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Immunology and Infection

एक प्रत्यक्ष रैपिड इम्यूनोहिस्टोकेमिकल टेस्ट का उपयोग कर बढ़ी रेबीज निगरानी

Published: April 30, 2019 doi: 10.3791/59416
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 4, 5
1Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS), Wildlife Services, Knoxville, TN, United States Department of Agriculture (USDA), 2Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS), Wildlife Services, Sutton, MA, United States Department of Agriculture (USDA), 3Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS), Wildlife Services, Milton, FL, United States Department of Agriculture (USDA), 4Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS), Wildlife Services, Concord, NH, United States Department of Agriculture (USDA), 5Lyssa LLC

Summary

प्रत्यक्ष रैपिड इम्यूनोहिस्टोकेमिकल टेस्ट (डीआईआईटी) रेबीज निदान के लिए प्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी (डीएफए) परीक्षण के लिए मान्यता प्राप्त पशु स्वास्थ्य और विश्व स्वास्थ्य संगठन (ओआईई/डब्ल्यूएचओ) के लिए एक विश्व संगठन प्रदान करता है। यह परीक्षण क्षेत्र आधारित अनुप्रयोगों है कि लगभग में किया जा सकता के लिए अनुमति देता है 1 एच मस्तिष्क छापों पर प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर.

Abstract

प्रयोगशाला आधारित निगरानी रेबीज की रोकथाम, नियंत्रण और प्रबंधन के प्रयासों का अभिन्न अंग है। जबकि डीएफए रेबीज निदान के लिए सोने का मानक है, विशेष रूप से विकासशील देशों में रेबीज निगरानी में सुधार करने के लिए अतिरिक्त नैदानिक तकनीकों को मान्य करने की आवश्यकता है। यहाँ, हम एक विकल्प के रूप में DRIT के लिए एक मानक प्रोटोकॉल प्रस्तुत, प्रयोगशाला या क्षेत्र आधारित परीक्षण विकल्प है कि डीएफए की तुलना में प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करता है. संदिग्ध जानवरों से एकत्र मस्तिष्क ऊतक के टच छापों 10% बफर formalin में तय कर रहे हैं. DRIT संक्रमित ऊतक के भीतर वायरल inclusions का पता लगाने के लिए रेबीज वायरस-विशिष्ट मोनोक्लोनल या पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी (बायोटिन के लिए संयोजित), एक स्ट्रेप्विडिन-peroxidase एंजाइम, और एक क्रोमोजेन रिपोर्टर (जैसे एसिटाइल 3-एमिनो-9-एथिलकारबाज़ोल) का उपयोग करता है। लगभग 1 ज में, एक मस्तिष्क ऊतक नमूना परीक्षण किया जा सकता है और DRIT द्वारा व्याख्या की. संदिग्ध पशु दिमाग उत्तरी अमेरिका, एशिया, अफ्रीका, और यूरोप में प्रजातियों की एक किस्म से परीक्षण का मूल्यांकन उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता डीआईआईटी द्वारा सचित्र है 100% DFA की तुलना में परिणामों के साथ आ रहा है. 2005 के बाद से, संयुक्त राज्य अमेरिका के कृषि वन्यजीव सेवा विभाग (USDA WS) कार्यक्रम रणनीतिक रेबीज प्रबंधन क्षेत्रों में वन्य जीवन से एकत्र परीक्षण करने के लिए डीआईआईटी का उपयोग कर बड़े पैमाने पर बढ़ाया रेबीज निगरानी प्रयासों का आयोजन किया गया है . DRIT रेबीज निदान के लिए एक शक्तिशाली, किफायती उपकरण है कि laboratorians और क्षेत्र जीवविज्ञानियों द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता वर्तमान रेबीज निगरानी, रोकथाम और नियंत्रण कार्यक्रमों में सुधार के लिए विश्व स्तर पर प्रदान करता है.

Introduction

जबकि डीएफए नियमित रेबीज निदान1के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया परीक्षण है , खरीद और एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप बनाए रखने की लागत विकासशील देशों के लिए सीमित किया जा सकता है2,3,4 और व्यापक के लिए , बड़े पैमाने पर बढ़ाया रेबीज निगरानी कार्यक्रम3,4. इसके अलावा, डीएफए को निर्धारण के दौरान नमूनों को फ्रिज में रखने और एंटीबॉडी-एंटीजन प्रतिक्रियाओं के दौरान परिवेश तापमान से ऊपर के नमूनों को इनक्यूबेट करने की क्षमता की आवश्यकता होती है, जो उपयुक्त बुनियादी ढांचे के बिना देशों में एक महत्वपूर्ण बाधा हो सकती है। आधुनिक डीएफए परीक्षण से जुड़ी सीमाओं के कारण रेबीज के वैश्विकप्रभाव को लंबे समय से कम आंका जा रहा है।

