Summary
Dit protocol beschrijft het gebruik van hoge-specificiteit-ionenwisselingschromatografie met multi hoek lichtverstrooiing voor een nauwkeurige molmassabepalingen van eiwitcomplexen, eiwitten en peptiden in een heterogene monster. Deze methode is waardevol voor kwaliteitsbeoordeling, alsook wat betreft de karakterisatie van inheemse oligomeren, gratis varianten en gemengd-EiwitSteekproeven.
Abstract
Ionenwisseling chromatografie met multi hoek lichtverstrooiing (IEX-MALS) is een krachtige methode voor eiwit scheiding en karakterisering. De combinatie van de techniek van de hoge-specificiteit scheiding IEX met de nauwkeurige molaire massa analyse bereikt door MALS de karakterisatie van heterogene EiwitSteekproeven kunt, met inbegrip van mengsels van oligomere formulieren of eiwit populaties, zelfs met zeer vergelijkbare molaire massa. Daarom IEX-MALS biedt een extra niveau van de karakterisering van het eiwit en vormt een aanvulling op de standaard grootte-uitsluiting chromatografie met multi hoek lichtverstrooiing (SEC-MALS) techniek.
Hier beschrijven we een protocol voor een fundamentele IEX-MALS experimenteren en aantonen dat deze methode op bovien serumalbumine (BSA). IEX scheidt BSA te zijn oligomere vormen waardoor een molaire massa analyse door MALS van elke afzonderlijke vorm. Optimalisatie van een experiment IEX-MALS is ook gepresenteerd en gedemonstreerd op BSA, bereiken van uitstekende scheiding tussen BSA monomeren en grotere oligomeren. IEX-MALS is een waardevolle techniek voor kwaliteitsbeoordeling van proteïne aangezien het biedt zowel mooie scheiding en bepaling van de molaire massa van meerdere soorten eiwit die bestaan in een monster.
Introduction
Kwantitatieve karakterisering van eiwitproducten wordt steeds belangrijker als middel van kwaliteitscontrole (QC), zowel voor reglementaire doeleinden in de biofarmaceutische industrie en te waarborgen van de betrouwbaarheid en integriteit van life science onderzoek1 , 2. zoals beschreven op de websites van eiwit netwerken eiwitproductie en zuivering partnerschap in Europa (P4EU) en de vereniging van de hulpbronnen voor biofysische onderzoek in Europa en moleculaire biofysica in Europa (ARBRE-MOBIEU) (https://p4eu.org/protein-quality-standard-pqs en https://arbre-mobieu.eu/guidelines-on-protein-quality-control, respectievelijk), eiwit QC moet niet alleen de zuiverheid van het eindproduct, maar ook de oligomere staat, homogeniteit, identiteit, karakteriseren conformatie, structuur, posttranslationele modificaties en andere eigenschappen3,4.
Een van de meest voorkomende QC karakteriseringsmethoden is SEC-MALS. Bij deze methode wordt is een analytische SEC kolom gekoppeld aan MALS en Spectrofotometrische en feractrometische detectors, waardoor nauwkeurige metingen van de molaire massa van eiwit van elke piek5. SEC-MALS bepaalt de molaire massa van de eluted toppen onafhankelijk van het elutievolume en overwint de onnauwkeurigheid van de analytische SEC met behulp van de kalibratie van de kolom. De toevoeging van een dynamische licht-verstrooiing (DLS) module voegt grootte meting vermogen waardoor hydrodynamische straal bepaling. In academisch onderzoek, SEC-MALS wordt meestal gebruikt om te bepalen van de oligomere staat van een eiwit, haar bevleesdheid, de mate van zuiverheid, mate van aggregatie, en de gemodificeerde eiwitten, zoals glycoproteïnen of lipide-ontbindend membraaneiwitten (bepalen de molaire massa van eiwit en de componenten afzonderlijk conjugaat)6,7,8.
In veel gevallen, de uiteindelijke proteïne van een zuiveringsproces is niet een goed-omschreven moleculaire soorten maar eerder omvat sommige heterogeniteit. De eiwitten in een dergelijk mengsel kunnen worden gevarieerd in termen van structuur (bijvoorbeeld verschillende oligomere vormen), conformaties of eiwit isoforms. Eiwit heterogeniteit kunnen ook een gevolg van kleine chemische verschillen veroorzaakt door C-terminal lysine verwerking of asparagine/glutamine deamination, wat leidt tot variatie9,10laden. Verschillen in posttranslationele modificaties zoals glycosylatie kunnen ook leiden tot heterogene monsters met gratis variaties9. Deze verschillende soorten heterogeniteit worden weerspiegeld in de biofysische kenmerken van de proteïne en kunnen invloed hebben op de stabiliteit en de biologische activiteit van de target eiwit11.
