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Biochemistry

Cromatografia a scambio ionico (IEX) accoppiata alla diffusione della luce multi-angolo (MALS) per la caratterizzazione e la separazione delle proteine

Published: April 5, 2019 doi: 10.3791/59408
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Wolfson Centre for Applied Structural Biology, The Alexander Silberman Institute of Life Science, The Hebrew University of Jerusalem, 2Wyatt Technology Corporation, 3Danyel Biotech Ltd

Summary

Questo protocollo descrive l'uso della cromatografia di scambio ionico ad alta specificità con dispersione della luce multi-angolo per un'accurata determinazione della massa molare di proteine, complessi di proteine e peptidi in un campione eterogeneo. Questo metodo è prezioso per la valutazione di qualità, anche per quanto riguarda la caratterizzazione di oligomeri nativi, carica varianti ed esempi di misto-proteina.

Abstract

Cromatografia a scambio ionico con multi-angolo dispersione della luce (IEX-MALS) è un metodo potente per la separazione delle proteine e caratterizzazione. La combinazione della tecnica ad alta specificità separazione IEX con l'accurata analisi di massa molare raggiunto da MALS permette la caratterizzazione di campioni di proteine eterogenee, compresi i miscugli di forme oligomeriche o popolazioni di proteina, anche con molto simili masse molari. Di conseguenza, IEX-MALS fornisce un ulteriore livello di caratterizzazione di proteine e complementare per la cromatografia di esclusione dimensionale standard con tecnica di dispersione della luce multi-angolo (SEC-MALS).

Qui descriviamo un protocollo per una base IEX-MALS sperimentare e dimostrare questo metodo su albumina di siero bovino (BSA). IEX separa BSA alle sue forme oligomeriche permettendo un'analisi di massa molare di Malles Venosta di ogni singolo modulo. Ottimizzazione di un esperimento di IEX-Malles Venosta è anche presentato e dimostrato su BSA, raggiungere eccellente separazione tra BSA monomeri e oligomeri più grandi. IEX-MALS è una tecnica importante per la valutazione della qualità delle proteine, in quanto offre sia separazione fine e determinazione della massa molare della specie multipla di proteine presenti in un campione.

Introduction

Caratterizzazione quantitativa di prodotti proteici è sempre più essenziale come mezzo di controllo di qualità (QC), sia per fini normativi nell'industria biofarmaceutica e di garantire l'affidabilità e l'integrità delle scienze della vita ricerca1 , 2. come descritto sui siti Web della proteina reti produzione di proteine e purificazione Partnership in Europa (P4EU) e associazione delle risorse per ricerca biofisica in Europa e biofisica molecolare in Europa (ARBRE-MOBIEU) (https://p4eu.org/protein-quality-standard-pqs e https://arbre-mobieu.eu/guidelines-on-protein-quality-control, rispettivamente), proteina QC deve caratterizzare non solo la purezza del prodotto finale, ma anche lo stato oligomerico, omogeneità, identità, conformazione, struttura, modifiche di posttranslational e altre proprietà3,4.

Uno dei più comuni metodi di caratterizzazione di QC è SEC-MALS. In questo metodo, una colonna analitica SEC è accoppiata a Malles e rivelatori spettrofotometrici e rifrattometrico, consentendo misurazioni accurate della massa molare della proteina di ogni picco5. SEC-MALS determina la massa molare dei picchi eluiti indipendentemente il volume di eluizione e supera l'inesattezza della SEC analitica mediante taratura della colonna. L'aggiunta di un modulo (DLS) di luce-dispersione dinamico aggiunge funzionalità di misura dimensioni permettendo la determinazione del raggio idrodinamico. Nella ricerca accademica, SEC-MALS in genere viene utilizzato per determinare lo stato oligomerico di una proteina, la sua conformazione, il livello di purezza, livello di aggregazione e proteine modificate, come glicoproteine o proteine di membrana del lipido-solubilizzato (determinare la massa molare di proteina e coniugare i componenti singolarmente)6,7,8.

