Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Øget rabies overvågning ved hjælp af en direkte, hurtig immun Histokemisk test

Published: April 30, 2019 doi: 10.3791/59416
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 4, 5
1Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS), Wildlife Services, Knoxville, TN, United States Department of Agriculture (USDA), 2Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS), Wildlife Services, Sutton, MA, United States Department of Agriculture (USDA), 3Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS), Wildlife Services, Milton, FL, United States Department of Agriculture (USDA), 4Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS), Wildlife Services, Concord, NH, United States Department of Agriculture (USDA), 5Lyssa LLC

Summary

Den direkte hurtige immun histokemiske test (DRIT) tilbyder en verdensorganisation for dyresundhed og Verdenssundhedsorganisationen (OIE/WHO) anerkendt alternativ til den direkte fluorescerende antistof (DFA) test for rabies diagnose. Denne test giver mulighed for felt-baserede applikationer, der kan udføres i ca 1 h på hjernen indtryk ved hjælp af lys mikroskopi.

Abstract

Laboratoriebaseret overvågning er en integrerende del af forebyggelsen, kontrollen og ledelsen af rabies. Mens DFA er den gyldne standard for rabies diagnose, er der behov for at validere yderligere diagnostiske teknikker til at forbedre rabies overvågning, især i udviklingslandene. Her præsenterer vi en standardprotokol for DRIT som en alternativ, laboratorium eller felt-baseret test option, der bruger lys mikroskopi i forhold til DFA. Touch indtryk af hjernevæv indsamlet fra mistænkte dyr er fastsat i 10% Buffered formalin. Den DRIT bruger rabiesvirus-specifikke monoklonale eller polyklonale antistoffer (konjugeret til biotin), en streptavidin-peroxidase enzym, og en kromogen reporter (såsom acetyl 3-amino-9-ethylcarbazole) til at detektere virale indeslutninger i inficerede væv. I ca. 1 time kan en hjerne vævsprøve testes og fortolkes af DRIT. Evaluering af mistænkte dyr hjerner testet fra en række forskellige arter i Nordamerika, Asien, Afrika, og Europa har illustreret høj følsomhed og specificitet af DRIT nærmer 100% med resultater i forhold til DFA. Siden 2005, de Forenede Staters Department of Agriculture Wildlife Services (USDA WS) program har gennemført storstilet øget rabies overvågning indsats ved hjælp af DRIT at teste > 94000 prøver indsamlet fra dyreliv i strategiske rabies Management områder . Den DRIT giver en kraftfuld, økonomisk værktøj til rabies diagnose, der kan bruges af laboratorierne og felt biologer til at forbedre nuværende rabies overvågning, forebyggelse og kontrolprogrammer globalt.

Introduction

Mens DFA er den mest udbredte test for rutinemæssig rabies diagnose1, kan omkostningerne ved at købe og vedligeholde et fluorescerende mikroskop begrænse til udviklingslande2,3,4 og for brede, storstilet forbedrede rabies overvågningsprogrammer3,4. Desuden kræver DFA evnen til at køle prøver under fiksering og til at inkubere prøver over omgivende temperatur under antistof-antigen-reaktionerne, hvilket kan være en betydelig forhindring i lande uden passende infrastruktur. På grund af de begrænsninger, der er forbundet med moderne DFA-testning, har den globale virkning af rabies længe været undervurderet5.

I denne forbindelse er der behov for at validere yderligere diagnostiske teknikker for at forbedre overvågningen af rabies globalt, især i udviklingslandene. Den DRIT-protokol, der præsenteres her, tilbyder et laboratorium eller felt baseret test alternativ til DFA, der bruger let mikroskopi og ikke kræver køling eller laboratorie inkubation under testen6. Den DRIT og DFA er ens i, at begge teknikker bruger touch indtryk af hjerne prøver indsamlet fra potentielt rabiat dyr. Men det første trin i DRIT bruger formalin som en historisk fixativ for prøver, som inaktiverer rabiesvirus. Dette giver en betydelig forbedring af biosikkerheden i forhold til acetone anvendes til at fastsætte prøver i DFA protokol3, hvilket er vigtigt ikke kun i laboratoriet, men måske endnu mere i marken-baserede eller decentrale Lab miljøer. Til dato, den drit viser følsomhed og specificitet svarende til DFA2,7,8,9.

