Summary
직접 급속 면역 조직 화학 검사 (DRIT)는 광견병 진단을위한 직접 형광 항체 (DFA) 테스트에 대한 인식 대안 동물 보건 및 세계 보건 기구 (OIE / WHO)에 대한 세계 기구를 제공합니다. 이 시험은 가벼운 현미경 검사법을 사용하여 두뇌 노출에 따라 대략 1 시간에서 수행 될 수있는 필드 기반 응용 프로그램을 허용합니다.
Abstract
실험실 기반 감시는 광견병 예방, 제어 및 관리 노력에 필수적입니다. DFA는 광견병 진단을 위한 금본위제이지만, 특히 개발도상국에서 광견병 감시를 개선하기 위한 추가 진단 기법을 검증할 필요가 있습니다. 여기에서, 우리는 DFA에 비교된 가벼운 현미경 검사법을 사용하는 대안, 실험실 또는 필드 기지를 둔 시험 선택권으로 DRIT를 위한 표준 프로토콜을 제시합니다. 의심되는 동물에게서 수집된 뇌 조직의 터치 노출은 10% 완충포르닌에 고정되어 있습니다. DRIT는 광견병 바이러스 특이적 단일클론 또는 폴리클로날 항체(비오틴에 공액), 스트렙타비딘-과산화효소 효소 및 염색체 리포터(아세틸 3-아미노-9-에틸카르바졸)를 사용하여 감염된 조직 내의 바이러스 포함을 감지합니다. 대략 1 시간에서, 뇌 조직 견본은 DRIT에 의해 시험되고 해석될 수 있습니다. 북미, 아시아, 아프리카 및 유럽의 다양한 종에서 테스트된 의심스러운 동물 뇌에 대한 평가는 DFA에 비해 100%에 근접한 DRIT에 의한 높은 민감도 및 특이성을 보여주었습니다. 2005년부터 미국 농무부 야생동물 서비스(USDA WS) 프로그램은 DRIT를 사용하여 전략적 광견병 관리 지역에서 야생 동물에서 채취한 94,000개의 샘플을 테스트하기 위해 대규모 광견병 감시 활동을 수행했습니다. . DRIT는 현재 광견병 감시, 예방 및 제어 프로그램을 전 세계적으로 개선하기 위해 노동자 및 현장 생물학자가 사용할 수있는 광견병 진단을위한 강력하고 경제적 인 도구를 제공합니다.
Introduction
DFA는 일상적인 광견병 진단1에가장 널리 사용되는 시험이지만, 형광 현미경을 구입하고 유지하는 비용은 개발도상국 2,3,4 및 광범위, 대규모 강화 광견병감시 프로그램 3,4. 또한, DFA는 고정 중에 시료를 냉장 보관하고 항체 항원 반응 동안 주변 온도 이상으로 시료를 배양하는 능력을 필요로 하며, 이는 적절한 인프라가 없는 국가에서 중요한 장애물이 될 수 있다. 현대 DFA 테스트와 관련된 제한으로 인해 광견병의 글로벌 영향은 오랫동안5.
이와 관련하여, 특히 개발도상국에서 광견병 감시를 전 세계적으로 개선하기 위해 추가 진단 기술을 검증할 필요가 있습니다. 여기에 제시된 DRIT 프로토콜은 가벼운 현미경 검사를 사용하고 시험6도중 냉장 또는 실험실 배양을 요구하지 않는 DFA에 실험실 또는 필드 기지를 둔 시험 대안을 제안합니다. DRIT와 DFA는 두 기술이 잠재적으로 광견병 동물에서 수집 된 뇌 샘플의 터치 노출을 사용한다는 점에서 유사합니다. 그러나 DRIT의 첫 번째 단계는 광견병 바이러스를 비활성화하는 샘플에 대한 역사적 고정제로 포르말린을 사용합니다. 이는 DFA 프로토콜3에서샘플을 수정하는 데 사용되는 아세톤에 비해 상당한 생체 안전성 개선을 제공하며, 이는 실험실뿐만 아니라 현장 기반 또는 분산 형 실험실 환경에서도 더욱 중요합니다. 현재까지 DRIT는 DFA 2, 7,8,9와동일한 감도 및 특이성을 보여줍니다.
2005년부터 USDA WS 프로그램은 포괄적인 야생 동물 광견병 관리 프로그램10의일환으로 DRIT를 사용하여 북미 지역에서 대규모 광견병 감시 활동을 수행해 왔습니다. 강화된 광견병 감시는 노출 기지를 둔 공중 위생 감시및 너구리(Procyon 로터),줄무늬 스컹크 (Mephitismephitis),회색 여우를 포함하여 주로 야생 동물 메소 육식 동물을 테스트하기 위한 보완으로 사용됩니다. 우로시온 시네레오아르헨테우스,붉은여우(Vulpes vulpes),및 코요테(Canislatrans)는인간 또는 국내 동물 노출에 관여하지 않았다. 테스트에 사용되는 동물 시체는 강화 된 광견병 감시 노력을 통해 USDA WS에 제출되었으며 광견병 벡터 종으로 구성되었습니다: 아프거나 이상한 행동; 죽은 발견, 도로 살해, 또는 성가신; 인간 또는 국내 동물 노출과 관련이 없습니다. DRIT는 광견병 감시를 개선하고 공중 보건 진단 실험실의 재정적 부담과 작업 부하를 줄이기 위해 거의 또는 전혀 실험실 경험이없는 훈련 된 현장 생물학자에 의해 고용 될 수있는 광견병 진단 테스트를 제공합니다10. USDA WS 현장 직원을 위한 기본 DRIT 교육은 일반적으로 1.5~2일이 소요되며, 여기에는 생물 안전의 기본 원칙, 샘플 수집 방법 및 DRIT 프로세스를 다루는 약 4시간의 강의실 수업이 포함되며, 시험을 실시하는 실험실 시간. 미국 질병통제예방센터(CDC), LYSSA LLC 및 위스타 연구소를 통해 USDA WS 및 프로그램 협력자들에게 교육 기회를 제공하고 있습니다.
전략적 관리 영역 내에서 USDA WS는 DRIT를 사용하여 94,000개 이상의 야생 동물 샘플을 테스트했으며, 의심되는 동물의 노출 기반 공중 보건 테스트에만 의존하여 발견되지 않았을 가능성이 있는 1,850개 이상의 광채 샘플을 발견했습니다. DRIT 결과에 의해 제공되는 향상된 광견병 감시 데이터는 미국 전역의 야생 동물에 대한 구강 광견병 예방 접종 프로그램을 지원하기 위해 풍경에 광견병의 보다 완전한 시간적 공간 표현을 제공하는 데 중요합니다10, 11. 마찬가지로, 캐나다의 지방 야생 동물 기관은 DRIT를 대규모 야생 동물 광견병 감시 노력에 통합하여 공중 보건 프로그램과 협력하여 성공8. USDA WS와 캐나다 DRIT 감시 프로그램은 모두 DFA에 의해 광견병을 확인하고 적절한 8로바이러스 변종 입력을 수행하기 위해 국가 참조 실험실을 사용했다. 또한, USDA WS 현장 생물학자는 DFA 확인을 위해 부정적인 표본의 10%를 참조 실험실에 보내고 2008년부터 위스콘신 주 위생 연구소에서 제공하는 연례 DRIT 숙련도 테스트에 표준의 일환으로 참여했습니다. 품질 보증 조치를 취할 수 있습니다.
이 방법의 목표는 분산 된 실험실, 현장 또는 전자 현미경 검사법에 일상적으로 접근하지 않는 지역에서 수행 할 수있는 광견병 진단 테스트를위한 대체 접근 법을 제공하는 것입니다.
Protocol
광견병 진단 검사를 수행하는 각 사람은 표준 사전 노출 광견병 예방 접종 시리즈를 받아야하며 필요에 따라 부스터 예방 접종과 함께 정기적 인 혈청 학적 항체 평가를 받아야합니다. 면역이 없는 개인은 실험실이나 그러한 작업이 수행되는 지역에 들어가지 않아야 합니다. 조직과 슬라이드의 모든 조작은 액체를 에어로졸화하거나 공기 중 입자를 생성하지 않도록 수행해야합니다. 연기 후드는 필요하지 않지만 가능하면 냄새, 외기생충 및 뼈 조각으로부터 추가적인 보호를 제공 할 수 있습니다. 장갑과 눈 보호를 포함한 최소한의 개인 보호 장비는 샘플 수집 및 테스트 중에 항상 착용해야 합니다.
1. 뇌간 수집
- 시체 수집 즉시 뇌간 샘플을 수집하거나 시체가 나중에 테스트 될 때까지 보관을 위해 냉동실에 보관되도록하십시오. 동물 시체가 동결되면 뇌간 수집 전에 주변 온도에서 해동하여 수집의 용이성을 확인하십시오. 어떤 상황에서는, 샘플은 냉동 동물에서 직접 수집됩니다.
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갓 수집되거나 주변 온도로 해동된 동물의 경우, 자궁 경부 척추가 검사관쪽으로 약간 회전하면서 평평한 표면에 동물 척추를 놓습니다. 자궁 경부 척추의 측면 측면에 아틀란토 후두 관절을 식별하기 위해 palpate.
- 여전히 완전히 동결된 시체의 경우, 실용적인 경우 위에서 설명한 대로 동물 척추를 배치하십시오. 톱, 칼, 뼈 가위 또는 이와 유사한 장비를 사용하여 머리를 몸에서 완전히 분리하십시오.
참고: 일회용이 아닌 사용되는 모든 장비는 시료 간에 철저히 세척해야 합니다.
- 여전히 완전히 동결된 시체의 경우, 실용적인 경우 위에서 설명한 대로 동물 척추를 배치하십시오. 톱, 칼, 뼈 가위 또는 이와 유사한 장비를 사용하여 머리를 몸에서 완전히 분리하십시오.
- 메스 블레이드를 사용하여 복부 측면에서 아틀란토 - 귀각 관절의 수준에서 절개를하고 기관과 식도를 포함한 근육과 연조직의 모든 층을 절단합니다. 자궁 경부 척추 척추의 전방 측면을 근사할 때까지 계속합니다. 냉동 된 조직의 경우, 메스 블레이드를 사용하여 근육과 연조직의 나머지 층을 제거하여 포라멘 매그넘을 노출시하십시오.
- 뇌간이 보일 때까지 동물의 머리를 끝 범위 확장으로 이동합니다. 메스 블레이드를 사용하여 샘플링을 위해 눈에 보이는 뇌간/중추 신경계(CNS) 조직을 모두 제거합니다. 냉동 된 샘플의 경우, 두개골 내부에서 가능한 한 얼어 붙은 뇌간 / CNS 조직을 제거하기 위해 메스 블레이드를 사용합니다.
- 뇌간 샘플을 깨지지 않는 용기(즉, 금속 연고 주석, 저온 바이알 등)에 넣고 그에 따라 라벨을 붙입니다.
- 뇌간 시료는 DRIT 테스트를 통해 수집 직후, 시험 전 최대 24시간 동안 냉장(4°C) 또는 시료 채취 후 24시간 이상 테스트가 진행될 때까지 냉동(-20°C)을 검사해야 합니다.
2. DRIT를 위한 재료의 준비
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슬라이드 염색 접시 10개 설정(그림 1)
참고: 염색 요리는 슬라이드의 완전한 침지 (직경 96mm, 높이 72mm, 깊이 42mm, 볼륨 250mL)를 완벽하게 침지 할 수있을만큼 깊습니다. 6개- 접시 1을 10% 인산완충 포르말린으로 채웁니다. 2번의 테스트 실행 또는 매주 후 포르말린을 교체하십시오.
- 접시 2, 4, 5를 인산염 완충 식염수로 1% 트웬-80(TPBS)으로 채웁니다. 각 테스트 전에 신선한 TPBS로 교체하십시오.
- 과산화수소 3%로 접시 3을 채웁니다. 각 시험 전에 과산화수소를 교체하십시오.
- 증류수 또는 탈이온수로 접시 6, 8, 9 및 10을 채웁니다. 각 시험 전에 물을 교체하십시오.
- 증류수에서 1:1 비율로 희석된 #2 질스 헤마톡실린 제제로 접시 7을 채우면6. 2번의 테스트 실행 또는 매주 후 헤마톡실린을 교체하십시오.
참고: CDC12에의해 개발 된 원래 DRIT 프로토콜에 따르면, 카운터 스테인링이 너무 어두운 경우 물에 길스 헤마톡실린의 1:2 비율을 사용할 수 있습니다.
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아미노 에틸카르바졸(AEC) 스톡 솔루션 의 제조
- 유리 파이펫을 사용하여 N,N-디메틸포마미드 5 mL를 유리 용기에 놓습니다.
- 3-아미노-9-에틸카르바졸 20 mg 정제 를 넣고 완전히 녹을 때까지 흔들어 주세요. 항아리에 "AEC 스톡"과 주식이 만들어진 날짜를 레이블로 지정합니다.
참고: AEC 스톡 솔루션은 냉장(4°C)에 보관할 수 있으며 1-2개월 동안 사용할 수 있습니다.
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AEC 작업 희석의 준비
- 15 mL 원심 분리튜브에 7 mL의 아세테이트 버퍼를 추가합니다.
- 유리 파이펫을 사용하여 AEC 스톡 솔루션 0.5 mL를 원심 분리튜브에 추가합니다.
- 튜브에 과산화수소 3%의 0.075 mL를 추가합니다.
- 0.45 μm 주사기 필터를 사용하여 10 mL 주사기로 용액을 필터링합니다.
참고: AEC 작업 희석은 2-3 시간 동안만 안정적이기 때문에 각 DRIT 테스트 직전에 만들어야합니다.
3. 직접 급속 면역 화학 검사
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얼룩 방지, 방수, 영구 잉크 마커를 사용하여 각 시편에 고유한 번호로 유리 현미경 슬라이드를 레이블지정합니다.
- 메스 블레이드를 사용하여 용기에서 뇌간을 제거하고 종이 타월에 놓습니다. 두 번째 종이 타월로 체액, 혈액 또는 모피의 과잉을 부드럽게 제거하여 뇌간 조직13을드러냅니다. 필요한 경우 뇌간 조직을 단면을 드러내도록 합니다.
- 매우 부드럽게 뇌간 조직의 단면에 현미경 슬라이드를 터치합니다. 측면 운동없이 여러 지점에서 뇌간으로 슬라이드를 터치하여 뇌간의 여러 영역이 슬라이드(13)로옮겨질 수 있도록합니다. 1~2층의 세포만 뇌 조직에서 부드러운 터치로 슬라이드로 옮겨지도록 하십시오. 뇌간 조직을 슬라이드에 부착하기 위해 장착 제가 필요하지 않습니다. 각 DRIT 실행에 양수 및 음성 제어를 모두 포함합니다.
- 슬라이드를 실온에서 약 5분 간 공기 건조시키십시오.
- 10% 완충 된 포르말린에 슬라이드를 10 분 동안 담그십시오 (접시 1).
- TPBS (접시 2)의 용액에 포르말린에서 슬라이드를 제거하고 딥 린스.
- 슬라이드를 3% 과산화수소에 10분 동안 담그십시오(접시 3).
- 과산화수소에서 슬라이드를 제거하고 신선한 TPBS (접시 4)에서 딥 린스. 과산화수소를 제거한 후, 슬라이드를 신선한 TPBS(접시 5)에 놓고 한 번에 하나의 슬라이드로 작업하고 다른 슬라이드는 TPBS에 담근 상태로 유지됩니다.
- TPBS (접시 5)에서 슬라이드를 한 번에 하나씩 가져 와서 여분의 버퍼를 흔들어 서 '습도 챔버'의 기초로 실험실 벤치에 축축한 종이 타월에 놓습니다. 파이펫을 사용하여, CNS 조직을 커버하기 위해 각 슬라이드에 충분한 원발성 광견병 바이러스 항체를 떨어뜨린다. 실온에서 습도 챔버에서 10 분 동안 슬라이드를 인큐베이션 (즉, 잘 접시 또는 다른 간단한 커버로 슬라이드를 덮고 있는동안 습식 종이 타월에 누워있는 동안).
- 습도 챔버에서 슬라이드를 제거하고, 여분의 컨쥬게이트를 흔들어 서 블롯하고, TPBS에서 슬라이드를 찍어 헹구십시오 (접시 5에서 동일한 TPBS를 재사용).
- 한 번에 하나의 슬라이드로 작업하는 반면, 다른 슬라이드는 TPBS에 몰두하는 반면 - 피펫을 사용하여 CNS 조직을 덮을 만큼 스트렙타비딘-퍼옥시다아제 복합체를 떨어뜨립니다. 실온에서 10 분 동안 습도 챔버에 인큐베이션하십시오.
- 습도 챔버에서 슬라이드를 제거하고, 여분의 복잡한 을 흔들어 얼룩, TPBS (접시 5)에서 슬라이드를 찍어 헹구십시오.
- 한 번에 하나의 슬라이드로 작업하고, 다른 사람들이 TPBS에 침지 된 반면, 흔들어 서 과잉 버퍼를 얼룩 - 충분한 AEC를 드롭 파이펫을 사용하여 (준비는 위에서 설명하고 사용 직전에 수행해야합니다) CNS 조직을 커버하기 위해. 실온에서 10 분 동안 습도 챔버에 인큐베이션하십시오.
- 슬라이드를 증류수(접시 6)에 담그십시오.
- 미끄럼틀을 2분(접시 7)에 2분 동안 길스 헤마톡실린(증류수로 희석1:1)에 놓습니다.
- 즉시 증류수 (접시 8)에 모든 슬라이드를 찍어 헹구십시오. 매번 담수로 두 번 반복하십시오(요리 9와 10).
- 한 번에 하나의 슬라이드로 작업하는 반면, 다른 사람들은 증류수(접시 10)에 침지된 상태를 유지합니다 — 여분의 물을 흔들어서 얼룩지게 하고 수용성 장착 매체를 사용하여 커버 슬립을 부착합니다.
- 정밀 검사가 필요한 경우 20배 목표가 있는 경현미경을 사용하여 슬라이드를 보고 40배 의 목표를 볼 수 있습니다.
Representative Results
DRIT에서 긍정적 인 결과는 푸르스름한 세포체의 세포질 내에서모양과 크기가 다를 수 있는 적색 세포 내 바이러스 성 포함을 보여줍니다 (그림 3). 개재는 매우 밝은 여백과 덜 집중적으로 얼룩진 중앙 영역으로 매끄럽게 나타납니다. 포함물이 검출될 때 강도 및 항원 분포가 기록됩니다. 강도는 +4에서 +1로 등급이 매겨집니다. 긍정적 인 제어 슬라이드는 +4 강도라고 강렬한, 눈부신 마젠타 광채가 있어야합니다. 특히 샘플 처리가 최적이 아닌 경우(즉, 샘플 조직이 약간 분해됨) +3으로 등급이 매겨져야 하는 경우 색상이 약간 손실될 수 있습니다. 눈에 띄게 둔한 얼룩은 +2에서 +1로 등급이 매겨지며 광견병 바이러스 감염에 대한 진단으로 간주되지 않으며 불확정으로 표시됩니다.
또한, 항원 분포는 크기와 모양에 따라 다양하고 크고 작은 개재물이 풍부하게 포함된 항원 분포를 나타내는 +4에서 +1로 등급이 매겨지며, CNS 조직 내의 모든 분야(또는 거의 모든 분야)에 존재합니다. 터치 인상. 양성 대조군은 전형적으로 +4 항원 분포를 가한다. +3의 항원 분포는 대부분의 경우 보기 의 모든 필드에 다양한 크기로 포함될 때 할당됩니다. 현미경 필드의 10%-50%에서 포함이 발견되는 경우에, +2 항원 분포는 할당됩니다. 현미경 필드의 <10%에서 포함물이 발견되면 +1 항원 분포가 할당됩니다.
광견병 바이러스를 가진 대부분의 CNS 조직은 현재 +3 또는 +4 강도 및 항원 분포로 등급이 매겨진 전형적인 바이러스 성 포함을 전시한다. 결과가 +2 또는 +1 강도 또는 +2 또는 +1 항원 분포를 나타내는 경우, 샘플은 "불확정"으로 선언되고 반복 테스트가 보증됩니다. 동일한 샘플에 반복 불확정 테스트 결과가 있는 경우 샘플을 DFA 또는 관련 확인 테스트를 위해 참조 실험실로 보내야 합니다.
DRIT를 이용한 시험 샘플은 CNS 조직을 포함하는 슬라이드가 200X 이상의 배율로 스캔되고 일반적인 바이러스 포함이 검출되지 않은 후 광견병바이러스 항원에 대해 음성으로 간주됩니다(도 4). 음성 샘플은 비특이적 염색이 거의 또는 전혀 없는 푸르스름한 세포체를 나타낸다.
그림 1: 테스트를 위해 시약을 사용하면 슬라이드 염색 접시 10개 설치. 접시는 프로토콜을 따르는 데 필요한 순서대로 시약 이름으로 레이블이 지정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 젖은 종이 타월과 세포 배양 플레이트로 만든 간단한 습도 챔버. 젖은 종이 타월과 세포 배양 플레이트를 사용하는 간단한 습도 챔버는 현장 기반 응용 프로그램을 허용합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 광견병 양성 바이러스 포함의 대표적인 슬라이드 +4 강도 및 +4 항원 분포. (A 및 B)200배 배율로 양성 광견병 바이러스 성 개재를 보여준다. (C 및 D)400 배배에서 양성 광견병 바이러스 성 포함을 보여줍니다. 배율 막대 = 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 광견병 바이러스 성 포함이없는 부정적인 샘플의 대표 슬라이드. (A 및 B)광견병 바이러스 성 개재에 대한 음의 샘플을 200 배율로 표시합니다. (C 및 D)광견병 바이러스 성 개재에 대한 음의 샘플을 400배 배율로 표시합니다. 배율 막대 = 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: USDA WS에서 사용하는 DRIT 테스트 시설의 대표적인 사진. (A) 운송을 위해 동봉된 트레일러의 모바일 테스트 시설. (B) DRIT 테스트를 위해 개조된 레크리에이션 차량. (C) 대학 실험실과 함께 DRIT 테스트 시설. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
DRIT는 분산 된 실험실 지역에서 사용할 수있는 광견병 바이러스의 존재를 감지하기위한 현장 기반 감시에 적합한 유연한 방법입니다. 트럭의 테일게이트와 같은 현장 기반 환경에서 전체 테스트를 수행할 수 있지만 화학, 장비 및 공급 저장 문제로 인해 DRIT 전용의 작은 실내 공간을 마련하는 것이 이상적입니다. 또한 모든 해당 연방, 주 및 지역 법률 및 화학 물질 사용 및 폐기 규정을 준수해야 합니다. 현재 USDA WS에는 17개 주에서 샘플을 테스트할 수 있는 15개의 DRIT 시설이 있습니다. USDA WS DRIT 시설은 대학 및 주 공중 보건 실험실과 함께, 더 큰 시설 내의 지정된 객실 및 개조 및 모바일 테스트 장치로 개조 된 밀폐 된 트레일러에 설립됩니다. 즉각적인 처리 시간으로 향상된 광견병 감시 테스트가 중요한비상 사태 대응의 경우(그림 5).
테스트는 가변 품질의 뇌간 재료를 사용하여 성공적이었지만, 조직 분해가없는 신선한 뇌간 조직은 최적입니다. 분해, 탈수 또는 액화가 발생하면 샘플 품질이 저하되고 테스트결과 혼동할 수 있는 비특이적 염색을 감지할 수 있습니다. 이 관찰은 DFA와 DRIT2. 뇌간/CNS는 가능한 한 빨리 수집한 다음 시험할 때까지 냉동(-20°C)을 보관해야 합니다.
일반적으로 대부분의 USDA WS 시설은 DRIT 세션 동안 한 번에 12~24개의 슬라이드를 처리하며, 여기에는 DFA를 통해 확인된 하나의 포지티브 컨트롤과 하나의 네거티브 컨트롤이 포함됩니다. 양수 및 음성 컨트롤은 각 DRIT 실행에 대한 기준점을 제공하여 테스트가 성공했는지 확인하고 테스트 슬라이드에서 해석 질문이 발생하는지 확인합니다. 샘플이 명확한 양성 또는 음수 결과를 가지고 결정되지 않은 경우, 그것은 확정되지 않은 것으로 표시되고 DRIT에 의해 두 번째로 테스트됩니다. 이 샘플이 두 번의 DRIT 테스트 후 명확한 양성 또는 음수가 아닌 경우 DFA 또는 관련 테스트를 위한 참조 실험실로 보내집니다.
다른 진단 테스트와 마찬가지로 '트러블 슈팅'은 예기치 않은 발견에 유용합니다. 예를 들어 DRIT 실행이 실패하는 경우(즉, 양성 대조군이 +3 또는 +4 염색 강도 및 항원 분포를 나타내지 않음) 모든 화학 물질 및 시약이 만료되지 않았는지 확인합니다. 우리는 일주일에 한 번 적어도 한 번 과산화수소의 새로 열린 병을 사용하여 뇌 조직의 산화를 통해 비 특정 염색을 방지하는 데 도움이 발견. 또한 레이블이 지정된 만료 날짜에 관계없이 매년 최소 한 번 아세테이트 버퍼를 교체하는 것이 좋습니다.
DFA에 비해 DRIT의 장점은 낮은 비용, 중앙 집중식 실험실 외부에서 테스트를 수행 할 수있는 능력, 형광 현미경 대신 가벼운 현미경 검사법만 필요, 그리고 상대적으로 간단한 교육 과정을 포함 사람들은 시험 2,3,4를관리하고 읽는다. 이러한 장점은 DFA 2, 7,8,9에 필적하는 DRIT의 민감도 및 특이성과 결합되어 이미 테스트가 광범위한 측면에서 중요한 도구역할을 한다는 것을 입증했습니다. 향상된 광견병감시 프로그램 8, 10 북미. 또한 DRIT는 특히 최근 OIE/WHO 지침이 권장된 테스트 이후 개발 도상국 이나 제한된 자원을 가진 다른 지역에서 감시 를 강화하고 신속한 테스트를 할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 현재 또는 이전에 향상된 광견병 감시 견본을 수집하고 광견병 진단을 위한 DRIT를 실시한 모든 USDA 야생 동물 서비스 직원을 인정합니다. 마찬가지로, 우리는 향상된 광견병 감시 컬렉션으로 우리를 돕는 많은 협력업체를 인정합니다. 우리는 또한 DRIT를 수행하는 데 필요한 중요한 시약에 액세스하고 교육 기회를 제공하는 질병 통제 및 예방 센터와 Wistar 연구소에 감사드립니다. 또한, 우리는 질병 통제 및 예방 센터와 뉴욕 주 보건부와 워즈워스 센터에서 제공하는 확인 진단 및 기술 지원을 주셔서 감사합니다. 상업용 제품의 사용은 비교 목적으로만 사용되며 보증을 구성하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Amino-9-Ethylcarbazole (AEC tablets; 50 count) | Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) | A6926 | |
| Acetate Buffer, 0.1M, 5.2 pH, 32 oz | Poly Scientific R&D Corp. (https://www.polyrnd.com/) | s140 | |
| Ag Tek MiniScalpel, PN110, Non-sterile #10, 40 per package | Patterson Veterinary (https://www.pattersonvet.com/) | PN110 | Supplemental equipment for sample touch impressions; Also available through Clipper Distributing (http://www.clipperdist.net/) |
| BD Luer-Lok Disposable Syringe without needle, 10 cc | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 14-823-2A | BD Manufacturer Number 309604 |
| Binocular Light Microscope with Seidentopf Head or equivalent | Multiple Vendors | ||
| Blue Rectangular UN-rated Disposal Container, 5G | Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/) | 1147T01BLU | Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Gill hematoxylin and AEC solution) |
| Corning Square and Rectangular Cover Glass, 24x60 | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 12-553-465 | Corning Manufacturer Number 2975246 |
| Corning Universal Fit Pipet Tips: Racked, Nonsterile (1-200ul) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 07-200-300 | Corning Manufacturer Number 4863 |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes, polypropylene | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 14-959-70C | Corning Manufacturer Number 352097 |
| Falcon 96-Well Assay Plates (Tissue culture plate lids) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 08-772-5 | Corning Manufacturer Number 353910 |
| Fisher Brand 25mm Syringe Filter, Nylon, 0.45 μm, Sterile | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 09-719D | |
| Fisher Chemical Gill Method Hematoxylin Stain (Gill-2), 4L | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | CS401-1D | |
| Fisherbrand Sharps-A-Gator Point-of-Use Sharps Containers, 5 qt | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 14-827-122 | Supplemental equipment for proper BSL-2 Laboratory Set-Up |
| Fluoro-Gel with Tris Buffer (Gel/Mount Media), 20 mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 102092-122 | Fluoro-Gel Substitute for BioMeda™ Gel-Mount, Electron Microscopy Sciences |
| Formalin, Buffered, 10%, 4L | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | SF100-4 | Available each or in case of 4 |
| Gilson Pipetman P200 Pipet, 50-200 μL | Daigger Scientific (https://www.daigger.com) | EF9930E | |
| Hy-Clone Phosphate Buffered Saline, 1x Solution, 1 L (PBS) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | SH30256LS | Alternative dry powder product can be used |
| Hydrogen Peroxide, 3% | Multiple Vendors | Any commercially available source, such as pharmacy or store brands, etc. | |
| Lens Microscope Objective 20x and 40x | Multiple Vendors | ||
| Lysol IC Quarternary Disinfecting Cleaner, 1G | Daigger Scientific (https://www.daigger.com) | EF8481 | Supplemental materials for proper BSL-2 Laboratory disinfection |
| Miltex brand Disposable Scalpel Size 22 (alternative size to MiniScalpel) | AMD Next (www.amdnext.com) | 999112314 | Supplemental equipment for sample touch impressions; Alternative size to Ag Tek MiniScalpel |
| N,N-Dimethylformamide, Amber Glass Packaging, 500 mL | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | D119-500 | |
| Peroxidase Labeled Streptavidin, 50 mL | SeraCare (https://www.seracare.com/) | 5550-0001 | KPL Immunoassay and Kits Reference Number 71-00-38 |
| Phosphate Buffered Saline Powder (alternative to Fisher liquid PBS) | Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) | P3813 | Must be prepared in 1 L distilled water; Available in quantities of 1, 10 and 50 packs |
| Primary antibody: Polyclonal anti-nucleoprotein or cocktail of anti-lyssavirus biotinylated antibodies | Store at 4 °C | ||
| PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 1.0 mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 7078D-1 | VWR Manufacturer Number 89091-220 |
| PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 10.0 mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 7078D-10 | VWR Manufacturer Number 89091-106 |
| PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 5.0 mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 7078D-5 | VWR Manufacturer Number 89091-484 |
| Richard-Allan Scientific Gills Hematoxylin Stain No. 2, 1PT (alternative to above) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 22-050-201 | Thermo Scientific Manufacturer Number 72504 |
| Slide Holders, 24-place | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 25608-868 | Sakura®Finetek Supplier Number 4465; Available through multiple vendors |
| Specimen Tin Boxes, 1/2 oz | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 101412-452 | Supplemental equipment for storage of brain tissue samples |
| Taylor 2-Event Digital Timer/Clock | Multiple Vendors | Supplemental equipment | |
| Tissue-Tek Slide Staining Kit | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 25608-902 | Sakura®Finetek Supplier Number 4551; Available through multiple vendors |
| TWEEN 80, Polyethylene glycol, 500 mL | Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) | P1754 | Also available in 25 mL, 1 L and 1 G volumes |
| VWR FLIP Pipette Filler (0.05-100 mL) | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 53497-055 | |
| VWR Soft Nitrile Examination Gloves, L (100 per box) | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 89038-272 | Supplemental equipment for proper PPE |
| Water, Deionized (20 L) | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 10806-022 | |
| Wheaton Clear Glass Sample Vials, 8 mL | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 06-408C | DWK Life Sciences Manufacturer Number 224884 |
| White Coated, Double Well Pattern Microscope Slides, 14 mm | Tekdon Incorporated (https://www.tekdon.com/coated-microscope-slides.html) | 2-140 | |
| White Rectangular UN-rate Disposal Container, 5G | Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/) | 1147T01WHT | Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Formalin) |
References
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