In molti casi, la proteina finale di un processo di purificazione non è una specie molecolare ben preciso ma piuttosto comprende alcune eterogeneità. Le proteine in tale miscela possono essere variate in termini di struttura (ad esempio, diverse forme oligomeriche), conformazioni o isoforme della proteina. Eterogeneità di proteina può anche essere un risultato di piccole differenze chimiche causate da C-terminale lisina elaborazione o deaminazione di asparagina e Glutammina, che conduce a pagare variazione9,10. Differenze nelle modifiche di posttranslational come glicosilazione possono anche portare a campioni eterogenei con variazioni di carica9. Questi diversi tipi di eterogeneità si riflettono nelle caratteristiche biofisiche della proteina e possono influenzare la stabilità e l'attività biologica delle proteine bersaglio11.

Controllo di qualità affidabile analisi di tali campioni eterogenei richiedono una tecnica di separazione analitica altamente risolutivo. Ci sono casi dove la buona separazione può essere contestata da realizzare con colonne analitiche di SEC, a causa della loro limitata risoluzione e separazione abilità12, con conseguente analisi SEC-MALS difettosa. Combinando una tecnica di separazione ad alta specificità come IEX con Malles Venosta può superare la limitazione di SEC-MALS in campioni eterogenei e forniscono un metodo complementare per la caratterizzazione di proteine (tabella 1, Amartely et al.12). A differenza di SEC, che separa macromolecole di loro idrodinamico formato13, IEX separa macromolecole di loro carica superficiale14. Scambio anionico (AIEX) e associazione di matrici di scambio cationico (CIEX) negativamente e positivamente carico varianti, rispettivamente. Con una separazione fine tra popolazioni di proteine che condividono una massa relativamente stretta o una forma, IEX-MALS determina correttamente la massa molare di ciascuno stato di singole proteine in un campione di miscela12.

Qui presentiamo un protocollo standard per l'esecuzione di un esperimento di IEX-Malles Venosta per la separazione e l'analisi delle forme oligomeriche BSA che esistono nello stesso campione. La scelta di una colonna IEX per una specifica proteina è importante e discusso, nonché le condizioni di pH e conducibilità dei buffer. L'analisi di dati sperimentali IEX-MALS inoltre è descritta passo dopo passo. Anche se la separazione degli oligomeri di BSA è necessaria e sufficiente a SEC-MALS, BSA è un buon esempio per mostrare le funzionalità di IEX-Malles e dimostrare l'ottimizzazione di un esperimento. Esempi di scarsa separazione raggiunto da SEC-MALS e corretta separazione e analisi attivata da IEX-Malles sono discusse in un precedente studio12.

Protocol

1. preparazione del sistema

  1. Installare il sistema di cromatografia in fase liquida (FPLC) di proteine veloci e MALS/refrattiva rivelatori di indice (RI) (Vedi Tabella materiali) insieme a loro rispettivi pacchetti per controllo, acquisizione dati e analisi per i costruttori istruzioni.
  2. Collegare i rilevatori di Malles Venosta e RI a valle di rivelatori UV e la conducibilità di FPLC. Escludere il sensore di pH a meno che non è assolutamente necessario per gradienti di pH, per ridurre al minimo il volume interdetector tra i rilevatori UV e Malles Venosta. Utilizzare tubazione capillare di 0,25-0,5 diametro mm interno (i.d.) tra la colonna e rivelatori e tubazione capillare di 0,75 mm i.d. sull'uscita del rivelatore RI al raccoglitore rifiuti o frazione.
  3. Assicurarsi che le connessioni di segnale necessario tra il FPLC e rivelatori sono state stabilite, tra cui un'uscita analogica UV dal rilevatore FPLC all'ingresso Aux Malles Venosta e uscita digitale dal FPLC al MALS Autoinject, tramite la casella dei / o.

2. preparazione del campione e del buffer

  1. Filtrare tutti i reagenti, tra cui i buffer di lavaggio e di eluizione, con un filtro 0,1 µm. Filtrare i primi 50 – 100 mL di tampone in una bottiglia dei rifiuti al fine di eliminare il particolato da filtri a secco e mantenere il resto del buffer in una bottiglia pulita e sterile che è stato accuratamente lavata con acqua filtrata e ridotta per impedire l'ingresso di polvere.
  2. Regolare un campione di BSA per un pH e forza ionica (ad es., pH = 8, 50 mM NaCl) che consentire l'associazione alla colonna IEX durante la diluizione, ultrafiltrazione o procedure di scambio di buffer.
    Nota: Si consiglia di prefiltrare il campione della proteina per il più piccolo formato del poro che non rimuove il materiale di interesse (0,02 – 0,1 µm). In alternativa, il campione può essere centrifugato ad alta velocità (13.000 – 16.000 x g) per 10 minuti consentire la precipitazione di particelle di grandi dimensioni.
  3. Preparare almeno 0,3 – 0,5 mg di BSA (Vedi Tabella materiali) per iniettare in una colonna di 1 mL (5/50 mm) per realizzare un'analisi di Malles Venosta di buona qualità. Si noti che il volume di iniezione è illimitato.