Siden 2005, USDA WS programmet har gennemført storstilet øget rabies overvågning indsats i Nordamerika ved hjælp af DRIT som en del af en omfattende Wildlife rabies Management program10. Øget rabies overvågning anvendes som et supplement til eksponeringsbaseret folkesundhedsmæssig overvågning og tester primært vildtlevende Meso-kødædende arter, herunder vaskebjørne (Procyon lotor), stribede skunks (mephitis mephitis), grå ræve ( Urocyon cinereoargenteus), røde ræve (Vulpes vulpes), og Coyoter (Canis latrans), der ikke har været involveret i en menneskelig eller indenlandsk dyrs eksponering. Dyrekroppe, der anvendes til testning, blev indsendt til USDA WS gennem øget rabies overvågningsindsats og bestod af rabies vektorarter, der er: syg eller mærkelig skuespil; fundet død, vej-dræbt, eller en plage; og ikke er forbundet med en eksponering af mennesker eller dyr i hjemmet. Den DRIT giver en rabies diagnostisk test, der kan være ansat af uddannede felt biologer med ringe eller ingen laboratorie erfaring til at forbedre rabies overvågning og reducere den finansielle byrde og arbejdsbyrden for den offentlige sundhed diagnostiske laboratorier10. Den grundlæggende DRIT-træning for USDA WS-medarbejdere tager typisk 1,5 til 2 dage, hvilket omfatter ca. 4 timer i klasseundervisning, der dækker grundlæggende principper for biosikkerhed, metoder til indsamling af prøver og DRIT-processerne samt > 8 timer laboratorie tiden, hvor testen udføres. Uddannelsesmuligheder har været til rådighed for USDA WS og program samarbejdsvillige gennem centre for Disease Control og forebyggelse (CDC), Lyssa LLC, og Wistar Institute.

Inden for strategiske Management områder, har USDA WS testet over 94.000 Wildlife prøver ved hjælp af DRIT og har opdaget mere end 1.850 rabiat prøver, der ville have sandsynligvis gået uopdaget afhængige kun ved eksponering baseret folkesundheden test af mistænkte dyr. Forbedrede rabies overvågningsdata leveret af DRIT resultater er afgørende for at give en mere komplet tidsmæssig og rumlig repræsentation af rabies på landskabet til støtte for oral rabiesvaccination programmer for dyreliv i hele USA10, 11. Tilsvarende, provins Wildlife agenturer i Canada har indarbejdet DRIT i stor skala dyreliv rabies overvågning indsats i tandem med deres offentlige sundhed programmer med succes8. Både USDA WS og Canadian DRIT overvågningsprogrammer har brugt nationale referencelaboratorier til at bekræfte rabies ved DFA og til at udføre viral variant indtastning som relevant8. Desuden, USDA WS biologer sende 10% af negative eksemplarer til DFA bekræftelse til referencelaboratorier og siden 2008, har deltaget i halvårlige DRIT præstationstest leveret af Wisconsin State Laboratory hygiejne, som en del af standard kvalitetssikringsforanstaltninger.

Målet med denne metode er at tilbyde en alternativ tilgang til rabies diagnostisk testning, der kan gøres i decentrale laboratorier, i marken, eller i områder uden rutinemæssig adgang til elektronmikroskopi.

Protocol

Hver person, der udfører rabies diagnostisk testning bør modtage en standard præ-eksponering rabiesvaccination serie og gennemgå regelmæssig serologisk antistof vurdering, med booster immuniseringer efter behov. Ikke-immuniserede personer bør ikke komme ind i laboratorier eller områder, hvor arbejdet udføres. Al manipulation af væv og slides bør udføres for ikke at aerosolize væsker eller producere luftbårne partikler. Røghætter er ikke påkrævet, men når det er muligt, kan de give ekstra beskyttelse mod lugte, ektoparasitter og knoglefragmenter. Der skal til enhver tid bæres et minimum af personlige værnemidler, herunder handsker og øjenværn, under prøveopsamling og-testning.