Betrouwbare kwaliteitscontrole testen van deze heterogene monsters vereisen een zeer ontbindende analytische scheiding techniek. Er zijn gevallen waar goede scheiding te bereiken met analytische kolommen van de SEC, vanwege hun beperkte resolutie en scheiding capaciteiten12, wat resulteert in gebrekkig SEC-MALS analyse kan worden aangevochten. Combinatie van een hoge-specificiteit scheiding techniek zoals IEX met MALS kan overwinnen de beperking van de SEC-MALS in heterogene monsters en bieden een complementaire methode voor de karakterisering van het eiwit (zie tabel 1 in Amartely et al.12). In tegenstelling tot de SEC, die macromoleculen door hun hydrodynamische grootte13 scheidt, scheidt IEX macromoleculen door hun oppervlakte kosten14. Anion exchange (AIEX) en cation exchange (CIEX) matrices bind negatief en positief geladen varianten, respectievelijk. Met een mooie scheiding tussen eiwit populaties die een relatief nauwe massa of vorm delen, bepaalt de IEX-MALS met succes de molaire massa van elke individuele eiwit staat in een mengsel monster12.
Hier presenteren we een standaardprotocol voor het uitvoeren van een experiment van de IEX-MALS voor de scheiding en de analyse van BSA oligomere vormen die bestaan in hetzelfde monster. De keuze van een IEX-kolom voor een specifiek eiwit is belangrijk en besproken, evenals de voorwaarden van de pH en de geleidbaarheid van de buffers. De analyse van experimentele gegevens van IEX-MALS wordt ook stap voor stap beschreven. Hoewel de scheiding van BSA oligomeren goed en voldoende in SEC-MALS is, is BSA een goed voorbeeld om te laten zien van de mogelijkheden van de IEX-MALS en om aan te tonen van de optimalisatie van een experiment. Voorbeelden van slechte scheiding bereikt door SEC-MALS en goede scheiding en analyse ingeschakeld door IEX-MALS worden besproken in een eerdere studie12.
Protocol
1. bereiding van het systeem
- De snelle proteïne vloeistofchromatografie (FPLC) systeem en MALS/refractieve index (RI) detectoren (Zie Tabel van materialen) samen met hun respectievelijke softwarepakketten voor controle, data-acquisitie en analyse per de fabrikanten installeren instructies.
- Sluit de MALS en RI detectoren stroomafwaarts van de FPLC van UV- en geleidbaarheid detectoren. De pH-detector omzeilen tenzij het absoluut noodzakelijk is voor pH verlopen, tot een minimum beperken van het interdetector volume tussen de UV en MALS detectoren. Gebruik van de capillaire buis van 0,25 – 0,5 mm binnendiameter (i.d.) tussen de kolom en detectoren en 0,75 mm i.d. capillaire buis op de uitgang van de detector van de RI aan de verzamelaar afval of breuk.
- Ervoor zorgen dat de nodige signaal verbindingen tussen de FPLC en de detectoren zijn vastgesteld, met inbegrip van een UV analoge uitgang van de detector van de FPLC op de MALS Aux ingang en digitale uitgang van de FPLC naar de MALS Autoinject, via de i/o-Box.
2. bereiding van het monster en de buffer
- Filteren alle reagentia, met inbegrip van het wassen en elutie buffers, met een 0.1 µm filter. Filtreer de eerste 50-100 mL buffer in een afval fles teneinde op te heffen deeltjes uit de droge filters, en houden de rest van de buffer in een schone, steriele fles die is grondig gewassen met gefilterd water en afgetopt om te voorkomen dat stof invoeren.
- Een BSA monster een pH en Ionische sterkte aanpassen (bijvoorbeeld pH = 8, 50 mM NaCl) dat binding aan de IEX kolom toestaan tijdens verdunning, ultrafiltratie of buffer uitwisselingsprocedures.
Opmerking: Het wordt aanbevolen om de eiwitSteekproef op de kleinste poriegrootte die niet het materiaal van belang verwijdert voorfilter (0.02-0.1 µm). Anderzijds kan het monster worden gecentrifugeerd met hoge snelheid (13.000 – 16.000 x g) gedurende 10 minuten om het neerslaan van grote deeltjes. - Bereiden van ten minste 0,3 – 0,5 mg van BSA (Zie Tabel van materialen) te injecteren in een kolom van 1 mL (5/50 mm) voor het bereiken van een goede kwaliteit MALS analyse. Merk op dat het volume van de injectie onbeperkt is.
3. de keuze en ontwikkeling van een methode van de IEX voor een eiwit
- Bereken het elektrisch punt (pI) van het eiwit op basis van de primaire volgorde, voor welke servers zoals hulpmiddel van de Protparam op de ExPASy website gebruikte15kan worden. Merk op dat de pI van BSA 5,8.
- Selecteer de kolom type en buffer parameters.
- Gebruik verschillende buffers voor AIEX en CIEX, afhankelijk van de pKeen van de buffer en de Ionische aard van de buffer. Kationogene buffers gebruiken bij het uitvoeren van de AIEX kolom en anionogene buffers bij het uitvoeren van de CIEX-kolom met kleine counterions. In dit voorbeeld gebruiken 20 mM Tris-HCl buffer, pH 8, voor de analyse van de BSA van een AIEX kolom.