3. scelta e lo sviluppo di un metodo IEX per una proteina

  1. Calcolare il punto isoelettrico (pI) della proteina basata sulla sequenza primaria, per i quali server come strumento di Protparam sulla ExPASy sito Web può essere usato15. Si noti che il pI di BSA è 5.8.
  2. Selezionare i parametri di tipo e buffer di colonna.
    1. Utilizzare diversi buffer per AIEX e CIEX, a seconda il pK del buffer e la natura ionica del buffer. Utilizzare i buffer cationici quando si esegue la colonna AIEX e anionici buffer quando si esegue la colonna CIEX con piccoli controioni. In questo esempio, utilizzare buffer 20 mM Tris-HCl, pH 8, per l'analisi di BSA su una colonna AIEX.
    2. Per una proteina con un pI inferiore a 7, come BSA, utilizzare una colonna AIEX e tampone con un pH superiore al pI da almeno due unità. Per una proteina con un pI superiore a 7, è possibile utilizzare una colonna CIEX e buffer con un pH inferiore al pI di proteine da almeno due unità.
    3. Ottimizzare il tampone pH secondo la forza del legame tra la proteina e la matrice di colonna. Se una proteina non legano bene alla colonna, utilizzare un pH più lontano il pI. Assicurarsi che la proteina è stabile al pH usato.
    4. Utilizzare una bassa concentrazione di sale nell'associazione e lavare i buffer per consentire l'associazione della proteina alla matrice, dal momento che il legame alle proteine dipende la forza ionica del campione caricato. Proteine di solito richiedono un po' di sale per la loro stabilità; Pertanto, utilizzare 50 mM NaCl (o sale alternativi) durante i passaggi di proteina-caricamento e lavare a colonna.
    5. Per tampone di eluizione, utilizzare un massimo di 0,5 M NaCl per scollegare la proteina dalla colonna.
      Nota: Più alte concentrazioni di sale non sono consigliate quando si lavora con il rifrattometro RI modello standard a causa della limitazione di gamma dello strumento. Tuttavia, un modello di alta concentrazione può essere utilizzato e ospiterà 2 M NaCl.
  3. Eseguire un metodo iniziale come segue.
    1. Caricare 1 mg di BSA (170 µ l di 6 mg/mL) in ~0.5 mL di un tampone di caricamento del buffer di 20 mM Tris-HCl, pH 8, contenente 50 mM NaCl. Lavare la colonna con lo stesso buffer per un volume di colonna di 10 – 15 (CV) consentire la completa eluizione delle molecole non associati e particelle dal sistema fino a quando la dispersione della luce (LS), UV, e RI segnali sono completamente stabilizzati.
    2. Eseguire una sfumatura lineare, breve sale di 20 – 30 CV, usando il tampone di eluizione di 20 mM Tris-HCl, pH 8, contenenti 0,5 M NaCl per staccare la proteina dalla colonna. Eseguire una sfumatura di 0 – 100% (o alternativa diffusa sfumatura) del buffer di eluizione o dividerlo in due sfumature: 0 – 50% di tampone di eluizione seguita da un'ulteriore sfumatura di 50 – 100% di tampone di eluizione, ogni sfumatura per 10 – 20 CV. Per BSA, usare un gradiente diffuso del 15% – 70% per 30 CV per il metodo iniziale.
      Nota: In alcuni casi, il metodo iniziale può fornire separazione per un'analisi affidabile di Malles Venosta e piste aggiuntive non sono necessarie. In molti casi, il metodo iniziale fornisce solo indicazioni per ulteriore ottimizzazione del metodo.
  4. Ottimizzare il metodo IEX per aumentare la risoluzione e migliorare la separazione dei picchi modificando parametri diversi.
    1. Modificare la pendenza pendenza e la lunghezza. Breve gradienti con pendenze elevate forniscono intensi picchi con meno separazione, mentre lunghi gradienti con lievi pendii inferiore picchi con una separazione migliore. Trovare un equilibrio tra intensità di segnale e risoluzione di picco per l'analisi di Malles Venosta ottimale.
      Nota: Caricamento di una maggiore quantità di proteine può aumentare LS, UV, e RI segnali ma ciò a scapito della risoluzione.
    2. Utilizzare un profilo graduale concentrazione salina per l'eluizione. Ricorda che una combinazione di passi e sfumatura lineare viene utilizzata comunemente.
    3. Diminuire la portata per migliorare la separazione dei picchi.
      Nota: Per matrici con particelle molto piccole, questo non è molto significativo.
    4. Modificare il pH del tampone per la variazione di carica tra le popolazioni della proteina nel campione di aumentare e migliorare la separazione tra quelle varianti. Nota che le proteine che non sono adeguatamente separate a un pH possono essere separate a pH diversi.
    5. Utilizzare un pH gradiente, lineare o graduale, per scollegare proteine dalla colonna IEX. Utilizzare i gradienti di eluizione che combinano pH e variazioni di concentrazione di sale se necessario.
    6. Utilizzare sali più forte, ad esempio MgCl2o sali più deboli, come l'acetato del sodio, per aumentare sensibilità e risoluzione16.
    7. Utilizzare una matrice colonna diversa o più IEX colonne con particelle più piccole di migliorare capacità di separazione.
    8. Modificare il tipo di colonna (AIEX/CIEX) per fornire un diverso modello di separazione. Nota che matrici con forte, debole o combinati ligandi (modalità mista) sono inoltre disponibili e possono migliorare la risoluzione di alcuni campioni.
    9. Utilizzare una colonna da un fornitore diverso con il ligando stesso che è attaccato alle resine di matrice diversa. La resina stessa, indipendentemente dal ligando, può interagire diversamente con le proteine e influiscono sul profilo di separazione.
    10. Sono additivi (molecole che stabilizzano le proteine nella soluzione) nei buffer per migliorare la stabilità delle proteine ed evitare l'aggregazione proteica, per migliorare l'esperimento IEX.
      Nota: Gli esempi di tali additivi sono alcoli, urea, zuccheri, detergenti non ionici o zwitterionici e17,18di sali caotropici e kosmotropic.