1. brainstorm kollektion

  1. Indsamle hjerne prøver enten umiddelbart efter indsamling af slagtekroppe eller sikre, at slagtekroppene anbringes i frysere til opbevaring indtil senere prøvning. Hvis dyrekroppe fryses, tø ved omgivelsestemperatur før brainstorming-samlingen for at lette indsamlingen. Under visse omstændigheder indsamles prøver direkte fra et frossen dyr.
  2. For dyr, der er frisk indsamlet eller er blevet optøet til omgivende temperatur, placere dyret liggende på en flad overflade med den cervikale rygsøjlen let drejes mod eksaminatoren. Palpate at identificere den atlanto-occipital fælles på det laterale aspekt af den cervikale rygsøjlen.
    1. For slagtekroppe, der stadig er helt frosne, Anbring dyrehår som beskrevet ovenfor, hvis det er praktisk. Brug Save, knive, knogle sakse eller lignende udstyr til helt at adskille hovedet fra kroppen.
      Bemærk: Alt udstyr, der anvendes, som ikke er engangsbrug, skal rengøres grundigt mellem prøverne.
  3. Ved hjælp af en skalpel klinge, lave et snit på niveau med atlanto-occipital leddet på ventrale aspekt, skære gennem alle lag af muskler og blødt væv, herunder luftrør og esophagus. Fortsæt indtil tilnærmevis forreste aspekt af halshvirvelsøjlen ryghvirvler. For frosset væv, bruge en skalpel klinge til at fjerne eventuelle resterende lag af muskler og blødt væv til at udsætte foramen magnum.
  4. Flyt dyrets overhoved til forlængelse af området, indtil hjernestammen er synlig. Brug en skalpel klinge til at fjerne alt synligt Brain EM/centralnervesystemet (CNS)-væv til prøvetagning. For en frossen prøve skal du bruge en skalpel klinge til at fjerne så meget af det frosne hjernestammen/CNS-væv som muligt fra indersiden af kraniet.
  5. Hjerne prøverne placeres i en ubrydelig beholder (dvs. metal salve tin, Cryo-hætteglas osv.) og mærket i overensstemmelse hermed.
  6. Sørg for, at hjerne prøverne testes umiddelbart efter indsamlingen via DRIT-testen, nedkølet (4 °C) i op til 24 timer før testning eller frosset (-20 °C) indtil prøvningstidspunktet, hvis testen vil finde sted mere end 24 timer efterprøve udtagning.

2. fremstilling af materialer til DRIT

  1. Opsætning af 10 glide pletter (figur 1)
    Bemærk: Farvning retter er dybe nok til at give mulighed for fuldstændig nedsænkning af dias (diameter 96 mm, højde 72 mm, dybde 42 mm, volumen 250 mL). 6
    1. Fyld skålen 1 med 10% fosfat Buffered formalin. Udskift formalin efter 2 testkørsler eller ugentligt.
    2. Fyld fade 2, 4 og 5 med fosfatbuffer saltvand med 1% Tween-80 (TPBS). Udskift med friske TPBS før hver test.
    3. Fyld skålen 3 med 3% hydrogenperoxid. Udskift hydrogenperoxid før hver test.
    4. Fyld fade 6, 8, 9 og 10 med destilleret eller deioniseret vand. Udskift vand før hver test.
    5. Fyld skålen 7 med Gills hematoxylinlegemer formulering #2 fortyndet i et 1:1-forhold i destilleret vand6. Udskift hematoxylinlegemer efter 2 testkørsler eller ugentligt.
      Bemærk: Ifølge den oprindelige DRIT protokol udviklet af CDC12, en 1:2 forholdet mellem gæller hematoxylinlegemer til vand kan anvendes, hvis kontra farvning er for mørkt.
  2. Fremstilling af amino-ethylcarbazol (AEC) stamopløsning
    1. Ved hjælp af en glas pipette placeres 5 mL N, N-dimethylformamid i en glasbeholder.
    2. Tilsæt 1 20 mg tablet 3-amino-9-ethylcarbazole og ryste indtil helt opløst. Mærk krukken med "AEC Stock" og den dato, hvor bestanden blev lavet.
      Bemærk: AEC-stamopløsningen kan opbevares under køling (4 °C) og anvendes i 1-2 måneder.
  3. Klargøring af AEC-arbejds fortynding
    1. Der tilsættes 7 mL acetatbuffer til et 15 mL centrifugeglas.
    2. Med en glas pipette tilsættes 0,5 mL af AEC-stamopløsningen til centrifugeglasset.
    3. Tilsæt 0,075 mL 3% hydrogenperoxid til røret.
    4. Opløsningen filtreres med en 10 mL sprøjte ved hjælp af et 0,45 μm sprøjte filter.
      Bemærk: AEC-arbejds fortyndingen skal laves lige før hver DRIT-test, da den kun er stabil i 2-3 h.