- Voor een eiwit met een pI lager dan 7, zoals BSA, AIEX kolom en buffer met een pH hoger dan de pI door ten minste twee eenheden te gebruiken. Voor een eiwit met een pI hoger dan 7, een CIEX kolom en de buffer met een pH lager dan het eiwit pI door ten minste twee eenheden te gebruiken.
- Optimaliseren van de pH van de buffer volgens de sterkte van de binding tussen het eiwit en de kolom-matrix. Als een eiwit niet goed naar de kolom bindt, gebruikt u een pH verder van de pI. Zorg ervoor dat het eiwit stabiel bij de gebruikte pH is.
- Gebruik een lage zoutconcentratie in de binding en wassen van de buffers zodat binding van het eiwit naar de matrix, omdat de binding aan eiwitten is afhankelijk van de Ionische sterkte van het geladen monster. Eiwitten vereisen gewoonlijk wat zout voor hun stabiliteit; Daarom gebruiken 50 mM NaCl (of alternatieve zout) tijdens de eiwit-laad- en kolom-wassen stappen.
- Voor de elutie buffer, kunt een maximum van 0,5 M NaCl loskoppelen van de proteïne van de kolom.
Opmerking: Hogere concentraties van zout worden niet aanbevolen bij het werken met de standaard-model RI refractometer als gevolg van de beperking van het bereik van het instrument. Echter, een hoge concentratie-model kan worden gebruikt en geschikt is voor 2 M NaCl.
- Een eerste methode als volgt uitvoeren.
- Laden van 1 mg van BSA (170 µL van 6 mg/mL) in mL van de ~0.5 van de buffer van een lading van 20 mM Tris-HCl buffer, pH 8, bevattende 50 mM NaCl. Was de kolom met de dezelfde buffer voor een 10-15 kolom volume (CV) om de volledige elutie van de niet-afhankelijke moleculen en deeltjes uit het systeem tot de verstrooiing van licht (LS), UV, en RI signalen zijn volledig gestabiliseerd.
- Voer een korte, lineaire zout gradiënt van 20-30 CV, met behulp van elutie buffer van 20 mM Tris-HCl, pH 8, bevattende 0,5 M NaCl als u wilt loskoppelen van de proteïne van de kolom. Uitvoeren van een helling van 0-100% (of alternatieve wijdverbreide verloop) van de buffer van de elutie of splitsen aan twee verlopen: 0%-50% van de elutie buffer gevolgd door een extra verloop van 50% – 100% van elutie buffer, elk verloop voor 10 – 20 CV. Voor BSA, gebruikt u een brede helling van 15%-70% voor 30 CV voor de eerste methode.
Opmerking: In sommige gevallen, de eerste methode kan bieden scheiding voor een betrouwbare analyse van MALS, en extra punten zijn niet nodig. In veel gevallen biedt de eerste methode slechts richtsnoeren voor de verdere optimalisering van de methode.
- Optimaliseer de IEX-methode voor het verhogen van de resolutie en de piek scheiding te verbeteren door verschillende parameters te wijzigen.
- Wijzig de kleurovergang helling en lengte. Korte hellingen met hoge hellingen bieden intensieve pieken met minder scheiding, terwijl lange hellingen met milde hellingen lagere pieken met betere scheiding bieden. Evenwicht vinden tussen piek resolutie en signaal intensiteit voor optimaal MALS analyse.
Opmerking: LS, UV, laden van een hogere hoeveelheid eiwitten kan verhogen en RI signalen maar wel ten koste van de resolutie. - Een stapsgewijze zoutconcentratie profiel gebruikt voor de elutie. Vergeet niet dat een combinatie van stappen en lineair verloop wordt vaak gebruikt.
- Het verlagen van het debiet ter verbetering van de piek scheiding.
Opmerking: Voor matrices met zeer kleine deeltjes, dit is niet zeer belangrijk. - Het wijzigen van de pH van de buffer te verhogen van de variatie van de kosten tussen de populaties van de eiwitten in de steekproef en de scheiding tussen deze varianten te verbeteren. Opmerking dat eiwitten die zijn niet goed bij een pH gescheiden kunnen worden gescheiden met een verschillende pH.
- Gebruik een pH verloop, lineair of stapsgewijze, loskoppelen van de eiwitten uit de IEX-kolom. Gebruik elutie verlopen die combineren zowel pH als zoutconcentratie variaties indien nodig.
- Gebruik sterkere zouten, zoals MgCl2of zwakkere zouten, zoals Natriumacetaat, het verhogen van de gevoeligheid en de resolutie van16.
- Gebruik langer IEX kolommen of een andere kolom matrix met kleinere deeltjes te verbeteren van de capaciteiten van de scheiding.
- Het wijzigen van het type kolom (AIEX/CIEX) om een ander patroon van scheiding. Merk op dat matrices met sterke, zwakke of gecombineerde (gemengde modus) liganden ook beschikbaar zijn en de resolutie van enkele monsters kunnen verbeteren.