इस संबंध में, विश्व स्तर पर, विशेष रूप से विकासशील देशों में रेबीज निगरानी में सुधार करने के लिए अतिरिक्त नैदानिक तकनीकों को सत्यापित करने की आवश्यकता है। यहाँ प्रस्तुत डीआरआईटी प्रोटोकॉल डीएफए के लिए एक प्रयोगशाला या क्षेत्र-आधारित परीक्षण विकल्प प्रदान करता है जो प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करता है और परीक्षण6के दौरान प्रशीतन या प्रयोगशाला ऊष्मायन की आवश्यकता नहीं होती है। DRIT और DFA में समान हैं कि दोनों तकनीकों संभावित पागल जानवरों से एकत्र मस्तिष्क के नमूने के स्पर्श छापों का उपयोग करें. हालांकि, डीआईआईटी का पहला कदम नमूनों के लिए एक ऐतिहासिक फिक्सेटिव के रूप में फॉर्मेलिन का उपयोग करता है, जो रेबीज वायरस को निष्क्रिय करता है। यह डीएफए प्रोटोकॉल3में नमूने को ठीक करने के लिए इस्तेमाल किया एसीटोन पर एक पर्याप्त जैव सुरक्षा सुधार प्रदान करता है, जो न केवल प्रयोगशाला में महत्वपूर्ण है, लेकिन शायद क्षेत्र आधारित या विकेन्द्रीकृत प्रयोगशाला वातावरण में भी अधिक है। आज तक डीआरआईटी डीएफए2,7,8,9 के बराबर संवेदनशीलता और विशिष्टता को दर्शाताहै.

2005 के बाद से, USDA WS कार्यक्रम एक व्यापक वन्यजीव रेबीज प्रबंधन कार्यक्रम10के भाग के रूप में डीआईआईटी का उपयोग कर उत्तरी अमेरिका में बड़े पैमाने पर बढ़ाया रेबीज निगरानी प्रयासों का आयोजन किया गया है। बढ़ी रेबीज निगरानी जोखिम आधारित सार्वजनिक स्वास्थ्य निगरानी के लिए एक पूरक के रूप में प्रयोग किया जाता है और परीक्षण मुख्य रूप से वन्य जीवन मेसो-कार्निवोर प्रजातियों, रैकून(प्रोसिऑन लोटर), धारीदार बदमाश (मेफिटिस मेफिटिस), ग्रे लोमड़ियों सहित ( Urocyon cinereorargenteus, लाल लोमड़ियों (Vulpes vulpes), और coyotes (कैनिस latrans) कि एक मानव या घरेलू पशु जोखिम में शामिल नहीं किया गया है. परीक्षण में इस्तेमाल किया पशु शव बढ़ाया रेबीज निगरानी प्रयासों के माध्यम से USDA WS को प्रस्तुत किया गया और रेबीज वेक्टर प्रजातियों है कि कर रहे हैं शामिल: बीमार या अजीब अभिनय; मृत पाया गया, सड़क मार डाला, या एक उपद्रव; और एक मानव या घरेलू पशु जोखिम के साथ जुड़े नहीं हैं. डीआईआईटी एक रेबीज नैदानिक परीक्षण प्रदान करता है जिसे प्रशिक्षित क्षेत्र जीवविज्ञानियों द्वारा रेबीज निगरानी में सुधार लाने औरसार्वजनिक स्वास्थ्य नैदानिक प्रयोगशालाओं के वित्तीय बोझ और कार्यभार को कम करने के लिए कम या कोई प्रयोगशाला अनुभव के साथ नियोजित किया जा सकता है . USDA WS क्षेत्र के कर्मचारियों के लिए बुनियादी DRIT प्रशिक्षण आम तौर पर लेता है 1.5 से 2 दिन, जो जैव सुरक्षा के मौलिक सिद्धांतों को कवर कक्षा अनुदेश के लगभग 4 एच भी शामिल है, नमूना संग्रह के लिए तरीकों और DRIT प्रक्रियाओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से gt; 8 ज के प्रयोगशाला समय परीक्षण का आयोजन. प्रशिक्षण के अवसर रोग नियंत्रण और रोकथाम (सीडीसी), LYSSA LLC, और Wistar संस्थान के लिए केंद्र के माध्यम से USDA WS और कार्यक्रम cooperators के लिए उपलब्ध किया गया है.

सामरिक प्रबंधन क्षेत्रों के भीतर, USDA WS DRIT का उपयोग कर 94,000 से अधिक वन्य जीवन नमूनों का परीक्षण किया है और अधिक से अधिक 1,850 पागल नमूने है कि संभावना संदिग्ध जानवरों के जोखिम आधारित सार्वजनिक स्वास्थ्य परीक्षण के आधार पर ही निर्भर नहीं चला गया होगा पता चला है. डीआईआईटी के परिणामों द्वारा उपलब्ध कराए गए उन्नत रेबीज निगरानी आंकड़े संयुक्त राज्य अमेरिका10भर में वन्य जीवन के लिए मौखिक रेबीज टीकाकरण कार्यक्रमों के समर्थन में परिदृश्य पर रेबीज का एक अधिक पूर्ण लौकिक और स्थानिक प्रतिनिधित्व प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, 11| इसी प्रकार, कनाडा में प्रांतीय वन्यजीव एजेंसियों ने डीआईआईटी को उनके जन स्वास्थ्यकार्यक्रमों की सफलता के साथ मिलकर बड़े पैमाने पर वन्यजीव रेबीज निगरानी प्रयासों में शामिल किया है। USDA WS और Canadian DRIT निगरानी दोनों कार्यक्रमों ने राष्ट्रीय संदर्भ प्रयोगशालाओं का उपयोग डीएफए द्वारा रेबीज की पुष्टि करने और वायरल टाइपिंग को उपयुक्त8के रूप में करने के लिए किया है . इसके अलावा, USDA WS क्षेत्र जीवविज्ञानी डीएफए पुष्टि के लिए नकारात्मक नमूनों का 10% भेजने के संदर्भ प्रयोगशालाओं और 2008 के बाद से, दो वार्षिक डीआईआईटी प्रवीणता परीक्षण स्वच्छता के विस्कॉन्सिन राज्य प्रयोगशाला द्वारा प्रदान की में भाग लिया है, मानक के भाग के रूप में गुणवत्ता आश्वासन उपायों.

इस विधि का लक्ष्य रेबीज नैदानिक परीक्षण के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण की पेशकश करना है जो विकेन्द्रीकृत प्रयोगशालाओं में किया जा सकता है, क्षेत्र में, या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए नियमित पहुंच के बिना क्षेत्रों में।

Protocol

रेबीज नैदानिक परीक्षण का आयोजन प्रत्येक व्यक्ति एक मानक पूर्व जोखिम रेबीज टीकाकरण श्रृंखला प्राप्त करना चाहिए और नियमित रूप से serological एंटीबॉडी मूल्यांकन से गुजरना चाहिए, बूस्टर प्रतिरक्षण के साथ के रूप में की जरूरत है. अप्रतिम व्यक्तियों को प्रयोगशालाओं या क्षेत्रों में प्रवेश नहीं करना चाहिए जहां इस तरह के काम किए जाते हैं। ऊतकों और स्लाइडों के सभी हेरफेर तरल पदार्थ को एयरोसोलाइज नहीं करने या हवाई कणों का उत्पादन करने के लिए आयोजित किया जाना चाहिए। धूआं डाकू की आवश्यकता नहीं है, लेकिन जब संभव हो वे odors, बहिर्परजीवी, और हड्डी के टुकड़े से अतिरिक्त सुरक्षा प्रदान कर सकते हैं. दस्ताने और आंख संरक्षण सहित न्यूनतम व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण, नमूना संग्रह और परीक्षण के दौरान हर समय पहना जाना चाहिए.

1. ब्रेनस्टेम संग्रह

  1. शव संग्रह पर या तो तुरंत brainstem नमूने ले लीजिए या सुनिश्चित करें कि शव बाद में परीक्षण तक भंडारण के लिए फ्रीजर में रखा जाता है. यदि पशु शव जमे हुए हैं, संग्रह में आसानी के लिए brainstem संग्रह से पहले परिवेश के तापमान पर thaw. कुछ परिस्थितियों में, नमूने सीधे एक जमे हुए जानवर से एकत्र कर रहे हैं.
  2. जानवरों है कि हौसले से एकत्र कर रहे हैं या परिवेश के तापमान के लिए thawed किया गया है के लिए, गर्भाशय ग्रीवा रीढ़ थोड़ा परीक्षक की ओर घुमाया के साथ एक फ्लैट सतह पर पशु supine स्थिति. Palpate गर्भाशय ग्रीवा रीढ़ के पार्श्व पहलू पर atlanto-occipital संयुक्त की पहचान करने के लिए।
    1. शवों कि अभी भी पूरी तरह से जमे हुए हैं के लिए, ऊपर वर्णित के रूप में पशु supine स्थिति, अगर व्यावहारिक. शरीर से सिर को पूरी तरह से अलग करने के लिए आरी, चाकू, हड्डी कतरनी या इसी तरह के उपकरणों का उपयोग करें।
      नोट: सभी उपकरण है कि एक बार उपयोग नहीं है इस्तेमाल किया नमूनों के बीच अच्छी तरह से साफ किया जाना चाहिए.
  3. एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करना, अधर पहलू पर एटलांटो-ऑकसीटल संयुक्त के स्तर पर एक चीरा बनाने, मांसपेशियों और कोमल ऊतक के सभी परतों के माध्यम से काटने, श्वासनली और घेघा सहित। गर्भाशय ग्रीवा रीढ़ की हड्डी की रीढ़ की हड्डी के लगभग पहलू लगभग जब तक जारी रखें. जमे हुए ऊतक के लिए, एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करने के लिए मांसपेशियों और नरम ऊतक के किसी भी शेष परतों को दूर करने के लिए रंभामेन मैग्नम का पर्दाफाश.
  4. brainstem दिखाई देता है जब तक अंत सीमा विस्तार में पशु के सिर ले जाएँ. नमूने के लिए सभी दृश्यbrain/केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) ऊतक को हटाने के लिए एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करें। एक जमे हुए नमूने के लिए, खोपड़ी के अंदर से संभव के रूप में जमे हुए brainstem / सीएनएस ऊतक के रूप में ज्यादा हटाने के लिए एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करें।
  5. एक अटूट कंटेनर में brainstem नमूने प्लेस (यानी, धातु मरहम टिन, क्रायो-वील, आदि) और तदनुसार लेबल.
  6. सुनिश्चित करें कि brainstem नमूने DRIT परीक्षण के माध्यम से संग्रह के तुरंत बाद परीक्षण कर रहे हैं, परीक्षण से पहले 24 एच के लिए फ्रिज (4 डिग्री सेल्सियस) या परीक्षण के समय तक जमे हुए (-20 डिग्री सेल्सियस) अगर परीक्षण नमूना संग्रह के बाद 24 से अधिक एच जगह ले जाएगा.

2. डीआईआईटी के लिए सामग्री की तैयारी

  1. 10 स्लाइड धुंधला व्यंजन की स्थापना (चित्र 1)
    नोट: दाग व्यंजन स्लाइड की पूरी विसर्जन के लिए अनुमति देने के लिए पर्याप्त गहरी कर रहे हैं (व्यास 96 मिमी, ऊंचाई 72 मिमी, गहराई 42 मिमी, मात्रा 250 एमएल). 6
    1. 10% फॉस्फेट बफर फॉर्मलिन के साथ पकवान 1 भरें। 2 टेस्ट रन या साप्ताहिक के बाद फॉर्मेलिन बदलें।
    2. 1% ट्वीन-80 (TPBS) के साथ फॉस्फेट बफर नमकीन के साथ व्यंजन 2, 4, और 5 भरें। प्रत्येक परीक्षण से पहले ताजा TPBS के साथ बदलें.
    3. 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ पकवान 3 भरें। प्रत्येक परीक्षण से पहले हाइड्रोजन पेरोक्साइड बदलें।
    4. आसुत या deionized पानी के साथ व्यंजन 6, 8, 9, और 10 भरें। प्रत्येक परीक्षण से पहले पानी बदलें.
    5. गिल्स हेमेटोक्सीलिन फॉर्मूलेशन के साथ 7 डिश भरें #2 आसुत जल में 1:1 अनुपात में पतला हो6. 2 टेस्ट रन या साप्ताहिक के बाद हेमेटॉक्सिलिन को बदलें।
      नोट: सीडीसी12द्वारा विकसित मूल डीआईआईटी प्रोटोकॉल के अनुसार, पानी के लिए गिल्स हेमेटोक्सीलिन के 1:2 अनुपात का उपयोग किया जा सकता है यदि काउंटरस्टेनिंग बहुत अंधेरा है।
  2. एमिनो-एथिलकार्बाज़ोल (एईसी) स्टॉक समाधान की तैयारी
    1. एक गिलास पिपेट का उपयोग करके, कांच के कंटेनर में एन,एन-डाइमेथिलफॉर्ममाइड के 5 एमएल रखें।
    2. 3-एमिनो-9-एथिलकार्बोजोल की एक 20 मिलीग्राम की गोली जोड़ें और पूरी तरह से भंग होने तक हिलाएं। "एईसी स्टॉक" और तारीख शेयर बनाया गया था के साथ जार लेबल.
      नोट: AEC स्टॉक समाधान प्रशीतन (4 डिग्री सेल्सियस) के तहत संग्रहीत किया जा सकता है और 1-2 महीने के लिए इस्तेमाल किया।
  3. एईसी काम कमजोर पड़ने की तैयारी
    1. एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में एसीटेट बफर के 7 एमएल जोड़ें।
    2. एक गिलास पिपेट का उपयोग करके, अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए एईसी स्टॉक समाधान के 0.5 एमएल जोड़ें।
    3. ट्यूब में 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड का 0ण्075 एमएल जोड़ें।
    4. 0.45 डिग्री सिरिंज फ़िल्टर का उपयोग करके 10 एमएल सिरिंज के साथ समाधान फ़िल्टर करें.
      नोट: AEC काम कमजोर पड़ने बस प्रत्येक DRIT परीक्षण से पहले बनाया जाना चाहिए के रूप में यह केवल 2-3 एच के लिए स्थिर है.

3. डायरेक्ट रैपिड इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री टेस्ट

  1. लेबल ग्लास माइक्रोस्कोप एक स्मीयर प्रूफ, निविड़ अंधकार, स्थायी स्याही मार्कर का उपयोग कर प्रत्येक नमूने के लिए एक अद्वितीय संख्या के साथ स्लाइड.
    1. एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करना, कंटेनर से brainstem निकालें और कागज तौलिया पर जगह है. धीरे से तरल पदार्थ, रक्त, या फर के किसी भी अतिरिक्त एक दूसरे कागज तौलिया के साथ दूर धब्बा सिर्फ brainstem ऊतक13प्रकट करने के लिए. यदि आवश्यक हो, एक पार अनुभाग प्रकट करने के लिए brainstem ऊतक अनुभाग.
    2. बहुत धीरे brainstem ऊतक के पार अनुभाग के लिए माइक्रोस्कोप स्लाइड स्पर्श करें. आगे की स्लाइड में बताते हैं कि बिना पार्श्व आंदोलन के कई बिंदुओं पर स्लाइड को टच करें ताकि ब्रेनस्टेम के कई क्षेत्रों को Slide13में स्थानांतरित किया जा सके. सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं के केवल 1 या 2 परतों एक कोमल स्पर्श के साथ स्लाइड करने के लिए मस्तिष्क के ऊतकों से स्थानांतरित कर रहे हैं. कोई बढ़ते एजेंट स्लाइड करने के लिए brainstem ऊतक चिपका करने के लिए आवश्यक है. प्रत्येक DRIT रन में एक सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण दोनों शामिल करें।
  2. स्लाइड कमरे के तापमान पर लगभग 5 मिनट के लिए हवा सूखी करते हैं।
  3. स्लाइड में 10 मिनट (डिश 1) के लिए 10% बफर फॉर्मेलिन विसर्जित कर दिया।
  4. TPBS (dish 2) के समाधान में फॉर्मलिन और डिप-रिस्ल से स्लाइड्स निकालें।
  5. स्लाइड में 10 मिनट (डिश 3) के लिए 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड विसर्जित कर दिया।
  6. ताजा TPBS (dish 4) में हाइड्रोजन पेरोक्साइड और डुबकी से स्लाइड निकालें. अतिरिक्त हाइड्रोजन पेरोक्साइड को हटाने के बाद, ताजा TPBS (dish 5) में स्लाइड जगह है और एक समय में एक स्लाइड के साथ काम करते हुए अन्य स्लाइड TPBS में डूबे रहते हैं.
  7. एक समय में एक TPBS (dish 5) से स्लाइड ले लो, बंद हिला और दाग अतिरिक्त बफर, और प्रयोगशाला बेंच पर एक गीला कागज तौलिया पर जगह, एक 'आर्द्रता कक्ष' के आधार के रूप में. एक पिपेट का उपयोग करना, सीएनएस ऊतक को कवर करने के लिए प्रत्येक स्लाइड पर पर्याप्त प्राथमिक एंटी रेबीज वायरस एंटीबॉडी ड्रॉप करें। आर्द्रता कक्ष में 10 मिनट के लिए स्लाइड्स को इनक्यूबेट करें (यानी, कमरे के तापमान पर नम हुए कागज तौलिया पर बिछाने के दौरान अच्छी प्लेटों या अन्य सरल कवर के साथ स्लाइड को कवर करना ) (चित्र2)।
  8. आर्द्रता कक्ष से स्लाइड निकालें, हिला और अतिरिक्त संयुग्मी बंद धब्बा, और डुबकी TPBS में स्लाइड धोने (डिश 5) में एक ही TPBS पुन: उपयोग करें.
  9. एक समय में एक स्लाइड के साथ कार्य करना, जबकि अन्य TPBS में डूबे रहते हैं - सीएनएस ऊतक को कवर करने के लिए पर्याप्त स्ट्रेपविडिन-peroxidase परिसर को छोड़ने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए आर्द्रता कक्ष में इनक्यूबेट।
  10. आर्द्रता कक्ष से स्लाइड निकालें, हिला और अतिरिक्त परिसर से धब्बा, और TPBS (dish 5) में स्लाइड डुबकी-निकालना.
  11. एक समय में एक स्लाइड के साथ कार्य करना, बंद हिला और अतिरिक्त बफर धब्बा, जबकि दूसरों TPBS में डूबे रहते हैं - पर्याप्त AEC ड्रॉप करने के लिए एक pippette का उपयोग करें (तैयारी ऊपर समझाया गया है और तुरंत उपयोग करने से पहले किया जाना चाहिए) CNS ऊतक को कवर करने के लिए. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए आर्द्रता कक्ष में इनक्यूबेट।
  12. डिस्टिल्ड वाटर (डिश 6) में स्लाइड्स को डुबकी दें।
  13. गिल्स हेमैटोक्सिलिन (डिस्टिल्ड पानी के साथ 1:1) के काउंटरस्टेन में 2 मिनट (डिश 7) के लिए स्लाइड्स रखें।
  14. तुरंत डिप-रस्से सभी स्लाइड्स में आसुत पानी (dish 8)। ताजा पानी के साथ दो बार दोहराएँ हर बार (प्रतिदिन 9 और 10).
  15. एक समय में एक स्लाइड के साथ कार्य करना, जबकि अन्य आसुत पानी में डूबे रहते हैं (dish 10) - हिला और अतिरिक्त पानी से धब्बा और एक कवर पर्ची चिपका करने के लिए एक पानी में घुलनशील बढ़ते माध्यम का उपयोग करें.
  16. स्लाइड और करीब निरीक्षण की जरूरत है, तो एक 40x उद्देश्य को देखने के लिए एक 20x उद्देश्य के साथ एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें।

Representative Results

डीआईआईटी के सकारात्मक परिणाम नीले कोशिका निकायों के कोशिकाद्रव्य के भीतर आकार और आकार (चित्र 3) में भिन्न हो सकते हैं कि लाल intracytoplasmic वायरल inclusions दिखा. शामिल किए जाने बहुत उज्ज्वल मार्जिन और एक कम गहन दाग केंद्रीय क्षेत्र के साथ चिकनी दिखाई देते हैं. तीव्रता और प्रतिजन वितरण दर्ज कर रहे हैं जब inclusions का पता चला रहे हैं. तीव्रता को +4 से +1 तक वर्गीकृत किया गया है. सकारात्मक नियंत्रण स्लाइड में एक तीव्र, स्पष्ट मैजंटा प्रतिभा होनी चाहिए जिसे +4 तीव्रता के रूप में जाना जाता है। रंग का एक मामूली नुकसान हो सकता है, खासकर जब नमूना हैंडलिंग इष्टतम नहीं किया गया है (यानी, नमूना ऊतक थोड़ा विघटित है) और इन के रूप में वर्गीकृत किया जाना चाहिए +3. उल्लेखनीय रूप से सुस्त दाग को +2 से +1 के रूप में वर्गीकृत किया जाता है, रेबीज वायरस संक्रमण के लिए नैदानिक नहीं माना जाता है और इसे अनिश्चित के रूप में लेबल किया जाता है।

इसके अतिरिक्त, प्रतिजन वितरण से वर्गीकृत किया जाता है +4 करने के लिए +1 के साथ +4 का प्रतिनिधित्व प्रतिजन वितरण आकार और आकार में अलग बड़े और छोटे inclusions की एक बहुतायत के शामिल है, और हर क्षेत्र में मौजूद (या लगभग हर क्षेत्र) सीएनएस ऊतक के भीतर देखने के स्पर्श प्रभाव. सकारात्मक नियंत्रण आम तौर पर एक +4 प्रतिजन वितरण है. +3 का एक प्रतिजन वितरण सौंपा जाएगा जब वहाँ सबसे अधिक लेकिन देखने के क्षेत्रों के सभी नहीं में आकार की एक किस्म में शामिल कर रहे हैं. यदि समावेशन माइक्रोस्कोप फ़ील्ड के 10%-50% में पाए जाते हैं, तो एक +2 प्रतिजन वितरण असाइन किया जाता है। जब माइक्रोस्कोप फ़ील्ड के 10% में समावेशन पाए जाते हैं, तो एक +1 प्रतिजन वितरण असाइन किया जाता है.

रेबीज वायरस के साथ अधिकांश सीएनएस ऊतक वर्तमान विशिष्ट वायरल inclusions के रूप में वर्गीकृत प्रदर्शन +3 या +4 तीव्रता और प्रतिजन वितरण. यदि परिणाम एक +2 या +1 तीव्रता या +2 या +1 प्रतिजन वितरण इंगित करते हैं, तो नमूना को "अनिश्चित" घोषित किया जाता है और दोहराने का परीक्षण वारंट किया जाता है. एक ही नमूना एक दोहराने अनिश्चित परीक्षण परिणाम है, तो नमूना DFA या संबंधित confirmatory परीक्षण के लिए एक संदर्भ प्रयोगशाला के लिए भेजा जाना चाहिए।

सीएनएस ऊतक युक्त स्लाइड 200X या अधिक की आवर्धन पर स्कैन किया गया है और कोई विशिष्ट वायरस inclusions का पता चला रहे हैं के बाद डीआईआईटी वायरस प्रतिजनों का उपयोग कर एक परीक्षण नमूना रेबीज वायरस प्रतिजनों के लिए नकारात्मक माना जाता है (चित्र 4) . नकारात्मक नमूने कम या कोई nonspecific धुंधला के साथ नीले सेल निकायों प्रदर्शन.

Figure 1
चित्रा 1: परीक्षण के लिए अभिकर्मकों के साथ 10 स्लाइड धुंधला व्यंजन का सेटअप। व्यंजन प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए आवश्यक क्रम में अभिकर्मक नाम के साथ लेबल कर रहे हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: सरल आर्द्रता कक्ष एक गीला कागज तौलिया और सेल संस्कृति प्लेटों के साथ बनाया.  एक गीला कागज तौलिया और सेल संस्कृति प्लेटों का उपयोग कर एक सरल आर्द्रता कक्ष क्षेत्र आधारित आवेदन के लिए अनुमति देता है.  कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: रेबीज सकारात्मक वायरल inclusions के प्रतिनिधि स्लाइड +4 तीव्रता और +4 प्रतिजन वितरण के साथ. (ए और बी) 200x आवर्धन में सकारात्मक रेबीज वायरल inclusions दिखा. (सी और डी) 400x आवर्धन पर सकारात्मक रेबीज वायरल inclusions दिखा. स्केल बार्स ] 5 m. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: कोई रेबीज वायरल शामिल किए जाने के साथ नकारात्मक नमूनों के प्रतिनिधि स्लाइड| (ए और बी) 200x आवर्धन में रेबीज वायरल inclusions के लिए नकारात्मक नमूने दिखाते हैं. (सी और डी) 400x आवर्धन पर रेबीज वायरल inclusions के लिए नकारात्मक नमूने दिखाते हैं. स्केल बार्स ] 5 m. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: यूएसडीए डब्ल्यूएस द्वारा उपयोग की जाने वाली डीआईआईटी परीक्षण सुविधाओं के प्रतिनिधि फोटो। (क) परिवहन के लिए एक संलग्न ट्रेलर में मोबाइल परीक्षण सुविधा। (बी) डीआरआईटी परीक्षण के लिए पुनर्निर्माण वाहन। (सी) विश्वविद्यालय प्रयोगशाला के साथ संयोजन के रूप में डीआईआईटी परीक्षण सुविधा. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

डीआईआईटी एक लचीला तरीका है जो विकेन्द्रीकृत प्रयोगशाला क्षेत्रों में इस्तेमाल किया जा सकता है रेबीज वायरस की उपस्थिति का पता लगाने के लिए क्षेत्र आधारित निगरानी के लिए अनुकूल है। हालांकि यह एक ट्रक के tailgate पर के रूप में एक क्षेत्र आधारित सेटिंग में पूरे परीक्षण का संचालन करने के लिए संभव है, यह रासायनिक, उपकरण और आपूर्ति भंडारण के मुद्दों के कारण डीआरआईटी के लिए समर्पित एक छोटे, इनडोर अंतरिक्ष के लिए आदर्श है। इसके अतिरिक्त, सभी लागू संघीय, राज्य, और स्थानीय कानूनों के पालन, और रासायनिक उपयोग और निपटान के लिए नियमों पर विचार किया जाना चाहिए. वर्तमान में, USDA WS 17 राज्यों से नमूनों का परीक्षण करने के लिए 15 डीआईआईटी सुविधाएं हैं। USDA WS DRIT सुविधाओं विश्वविद्यालय और राज्य सार्वजनिक स्वास्थ्य प्रयोगशालाओं के साथ संयोजन के रूप में स्थापित कर रहे हैं, बड़ी सुविधाओं के भीतर नामित कमरे में और संलग्न ट्रेलरों कि retrofitted किया गया है और में मोबाइल परीक्षण इकाइयों के रूप में सेवा करने के लिए परिवर्तित में आपात प्रकोप प्रतिक्रिया की स्थिति जहां तत्काल टर्नअराउंड समय के साथ बढ़ी हुई रेबीज निगरानी परीक्षण महत्वपूर्ण है (चित्र 5)

जबकि परीक्षण चर गुणवत्ता के brainstem सामग्री का उपयोग सफल रहा है, कोई ऊतक अपघटन के साथ ताजा brainstem ऊतक इष्टतम है. अपघटन, शुष्कता, या द्रवीकरण होता है के रूप में, नमूना गुणवत्ता कम हो जाती है और परीक्षण और अधिक nonspecific धुंधला जो परिणाम भ्रमित कर सकते हैं का पता लगा सकते हैं. यह प्रेक्षण डीएफए और डीआईटी2के बीच समान है। Brainstem/CNS जितनी जल्दी हो सके एकत्र किया जाना चाहिए और फिर परीक्षण तक जमे हुए (-20 डिग्री सेल्सियस) संग्रहीत किया जाना चाहिए।

सामान्यतया, सबसे USDA WS सुविधाप्रक्रिया 12 से 24 स्लाइड एक DRIT सत्र के दौरान एक सकारात्मक नियंत्रण और एक नकारात्मक नियंत्रण DFA के माध्यम से पुष्टि की गई है सहित एक बार में। सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण प्रत्येक DRIT रन के लिए एक संदर्भ बिंदु प्रदान करने के लिए सुनिश्चित करें कि परीक्षण सफल रहा था और पुष्टि करने के लिए अगर व्याख्यात्मक सवाल परीक्षण स्लाइड पर उठता है. यदि एक नमूना एक स्पष्ट सकारात्मक या नकारात्मक परिणाम के लिए निर्धारित नहीं है, यह एक अनिश्चित के रूप में लेबल और DRIT द्वारा दूसरी बार परीक्षण किया है. यदि यह नमूना दो DRIT परीक्षणों के बाद एक स्पष्ट सकारात्मक या नकारात्मक नहीं है, तो इसे डीएफए या संबंधित परीक्षण के लिए एक संदर्भ प्रयोगशाला में भेजा जाता है।

किसी भी नैदानिक परीक्षण के साथ के रूप में, 'समस्या शूटिंग' अप्रत्याशित निष्कर्षों के साथ उपयोगी है. उदाहरण के लिए, यदि कोई DRIT रन असफल होता है (यानी, धनात्मक नियंत्रण +3 या +4 धुंधला तीव्रता और प्रतिजन वितरण प्रदर्शित नहीं करता है), तो सुनिश्चित करें कि सभी रसायनों और अभिकर्मकों की समय सीमा समाप्त नहीं हुई है. हम प्रति सप्ताह एक बार की एक न्यूनतम पर हाइड्रोजन पेरोक्साइड की एक नई खोला बोतल का उपयोग कर पाया है मस्तिष्क के ऊतकों के ऑक्सीकरण के माध्यम से गैर विशिष्ट दाग को रोकने में मदद करने के लिए उपयोगी है. इसके अतिरिक्त, हम एक न्यूनतम पर हर साल कम से कम एक बार एसीटेट बफर की जगह की सिफारिश, लेबल समय सीमा समाप्ति दिनांक की परवाह किए बिना.

कम लागत सहित डीएफए पर डीआईआईटी के फायदे के एक नंबर रहे हैं, एक केंद्रीकृत प्रयोगशाला के बाहर परीक्षण प्रदर्शन करने की क्षमता, एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के बजाय केवल प्रकाश माइक्रोस्कोपी के लिए की जरूरत है, और अपेक्षाकृत सरल प्रशिक्षण प्रक्रिया के लिए लोग प्रशासन और पढ़ने के परीक्षण2,3,4. ये लाभ, संवेदनशीलता और डीआईआईटी की विशिष्टता के साथ मिलकर जो डीएफए2,7,8,9 के बराबर हैं, पहले से ही साबित कर चुके हैं कि परीक्षण व्यापक पैमाने पर एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में कार्य करता है बढ़ाया रेबीज निगरानी कार्यक्रम8,10 उत्तरी अमेरिका में. इसके अतिरिक्त, डीआईआईटी में विकासशील देशों या सीमित संसाधनों वाले अन्य क्षेत्रों में अधिक त्वरित परीक्षण की अनुमति देने की क्षमता है, विशेष रूप से अनुशंसित परीक्षण के रूप में हाल ही में OIE/डब्ल्यूएचओ मार्गदर्शन के बाद।

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम सभी USDA वन्यजीव सेवा स्टाफ जो वर्तमान में या पहले बढ़ाया रेबीज निगरानी नमूने एकत्र किया है और रेबीज निदान के लिए डीआईआईटी का आयोजन स्वीकार करते हैं. इसी तरह, हम कई cooperators जो हमें बढ़ाया रेबीज निगरानी संग्रह के साथ सहायता स्वीकार करते हैं. हम भी रोग नियंत्रण और रोकथाम और महत्वपूर्ण डीआईआईटी का संचालन करने के लिए और प्रशिक्षण के अवसर प्रदान करने के लिए आवश्यक अभिकर्मकों के उपयोग के लिए Wistar संस्थान के लिए केंद्र धन्यवाद. इसके अलावा, हम रोग नियंत्रण और रोकथाम के लिए केंद्र द्वारा और स्वास्थ्य के न्यूयॉर्क राज्य विभाग के साथ Wadsworth केंद्र द्वारा प्रदान की confirmatory निदान और तकनीकी सहायता की सराहना करते हैं. किसी भी वाणिज्यिक उत्पादों का उपयोग केवल तुलना प्रयोजनों के लिए है और बेचान का गठन नहीं करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Amino-9-Ethylcarbazole (AEC tablets; 50 count) Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) A6926
Acetate Buffer, 0.1M, 5.2 pH, 32 oz Poly Scientific R&D Corp. (https://www.polyrnd.com/) s140
Ag Tek MiniScalpel, PN110, Non-sterile #10, 40 per package Patterson Veterinary (https://www.pattersonvet.com/) PN110 Supplemental equipment for sample touch impressions; Also available through Clipper Distributing (http://www.clipperdist.net/)
BD Luer-Lok Disposable Syringe without needle, 10 cc Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) 14-823-2A BD Manufacturer Number 309604
Binocular Light Microscope with Seidentopf Head or equivalent Multiple Vendors
Blue Rectangular UN-rated Disposal Container, 5G Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/) 1147T01BLU Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Gill hematoxylin and AEC solution)
Corning Square and Rectangular Cover Glass, 24x60 Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) 12-553-465 Corning Manufacturer Number 2975246
Corning Universal Fit Pipet Tips: Racked, Nonsterile (1-200ul) Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) 07-200-300 Corning Manufacturer Number 4863
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes, polypropylene Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) 14-959-70C Corning Manufacturer Number 352097
Falcon 96-Well Assay Plates (Tissue culture plate lids) Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) 08-772-5 Corning Manufacturer Number 353910
Fisher Brand 25mm Syringe Filter, Nylon, 0.45 μm, Sterile Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) 09-719D
Fisher Chemical Gill Method Hematoxylin Stain (Gill-2), 4L Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) CS401-1D
Fisherbrand Sharps-A-Gator Point-of-Use Sharps Containers, 5 qt Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) 14-827-122 Supplemental equipment for proper BSL-2 Laboratory Set-Up
Fluoro-Gel with Tris Buffer (Gel/Mount Media), 20 mL VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 102092-122 Fluoro-Gel Substitute for BioMeda™ Gel-Mount, Electron Microscopy Sciences
Formalin, Buffered, 10%, 4L Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) SF100-4 Available each or in case of 4
Gilson Pipetman P200 Pipet, 50-200 μL Daigger Scientific (https://www.daigger.com) EF9930E
Hy-Clone Phosphate Buffered Saline, 1x Solution, 1 L (PBS) Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) SH30256LS Alternative dry powder product can be used
Hydrogen Peroxide, 3% Multiple Vendors Any commercially available source, such as pharmacy or store brands, etc.
Lens Microscope Objective 20x and 40x Multiple Vendors
Lysol IC Quarternary Disinfecting Cleaner, 1G Daigger Scientific (https://www.daigger.com) EF8481 Supplemental materials for proper BSL-2 Laboratory disinfection
Miltex brand Disposable Scalpel Size 22 (alternative size to MiniScalpel) AMD Next (www.amdnext.com) 999112314 Supplemental equipment for sample touch impressions; Alternative size to Ag Tek MiniScalpel
N,N-Dimethylformamide, Amber Glass Packaging, 500 mL Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) D119-500
Peroxidase Labeled Streptavidin, 50 mL SeraCare (https://www.seracare.com/) 5550-0001 KPL Immunoassay and Kits Reference Number 71-00-38
Phosphate Buffered Saline Powder (alternative to Fisher liquid PBS) Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) P3813 Must be prepared in 1 L distilled water; Available in quantities of 1, 10 and 50 packs
Primary antibody: Polyclonal anti-nucleoprotein or cocktail of anti-lyssavirus biotinylated antibodies Store at 4 °C
PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 1.0 mL VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 7078D-1 VWR Manufacturer Number 89091-220
PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 10.0 mL VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 7078D-10 VWR Manufacturer Number 89091-106
PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 5.0 mL VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 7078D-5 VWR Manufacturer Number 89091-484
Richard-Allan Scientific Gills Hematoxylin Stain No. 2, 1PT (alternative to above) Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) 22-050-201 Thermo Scientific Manufacturer Number 72504
Slide Holders, 24-place VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 25608-868 Sakura®Finetek Supplier Number 4465; Available through multiple vendors
Specimen Tin Boxes, 1/2 oz VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 101412-452 Supplemental equipment for storage of brain tissue samples
Taylor 2-Event Digital Timer/Clock Multiple Vendors Supplemental equipment
Tissue-Tek Slide Staining Kit VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 25608-902 Sakura®Finetek Supplier Number 4551; Available through multiple vendors
TWEEN 80, Polyethylene glycol, 500 mL Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) P1754 Also available in 25 mL, 1 L and 1 G volumes
VWR FLIP Pipette Filler (0.05-100 mL) VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 53497-055
VWR Soft Nitrile Examination Gloves, L (100 per box) VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 89038-272 Supplemental equipment for proper PPE
Water, Deionized (20 L) VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 10806-022
Wheaton Clear Glass Sample Vials, 8 mL Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) 06-408C DWK Life Sciences Manufacturer Number 224884
White Coated, Double Well Pattern Microscope Slides, 14 mm Tekdon Incorporated (https://www.tekdon.com/coated-microscope-slides.html) 2-140
White Rectangular UN-rate Disposal Container, 5G Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/) 1147T01WHT Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Formalin)

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References

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  13. Khalid, A., Haque, A. Touch Impression Cytology Versus Frozen Section as Intraoperative Consultation Diagnosis. 2, (2004).

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Retraction अंक 146 निदान प्रत्यक्ष तेजी से इम्यूनोहिस्टोकेमिकल परीक्षण फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी परीक्षण lysavirus रेबीज प्राणि-विज्ञान
एक प्रत्यक्ष रैपिड इम्यूनोहिस्टोकेमिकल टेस्ट का उपयोग कर बढ़ी रेबीज निगरानी
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Patrick, E. M., Bjorklund, B. M.,… More

Patrick, E. M., Bjorklund, B. M., Kirby, J. D., Nelson, K. M., Chipman, R. B., Rupprecht, C. E. Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test. J. Vis. Exp. (146), e59416, doi:10.3791/59416 (2019).

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