3. direkte hurtig immun Histokemisk test

  1. Mærk glas mikroskop slides med et unikt nummer for hver prøve ved hjælp af en smear-Proof, vandtæt, permanent blæk markør.
    1. Brug et skalpel blad til at fjerne hjernestammen fra beholderen og placere den på papirhåndklæde. Forsigtigt fjerne ethvert overskud af væske, blod eller pels med en anden papir håndklæde til at afsløre bare hjernestammen13. Hvis det er nødvendigt, sektion hjernestammen til at afsløre et tværsnit.
    2. Meget forsigtigt røre mikroskop slide til tværsnit af hjernestammen væv. Tryk på diaset til hjernestammen på flere punkter uden lateral bevægelse for at tillade, at flere områder af hjernestammen overføres til slide13. Sørg for, at kun 1 eller 2 lag af celler overføres fra hjernevæv til diaset med en blid berøring. Ingen monterings middel er nødvendig for at anbringe hjernestammen på diasene. Medtag både en positiv og negativ kontrol i hver DRIT-kørsel.
  2. Lad gliderne lufttørre i ca. 5 minutter ved stuetemperatur.
  3. Nedsænk lysbillederne i 10% Buffered formalin i 10 minutter (skål 1).
  4. Fjern slidene fra formalin og dip-skyl i en opløsning af TPBS (skål 2).
  5. Nedsænk gliderne i 3% hydrogenperoxid i 10 min (skål 3).
  6. Fjern slides fra hydrogenperoxid og dip-skyl i frisk TPBS (fad 4). Efter fjernelse overskydende hydrogenperoxid, placere slides i frisk TPBS (skål 5) og arbejde med en slide ad gangen, mens de andre slides ophold nedsænket i TPBS.
  7. Tag slides fra TPBS (fad 5) en ad gangen, ryste og blot overskydende buffer, og Placer på en fugtet papir håndklæde på Lab bænk, som grundlag for en ' fugtighedskammer '. Ved hjælp af en pipette, drop nok primære anti-rabiesvirus antistof på hver slide til at dække CNS væv. Der inkubates i 10 min i fugtigheds kammeret (dvs. dækker slides med brønd plader eller andet simpelt dæksel, mens de lægger på det fugtet papirhåndklæde) ved stuetemperatur (figur 2).
  8. Fjern slidene fra fugtigheds kammeret, ryst og Afskær overskydende konjugat, og skyl gliderne i TPBS (genbrug de samme TPBS i fad 5).
  9. Arbejde med et dias ad gangen, mens andre forbliver fordybet i TPBS-brug en pipette til at droppe nok streptavidin-peroxidase kompleks til at dække CNS-vævet. Inkuber i fugtigheds kammeret i 10 minutter ved stuetemperatur.
  10. Fjern diasene fra fugtigheds kammeret, ryst og Afskær overskydende kompleks, og dip-skyl diasene i TPBS (skål 5).
  11. Arbejde med et dias ad gangen, ryste og blot overskydende buffer, mens andre forbliver nedsænket i TPBS-brug en pipette til at droppe nok AEC (forberedelse er forklaret ovenfor og bør ske umiddelbart før brug) til at dække CNS væv. Inkuber i fugtigheds kammeret i 10 minutter ved stuetemperatur.
  12. DIP-skyl gliderne i destilleret vand (fad 6).
  13. Placer gliderne i modplet af gæller Hematoxylin (fortyndet 1:1 med destilleret vand) i 2 min (skål 7).
  14. DIP-skyl straks alle slides i destilleret vand (fad 8). Gentag to gange med frisk vand hver gang (fade 9 og 10).
  15. Arbejde med et dias ad gangen, mens andre forbliver nedsænket i destilleret vand (fad 10) — ryst og aflad overskydende vand og brug et vandopløseligt monterings medium til at anbringe en dækseddel.
  16. Brug en lys mikroskop med en 20x mål at se slides og en 40x mål, hvis tættere inspektion er nødvendig.