- Een kolom van een andere leverancier gebruiken met de dezelfde ligand die is gekoppeld aan verschillende matrix harsen. De hars zelf, onafhankelijk van het ligand, kan anders communiceren met de eiwitten en invloed op het profiel van de scheiding.
- Additieven (moleculen die de proteïne in de oplossing te stabiliseren) opnemen in de buffers te verbeteren van eiwitstabiliteit en vermijden van aggregatie van eiwitten, ter verbetering van de IEX-experiment.
Opmerking: Voorbeelden van dergelijke additieven zijn suikers, nonionic of zwitterion detergenten, alcoholen, ureum en zouten van chaotropic en kosmotropic17,18.
- Wijzig de kleurovergang helling en lengte. Korte hellingen met hoge hellingen bieden intensieve pieken met minder scheiding, terwijl lange hellingen met milde hellingen lagere pieken met betere scheiding bieden. Evenwicht vinden tussen piek resolutie en signaal intensiteit voor optimaal MALS analyse.
4. IEX-MALS experiment
- Open New\Experiment van methode in de MALS-software en selecteer de online methode van de map van de methoden van het systeem van Licht verstrooiing . Als de DLS-module beschikbaar is en DLS gegevens moeten worden overgenomen, schakelt u de online methode uit de submap Licht Scattering\With QELS .
- De parameters van de run instellen onder de configuratiesectie .
- Instellen van het debiet van de run in de sectie Algemene pomp de stroomsnelheid gebruikt in de FPLC (1,5 mL/min), en voer of Controleer of de parameters van de buffer onder de sectie van het oplosmiddel .
- Voer de naam in eiwit (BSA), brekingsindex (dn/dc, de standaard waarde voor eiwitten is 0,185 mL/g), UV uitsterven coëfficiënt bij de golflengte van 280 nm (0,66 g/L-1•cm-1), en de concentratie van het eiwit monster (6 mg/mL) in het tabblad voorbeeld onder de sectie van de Injector . Het monstervolume voor injectie (170 µL) evenals onder dezelfde sectie invoegen
- In het tabblad Basic collectie onder de sectie van de Procedure , Vink het selectievakje Trigger op Autoinject en stel de duur van de vlucht zodat gegevensverzameling zal worden voortgezet gedurende ten minste 5 minuten nadat het verloop heeft bereikt zijn verkoopcommissie.
- Het experiment parameters instellen in de FPLC-software.
- Maak een nieuw experiment in het tabblad Method Editor . Het eerste experiment zullen een lineair verloop van zout of pH (zie stap 3.3). Voor de geoptimaliseerde methode, maakt een meer specifieke verloop- of een stapsgewijze programma volgens de elutie resultaten tijdens de eerste methode (zie stap 3.4 en Figuur 1). Een puls signaal in de methode die leiden de verzameling van de gegevens in de MALS-software tot zal opnemen.
- Wassen van de kolom en kleppen met de relevante buffers: 20 mM Tris-HCl, pH 8, met 50 mM NaCl voor het wassen buffer (een klep) en de dezelfde buffer met 500 mM NaCl voor de elutie buffer (B valve). Zorg ervoor dat de laatste kolom-wash de bindende buffer, met een lage zoute concentratie, gebruikt om de binding van het eiwit op de kolom-matrix. Gebruik voor een massale wassen van sterk gebonden onzuiverheden, 0,5 M NaOH vóór het wassen met de relevante buffers, gevolgd door een neutralisatie buffer wassen.
- Leg het monster van eiwit in de lus met een injectiespuit. Als meer dan 10 mL van het monster is geladen, gebruikt u een superloop of de pomp-klep van de FPLC instrument terwijl het omzeilen van de filter pomp en de mixer van de FPLC.
- Het experiment eerst starten in de MALS-software door te klikken op de knop uitvoeren , en vervolgens in de FPLC-software. Gegevens zal gebeuren na ontvangst van het signaal van de pols van het instrument van de FPLC via de detector MALS.
- Dezelfde parameters van de run en de instructies beschreven in stap 4.1-4.4 als de IEX-MALS handmatig is uitgevoerd met een continue-stroom-modus in plaats van een zelfstandige methode toepassen.
- Zodra de laatste methode is gecontroleerd en uitgevoerd, precies dezelfde methode met behulp van een lege injectie (laden buffer in plaats van het monster) uitvoeren Het is belangrijk dat de timing tussen de autoinject pols en het verloop van de lege run identiek aan die van het monster uitgevoerd is.
5. analyse van experimentele gegevens van IEX-MALS
- De analyses stap voor stap onder de sectie van de Procedure in de MALS-software uit te voeren. De Basic collectie weergave het verzamelen van de ruwe gegevens van het experiment.
- Gebruik het tabblad Despiking de chromatogrammen glad als ze een heleboel lawaai vertonen. Normaal gesproken gebruiken het normale niveau.
- Definiëren van de basislijn voor alle signalen (alle LS, UV en RI detectoren) volgens de basislijn .
- De pieken voor analyse in de pieken weergave definiëren. Controleer of de juiste waarden van dn/dc en de UV-uitsterven-coëfficiënt voor het eiwit onder elke piek.
Opmerking: Voor eiwitten, het is gebruikelijk om het gebruik van een standaard RI increment-waarde van 0,185 mL/g, maar voor andere macromoleculen, verschillende dn/dc waarden gebruikt moeten worden, volgens de aard van het molecuul. De gemiddelde dn/dc van polynucleotiden (DNA/RNA) is 0,17 mL/g19, terwijl sacchariden, zoals sucrose, een gemiddelde dn/dc-waarde van 0.145 mL/g-20 en de dn/dc waarden van lipiden en detergenten bereik tussen 0.1 – 0.16 hebben mL/g21. - Analyseer de molaire massa en de straal met behulp van de montage-parameters en de correlatiefunctie onder de weergaven molaire massa en straal van LS en Rh uit QELS .
- De RI-signaal veranderingen aanzienlijk tijdens de IEX-MALS uitgevoerd als gevolg van de toename van de zoutconcentratie. Daarom aftrekken het signaal van de basislijn van de lege injectie voor massale berekeningen die RI gegevens nodig.
- Open zowel het eiwit als de lege IEX-MALS experimenten. Klik met de rechtermuisknop op de naam van de eiwit-experiment, selecteer Methode toepassenen de Basislijn aftrekken map kiezen uit het bestandsdialoogvenster. Selecteer het juiste type (bijvoorbeeld online) methode voor standaardanalyse molaire massa. Merk op dat de parameters en instellingen die zijn gedefinieerd voor de eiwit-experiment zal worden opgeslagen op de nieuwe open methode.
- Onder de Basislijn aftrekken weergave, klikt u op Lege importeren als u wilt importeren van de signalen van de lege run. Controleer onder instrumenten (naast de Import lege knop), alle van de detectoren aftrekken.
- In de weergave pieken waardecorrecties op dn/dc (indien nodig) als gevolg van de geleidbaarheid van de oplossing bij het eiwit piekoppervlakte, aangezien de RI van de oplossing wordt gewijzigd tijdens de uitvoering12.
- Kalibreer het systeem van de IEX-MALS met BSA monomeer.
Opmerking: Normaal gesproken het IEX-MALS-systeem wordt regelmatig gekalibreerd voor piek uitlijning, verbreding van de band en de normalisatie van de hoekige detectoren naar de detector van de 90° met behulp van een monodispers eiwit met een straal van traagheidsstralen (Rg) van < 10 nm, zoals BSA monomeer. In dit voorbeeld, BSA serveert zowel als de kalibratie-molecuul en is zelf het onderwerp van de molaire massa analyse.- Uitlijnen van de toppen, volgens de Procedures > configuratie weergeven.
- Uitvoeren van normalisatie onder de weergave van de normalisatie , invoeren van 3.0 nm als de R-g -waarde.
- Selecteer onder Verbreding van de Band in het zelfde lusje van de configuratie , de piek en overeenkomen met de UV- en LS signalen aan het RI-signaal, met behulp van de knop Uitvoeren passen .
- De grafiek van de resultaten wordt weergegeven in de weergave Resultaten passend . De as-schalen en andere parameters van de grafiek wijzigen door met de rechtermuisknop op de grafiek, selecteren, bewerkenen vervolgens op de knop Geavanceerd te klikken. De figuur van een grafiek met meer weergaveopties is ook beschikbaar in het tabblad EASI grafiek : Selecteer Molaire massa van het drop-down-menu weergeven boven aan het venster.
- Merk op dat alle resultaten, met inbegrip van de molaire massa, straal, niveau van zuiverheid en anderen, vindt u in de rapportweergave (beknopte of gedetailleerde) onder het gedeelte ' resultaten ' . Gebruik de Report Designer knop meer resultaten of parameters, evenals cijfers, aan het rapport toevoegen.
Representative Results
BSA is een gemeenschappelijk eiwit die in de chromatografie wordt gebruikt voor de kalibratie van de experimenteel systeem22 en is zeer geschikt voor het beoefenen van IEX-MALS, evenals SEC-MALS. Het is voornamelijk monomeer met een theoretische monomeer massa van 66,7 kDa en meestal bevat een klein aantal Dimeren en hogere oligomeren23.
BSA werd geanalyseerd op IEX-MALS met behulp van een analytische wisselingskolom anion (Zie Tabel van materialen). Een brede lineaire gradiënt bestaande uit 30 CV van 75 mM tot 350 mM NaCl gescheiden BSA monomeren van de hogere oligomeren. Stroomafwaarts MALS analyse resulteerde in een berekende monomeer molaire massa van 66.8 ± 0,7 kDa en een molaire massa van berekende dimeer van 130 ± 5 kDa(Figuur 1).
Op basis van de geleidbaarheid van de buffer op de eluted toppen, het verloop werd veranderd naar een ander programma: een lange stap van 175 mM NaCl gevolgd door een lineair verloop van 175 mM tot 500 mM NaCl. Het nieuwe verloop sterk verbeterd de resolutie en de uitstekende scheiding tussen BSA monomeer (met een berekende molaire massa van 66,1 ± 0,7 kDa) en de hogere oligomere soorten (met een berekende gemiddelde massa van 132 ± 2 kDa) (Figuur 1B). Om te richten ook op de hoge oligomere soorten en voor de berekening van de molaire massa van elke individuele oligomere vorm van BSA, werd een stapsgewijze programma van 200 mM en 250 mM NaCl toegepast. Dit experiment heeft geleid tot een uitstekende scheiding tussen BSA monomeer (met een berekende massa van 62,4 ± 0,4 kDa), (met een berekende massa van 130 ± 10 kDa) dimeer en trimeer (met een berekende massa van 170 ± 10 kDa) (Figuur 1C). Alle IEX-MALS experimenten tonen aan dat BSA GC meestal als een monomeer met een zuiverheidsgraad van 80%, in overeenstemming met de resultaten van de SEC-MALS waar BSA monomeren Elueer met een zuiverheid van 85%12.
Figuur 1 : Optimalisatie van IEX-MALS experiment voor BSA. (A) IEX-MALS experimenteren van BSA met een kleurovergang programma van 75 – 350 mM NaCl. (B) IEX-MALS experimenteren van BSA met een programma van een 175 mM NaCl stap gevolgd door een lineaire gradiënt programma van 175-500 mM NaCl. (C) IEX-MALS experimenteren van BSA met een programma van de stap van 200 mM en 250 mM NaCl. De chromatogrammen weergeven de UV bij 280 nm (blauw), licht verstrooiing op een hoek van 90° (rood), en de brekingsindex (roze) en de curven van de geleidbaarheid (grijs) samen met de molaire massa van elke piek berekend door MALS (zwart). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
IEX-MALS is een krachtige methode om eiwit scheiding en karakterisering waarmee de nauwkeurige molmassabepalingen van pure eiwitten zo goed vanaf heterogene monsters, karakteriseren van inheemse oligomeren, native aggregaten, covalente en noncovalent complexen, en conjugated eiwitten. Een programma dat bestaat uit een lineair verloop of een reeks van zoute concentratie stappen kan bereiken van een goede scheiding van de bevolking van eiwit en degelijke analyse van elke individuele piek door de MALS toestaan. Verdere optimalisatie door het variëren van de verschillende parameters, zoals verloop helling (zie stap 3.4 van het protocol), kan worden uitgevoerd als een betere resolutie vereist is. IEX-MALS kunnen een waardevolle eiwitten kwaliteitscontrole assay omdat het voorziet in een extra, kritische niveau van eiwit karakterisering, complementair aan andere methoden zoals SEC-MALS.
SEC-MALS is een standaard en gemeenschappelijke techniek voor eiwitten molmassabepalingen, kan de relatief lage resolutie van de analytische SEC standaardkolommen nauwkeurige molaire massa metingen bereikt door MALS12beperken. Enkele voorbeelden van de beperkingen van de SEC-MALS oplossingen die opeenvolgende oligomeren, hoge niveaus van aggregatie die niet volledig zijn gescheiden van het monomeer peak en heterogene populaties met vergelijkbare molaire massa, zoals de gemodificeerde eiwitten bevatten.
IEX is een meer complexe chromatografie methode te ontwerpen en uit te voeren dan SEC, maar de informatie verkregen uit een experiment IEX-MALS kan aanvullen en soms zelfs meer informatief dan SEC-MALS analyse. IEX-MALS heeft met succes gekarakteriseerd antilichaam varianten die delen van de dezelfde molaire massa, oligomeren, die niet volledig op SEC, en korte peptides die moeilijk gescheiden zijn te analyseren door SEC12,24. Macromoleculaire assembly's die zijn te groot om te worden gescheiden door de SEC, zoals volledige (met virale DNA) en lege deeltjes van adeno-associated virus (AAV), kunnen ook worden opgelost door IEX25 vóór MALS analyse. Vergeleken met de SEC, IEX biedt diverser scheiding mogelijkheden14 en heeft de flexibiliteit van het aanpassen van verschillende parameters te verhogen piek resolutie, zoals de pH van de buffer, soorten zout, typen en lengte van de kolom, en anderen. In tegenstelling tot de SEC, er is geen volumebeperking voor monster injectie in IEX en elke molecuul kan onafhankelijk van de grootte worden geanalyseerd (zie tabel 1 in Amartely et al.12). Dit is een groot voordeel van IEX-MALS, vooral voor monsters met een lage intensiteit LS, zoals zeer kleine eiwitten of verdunde eiwitten met een tendens voor de aggregatie van concentratie. Aangezien analytische IEX kolommen meer stabiel zijn en hebben de neiging om minder deeltjes dan SEC kolommen, IEX-MALS vereist zeer korte equilibratietijd en LS signalen zeer snel zijn gestabiliseerd. Hierdoor wordt het functioneren van individuele experimenten zoals beschreven in dit protocol en het stoppen van de run zoals vereist.
In tegenstelling tot de SEC, die meestal biedt goede resultaten met slechts één experiment (met behulp van een kolom met het juiste fractionering bereik), IEX kan vereisen verschillende experimenten om optimale resolutie door de methodeparameters tuning. In het IEX-MALS experimenten die zijn uitgevoerd met een zout gradiënt, de geleidbaarheid van de buffer en, vandaar, de RI drastisch veranderen tijdens de vlucht, met de daaruit voortvloeiende wijzigingen in het RI-signaal. Dit vereist een extra spatie voor elk experiment IEX-MALS en een analyse worden uitgevoerd met aftrekken van de basislijn (zoals beschreven in stap 5.2 van het protocol) als de analyse van de concentratie beperkt tot UV-detectie is (waarbij een priori kennis van het uitsterven coëfficiënten voor elke piek). De analyse met aftrekken van de basislijn is robuust voor lineaire verlopen, hoewel de verdere ontwikkeling van de methode is nog steeds vereist voor het aftrekken van de succesvolle basislijn van zout stapsgewijze programma's. De dn/dc waarden van elke piek moeten worden aangepast volgens de specifieke buffer geleiding bij de eluted piek (berekeningen kunnen worden gevonden in de literatuur12). Als een eiwit geëlueerd bij een NaCl concentratie lager dan 200 mM (zoals in het voorbeeld van de BSA), deze aanpassing is te verwaarlozen.
De relatief grote hoeveelheid eiwitten gebruikt in IEX-MALS (zoals beschreven in stap 2.3 van het protocol) in vergelijking met de SEC-MALS is belangrijk om te overwinnen de dramatische verandering van het RI-signaal veroorzaakt door het zout gradiënt en de schommelingen van de RI als gevolg van onvolmaakte mengen van de kleurovergang buffers. Als alleen UV-detectie wordt gebruikt voor de meting van de massa, mogen kleinere hoeveelheden worden gebruikt. De hoeveelheid eiwit te injecteren, is afhankelijk van de molaire massa van het eiwit, homogeniteit, zuiverheid en de UV uitsterven coëfficiënt. De noodzakelijke ingespoten massa moet hoger voor kleinere proteïnen en lager voor grotere proteïnen (~ 1 mg voor een 20 kDa proteïne en ~0.2 mg voor een 150 kDa proteïne). Heterogene monsters nodig injectie van meer monster omdat de hoeveelheid is verdeeld tussen verschillende populaties. Analytische hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) wellicht minder materiaal dan een FPLC systeem.
Onlangs, in-line analyse met behulp van MALS tijdens zuiveringsprocedures heeft gemeld. Dergelijke een real-time analyse is zeer efficiënt voor het opsporen van aggregatie producten die optreden tijdens het zuiveringsproces ongehinderd en kunnen elimineren de noodzaak voor een nadere analyse van het eiwit na zuivering26. IEX chromatografie wordt vaak gebruikt als een tussenliggende zuivering; Dus, de combinatie van preparatieve IEX kolommen met MALS kan bruikbaar niet alleen als een karakterisering van de analytische methode maar ook als een real-time analyse van grootschalige zuiveringsprocedures. Nonanalytical IEX kolommen zijn ook stabiel, met een lage graad van het vrijgeven van de deeltjes en daarom kunnen worden gebruikt met MALS. Andere scheidingstechnieken, zoals chromatografie van de affiniteit of hydrofobe uitwisseling chromatografie, kunnen ook worden gecombineerd met MALS wanneer onderworpen aan relatief zuiver monsters (om besmetting te voorkomen van de detectoren MALS en RI). Dit vergt de aanpassing en optimalisatie van de werkwijze te halen niet alleen goede piek scheiding maar ook voldoende schone LS en RI signalen voor een succesvolle MALS-analyse.
Disclosures
D.S. is een medewerker van Wyatt Technology Corporation, waarvan de producten worden gebruikt in dit protocol. A.T. is een medewerker van Danyel Biotech, een distributeur van Wyatt en ÄKTA instrumenten.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Dr. Tsafi Danieli (Wolfson centrum voor toegepast, Structural Biology, Hebreeuwse Universiteit) voor haar advies en samenwerkingen. Danyel Biotech Ltd (Rehovot, Israël) bedanken de auteurs ook voor de hulp en vestiging van de analytische FPLC-MALS systeem gebruikt in deze studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ÄKTA pure | GE Healthcare | 29-0182-26 | FPLC |
| 0.02 µm Anotop Whatman Filter 10 mm | GE Healthcare | 6809-1002 | Sample Filter |
| 0.1 µm Anotop Whatman Filter 10 mm | GE Healthcare | 6809-1012 | Sample Filter |
| 0.1 µm Anotop Whatman Filter 25 mm | GE Healthcare | 6809-2012 | Mobile phase filter |
| BSA (purity >97%) | Sigma | A1900 | Bovine serum albumin |
| miniDAWN TREOS | Wyatt Technology | WTREOS | MALS |
| mono Q HR 5/50 GL | GE Healthcare | 17-5166-01 | Anion exchange analytical column |
| Optilab T-rEX | Wyatt Technology | WTREX | Refractometer |
| 0.1 mm PES 1000 mL Stericup | Millipore | SCVPU11RE | Mobile phase filter |
| Sodium chloride | Sigma | 71382 | HPLC grade NaCl |
| TRISMA base | Sigma | T-1503 | TRIS buffer |
References
- Lebendiker, M., Danieli, T., de Marco, A. The Trip Adviser guide to the protein science world: a proposal to improve the awareness concerning the quality of recombinant proteins. BMC Research Notes. 7, 585 (2014).