4. esperimento IEX-Malles Venosta

  1. Aprire New\Experiment dal metodo nel software Malles Venosta e selezionare il metodo online dalla cartella dei metodi del sistema di Light Scattering . Se è disponibile il modulo DLS e DLS dati devono essere acquisiti, è possibile selezionare il metodo online dalla sottocartella QELS Scattering\With luce .
  2. Impostare i parametri di funzionamento sotto la sezione di configurazione .
    1. Impostare la portata della corsa nella sezione Pompa generico per il tasso di flusso utilizzato in FPLC (1,5 mL/min) e immettere o verificare i parametri del buffer nella sezione di solvente .
    2. Immettere il nome di proteina (BSA), incremento di indice di rifrazione (dn/dc; lo standard valore per le proteine è 0,185 mL/g), coefficiente di estinzione UV a lunghezza d'onda di 280 nm (0,66 g/L-1ma-1) e la concentrazione del campione della proteina (6 mg/mL) in la scheda di esempio nella sezione iniettore . Inserire il volume del campione per l'iniezione (170 µ l) come pure nella stessa sezione.
    3. Nella scheda Collezione Basic , nella sezione procedura , selezionare la casella di controllo Trigger su Autoinject e impostare la durata dell'esecuzione in modo che la raccolta dati sarà continuata per almeno 5 min dopo che ha raggiunto il gradiente relativo valore finale.
  3. Impostare i parametri di esperimento nel software FPLC.
    1. Creare un nuovo esperimento nella scheda Editor di metodo . L'esperimento iniziale sarà una sfumatura lineare di sale o di pH (Vedi punto 3.3). Per il metodo ottimizzato, creare una sfumatura più specifica o un programma graduale in base ai risultati di eluizione durante il metodo iniziale (Vedi punto 3.4 e Figura 1). Sono un segnale di impulso nel metodo che attiverà la raccolta di dati del software di Malles Venosta.
    2. Lavare la colonna e valvole con i relativi buffer: 20 mM Tris-HCl, pH 8, con 50 mM NaCl per il tampone di lavaggio (una valvola) e lo stesso buffer con 500 mM NaCl per il buffer di eluizione (valvola di B). Assicurarsi che il lavaggio finale colonna utilizza il buffer di associazione, contenente una bassa concentrazione di sale, per attivare l'associazione della proteina alla matrice colonna. Per un lavaggio massiccio delle impurità fortemente associati, è necessario utilizzare 0,5 M NaOH prima di lavare con i relativi buffer, seguiti da una lavatura di tampone di neutralizzazione.
    3. Posto il campione della proteina nel ciclo usando una siringa. Se più di 10 mL di campione viene caricato, è possibile utilizzare un superloop o la pompa-valvola dello strumento FPLC, aggirando la pompa del filtro e il mixer del FPLC.
  4. Prima di avviare l'esperimento nel software Malles Venosta facendo clic sul pulsante Esegui e poi nel software FPLC. I dati saranno raccolti dopo la ricezione del segnale di impulso dallo strumento FPLC attraverso il rilevatore di Malles Venosta.
  5. Si applicano gli stessi parametri Esegui le istruzioni descritte nei passaggi 4.1 – 4.4 se IEX-Malles Venosta viene eseguita manualmente con una modalità flusso continuo anziché un metodo autonomo.
  6. Dopo aver verificato ed eseguito il metodo finale, eseguire esattamente lo stesso metodo con un'iniezione in bianco (buffer di caricamento anziché il campione). È importante che i tempi tra l'impulso di autoinject e la sfumatura dell'esecuzione del vuoto sono identico a quello dell'esecuzione dell'esempio.

5. analisi dei dati sperimentali IEX-Malles Venosta

  1. Eseguire l'analisi passo per passo nella sezione procedura del software di Malles Venosta. La Collezione Basic visualizzare la raccolta di dati grezzi dell'esperimento.
    1. Utilizzare la scheda Despiking per lisciare i cromatogrammi se esibiscono un sacco di rumore. Normalmente, si usa il livello normale .
    2. Definire la linea di base per tutti i segnali (tutti LS, UV e RI rivelatori) nella visualizzazione della linea di base .
    3. Definire le cime per analisi nella vista vette . Verificare i valori corretti di dn/dc e del coefficiente di estinzione UV per la proteina sotto ogni picco.
      Nota: Per le proteine, è comune utilizzare un valore di incremento di RI standard di 0,185 mL/g, ma per altre macromolecole, dn/dc diversi valori devono essere utilizzati, secondo la natura della molecola. Il dn/dc medio di polinucleotidi (DNA/RNA) è 0,17 mL/g19, mentre saccaridi, come saccarosio, hanno un valore medio dn/dc di 0,145 mL/g20 e i valori di dn/dc di lipidi e detersivi compresi tra 0,1-0,16 mL/g21.
    4. Analizzare la massa molare e il raggio utilizzando i parametri di montaggio e la funzione di correlazione sotto la massa molare & raggio da LS e Rh da QELS visualizzazioni.
  2. I cambiamenti del segnale RI significativamente durante la IEX-MALS eseguire dovuto l'aumento nella concentrazione di sale. Quindi sottrarre il segnale di linea di base dall'iniezione in bianco per i calcoli di massa che richiedono dati RI.
    1. Aprire sia la proteina ed il vuoto IEX-MALS esperimenti. Pulsante destro del mouse sul nome di esperimento della proteina, selezionare Metodo di applicaree scegliere la cartella di Sottrazione della linea di base nella finestra di dialogo file. Selezionare il tipo corretto di metodo (ad esempio, online) per analisi di massa molare standard. Si noti che i parametri e le impostazioni definite per l'esperimento di proteina verranno salvate il nuovo metodo aperto.
    2. Sotto la vista di Sottrazione della linea di base , fare clic su Importazione vuoto per importare i segnali dell'esecuzione del vuoto. Nell'ambito di strumenti (accanto al pulsante di Importazione in bianco ), controllare tutti i rivelatori per sottrarre.
    3. Nella vista vette , è possibile regolare i valori di dn/dc (se necessario) a causa della conducibilità della soluzione presso l'area del picco della proteina, poiché l'indice di rifrazione della soluzione viene modificato durante l'esecuzione di12.
  3. Calibrare il sistema IEX-MALS con monomero di BSA.
    Nota: Normalmente, il sistema IEX-MALS periodicamente è calibrato per allineamento di picco, ampliando la banda e la normalizzazione dei rivelatori angolari per il rilevatore di 90° utilizzando una proteina monodispersi con un raggio di girazione (Rg) di < 10 nm, come monomero di BSA. In questo esempio, BSA serve sia come la molecola di calibrazione ed è essa stessa oggetto di analisi di massa molare.
    1. Allineare le cime, nell'ambito delle procedure > visualizzazione configurazione .
    2. Eseguire la normalizzazione sotto la vista di normalizzazione , entrando 3.0 nm come il valore dig R.
    3. Sotto Ampliando la banda nella stessa scheda configurazione , scegliere il picco e abbinare i segnali UV e LS per il segnale di RI, utilizzando il tasto Eseguire Fit .
  4. Il grafico dei risultati viene visualizzato nella visualizzazione Risultati raccordo . Modificare le scale asse e altri parametri del grafico facendo clic destro sul grafico, selezionando Edite quindi facendo clic sul pulsante Avanzate . Una figura di grafico con più opzioni di visualizzazione è anche disponibile nella scheda Grafico EASI : Massa molare di selezionare dal menu a discesa Visualizza nella parte superiore della finestra.
  5. Si noti che tutti i risultati, tra cui massa molare, raggio, livello di purezza e altri, sono disponibili nella visualizzazione Report (riepilogo o dettagliata) sotto la sezione risultati . Utilizzare il pulsante di Progettazione Report per aggiungere ulteriori risultati o parametri, nonché figure, la relazione.

Representative Results

BSA è una proteina comune che viene utilizzata nella cromatografia per la calibrazione del sistema sperimentale22 ed è particolarmente adatto per praticare IEX-Malles Venosta, nonché SEC-MALS. È principalmente monomerico con una massa di monomero teorica di 66,7 kDa e di solito comprende un piccolo numero di dimeri e superiore oligomeri23.

BSA è stata analizzata su IEX-MALS utilizzando una colonna analitica di scambio anionico (Vedi Tabella materiali). Un ampio lineare gradiente composto da 30 CV da 75 mM a 350 mM NaCl separati monomeri BSA da oligomeri superiori. Analisi di Malles Venosta a valle ha provocato in una massa molare del monomero calcolato di 66,8 ± 0,7 kDa e una massa molare di dimero calcolato di 130 ± 5 kDa (Figura 1A).

Basato sulla conduttività buffer presso i picchi eluiti, la sfumatura è stata cambiata in un programma diverso: un lungo passo di 175 mM NaCl, seguita da una sfumatura lineare da 175 mM a 500 mM NaCl. La nuova sfumatura notevolmente migliorata la risoluzione e l'eccellente separazione tra monomero di BSA (con una massa molare calcolata di 66,1 ± 0,7 kDa) e le sue specie oligomeriche superiore (con una massa media calcolata di 132 ± 2 kDa) (Figura 1B). Al fine di concentrarsi anche sulle specie oligomeriche alta e per calcolare le masse molari di ogni singola forma oligomerica della BSA, è stato applicato un programma graduale di 200 mM e 250 mM NaCl. Questo esperimento ha provocato un'eccellente separazione tra BSA monomero (con una massa calcolata di 62,4 ± 0,4 kDa), dimero (con una massa calcolata di 130 ± 10 kDa) e trimero (con una massa calcolata di 170 ± 10 kDa) (Figura 1C). Tutti IEX-MALS esperimenti mostrano che BSA eluisce principalmente come monomero con una purezza del 80%, in accordo con i risultati di SEC-MALS dove monomeri BSA eluire con una purezza del 85%12.

Figure 1
Figura 1 : Ottimizzazione dell'esperimento IEX-MALS per BSA. (A) IEX-MALS esperimento di BSA con un programma di gradiente di 75 – 350 mM NaCl. (B) IEX-MALS esperimento di BSA con un programma di un passo di 175 mM NaCl seguito da un programma di gradiente lineare di 175 – 500 mM NaCl. (C) IEX-MALS esperimento di BSA con un programma passo 200 mM e 250 mM NaCl. I cromatogrammi visualizzare l'UV a 280 luce nm (blu), scattering in un angolo di 90° (rosso) e l'indice di rifrazione (rosa) e le curve di conducibilità (grigio) insieme con la massa molare di ogni picco calcolato da MALS (nero). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