Representative Results

Positive resultater fra drit viser røde ICSI virale indeslutninger, der kan variere i form og størrelse (figur 3) inden for cytoplasmaet af blålig celle legemer. Inklusionerne vises glatte med meget lyse margener og et mindre intensivt farvet centralt område. Intensitet og antigen fordeling registreres, når indeslutninger detekteres. Intensiteten er gradueret fra + 4 til + 1. Den positive kontrol slide skal have en intens, iøjnefaldende magenta glans, som omtales som en + 4 intensitet. En let tab af farve kan forekomme, især når prøvehåndtering ikke har været optimal (dvs., prøve vævet har nedbrydes lidt), og disse bør klassificeres som + 3. Mærkbart kedelig bejdset er klassificeret som en + 2 til + 1, er ikke betragtes som diagnostisk for rabiesvirus infektion og er mærket som ubestemt.

Desuden er antigen fordeling klassificeret fra + 4 til + 1 med + 4 repræsenterer antigen fordeling består af en overflod af store og små indeslutninger varierende i størrelse og form, og til stede i alle felter (eller næsten alle felter) af synspunkt i CNS væv Tryk på indtryk. Den positive kontrol har typisk en + 4 antigen fordeling. En antigen fordeling på + 3 ville blive tildelt, når der er indeslutninger i en række størrelser i de fleste, men ikke alle synsfelter. Hvis der findes indeslutninger i 10%-50% af mikroskop felterne, tildeles a + 2 antigen fordeling. Når indeslutninger findes i < 10% af mikroskop felterne, tildeles a + 1 antigen fordeling.

De fleste CNS-væv med rabiesvirus tilstedeværende udviser typiske virale indeslutninger klassificeret som + 3 eller + 4 intensitet og antigen fordeling. Hvis resultaterne indikerer en intensitet på + 2 eller + 1 eller a + 2 eller + 1 antigen, erklæres prøven for "ubestemt", og gentagen testning er berettiget. Hvis den samme prøve har et gentaget udefineret prøvningsresultat, skal prøven sendes til et referencelaboratorium for DFA eller relateret bekræftende prøvning.

En test prøve, der anvender DRIT, anses for at være negativ for rabiesvirus antigener, efter at det dias, der indeholder CNS-vævet, er blevet scannet med en forstørrelse på 200X eller derover, og der ikke er påvist nogen typiske virus indeslutninger (figur 4). Negative prøver udviser blålig celle legemer med ringe eller ingen uspecifik farvning.

Figure 1
Figur 1: Opsætning af 10 slide farvning retter med reagenser til testning. Retterne er mærket med reagensnavn i den rækkefølge, der kræves for at følge protokollen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: enkel fugtighedskammer skabt med en våd papir håndklæde og cellekultur plader.  En simpel fugtighedskammer ved hjælp af en våd papir håndklæde og cellekultur plader giver mulighed for felt-baseret applikation.  Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: repræsentative lysbilleder af rabies positive virale indeslutninger med + 4 intensitet og + 4 antigen distribution. (A og B) udviser positive rabies virale indeslutninger ved 200x forstørrelse. (C og D) udviser positive rabies virale indeslutninger ved 400x forstørrelse. Skala stænger = 5 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: repræsentative dias af negative prøver uden rabies viral indeslutninger. (A og B) viser prøver negativt for rabies viral indeslutninger ved 200x forstørrelse. (C og D) viser prøver negativt for rabies viral indeslutninger ved 400x forstørrelse. Skala stænger = 5 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: repræsentative fotografier af DRIT-prøvningsfaciliteter, der anvendes af USDA ws. A) mobilt prøvningsanlæg i en lukket påhængsvogn til transport. B) efter montering af køretøjer til drit-prøvning. C) anlæg til afprøvning af drit i forbindelse med universitetslaboratorium. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

