قوية لفصل البروتين وتوصيف يسمح تصميم الشامل المولى دقيقة من البروتينات الصرفة كذلك اعتبارا من عينات غير المتجانسة، تميز الأصلي ليغومرات، المجاميع غير الأصلية، التساهمية ونونكوفالينت المجمعات، والبروتينات كونجوجاتيد. يمكن لبرنامج يتألف من تدرج خطي أو سلسلة من الخطوات تركيز الملح تحقيق فصل جيدة للسكان البروتين والسماح بتحليل مناسب لكل ذروة الفردية قبل مالس. التحسين إضافية قبل متفاوتة معلمات مختلفة، مثل التدرج المنحدر (راجع الخطوة 3، 4 من البروتوكول)، ويمكن أن يؤديها إذا كان مطلوباً حل أفضل. مالس المستوى يمكن مقايسة مراقبة جودة بروتين قيمة حيث أنه يوفر مستوى إضافية، حاسمة لتوصيف البروتين، مكملة لأساليب أخرى مثل مالس ثانية.

بينما مالس ثانية تقنية موحدة ومشتركة للتصميم الجماعي المولى البروتين، القرار منخفضة نسبيا من الأعمدة ثانية التحليلية المعيارية قد تحد من دقة القياسات الشامل المولى حققها مالس12. وتشمل بعض الأمثلة على القيود المفروضة على مالس ثانية الحلول التي تحتوي على التوالي ليغومرات، مستويات عالية من التجميع التي لا يفصلون تماما من ذروة مونومر، والسكان غير متجانسة مع الجماهير المولى مماثلة، مثل البروتينات المعدلة.

المستوى طريقة الفصل لوني أكثر تعقيداً تصميم وتنفيذ من ثانية، ولكن يمكن أن تكمل المعلومات المستقاة من تجربة مالس المستوى وأحيانا تكون مفيدة أكثر من تحليل مالس ثانية. مالس المستوى اتسم بنجاح جسم المتغيرات التي تشترك في نفس المولى، الشامل، ليغومرات التي لا يفصل تماما في ثانية والببتيدات القصيرة التي يصعب على تحليل ثانية12،24. أيضا، يمكن حل الجمعيات الجزيئات التي تكون كبيرة جداً تكون مفصولة ثانية، مثل جسيمات فارغة من الفيروسات المرتبطة بالغدة (إف)، والكامل (تحتوي على الحمض النووي الفيروسي) ب المستوى25 قبل التحليل مالس. مقارنة ثانية، المستوى يوفر قدرات أكثر تنوعاً في الفصل14 ، والمرونة في ضبط العديد من المعلمات لزيادة دقة الذروة، مثل درجة الحموضة العازلة، وأنواع الملح وأنواع وطول العمود، وغيرهم. خلافا ثانية، لا يوجد أي حد حجم لحقن العينة في المستوى، ويمكن تحليل أي جزيء مستقلة عن حجمه (انظر الجدول 1 في أمارتيلي et al.12). وهذا ميزة كبيرة من المستوى-مالس، أساسا لعينات بكثافة LS منخفضة، مثل البروتينات الصغيرة جداً أو البروتينات المخفف مع ميل للتجميع عند التركيز. منذ أعمدة المستوى التحليلي أكثر استقرارا وتميل إلى الإفراج عن الجسيمات أقل من ثانية الأعمدة، مالس المستوى يتطلب الموازنة قصيرة جداً من الوقت، واستقرت إشارات LS سريع جداً. وهذا يسمح لتشغيل التجارب الفردية كما هو موضح في هذا البروتوكول، ووقف تشغيل كما هو مطلوب.

خلافا للبورصة، الذي يوفر عادة نتائج جيدة مع واحد فقط تجربة (باستخدام عمود مع نطاق وجود الحق)، والمستوى قد يتطلب عدة تجارب لتحقيق الدقة المثلى بضبط معلمات الأسلوب. في المستوى-مالس التجارب التي تجري مع تدرج ملح، الموصلية المخزن المؤقت، ومن ثم تغيير ري هائلة أثناء التشغيل، مع ما يترتب عليه من تغييرات على إشارة ري. وهذا يتطلب فارغة إضافية تشغيل لكل تجربة مالس المستوى وتحليل مع الطرح خط الأساس (كما هو موضح في الخطوة 5، 2 من البروتوكول) إلا إذا كان تحليل تركيز محدود لكشف الأشعة فوق البنفسجية (التي تتطلب معرفة مسبقة الانقراض معاملات لكل ذروة). التحليل مع الطرح الأساس قوية للتدرجات الخطية، على الرغم من أن زيادة تطوير أسلوب ما زال لازما للطرح خط أساس نجاح برامج التدرجي الملح. وينبغي تعديل قيم dn/dc كل ذروة وفقا الموصلية المخزن المؤقت المحدد في ذروة التيد (العمليات الحسابية يمكن العثور عليها في الأدب12). إذا كان بروتين الوتيد بتركيز كلوريد الصوديوم أقل من 200 ملم (كما هو الحال في المثال جيش صرب البوسنة)، وهذا التعديل لا يكاد يذكر.

المهم كمية كبيرة نسبيا من البروتين المستخدمة في المستوى-مالس (كخطوة مفصلة في 2.3 من البروتوكول) مقارنة مالس ثانية من التغلب على تغيير جذري الإشارة ري بسبب التدرج الملح وتقلبات ري بسبب خلط ناقصة المخازن المؤقتة للتدرج. إذا تم استخدام كشف الأشعة فوق البنفسجية لقياس كتلة، فقط يمكن أن تستخدم كميات أصغر. كمية البروتين لحقن يعتمد على كتلة المولى للبروتين والتجانس والنقاء ومعامل الانقراض الأشعة فوق البنفسجية. ينبغي أن تكون الكتلة اللازمة وحقن أعلى بالنسبة للبروتينات أصغر حجماً وأقل بالنسبة للبروتينات الكبيرة (~ 1 ملغ كاتشين 20 مغ البروتين و ~0.2 لبروتين كاتشين 150). عينات متجانسة تتطلب الحقن بعينه أكثر حيث يتم تقسيم الكمية بين العديد من السكان. وقد تتطلب تحليلية عالية الأداء اللوني السائل ([هبلك]) المواد أقل من نظام فبلك.

في الآونة الأخيرة، أبلغ عن التحليل في خط باستخدام مالس أثناء إجراءات التطهير. مثل هذا تحليل في الوقت الحقيقي فعالة جداً للكشف عن منتجات التجميع التي تحدث أثناء تنقية ويمكن الاستغناء عن أي تحليل المزيد من البروتين بعد تنقية26. المستوى اللوني يستخدم بشكل متكرر كخطوة وسيطة تنقية؛ وهكذا، يمكن أن يكون تركيبة الأعمدة المستوى محضرة مع مالس مفيدة ليس فقط كأسلوب وصف تحليلي ولكن أيضا كإجراء تحليل في الوقت الحقيقي لإجراءات تطهير واسعة النطاق. نوناناليتيكال المستوى الأعمدة هي أيضا مستقرة، مع درجة منخفضة من الإفراج عن الجسيمات، وذلك، يمكن استخدامها مع مالس. تقنيات فصل أخرى، مثل التقارب اللوني أو تبادل مسعور اللوني، كما يمكن أن يقترن مالس عندما تعرض لعينات نقية نسبيا (لتفادي تلوث كاشفات مالس ومنظمة الروتاري الدولية). وهذا يتطلب تكييف وإشارات الأمثل لطريقة الحصول على ليس فقط فصل الذروة جيدة لكن LS نظيفة بما فيه الكفاية أيضا ومنظمة الروتاري الدولية لتحليل مالس ناجحة.