IEX-Malles Venosta è un potente metodo per la separazione delle proteine e caratterizzazione che permette l'accurata determinazione della massa molare di proteine pure pure a partire da campioni eterogenei, che caratterizzano nativi oligomeri, aggregati non nativi, covalenti e non covalenti complessi e proteine coniugate. Un programma composto da una sfumatura lineare o una serie di passaggi di concentrazione salina può ottenere una buona separazione delle popolazioni della proteina e consentire un'adeguata analisi di ogni singolo picco dal MALS. Ulteriore ottimizzazione variando diversi parametri, come la pendenza del pendio (Vedi punto 3.4 del protocollo), può essere eseguita se è necessaria una risoluzione migliore. IEX-MALS può essere un saggio di controllo di qualità di preziose proteine, poiché fornisce un livello aggiuntivo, critico di caratterizzazione di proteine, complementare ad altri metodi come la SEC-MALS.

Mentre SEC-MALS è una tecnica standard e comune per la determinazione della massa molare della proteina, la relativamente bassa risoluzione delle colonne standard analitiche SEC può limitare accurate misurazioni di massa molare raggiunti da Malles Venosta12. Alcuni esempi di limitazioni di SEC-MALS soluzioni che contengono oligomeri consecutivi, elevati livelli di aggregazione che non sono completamente separati dal picco di monomero e popolazioni eterogenee con masse molari simili, quali le proteine modificate.

IEX è un metodo più complesso di cromatografia per progettare e realizzare di SEC, ma le informazioni ottenute da un esperimento IEX-MALS possono integrare e a volte essere anche più informativo di analisi SEC-MALS. IEX-MALS con successo ha caratterizzato varianti di anticorpo che condividono lo stessi oligomeri molari massa, che non sono completamente separati su SEC e brevi peptidi che sono difficili da analizzare da SEC12,24. Inoltre, assembly macromolecolari che sono troppo grandi per essere separati da SEC, come completo (contenente DNA virale) e vuote particelle di virus adeno-associato (AAV), può essere risolto da IEX25 prima dell'analisi di Malles Venosta. Rispetto al SEC, IEX offre per la capacità di separazione più diversificata14 e ha la flessibilità di regolare diversi parametri per aumentare la risoluzione dei picchi, come tampone pH, tipi di sale, tipi e lunghezza della colonna e altri. A differenza di SEC, non c'è nessuna limitazione del volume di iniezione del campione in IEX, e qualsiasi molecola possa essere analizzato indipendentemente dalle sue dimensioni (Vedi tabella 1 in Amartely et al.12). Questo è un grande vantaggio di IEX-Malles Venosta, principalmente per i campioni con una bassa intensità di LS, quali proteine molto piccole o diluito con una tendenza per l'aggregazione di concentrazione. Poiché colonne IEX analitiche sono più stabili e tendono a rilasciare particelle meno rispetto alle colonne SEC, IEX-MALS richiede tempo di equilibramento molto breve, e segnali di LS sono stabilizzati molto veloce. Questo consente l'esecuzione di esperimenti individuali come descritto in questo protocollo e l'arresto della corsa come richiesto.

A differenza di SEC, che solitamente fornisce ottimi risultati con un solo esperimento (utilizzando una colonna con la fascia destra frazionamento), IEX possono richiedere diversi esperimenti per ottenere la risoluzione ottimale regolando i parametri del metodo. Negli esperimenti IEX-Malles Venosta che vengono eseguite con un gradiente di sale, la conducibilità di buffer e, quindi, il RI drasticamente cambiare durante l'esecuzione, con conseguenti modifiche al segnale RI. Questo richiede un ulteriore vuoto eseguito per ogni esperimento IEX-Malles e un'analisi con sottrazione della linea di base (come descritto al punto 5.2 del protocollo), a meno che l'analisi di concentrazione è limitata alla rilevazione UV (che richiedono una conoscenza a priori dell'estinzione coefficienti per ogni picco). L'analisi con sottrazione della linea di base è robusto per sfumature lineari, anche se ulteriore sviluppo del metodo è ancora necessario per la sottrazione di successo della linea di base dei programmi di graduale sale. I valori di dn/dc di ogni picco dovrebbero essere regolati secondo la conducibilità di buffer specifico al picco eluito (calcoli possono essere trovati nella letteratura12). Se una proteina eluito a una concentrazione di NaCl inferiore a 200 mM (come nell'esempio BSA), questa regolazione è trascurabile.

La relativamente grande quantità di proteina usata nel IEX-Malles Venosta (come dettagliate nel punto 2.3 del protocollo) rispetto al SEC-MALS è importante per superare il drammatico cambiamento del segnale RI causato da sfumatura sale e le fluttuazioni di RI a causa imperfetta miscelazione della buffer di gradiente. Se rilevazione UV viene utilizzata per la misurazione della massa, solo piccole quantità può essere utilizzata. La quantità di proteina per iniettare dipende dalla massa molare della proteina, omogeneità, purezza e il coefficiente di estinzione UV. La massa iniettata necessaria dovrebbe essere più elevato per le più piccole proteine e inferiore per le più grandi proteine (~ 1 mg per mg 20 kDa proteina e ~0.2 per una proteina di 150 kDa). Campioni eterogenei richiedono iniezione di campione più dato che la quantità è divisa tra popolazioni diverse. Analisi cromatografia liquida (HPLC) può richiedere meno materiale rispetto ad un sistema FPLC.

Recentemente, l'analisi in linea usando MALS durante le procedure di purificazione è stata segnalata. Tale analisi in tempo reale sono molto efficiente per la rilevazione di prodotti di aggregazione che si verificano durante la purificazione e possono eliminare la necessità di qualsiasi ulteriore analisi della proteina dopo purificazione26. IEX cromatografia è frequentemente utilizzata come un passo intermedio purificazione; Pertanto, la combinazione di preparativa IEX colonne con Malles Venosta può essere utile non solo come metodo di caratterizzazione analitica, ma anche come un'analisi in tempo reale delle procedure di purificazione su grande scala. Analitici IEX colonne anche sono stabili, con un basso grado di rilascio di particelle e, pertanto, possono essere utilizzate con Malles Venosta. Abbinabile anche altre tecniche di separazione, come cromatografia di affinità o cromatografia di scambio idrofobo, MALS quando sottoposti a campioni relativamente puri (per evitare la contaminazione dei rivelatori Malles Venosta e RI). Ciò richiederà l'adeguamento e ottimizzazione del metodo di ottenere non solo separazione dei picchi buona ma anche sufficientemente pulito LS e RI segnala per una riuscita analisi di Malles Venosta.

Disclosures

D.S. è un dipendente di Wyatt Technology Corporation, i cui prodotti sono utilizzati nel presente protocollo. A.T. è un dipendente di Danyel Biotech, un distributore di Wyatt e ÄKTA strumenti.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano il Dr. Tsafi Danieli (Wolfson centro per biologia strutturale applicata, Università ebraica) per i suoi consigli e collaborazioni. Gli autori ringraziano anche Danyel Biotech Ltd. (Rehovot, Israele) per l'assistenza e l'istituzione del sistema FPLC-MALS analitico utilizzato in questo studio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ÄKTA pure GE Healthcare 29-0182-26 FPLC 
0.02 µm Anotop Whatman Filter 10 mm GE Healthcare 6809-1002 Sample Filter
0.1 µm Anotop Whatman Filter 10 mm GE Healthcare 6809-1012 Sample Filter
0.1 µm Anotop Whatman Filter 25 mm GE Healthcare 6809-2012 Mobile phase filter
BSA (purity >97%) Sigma  A1900 Bovine serum albumin
miniDAWN TREOS  Wyatt Technology WTREOS MALS
mono Q HR 5/50 GL GE Healthcare 17-5166-01 Anion exchange analytical column
Optilab T-rEX Wyatt Technology WTREX Refractometer
0.1 mm PES 1000 mL Stericup Millipore SCVPU11RE Mobile phase filter
Sodium chloride Sigma  71382 HPLC grade NaCl
TRISMA base Sigma  T-1503 TRIS buffer

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References

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Biochimica problema 146 scambio ionico (IEX) multi-angolo dispersione della luce (MALS) cromatografia separazione delle proteine peso molecolare albumina di siero bovino (BSA) oligomeri controllo di qualità
Cromatografia a scambio ionico (IEX) accoppiata alla diffusione della luce multi-angolo (MALS) per la caratterizzazione e la separazione delle proteine
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Amartely, H., Some, D., Tsadok, A.,… More

Amartely, H., Some, D., Tsadok, A., Lebendiker, M. Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization. J. Vis. Exp. (146), e59408, doi:10.3791/59408 (2019).

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