DRIT er en fleksibel metode, der er velegnet til felt baseret overvågning til påvisning af tilstedeværelsen af rabiesvirus, som kan anvendes i decentraliserede laboratorieområder. Selv om det er muligt at gennemføre hele testen i en felt-baseret indstilling som på bagklap af en lastbil, er det ideelt at have en lille, indendørs rum dedikeret til DRIT på grund af kemiske, udstyr og forsyning opbevaring spørgsmål. Desuden skal overholdelse af alle gældende føderale, statslige og lokale love, og regler for kemisk brug og bortskaffelse overvejes. I øjeblikket, USDA WS har 15 DRIT faciliteter til at teste prøver fra 17 stater. USDA WS DRIT-faciliteterne er etableret i samarbejde med universitets-og stats folkesundheds laboratorier, i udpegede lokaler inden for større faciliteter og i lukkede påhængskøretøjer, der er blevet eftermonteret og ombygget til at fungere som mobile prøvnings enheder i tilfælde af et akut udbrud svar, hvor øget rabies overvågning test med øjeblikkelig behandlingstid er kritisk (figur 5).

Mens testen har været vellykket ved hjælp af hjernestammen materiale af varierende kvalitet, frisk hjernestammen væv uden vævs nedbrydning er optimal. Da nedbrydning, udtørring eller likvefaktion forekommer, mindskes prøve kvaliteten, og testen kan detektere mere uspecifik farvning, som kan forvirre resultaterne. Denne observation er den samme mellem DFA og DRIT2. Hjernestammen/CNS skal indsamles så hurtigt som muligt og derefter opbevares frosset (-20 °C) indtil testning.

Typisk, de fleste USDA WS faciliteter proces fra 12 til 24 slides på én gang i løbet af en DRIT session, herunder en positiv kontrol og en negativ kontrol, der er blevet bekræftet via DFA. Positive og negative kontroller udgør et referencepunkt for hver enkelt DRIT kørsel for at sikre, at testen blev gennemført, og for at bekræfte, om der opstår fortolkningsspørgsmål på prøve diasene. Hvis en prøve ikke er bestemt til at have et klart positivt eller negativt udfald, mærkes den som en ubestemt og afprøvet anden gang af DRIT. Hvis denne prøve ikke er en klar positiv eller negativ efter to DRIT-tests, sendes den til et referencelaboratorium for DFA eller relateret testning.

Som med enhver diagnostisk test, ' Trouble Shooting ' er nyttigt med uventede resultater. For eksempel, hvis en DRIT kørsel mislykkes (dvs. den positive kontrol ikke udviser + 3 eller + 4 farvning intensitet og antigen fordeling), sikre alle kemikalier og reagenser er ikke udløbet. Vi har fundet ved hjælp af en nyåbnet flaske hydrogenperoxid på mindst én gang om ugen er nyttigt at hjælpe med at forhindre ikke-specifik farvning gennem oxidation af hjernevæv. Derudover anbefaler vi udskiftning af acetatbuffer mindst én gang om året som minimum, uanset den mærkede udløbsdato.