- Raynal, B., Lenormand, P., Baron, B., Hoos, S., England, P. Quality assessment and optimization of purified protein samples: why and how. Microbial Cell Factories. 13, 180 (2014).
- Oliveira, C., Domingues, L. Guidelines to reach high-quality purified recombinant proteins. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (1), 81-92 (2018).
- Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. Tools to evaluate the conformation of protein products. Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).
- Minton, A. P. Recent applications of light scattering measurement in the biological and biopharmaceutical sciences. Analytical Biochemistry. 501, 4-22 (2016).
- Sahin, E., Roberts, C. J. Size-Exclusion Chromatography with Multi-angle Light Scattering for Elucidating Protein Aggregation Mechanisms. Methods in Molecular Biology. 899, 403-423 (2012).
- Ogawa, T., Hirokawa, N. Multiple analyses of protein dynamics in solution. Biophysical Reviews. 10 (2), 299-306 (2018).
- Rebolj, K., Pahovnik, D., Žagar, E. Characterization of a Protein Conjugate Using an Asymmetrical-Flow Field-Flow Fractionation and a Size-Exclusion Chromatography with Multi-Detection System. Analytical Chemistry. 84 (17), 7374-7383 (2012).
- Liu, H., Gaza-Bulseco, G., Faldu, D., Chumsae, C., Sun, J. Heterogeneity of Monoclonal Antibodies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (7), 2426-2447 (2008).
- Hintersteiner, B., et al. Charge heterogeneity: Basic antibody charge variants with increased binding to Fc receptors. mAbs. 8 (8), 1548-1560 (2016).
- Wei, B., Berning, K., Quan, C., Zhang, Y. T. Glycation of antibodies: Modification, methods and potential effects on biological functions. mAbs. 9 (4), 586-594 (2017).
- Amartely, H., Avraham, O., Friedler, A., Livnah, O., Lebendiker, M. Coupling Multi Angle Light Scattering to Ion Exchange chromatography (IEX-MALS) for protein characterization. Scientific Reports. 8 (1), 6907 (2018).
- Goyon, A., et al. Evaluation of size exclusion chromatography columns packed with sub-3μm particles for the analysis of biopharmaceutical proteins. Journal of Chromatography A. 1498, 80-89 (2016).
- Fekete, S., Beck, A., Veuthey, J. -L., Guillarme, D. Ion-exchange chromatography for the characterization of biopharmaceuticals. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 113, 43-55 (2015).
- Gasteiger, E., et al. ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).
- Kopaciewicz, W., Regnier, F. E. Mobile phase selection for the high-performance ion-exchange chromatography of proteins. Analytical Biochemistry. 133 (1), 251-259 (1983).
- Lebendiker, M., Danieli, T. Production of prone-to-aggregate proteins. FEBS Letters. 588 (2), 236-246 (2014).
- Lebendiker, M., Maes, M., Friedler, A. A screening methodology for purifying proteins with aggregation problems. Methods in Molecular Biology. 1258, 261-281 (2015).
- Fu, D., et al. Ultraviolet refractometry using field-based light scattering spectroscopy. Optics Express. 17 (21), 18878-18886 (2009).
- Scafati, A. R., Stornaiuolo, M. R., Novaro, P. Physicochemical and Light Scattering Studies on Ribosome Particles. Biophysical Journal. 11 (4), 370-384 (1971).
- Berthaud, A., Manzi, J., Pérez, J., Mangenot, S. Modeling Detergent Organization around Aquaporin-0 Using Small-Angle X-ray Scattering. Journal of the American Chemical Society. 134 (24), 10080-10088 (2012).
- Umrethia, M., Kett, V. L., Andrews, G. P., Malcolm, R. K., Woolfson, A. D. Selection of an analytical method for evaluating bovine serum albumin concentrations in pharmaceutical polymeric formulations. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 51 (5), 1175-1179 (2010).
- Hirano, A., Arakawa, T., Kameda, T. Effects of arginine on multimodal anion exchange chromatography. Protein Expression and Purification. 116, 105-112 (2015).
- Avraham, O., Bayer, E. A., Livnah, O. Crystal structure of afifavidin reveals common features of molecular assemblage in the bacterial dimeric avidins. The FEBS Journal. , (2018).
- Lock, M., Alvira, M. R., Wilson, J. M. Analysis of Particle Content of Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 8 Vectors by Ion-Exchange Chromatography. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 56-64 (2012).
- Patel, B. A., et al. Multi-angle light scattering as a process analytical technology measuring real-time molecular weight for downstream process control. mAbs. 10 (7), 945-950 (2018).