Disclosures

D.S. هو موظف في شركة تكنولوجيا وايت، المنتجات التي تستخدم في هذا البروتوكول. أ. ت. موظف Danyel للتكنولوجيا الحيوية، موزع صكوك وايت و ÄKTA.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون الدكتور صافي Danieli (مركز وولفسون "تطبيق علم الأحياء الهيكلية"، الجامعة العبرية) للمشورة والتعاون. كما يشكر المؤلفون Danyel للتكنولوجيا الحيوية المحدودة (رحوفوت، إسرائيل) لتقديم المساعدة، وإنشاء نظام فبلك مالس التحليلية المستخدمة في هذه الدراسة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ÄKTA pure GE Healthcare 29-0182-26 FPLC 
0.02 µm Anotop Whatman Filter 10 mm GE Healthcare 6809-1002 Sample Filter
0.1 µm Anotop Whatman Filter 10 mm GE Healthcare 6809-1012 Sample Filter
0.1 µm Anotop Whatman Filter 25 mm GE Healthcare 6809-2012 Mobile phase filter
BSA (purity >97%) Sigma  A1900 Bovine serum albumin
miniDAWN TREOS  Wyatt Technology WTREOS MALS
mono Q HR 5/50 GL GE Healthcare 17-5166-01 Anion exchange analytical column
Optilab T-rEX Wyatt Technology WTREX Refractometer
0.1 mm PES 1000 mL Stericup Millipore SCVPU11RE Mobile phase filter
Sodium chloride Sigma  71382 HPLC grade NaCl
TRISMA base Sigma  T-1503 TRIS buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lebendiker, M., Danieli, T., de Marco, A. The Trip Adviser guide to the protein science world: a proposal to improve the awareness concerning the quality of recombinant proteins. BMC Research Notes. 7, 585 (2014).
  2. Raynal, B., Lenormand, P., Baron, B., Hoos, S., England, P. Quality assessment and optimization of purified protein samples: why and how. Microbial Cell Factories. 13, 180 (2014).
  3. Oliveira, C., Domingues, L. Guidelines to reach high-quality purified recombinant proteins. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (1), 81-92 (2018).
  4. Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. Tools to evaluate the conformation of protein products. Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).
  5. Minton, A. P. Recent applications of light scattering measurement in the biological and biopharmaceutical sciences. Analytical Biochemistry. 501, 4-22 (2016).
  6. Sahin, E., Roberts, C. J. Size-Exclusion Chromatography with Multi-angle Light Scattering for Elucidating Protein Aggregation Mechanisms. Methods in Molecular Biology. 899, 403-423 (2012).
  7. Ogawa, T., Hirokawa, N. Multiple analyses of protein dynamics in solution. Biophysical Reviews. 10 (2), 299-306 (2018).
  8. Rebolj, K., Pahovnik, D., Žagar, E. Characterization of a Protein Conjugate Using an Asymmetrical-Flow Field-Flow Fractionation and a Size-Exclusion Chromatography with Multi-Detection System. Analytical Chemistry. 84 (17), 7374-7383 (2012).
  9. Liu, H., Gaza-Bulseco, G., Faldu, D., Chumsae, C., Sun, J. Heterogeneity of Monoclonal Antibodies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (7), 2426-2447 (2008).
  10. Hintersteiner, B., et al. Charge heterogeneity: Basic antibody charge variants with increased binding to Fc receptors. mAbs. 8 (8), 1548-1560 (2016).
  11. Wei, B., Berning, K., Quan, C., Zhang, Y. T. Glycation of antibodies: Modification, methods and potential effects on biological functions. mAbs. 9 (4), 586-594 (2017).
  12. Amartely, H., Avraham, O., Friedler, A., Livnah, O., Lebendiker, M. Coupling Multi Angle Light Scattering to Ion Exchange chromatography (IEX-MALS) for protein characterization. Scientific Reports. 8 (1), 6907 (2018).
  13. Goyon, A., et al. Evaluation of size exclusion chromatography columns packed with sub-3μm particles for the analysis of biopharmaceutical proteins. Journal of Chromatography A. 1498, 80-89 (2016).
  14. Fekete, S., Beck, A., Veuthey, J. -L., Guillarme, D. Ion-exchange chromatography for the characterization of biopharmaceuticals. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 113, 43-55 (2015).
  15. Gasteiger, E., et al. ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).
  16. Kopaciewicz, W., Regnier, F. E. Mobile phase selection for the high-performance ion-exchange chromatography of proteins. Analytical Biochemistry. 133 (1), 251-259 (1983).
  17. Lebendiker, M., Danieli, T. Production of prone-to-aggregate proteins. FEBS Letters. 588 (2), 236-246 (2014).
  18. Lebendiker, M., Maes, M., Friedler, A. A screening methodology for purifying proteins with aggregation problems. Methods in Molecular Biology. 1258, 261-281 (2015).
  19. Fu, D., et al. Ultraviolet refractometry using field-based light scattering spectroscopy. Optics Express. 17 (21), 18878-18886 (2009).
  20. Scafati, A. R., Stornaiuolo, M. R., Novaro, P. Physicochemical and Light Scattering Studies on Ribosome Particles. Biophysical Journal. 11 (4), 370-384 (1971).
  21. Berthaud, A., Manzi, J., Pérez, J., Mangenot, S. Modeling Detergent Organization around Aquaporin-0 Using Small-Angle X-ray Scattering. Journal of the American Chemical Society. 134 (24), 10080-10088 (2012).
  22. Umrethia, M., Kett, V. L., Andrews, G. P., Malcolm, R. K., Woolfson, A. D. Selection of an analytical method for evaluating bovine serum albumin concentrations in pharmaceutical polymeric formulations. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 51 (5), 1175-1179 (2010).
  23. Hirano, A., Arakawa, T., Kameda, T. Effects of arginine on multimodal anion exchange chromatography. Protein Expression and Purification. 116, 105-112 (2015).
  24. Avraham, O., Bayer, E. A., Livnah, O. Crystal structure of afifavidin reveals common features of molecular assemblage in the bacterial dimeric avidins. The FEBS Journal. , (2018).
  25. Lock, M., Alvira, M. R., Wilson, J. M. Analysis of Particle Content of Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 8 Vectors by Ion-Exchange Chromatography. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 56-64 (2012).
  26. Patel, B. A., et al. Multi-angle light scattering as a process analytical technology measuring real-time molecular weight for downstream process control. mAbs. 10 (7), 945-950 (2018).

Tags

الكيمياء الحيوية، 146 قضية، التبادل الأيوني (المستوى)، وتشتت الضوء زاوية المتعددة (مالس)، اللوني، فصل البروتين، الوزن الجزيئي، ألبومين المصل البقري (BSA)، ليغومرات، ومراقبة الجودة
التبادل الأيوني اللوني (المستوى) بالإضافة إلى تشتت الضوء زاوية المتعددة (مالس) لفصل البروتين وتوصيف
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Amartely, H., Some, D., Tsadok, A.,… More

Amartely, H., Some, D., Tsadok, A., Lebendiker, M. Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization. J. Vis. Exp. (146), e59408, doi:10.3791/59408 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter