Summary
直接急速免疫組織化学検査(DRIT)は、狂犬病診断のための直接蛍光抗体(DFA)検査に代わる世界動物衛生・世界保健機関(OIE/WHO)に代わる方法を提供しています。このテストは軽い顕微鏡を使用して脳の印象に約1時間で行うことができる分野ベースの適用を可能にする。
Abstract
ラボベースの監視は狂犬病の予防、制御および管理の努力のために不可欠である。DFAは狂犬病診断のゴールドスタンダードですが、特に開発途上国では狂犬病の監視を改善するための追加の診断技術を検証する必要があります。ここでは、DFA と比較して光顕微鏡を使用する代替、実験室またはフィールド ベースのテスト オプションとして DRIT の標準プロトコルを示します。疑わしい動物から採取された脳組織のタッチインプレッションは、10%緩衝ホルマリンで固定される。DRITは狂犬病ウイルス特異的モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体(ビオチンに結合)、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ酵素、およびクロモゲンレポーター(例えば、アセチル3-アミノ-9-エチルカルバゾール)を使用して、感染組織内のウイルス包含物を検出します。約1時間で、脳組織サンプルをDRITによってテストおよび解釈することができる。北米、アジア、アフリカ、ヨーロッパの様々な種から試験された疑わしい動物の脳の評価は、DRITがDFAと比較して100%に近づいていることで高い感度と特異性を示しています。2005年以来、米国農務省野生生物サービス(USDA WS)プログラムは、DRITを使用して大規模な強化狂犬病監視活動を実施し、戦略的狂犬病管理地域で野生生物から収集された94,000サンプルをテストし、94,000サンプルをテストしました。.DRITは狂犬病の診断のための強力で経済的な用具を提供し、現在の狂犬病の監視、予防および制御プログラムを世界的に改善するために実験室および分野生物学者によって使用することができる。
Introduction
DFAは、日常的な狂犬病診断1のために最も広く使用されているテストですが、蛍光顕微鏡の購入と維持のコストは、発展途上国2、3、4および広範なに制限することができます。大規模な強化狂犬病監視プログラム3,4 .さらに、DFAは、固定中にサンプルを冷蔵し、抗体抗原反応中に周囲温度以上のサンプルをインキュベートする能力を必要とし、適切なインフラのない国では大きなハードルとなる可能性があります。現代のDFA試験に関連する制限の一部により、狂犬病の世界的な影響は長い間過小評価されてきた5.
この点に関しては、特に開発途上国において、狂犬病の監視を世界的に改善するための追加の診断技術を検証する必要がある。ここで提示されるDRITプロトコルは軽い顕微鏡を使用し、テスト6の間に冷凍か実験室のインキュベーションを要求しないDFAに代わる実験室または分野ベースのテストの代わりを提供する。DRITとDFAは、両方の技術が潜在的に狂犬病の動物から収集された脳サンプルのタッチインプレッションを使用するという点で類似しています。しかし、DRITの最初のステップでは、狂犬病ウイルスを不活性化するサンプルの歴史的固定剤としてホルマリンを使用しています。これは、DFAプロトコル3のサンプルを固定するために使用されるアセトンに対して大幅なバイオセーフティの改善を提供します。現在までに、DRITはDFA2、7、8、9と同等の感度と特異性を示しています。
2005年以来、USDA WSプログラムは、包括的な野生動物狂犬病管理プログラム10の一環としてDRITを使用して、北米で大規模な強化狂犬病監視活動を実施してきました。強化された狂犬病の監視は、暴露ベースの公衆衛生監視とテストの補完として使用され、主に野生動物のメソ肉食動物種、アライグマ(プロシオンローター)、ストライプスカンク(メフィティスメフィティス)、灰色のキツネ(ウロシオン・シネレオアルジェンテウス、赤キツネ(ヴァルペス・ヴァルペス)、コヨーテ(カニス・ラトランス)は、ヒトまたは家畜の暴露に関与していない。テストで使用される動物の死体は、強化された狂犬病の監視努力を通じてUSDA WSに提出され、狂犬病ベクター種で構成されました:病気または奇妙な作用;死体、道路死亡、または迷惑が見つかりました。人間または家畜の暴露とは関連していません。DRITは狂犬病の調査を改善し、公衆衛生診断研究所の財政的負担と負荷を減らすために、研究室の経験がほとんどまたは全く訓練された分野生物学者によって採用することができる狂犬病診断テストを提供します 10.USDA WSフィールド従業員のための基本的なDRITトレーニングは、通常、バイオセーフティの基本的な原則、サンプル収集方法とDRITプロセスの方法、および>8 hをカバーする教室の指導の約4時間を含む1.5から2日かかります。テストを行う実験室の時間。トレーニングの機会は、疾病管理予防センター(CDC)、LYSSA LLC、およびウィスター研究所を通じて、USDA WSおよびプログラム協力者に提供されています。
戦略的管理分野では、USDA WSはDRITを使用して94,000以上の野生生物サンプルをテストし、疑わしい動物の暴露ベースの公衆衛生テストのみに依存して検出されなかった可能性が高い1,850以上の狂犬病のサンプルを検出しました。DRITの結果によって提供される強化された狂犬病の監視データは、米国全体の野生動物のための口腔狂犬病ワクチン接種プログラムをサポートするために、風景上の狂犬病のより完全な時間的および空間的表現を提供するために重要です10, 11.同様に、カナダの州の野生動物機関は、DRITを大規模な野生動物狂犬病の監視活動に組み込み、成功8を持つ公衆衛生プログラムと並行して取り組んでいます。USDA WSとカナダのDRIT監視プログラムの両方が、DFAによって狂犬病を確認し、適切な8としてウイルス変異型タイピングを実行するために、国家参照研究所を使用しています。さらに、USDA WSフィールド生物学者は、DFA確認のための陰性標本の10%を参照ラボに送り、2008年以来、標準の一部としてウィスコンシン州衛生研究所が提供する二年に一度のDRIT能力試験に参加しています。品質保証対策を実施します。
この方法の目的は、分散型の実験室、現場、または電子顕微鏡への日常的なアクセスのない領域で行うことができる狂犬病診断検査のための代替アプローチを提供することです。
Protocol
狂犬病診断検査を行う各人は、標準的な曝露前狂犬病ワクチン接種シリーズを受け取り、必要に応じてブースター免疫を伴う定期的な血清抗体評価を受けるべきである。予防接種を受けていない個人は、そのような作業が行われる実験室や領域に入ってはならない。組織およびスライドのすべての操作は、液体をエアロゾル化したり、空気中の粒子を生成しないように行われるべきです。ヒュームフードは必要ありませんが、可能な場合には、臭気、エクトパラサイト、および骨片から余分な保護を提供することができます。手袋や目の保護を含む最小限の個人用保護具は、サンプルの収集とテスト中に常に着用する必要があります。
1. ブレインステムコレクション
- 死体採取直後に脳幹サンプルを採取するか、死体が後で検査するまで冷凍庫に保管されていることを確認します。動物の死体が凍結されている場合は、収集を容易にするために、脳幹収集の前に周囲温度で解凍します。状況によっては、サンプルは凍結動物から直接採取されます。
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新たに採取された動物や周囲温度に解凍された動物の場合は、子宮頸椎を検査官に向かってわずかに回転させた平らな表面に動物のスパインを配置します。子宮頸椎の側面に対するアトラント後頭関節を同定する触診。
- まだ完全に凍結している死体の場合は、実用的であれば、上記のように動物のスフィンを配置します。のこぎり、ナイフ、骨せん断または同様の機器を使用して、頭部を体から完全に分離します。
注:1回限り使用しないすべての機器は、サンプル間で十分に洗浄する必要があります。
- まだ完全に凍結している死体の場合は、実用的であれば、上記のように動物のスフィンを配置します。のこぎり、ナイフ、骨せん断または同様の機器を使用して、頭部を体から完全に分離します。
- メスブレードを使用して、気管および食道を含む筋肉および軟部組織のすべての層を切断し、腹部の側面でアトラント後頭関節のレベルで切開を行う。頸椎椎の前部の側面を近似するまで続けます。凍結組織の場合は、メスブレードを使用して筋肉と軟部組織の残りの層を除去し、前頭骨を露出させます。
- 脳幹が見えるまで、動物の頭部をエンドレンジ延長に移動します。メスブレードを使用して、サンプリング用のすべての可視脳幹/中枢神経系(CNS)組織を除去します。凍結サンプルの場合は、メスブレードを使用して、頭蓋骨の内部からできるだけ多くの凍結脳幹/CNS組織を除去します。
- 脳幹サンプルを壊れない容器(金属のチントスズ、クライオバイアルなど)に入れ、それに応じてラベルを付けます。
- DRIT試験を介して収集直後に脳幹サンプルを検査し、試験前に最大24時間冷蔵(4°C)、またはサンプル収集後24時間以上の検査が行われるかどうかのテスト時まで凍結(-20°C)を確認してください。
2. DRIT用材料の準備
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スライド染色皿10枚の設定(図1)
注:染色皿はスライドの完全な浸漬を可能にするのに十分な深さである(直径96のmm、高さ72のmm、深さ42のmm、容積250 mL)。6- 10%リン酸緩衝ホルマリンで皿1を充填します。2 回のテスト実行後または毎週、ホルマリンを交換してください。
- 皿2、4、5をリン酸緩衝生理食生を1%の1%の12en-80(TPBS)で満たします。各テストの前に、新鮮な TPBS に置き換えます。
- 皿3を3%過酸化水素で満たします。各試験の前に過酸化水素を交換してください。
- 皿6、8、9、および10を蒸留水または脱イオン水で充填します。各テストの前に水を交換してください。
- ジルヘマトキシリン製剤で皿7を充填#2蒸留水6で1:1比で希釈した。2 回のテスト実行または毎週のテストの実行後にヘマトキシリンを交換します。.
注:CDC12によって開発された元のDRITプロトコルによると、逆染色が暗すぎる場合、水に対するギルスヘマトキシリンの1:2の比率が使用されてもよい。
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アミノエチルカルバゾール(AEC)ストックソリューションの調製
- ガラスピペットを使用して、5 mLのN-ジメチルホルミドをガラス容器に入れます。
- 3-アミノ-9-エチルカルバゾールの20mg錠剤を1錠加え、完全に溶解するまで振ります。瓶に「AEC在庫」と在庫が作られた日付にラベルを付けます。
注:AECのストックソリューションは、冷凍(4°C)の下で保存し、1〜2ヶ月間使用することができます。
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AEC作業希釈の準備
- 15 mL遠心管にアセテートバッファーの7 mLを追加します。
- ガラスピペットを使用して、遠心管にAECストック溶液の0.5 mLを追加します。
- チューブに3%過酸化水素の0.075 mLを追加します。
- 0.45 μmのシリンジフィルターを使用して、10 mLシリンジで溶液をろ過します。
注:AECの作業希釈は、2~3時間しか安定しており、各DRIT試験の直前に作成する必要があります。
3. 直接急速免疫組織化学試験
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ラベルガラス顕微鏡スライドは、スミアプルーフ、防水、永久インクマーカーを使用して、各標本に固有の番号を持つ。
- メスブレードを使用して、容器から脳幹を取り出し、ペーパータオルの上に置きます。2枚目のペーパータオルで過剰な液体、血液、または毛皮をそっとふくらまして、脳幹組織13だけを明らかにする。必要に応じて、脳幹組織を切り取って断面を明らかにする。
- 非常に穏やかに脳幹組織の断面に顕微鏡スライドに触れます。横運動なしでいくつかの点で脳幹にスライドをタッチして、脳幹の複数の領域をスライド13に転送できるようにします。細胞の1つまたは2つの層だけが穏やかなタッチで脳組織からスライドに移されることを確認してください。スライドに脳幹組織を貼り付けるために取り付け剤は必要ありません。各 DRIT 実行に正と負の両方のコントロールを含めます。
- スライドを室温で約5分間空気乾燥させます。
- スライドを10%バッファリングホルマリンに10分間浸します(皿1)。
- TPBS(皿2)の溶液中のホルマリンとディップリンスからスライドを取り外します。
- スライドを3%過酸化水素に10分間浸します(皿3)。
- 過酸化水素からスライドを取り出し、新鮮なTPBS(皿4)で浸す。余分な過酸化水素を除去した後、スライドを新鮮なTPBS(皿5)に入れ、他のスライドがTPBSに浸漬している間、一度に1つのスライドで作業します。
- TPBS(皿5)のスライドを一度に1つずつ取り、余分なバッファーを振り落とし、湿ったペーパータオルの上に置き、「湿度室」の基礎として、ラボのベンチに置きます。ピペットを使用して、CNS組織をカバーするために各スライドに十分な原発抗狂犬病ウイルス抗体をドロップします。湿度室で10分間スライドをインキュベートします(つまり、湿ったペーパータオルの上に置いている間に、ウェルプレートやその他のシンプルなカバーでスライドを覆います)(図2)。
- 湿度室からスライドを取り外し、余分なコンジュゲートを振ってブロットし、TPBSのスライドをディップリンスします(皿5で同じTPBSを再利用します)。
- 一度に1つのスライドで作業し、他の人がTPBSに浸漬している間 - CNS組織をカバーするのに十分なストレプトアビジンペルオキシダーゼ複合体をドロップするためにピペットを使用してください。室温で10分間湿度室でインキュベートします。
- 湿度室からスライドを取り外し、余分な複合体を振ってブロットし、TPBS(皿5)でスライドをすすいでください。
- 一度に1つのスライドで作業し、余分なバッファを振り落とし、他の人がTPBSに浸漬したままである間-十分なAECを落とすためにピペットを使用します(準備は上記で説明され、使用する直前に行われるべきです)CNS組織をカバーする必要があります。室温で10分間湿度室でインキュベートします。
- スライドを蒸留水(皿6)で浸す。
- スライドをギルス・ヘマトキシリン(蒸留水で希釈1:1)のカウンターステインに2分間置きます(皿7)。
- すぐに蒸留水(皿8)ですべてのスライドを浸す。毎回淡水で2回繰り返します(皿9と10)。
- 一度に1つのスライドで作業し、他の人が蒸留水(皿10)に浸漬したままである間、余分な水を振って消し、カバースリップを貼り付けるために水溶性の取り付け媒体を使用します。
- 20倍の目的を持つ小顕微鏡を使用して、スライドを表示し、詳細な検査が必要な場合は40倍の目的を見ます。
Representative Results
DRITからの肯定的な結果は青みを帯びた細胞体の細胞質内の形およびサイズ(図3)で変化することができる赤い細胞質内のウイルス包含物を示す。包含物は非常に明るい余白およびより集中的に染色された中央区域と滑らかに見える。強度および抗原分布は、包含物が検出されたときに記録されます。強度は+4から+1に等級付けされます。肯定的な制御スライドは+4の強さと呼ばれる強烈な、輝くマゼンタの輝きを持っている必要があります。特にサンプル処理が最適でない場合(サンプル組織がわずかに分解している)、これらは+3としてグレーディングする必要がある場合に、わずかな色の損失が発生する可能性があります。顕著に鈍い染色は+2から+1として等級付けされ、狂犬病ウイルス感染の診断とは見なされず、不確定として標識される。
さらに、抗原分布は+4から+1にグレードされ、+4はサイズと形状が変化する大小の包含物の豊富さで構成される抗原分布を表し、CNS組織内のあらゆる視野(またはほぼすべての分野)に存在する。タッチインプレッション。陽性対照は、通常、+4抗原分布を有する。+3 の抗原分布は、ほとんどの場合、すべての視野にさまざまなサイズの包含がある場合に割り当てられます。顕微鏡分野の10%~50%に含有物が見つかった場合、+2抗原分布が割り当てられます。顕微鏡分野の<10%に含有物が見つかった場合、+1抗原分布が割り当てられます。
狂犬病ウイルスを有するほとんどのCNS組織は、+3または+4強度および抗原分布として等級付けされた典型的なウイルス包含物を示す。結果が+2または+1強度または+2または+1抗原分布を示す場合、サンプルは「不確定」と宣言され、繰り返しテストが保証されます。同じサンプルに繰り返し不確定試験結果がある場合、サンプルはDFAまたは関連する確認試験のリファレンスラボに送られるべきです。
DRITを用いた試験サンプルは、CNS組織を含むスライドが200X以上の倍率でスキャンされ、典型的なウイルス包含物が検出されなかった後、狂犬病ウイルス抗原に対して陰性と見なされる(図4)。陰性サンプルは、非特異的染色をほとんどまたは全く伴う青みを帯びた細胞体を示す。
図1:試験用試薬を用いた10枚のスライド染色皿のセットアップ。皿はプロトコルに従うために必要な順序で試薬名でラベル付けされる。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:湿ったペーパータオルと細胞培養プレートで作られた単純な湿度室。 湿ったペーパータオルおよび細胞培養版を使用する簡単な湿気の部屋は分野ベースの適用を可能にする。 この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:+4強度および+4抗原分布を有する狂犬病陽性ウイルス包含物の代表的なスライド。(AおよびB)は、200倍の倍率で陽性狂犬病ウイルス包含を示す。 (CおよびD)は、400倍の倍率で陽性狂犬病ウイルス包含を示す。 スケールバー = 5 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:狂犬病ウイルス含有物のない陰性サンプルの代表的なスライド。(AおよびB)は、200倍の倍率で狂犬病ウイルス包含物に対して陰性のサンプルを示す。 (CおよびD)は、狂犬病ウイルス包含物に対して400倍の倍率で陰性のサンプルを示す。 スケールバー = 5 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:USDA WSが使用するDRIT試験施設の代表的な写真。(A) 輸送用の密閉されたトレーラー内のモバイル試験施設。(B) DRITテスト用に改造されたレクリエーション車両。(C) DRIT試験施設は、大学の研究室と連携しています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
DRITは、分散型実験室エリアで使用できる狂犬病ウイルスの存在を検出するためのフィールドベースの監視に適した柔軟な方法です。トラックのテールゲートなど、フィールドベースの設定で全体のテストを行うことは可能ですが、化学、機器、供給保管の問題により、DRIT専用の小さな室内空間を持つことが理想的です。さらに、適用されるすべての連邦法、州法、および地域の法律の遵守、および化学物質の使用と廃棄に関する規制を考慮する必要があります。現在、USDA WS には 17 の州のサンプルをテストする 15 の DRIT 施設があります。USDA WS DRIT施設は、大学および州の公衆衛生研究所と連携して設立され、より大きな施設内の指定された部屋や、改装され、モバイルテストユニットとして機能するように改造され、改造されたトレーラー内に設置されています。緊急発生時の緊急発生対応の場合、即時のターンアラウンドタイムで強化された狂犬病監視テストが重要です(図5)。
この検査は可変品質の脳幹材料を用いて成功しているが、組織分解のない新鮮な脳幹組織が最適である。分解、乾燥、または液化が起こると、サンプルの品質が低下し、試験は結果を混乱させる可能性のあるより多くの非特異的染色を検出する可能性があります。この観測値は、DFA と DRIT2の間で類似しています。脳幹/CNSは、できるだけ早く収集し、試験まで凍結(-20°C)保存する必要があります。
通常、ほとんどの USDA WS 施設は、DRIT セッション中に 12 ~ 24 スライドを一度に処理します。正と負のコントロールは、テストが成功したことを確認し、テスト スライドで解釈上の質問が発生するかどうかを確認するために、DRIT 実行の各基準点を提供します。サンプルが明確な正または負の結果を持っていると判断されない場合、それは不確定としてラベル付けされ、DRITによって2回目のテストを行います。このサンプルが 2 回の DRIT テストの後に明確な正または負でない場合は、DFA または関連するテストのリファレンス ラボに送信されます。
他の診断テストと同様に、「トラブルシューティング」は予期しない発見に役立ちます。たとえば、DRIT の実行が失敗した場合(つまり、正の対照は+3 または+4 の染色強度と抗原分布を示さない)、すべての化学物質および試薬の有効期限が切れていないことを確認します。新たに開いた過酸化水素のボトルを週に1回以上使用することは、脳組織の酸化による非特異的染色を防ぐのに役立つことがわかった。また、ラベル付けされた有効期限に関係なく、少なくとも年に1回はアセテートバッファーを交換することをお勧めします。
DFAに対するDRITの多くの利点には、低コスト、集中型実験室の外でテストを行う能力、蛍光顕微鏡の代わりに光顕微鏡検査の必要性、および比較的簡単なトレーニングプロセスが含まれ、DRITの多くの利点があります。テスト2、3、4を管理し、読む人々。これらの利点は、DFA2、7、8、9に匹敵するDRITの感度と特異性と相まって、テストが広いスケールで重要なツールとして機能することをすでに証明しています強化狂犬病監視プログラム8、北米で10。さらに、DRITは、特に最近のOIE/WHOガイダンスを推奨テストとして、開発途上国や限られた資源を持つ他の地域で、監視の増加と迅速なテストを可能にする可能性があります。
Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
我々は、現在または以前に強化された狂犬病の監視サンプルを収集し、狂犬病診断のためのDRITを実施したすべてのUSDA野生生物サービススタッフを認めます。同様に、我々は強化狂犬病監視コレクションで私たちを支援する多くの協力者を認めます。また、DRITの実施に必要な重要な試薬へのアクセスとトレーニングの機会を提供するために、疾病管理予防センターとウィスター研究所に感謝します。さらに、疾病管理予防センターとニューヨーク州保健省のワズワースセンターが提供する確認診断と技術支援に感謝します。商用製品の使用は比較のみを目的としており、推奨を構成するものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Amino-9-Ethylcarbazole (AEC tablets; 50 count) | Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) | A6926 | |
| Acetate Buffer, 0.1M, 5.2 pH, 32 oz | Poly Scientific R&D Corp. (https://www.polyrnd.com/) | s140 | |
| Ag Tek MiniScalpel, PN110, Non-sterile #10, 40 per package | Patterson Veterinary (https://www.pattersonvet.com/) | PN110 | Supplemental equipment for sample touch impressions; Also available through Clipper Distributing (http://www.clipperdist.net/) |
| BD Luer-Lok Disposable Syringe without needle, 10 cc | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 14-823-2A | BD Manufacturer Number 309604 |
| Binocular Light Microscope with Seidentopf Head or equivalent | Multiple Vendors | ||
| Blue Rectangular UN-rated Disposal Container, 5G | Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/) | 1147T01BLU | Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Gill hematoxylin and AEC solution) |
| Corning Square and Rectangular Cover Glass, 24x60 | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 12-553-465 | Corning Manufacturer Number 2975246 |
| Corning Universal Fit Pipet Tips: Racked, Nonsterile (1-200ul) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 07-200-300 | Corning Manufacturer Number 4863 |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes, polypropylene | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 14-959-70C | Corning Manufacturer Number 352097 |
| Falcon 96-Well Assay Plates (Tissue culture plate lids) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 08-772-5 | Corning Manufacturer Number 353910 |
| Fisher Brand 25mm Syringe Filter, Nylon, 0.45 μm, Sterile | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 09-719D | |
| Fisher Chemical Gill Method Hematoxylin Stain (Gill-2), 4L | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | CS401-1D | |
| Fisherbrand Sharps-A-Gator Point-of-Use Sharps Containers, 5 qt | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 14-827-122 | Supplemental equipment for proper BSL-2 Laboratory Set-Up |
| Fluoro-Gel with Tris Buffer (Gel/Mount Media), 20 mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 102092-122 | Fluoro-Gel Substitute for BioMeda™ Gel-Mount, Electron Microscopy Sciences |
| Formalin, Buffered, 10%, 4L | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | SF100-4 | Available each or in case of 4 |
| Gilson Pipetman P200 Pipet, 50-200 μL | Daigger Scientific (https://www.daigger.com) | EF9930E | |
| Hy-Clone Phosphate Buffered Saline, 1x Solution, 1 L (PBS) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | SH30256LS | Alternative dry powder product can be used |
| Hydrogen Peroxide, 3% | Multiple Vendors | Any commercially available source, such as pharmacy or store brands, etc. | |
| Lens Microscope Objective 20x and 40x | Multiple Vendors | ||
| Lysol IC Quarternary Disinfecting Cleaner, 1G | Daigger Scientific (https://www.daigger.com) | EF8481 | Supplemental materials for proper BSL-2 Laboratory disinfection |
| Miltex brand Disposable Scalpel Size 22 (alternative size to MiniScalpel) | AMD Next (www.amdnext.com) | 999112314 | Supplemental equipment for sample touch impressions; Alternative size to Ag Tek MiniScalpel |
| N,N-Dimethylformamide, Amber Glass Packaging, 500 mL | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | D119-500 | |
| Peroxidase Labeled Streptavidin, 50 mL | SeraCare (https://www.seracare.com/) | 5550-0001 | KPL Immunoassay and Kits Reference Number 71-00-38 |
| Phosphate Buffered Saline Powder (alternative to Fisher liquid PBS) | Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) | P3813 | Must be prepared in 1 L distilled water; Available in quantities of 1, 10 and 50 packs |
| Primary antibody: Polyclonal anti-nucleoprotein or cocktail of anti-lyssavirus biotinylated antibodies | Store at 4 °C | ||
| PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 1.0 mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 7078D-1 | VWR Manufacturer Number 89091-220 |
| PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 10.0 mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 7078D-10 | VWR Manufacturer Number 89091-106 |
| PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 5.0 mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 7078D-5 | VWR Manufacturer Number 89091-484 |
| Richard-Allan Scientific Gills Hematoxylin Stain No. 2, 1PT (alternative to above) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 22-050-201 | Thermo Scientific Manufacturer Number 72504 |
| Slide Holders, 24-place | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 25608-868 | Sakura®Finetek Supplier Number 4465; Available through multiple vendors |
| Specimen Tin Boxes, 1/2 oz | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 101412-452 | Supplemental equipment for storage of brain tissue samples |
| Taylor 2-Event Digital Timer/Clock | Multiple Vendors | Supplemental equipment | |
| Tissue-Tek Slide Staining Kit | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 25608-902 | Sakura®Finetek Supplier Number 4551; Available through multiple vendors |
| TWEEN 80, Polyethylene glycol, 500 mL | Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) | P1754 | Also available in 25 mL, 1 L and 1 G volumes |
| VWR FLIP Pipette Filler (0.05-100 mL) | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 53497-055 | |
| VWR Soft Nitrile Examination Gloves, L (100 per box) | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 89038-272 | Supplemental equipment for proper PPE |
| Water, Deionized (20 L) | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 10806-022 | |
| Wheaton Clear Glass Sample Vials, 8 mL | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 06-408C | DWK Life Sciences Manufacturer Number 224884 |
| White Coated, Double Well Pattern Microscope Slides, 14 mm | Tekdon Incorporated (https://www.tekdon.com/coated-microscope-slides.html) | 2-140 | |
| White Rectangular UN-rate Disposal Container, 5G | Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/) | 1147T01WHT | Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Formalin) |
References
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