Der er en række fordele ved DRIT over DFA, herunder lavere omkostninger, evne til at udføre testen uden for et centraliseret laboratorium, behov for kun lys mikroskopi i stedet for et fluorescerende mikroskop, og den relativt ligetil træning proces for mennesker, som administrerer og læser testen2,3,4. Disse fordele, kombineret med følsomhed og specificitet af drit, der er sammenlignelige med DFA2,7,8,9 har allerede bevist, at testen fungerer som et vigtigt redskab i bred skala forbedrede rabies overvågningsprogrammer8,10 i Nordamerika. Derudover har DRIT potentiale til at give mulighed for øget overvågning og mere hurtig testning i udviklingslande eller andre områder med begrænsede ressourcer, især efter den seneste OIE/WHO-vejledning som en anbefalet test.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi anerkender alle USDA Wildlife Services personale, der i øjeblikket eller har tidligere indsamlet øget rabies overvågning prøver og har gennemført DRIT for rabies diagnose. På samme måde anerkender vi de mange medarrangører, der hjælper os med forbedret indsamling af rabies overvågning. Vi takker også centrene for sygdomskontrol og forebyggelse og Wistar Institute for adgang til kritiske reagenser, der kræves for at gennemføre DRIT og for at give uddannelsesmuligheder. Derudover sætter vi pris på den bekræftende diagnose og teknisk assistance fra centrene for sygdomskontrol og forebyggelse og af Wadsworth Center med New Yorks sundhedsministerium. Brug af kommercielle produkter er kun til sammenligningsformål og udgør ikke en påtegning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Amino-9-Ethylcarbazole (AEC tablets; 50 count) Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) A6926
Acetate Buffer, 0.1M, 5.2 pH, 32 oz Poly Scientific R&D Corp. (https://www.polyrnd.com/) s140
Ag Tek MiniScalpel, PN110, Non-sterile #10, 40 per package Patterson Veterinary (https://www.pattersonvet.com/) PN110 Supplemental equipment for sample touch impressions; Also available through Clipper Distributing (http://www.clipperdist.net/)
BD Luer-Lok Disposable Syringe without needle, 10 cc Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) 14-823-2A BD Manufacturer Number 309604
Binocular Light Microscope with Seidentopf Head or equivalent Multiple Vendors
Blue Rectangular UN-rated Disposal Container, 5G Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/) 1147T01BLU Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Gill hematoxylin and AEC solution)
Corning Square and Rectangular Cover Glass, 24x60 Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) 12-553-465 Corning Manufacturer Number 2975246
Corning Universal Fit Pipet Tips: Racked, Nonsterile (1-200ul) Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) 07-200-300 Corning Manufacturer Number 4863
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes, polypropylene Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) 14-959-70C Corning Manufacturer Number 352097
Falcon 96-Well Assay Plates (Tissue culture plate lids) Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) 08-772-5 Corning Manufacturer Number 353910
Fisher Brand 25mm Syringe Filter, Nylon, 0.45 μm, Sterile Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) 09-719D
Fisher Chemical Gill Method Hematoxylin Stain (Gill-2), 4L Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) CS401-1D
Fisherbrand Sharps-A-Gator Point-of-Use Sharps Containers, 5 qt Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) 14-827-122 Supplemental equipment for proper BSL-2 Laboratory Set-Up
Fluoro-Gel with Tris Buffer (Gel/Mount Media), 20 mL VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 102092-122 Fluoro-Gel Substitute for BioMeda™ Gel-Mount, Electron Microscopy Sciences
Formalin, Buffered, 10%, 4L Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) SF100-4 Available each or in case of 4
Gilson Pipetman P200 Pipet, 50-200 μL Daigger Scientific (https://www.daigger.com) EF9930E
Hy-Clone Phosphate Buffered Saline, 1x Solution, 1 L (PBS) Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) SH30256LS Alternative dry powder product can be used
Hydrogen Peroxide, 3% Multiple Vendors Any commercially available source, such as pharmacy or store brands, etc.
Lens Microscope Objective 20x and 40x Multiple Vendors
Lysol IC Quarternary Disinfecting Cleaner, 1G Daigger Scientific (https://www.daigger.com) EF8481 Supplemental materials for proper BSL-2 Laboratory disinfection
Miltex brand Disposable Scalpel Size 22 (alternative size to MiniScalpel) AMD Next (www.amdnext.com) 999112314 Supplemental equipment for sample touch impressions; Alternative size to Ag Tek MiniScalpel
N,N-Dimethylformamide, Amber Glass Packaging, 500 mL Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) D119-500
Peroxidase Labeled Streptavidin, 50 mL SeraCare (https://www.seracare.com/) 5550-0001 KPL Immunoassay and Kits Reference Number 71-00-38
Phosphate Buffered Saline Powder (alternative to Fisher liquid PBS) Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) P3813 Must be prepared in 1 L distilled water; Available in quantities of 1, 10 and 50 packs
Primary antibody: Polyclonal anti-nucleoprotein or cocktail of anti-lyssavirus biotinylated antibodies Store at 4 °C
PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 1.0 mL VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 7078D-1 VWR Manufacturer Number 89091-220
PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 10.0 mL VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 7078D-10 VWR Manufacturer Number 89091-106
PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 5.0 mL VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 7078D-5 VWR Manufacturer Number 89091-484
Richard-Allan Scientific Gills Hematoxylin Stain No. 2, 1PT (alternative to above) Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) 22-050-201 Thermo Scientific Manufacturer Number 72504
Slide Holders, 24-place VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 25608-868 Sakura®Finetek Supplier Number 4465; Available through multiple vendors
Specimen Tin Boxes, 1/2 oz VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 101412-452 Supplemental equipment for storage of brain tissue samples
Taylor 2-Event Digital Timer/Clock Multiple Vendors Supplemental equipment
Tissue-Tek Slide Staining Kit VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 25608-902 Sakura®Finetek Supplier Number 4551; Available through multiple vendors
TWEEN 80, Polyethylene glycol, 500 mL Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) P1754 Also available in 25 mL, 1 L and 1 G volumes
VWR FLIP Pipette Filler (0.05-100 mL) VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 53497-055
VWR Soft Nitrile Examination Gloves, L (100 per box) VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 89038-272 Supplemental equipment for proper PPE
Water, Deionized (20 L) VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 10806-022
Wheaton Clear Glass Sample Vials, 8 mL Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) 06-408C DWK Life Sciences Manufacturer Number 224884
White Coated, Double Well Pattern Microscope Slides, 14 mm Tekdon Incorporated (https://www.tekdon.com/coated-microscope-slides.html) 2-140
White Rectangular UN-rate Disposal Container, 5G Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/) 1147T01WHT Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Formalin)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, P. Laboratory techniques in rabies. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. 23, World Health Organization. eds 88-89 (1996).
  2. Durr, S., et al. Rabies diagnosis for developing countries. PLOS Neglected Tropical Diseases. 2 (3), e206 (2008).
  3. Rupprecht, C., et al. Progress in the development of a direct rapid immunohistochemical test for diagnosing rabies. , (2014).
  4. Rupprecht, C. E., et al. Additional Progress in the Development and Application of a Direct, Rapid Immunohistochemical Test for Rabies Diagnosis. Journal of Veterinary Science. 5 (2), (2018).
  5. Coleman, P. G., Fevre, E. M., Cleaveland, S. Estimating the public health impact of rabies. Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 140-142 (2004).
  6. Standard Operating Procedure for the Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) for the detection of rabies virus antigens. , Centers for Disease Control and Prevention. (2016).
  7. Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
  8. Middel, K., Fehlner-Gardiner, C., Pulham, N., Buchanan, T. Incorporating Direct Rapid Immunohistochemical Testing into Large-Scale Wildlife Rabies Surveillance. Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 21 (2017).
  9. Coetzer, A., Sabeta, C. T., Markotter, W., Rupprecht, C. E., Nel, L. H. Comparison of biotinylated monoclonal and polyclonal antibodies in an evaluation of a direct rapid immunohistochemical test for the routine diagnosis of rabies in southern Africa. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (9), e3189 (2014).
  10. Kirby, J., et al. Enhanced Rabies Surveillance to Support Effective Oral Rabies Vaccination of Raccoons in the Eastern United States. Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 34 (2017).
  11. Slate, D., et al. Oral rabies vaccination in north america: opportunities, complexities, and challenges. PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (12), e549 (2009).
  12. Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) protocols. , Available from: https://rabiessurveillanceblueprint.org/Direct-Rapid-Immunohistochemistry?lang=fr (2019).
  13. Khalid, A., Haque, A. Touch Impression Cytology Versus Frozen Section as Intraoperative Consultation Diagnosis. 2, (2004).

Tags

Retraktion diagnose direkte hurtig immunohistokemisk test fluorescerende antistof test lyssavirus rabies zoonose
Øget rabies overvågning ved hjælp af en direkte, hurtig immun Histokemisk test
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Patrick, E. M., Bjorklund, B. M.,… More

Patrick, E. M., Bjorklund, B. M., Kirby, J. D., Nelson, K. M., Chipman, R. B., Rupprecht, C. E. Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test. J. Vis. Exp. (146), e59416, doi:10.3791/59416 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter