Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

כרומוגניים היברידיזציה באתרו הכלי עבור אבחון הקשורות HPV וסרטן צוואר

Published: June 14, 2019 doi: 10.3791/59422
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1, 1, 1, 2, 2,3, 1,2
1Department of Pathology, Georges Pompidou European Hospital, Assistance publique - Hôpitaux de Paris (APHP), Paris Descartes University, 2Paris Cardiovascular Research Center (PARCC), Institut national de la santé et de la recherche médicale (Inserm) U970, 3Laboratory of Immunology, Georges Pompidou European Hospital, APHP, Paris Descartes University

Summary

וירוס הפפילומה האנושי (HPV) כרומוגניים בתוך היברידיזציה באתרו נחשב לאחד מתקני זהב לגילוי זיהום וירוס הפפילומה האנושי בתוך גידולים. זה מאפשר ויזואליזציה של HPV E6-E7 ביטוי mRNA עם לוקליזציה והערכה כמותית למחצה של האות שלה.

Abstract

נגיף הפפילומה האנושי (HPV) זיהום הוא גורם סיכון מרכזי עבור תת-סוג של קרצינומה של תאים לוע קשקשיים (OPSCC), אשר נוטה להיות משויך לתוצאה טובה יותר מאשר אלכוהול וטבק OPSCC הקשורות. כרומוגניים היברידיזציה באתרו (CISH) של ה-RNA נגיפי HPV יכול לאפשר את הערכה כמותית למחצה של תעתיקים ויראלי של חלבונים אונגניים E6 ו E7 ו הדמיה באתרו עם רזולוציה מרחבית טובה. טכניקה זו מאפשרת את האבחנה של זיהום פעיל עם ויזואליזציה של שעתוק HPV ב-HPV מוסרי מזוהם תאים. היתרון של טכניקה זו הוא הימנעות זיהום מתאי HPV הנגועים שאינם נאופלסטיים הסמוכים לגידול. בסך הכל, הופעות אבחנה טובה שלה יש את זה נחשב כסטנדרט הזהב לזיהוי זיהום HPV פעיל. מאז E6 ו E7 אינטראקציה חלבון ויראלי עם חלבונים תא pRb ו p53 הוא חובה עבור שינוי התא, HPV RNA CISH הוא רלוונטי מבחינה פונקציונלית ומשקף זיהום HPV אונגניים פעיל. טכניקה זו היא רלוונטית קלינית, כמו גם מאז "נמוך" או "גבוהה" התעתיק HPV רמות עזר זיהוי של שתי קבוצות פרוגנוזה בקרב HPV הקשורות p16-הראש והצוואר סרטן החולים. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול עבור HPV הידני RNA CISH ביצע על formalin-קבוע פרפין-מוטבע (FFPE) שקופיות עם ערכת שהתקבל מהיצרן. במקום ההתגלות כרומוגניים, RNA באתרו היברידיזציה ניתן גם לבצע עם גילוי פלורסנט (ה-RNA FISH). ניתן גם לשלב אותו עם כתמים קונבנציונליים.

Introduction

HPV RNA CISH הוא כלי רב עוצמה לאיתור זיהום HPV פעיל, אשר עשוי להוכיח קריטי נגעים שפירים או ממאירים במיקומים שונים כגון oropharynx או צוואר הרחם הרחם. זיהוי של זיהום HPV פעיל עשוי לתמוך באבחון של נגע HPV המושרה, ובכך, להשפיע על הטיפול והפרוגנוזה שלה.

HPV הוא זיהום המועברות באופן מיני התכוף ביותר, ויותר מ-100 גנוטיפים ויראליות תוארו1. באופן שונה, גנוטיפים בסיכון נמוך כגון גנוטיפים 6 ו -11 ידועים לגרום יבלות באברי המין, ונשנים הפפילומה הנשימה, נגעים שפירים אחרים, בעוד גנוטיפים בסיכון גבוה כגון גנוטיפים 16 וגם 18 אחראים לסרטן צוואר הרחם ביותר וסרטן אנאלי לשחק תפקיד ב-HNSCC אונגנזה בפרופורציות משתנה כפי שנספרו על ידי נתונים אפידמיולוגיים האזורית2.

כלים מספר זמינים לזיהוי של זיהום HPV. כמו זיהום HPV סיכון גבוה מוביל לביטוי של חלבונים אונגניים ויראלי E6 ו E73, זיהוי של E6 ו E7 התעתיקים הוא הוצג באופן נרחב כמו תקן זהב עבור הזיהוי הפעיל HPV זיהום4. HPV RNA CISH יכול להתבצע על דגימות FFPE כי הם די בקלות מתקבלים מחולים הסובלים ממחלות HPV הקשורות שונות. הביצועים שלו כבר הוערך ב neoplasia קשקשיים האפיתל בצוואר הרחם, את פי הטבעת, ואת הנרתיק, ו קרצינומה של תאים פולשנית בצוואר הרחם, פי הטבעת, ואתבמערכת העיכול העליון aerodigestive: היא משיגה רגישות של מעל 98% בין התגובה לשרשרת HPV DNA פולימראז (PCR)-מקרים חיוביים. זה קצת יותר טוב מאשר p16 כתמים (93%) ו-DNA HPV באתרו היברידיזציה (DNA ISH: 97%), אשר נפוצים יותר בשימוש. בקבוצה אחרת של 57 חולים עם קרצינומה של תאים קשקשיים (SCC) הנובעים מן הראש והצוואר, אזור איברי המין, העור, ואת דרכי השתן, לעומת HPV DNA ISH, HPV RNA CISH השיגה רגישות טובה יותר (100% לעומת 88%) וספציפיות (87% לעומת 74%)

P16 חיסוני הוא סמן עקיף המשקף מחזור התא שיבושים שעלולים להיגרם (אך לא באופן בלעדי) על ידי זיהום HPV4,7. זה מבחן חסכוני בעל רגישות טובה וערך ניבוי שלילי מומלץ כסמן פונדקאית של זיהום בסיכון גבוה HPV בסרטן oropharynx (OPC) על ידי המכללה לפתוקולוגים אמריקאי (CAP) ועל ידי האיחוד עבור הבינלאומי בקרת סרטן (UICC)8.

למרות הנייר הזה רק מתמקד בזיהוי של HPV ב HNSCC, HPV RNA CISH הוא רלוונטי קלינית בתנאים אחרים שונים הכרוכים זיהום HPV. למשל, טכניקה זו עשויה לשפר את הדיוק של האבחנה של נגעים בדרגה נמוכה האפיתל הפנימי של צוואר הרחם (LSIL, לשעבר המכונה הneoplasia הצוואר הצווארי, כיתה 1 [CIN1]) עבור מקרים דו-משמעיים מורפולוגית9. בנוגע לוע SCC, HPV RNA CISH מאפשר זיהוי של ה-HPV הקשורים SCC, המסומן בנפרד HPV-לא קשור לוע SCC במהדורה השמינית האחרונות של סיווג TNM של הראש והצוואר סרטן (של האיחוד לסרטן הבינלאומי שליטה [UICC])10. מאז scc הקשורות HPV מוצגים פרוגנוזה טובה יותר עם הישרדות ארוכה יותר הקרנות משופרות רגישות כימותרפיה מאשרHPV-שאינם קשורים,12,13, זיהוי של זיהום hpv עשוי להשפיע . ניהול החולה14,15 חוץ מזה, HPV RNA CISH יכול לשמש עבור האבחנה של קרצינומה של הקשורות HPV מרובת-הקשר עם אות גבוה יותר מאשר HPV DNA CISH16. כמה מנתח סטטיסטי מציע כי גילוי של E6 ו E7 התעתיקים מתואם עם פרוגנוזה טובה יותר לוע scc הכולל7,15,17,18 וב קבוצת המשנה של p16 חיובי לוע scc19,20.

כאן אנו מציגים את הפרוטוקול עבור HPV הידני RNA CISH ביצע על שקופיות FFPE עם ערכת שהתקבלו מן היצרן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקול מלווה בהנחיות אתיות ואושר על-ידי הוועדה האתית (קומיא-דה-הגנה-דס-פרבין-דה-פראנס-השני,2015-09-04).

1. הכנת החומרים

  1. הכנת מאגר כביסה של 1 x
    1. להכין 3 L של מאגר שטיפת 1 x על ידי הוספת 2.94 L של מים מזוקקים ובקבוק אחד (60 mL) של מאגר לשטוף (50x) (לראות את הטבלה של חומרים) על carboy גדול. . תערבב היטב
      הערה: מאגר הכביסה של 1x עשוי להיות מוכן לפני הזמן ומאוחסן בטמפרטורת החדר עד לחודש אחד.
  2. הכנת ריאגנטים נגד כתמים
    1. . הכן 50% המטאוקסילין
      1. בתוך משקה, הוסיפו 100 מ ל של המטאוקסילין האני (ראו את שולחן החומרים) עד 100 מ ל של מים מזוקקים בצלוחית מכתים.
        הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר בפתרון כתמים של 50% המטאוקסילין עד שבוע אחד.
    2. הכן 0.02% (w/v) מי אמוניה (מגיב כחול).
    3. בתוך מכסה המנוע, להוסיף 1.43 mL של 1 N אמוניום הידרוקסידי כדי 250 mL של מים מזוקקים בצילינדר בוגר או אחר מיכל. לאטום את הצילינדר עם סרט פרפין. מערבבים היטב את תוכנו עבור 3x – 5x.
      הערה: עבור כימות השימוש, חשוב להשתמש באמוניום הידרוקסידי. הריאגנטים יכול להיות מוכן לפני הזמן. ודא שכל המכלים נותרים מכוסים.
  3. הכנת מגיב לאחזור כיעד של 1x
    1. בגביע גדול, להוסיף 70 mL של 10 x היעד אחזור מגיב (לראות את הטבלה של חומרים) כדי 630 mL של מים מזוקקים.
    2. מניחים את הגביע על צלחת חימום עם מערבב מגנטי. . תכסה את זה ברדיד אלומיניום
    3. מרתיחים את תוכנו ב 100 ° c עבור 10 – 15 דקות.
      הערה: אל תתנו לו לרתוח יותר מ 30 דקות.
  4. מגיב בשפה מיכימית
    1. ודאו שהתנור הכלאה מופעל וב-40 ° c. מניחים לחות רטוב נייר בתחתית המגש.
      הערה: תנור הכלאה (עיין בטבלת החומרים) נדרש לצעדים 3.4 עד 4.2.
    2. הסר את ריאגנטים הגברה (AMP1 – AMP6, לראות את הטבלה של חומרים) מהמקרר ולשמור אותם בטמפרטורת החדר, לפחות 30 דקות לפני השלב הרלוונטי הדגירה.
    3. לפני כל שימוש, לחמם את המטרה ו/או בקרת הבדיקות לפחות 10 דקות ב 40 ° c בתנור או באמבט מים או בחממה.

2. שיפור והדבקה במנוע

הערה: הפעל את הפרוטוקול עם 3 – 5 מדגמים היסטלוגיים בעובי μm, המותקנים על שקופיות בלתי מוכתמות.

  1. על מנת לשפר את הדבקה, אופים את השקופיות ב-60 ° צ' עבור 1 h או ב 40 ° c לילה בתנור.
  2. טען את מתלה השקופיות באמצעות שקופיות היסטולוגית ללא כתמים. הישאב את מתלה השקופיות למשך 5 דקות בקסילן טרי הכלול במנה מכתימה, עם עצבנות מזדמנת. . אני חוזר עם קסילין טרי
  3. לטבול את מתלה השקופיות עבור 3 דקות טריות 100% אתנול הכלול בצלחת מכתים, עם עצבנות מתמדת. חזור עם חדש 100% אתנול.
  4. תנו לשקופיות להתייבש. בטמפרטורת חדר 2 דקות
    הערה: אל תעשה שימוש חוזר בריאגנטים לקבלת התייבשות של השקופיות לאחר הצורך.

3. טיפול מקדים ברקמה

הערה: צעדים אלה משלבים את ההמלצה "תקן" לפי הוראות היצרן לגבי דגימות ראש וצוואר. העיתוי של סעיפים 3.1 ו 3.2 צריך להיות מותאם בהתאם לרקמות מניפולציות.

  1. המצור על פעילות peroxidase
    1. הוסף 4 – 6 טיפות של מי חמצן (לראות את הטבלה של חומרים) על כל שקופית ו דגירה אותם 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. רוחצים את השקופיות 2x עבור 2 דקות במים מזוקקים בטמפרטורת החדר.
  2. שבירת הגבולות של RNA/רקמות
    1. עם טופר, להסיר את רדיד אלומיניום מתוך הרתיחה 1x היעד אחזור מגיב (TTR1x) מסעיף 1.3 ולהפסיק ערבוב. החלק את ארון השקופיות לאט ובזהירות רבה במשך 15 דקות. כסו שוב את הגביע עם רדיד האלומיניום.
      הערה: על הרותח להמשיך בשלב זה.
      התראה: השתמש בטופר כדי לטפל ברדיד האלומיניום ובמדף השקופיות כדי למנוע פציעות מכוויות. הקפידו ללבוש ציוד הגנה אישי מתאים, כגון כפפות וחלוק מעבדה.
    2. עם הציפורן, מיד להעביר את המתלה להחליק חם לאמבט מים מזוקקים ולשטוף אותו עבור 2 דקות.
      הערה: ודא שהדגימות אינן מTTR1x.
    3. שוטפים את השקופיות ב-100% אתנול במשך 2 דקות.
    4. תנו לשקופיות להתייבש בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.
  3. יצירת מכשול
    1. עם עט מחסום הידרופובי (ראה את שולחן החומרים), צייר מחסום סביב המדגם. . תנו לו להתייבש לפחות 5 דקות
      הערה: הניחו למכשול להתייבש באמת. אם זה מתפוגג במהלך ההליך, אל תהססו לצייר אותו שוב. הימנע לגעת ברקמה עם העט. הפרוטוקול יכול להיות מושהה לילה כאן.
  4. עיכול פרוטאז
    1. הצב את השקופיות על מדף השקופיות והוסף ~ 4 טיפות של פרוטאז פלוס לכל מדגם (ראה טבלת החומרים).
    2. כסו את מגש בקרת הלחות במכסה והכניסו אותו לתנור הכלאה במשך 30 דקות ב-40 ° c.
      הערה: כדי למנוע אידוי, ודא שידית הסיבוב מופעלת לחלוטין לתנוחת הנעילה.
    3. הסר את המגש מהתנור והסר את מתלה השקופיות.
    4. שקופית אחת בכל פעם, להסיר במהירות כל נוזל עודף ולמקם את השקופית במדף שקופית שקוע בתוך צלחת מכתים מלא מים מזוקקים.
    5. רוחצים את השקופיות 2x עבור 2 דקות במים מזוקקים בטמפרטורת החדר. . מתפרעים כל הזמן

4. הפעלת הסדר

הערה: אין להניח למקטעים להתייבש בין צעדי הדגירה.

  1. הכלאה של בדיקה HPV
    הערה: ודא כי הבדיקות מתחממות מראש כדי לפזר את כל המשקעים לפני השימוש. עבור שלב זה, במקום בדיקה HPV, peptidyl-prolyl-למחוק B (ppib) עבור בקרה חיובית או דיהידרוטסטוסטרון (דף העניינים) עבור שליטה שלילית (עיין בטבלה של חומרים) ניתן להשתמש גם.
    1. הקש ו/או גלול את השקופיות כדי להסיר כל נוזל עודף ולמקם אותן במדף השקופיות. הוסף ~ 4 טיפות של בדיקה HPV כדי לכסות לחלוטין כל מקטע.
    2. כסו את המגש במכסה והכניסו אותו לתנור במשך 2 מעלות ב 40 ° c.
      הערה: כדי למנוע אידוי, ודא כי התור נוב לחלוטין לתנוחת המנעול.
    3. הסר את המגש מהתנור והסר את מתלה השקופיות.
    4. שקופית אחת בכל פעם, להסיר במהירות כל נוזל עודף ולמקם את השקופית במדף שקופית שקוע בתוך צלחת מכתים מלא מאגר שטיפת 1x.
    5. שטוף את השקופיות ב-1x מאגר לשטוף עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר עם עצבנות מתמדת. חזור על הפעולה עם מאגר כביסה של 1x טרי.
  2. הכלאה של AMP1, AMP2, AMP3, ו AMP4
    הערה: השלבים הללו כוללים היברידיזציה בתנור הכלאה ו-AMP1 – AMP4 מתוך הקיט שנרכש (עיין בטבלת החומרים).
    1. הקש ו/או קפיצי כדי להסיר כל נוזל עודף מהשקופיות ולמקם אותם במדף השקופיות. הוסף ~ 4 טיפות של AMP1 כדי לכסות לחלוטין כל מקטע.
    2. כסו את המגש במכסה והכניסו אותו לתנור במשך 30 דקות ב- 40 ° c.
    3. הסר את המגש מהתנור והסר את מתלה השקופיות.
    4. שקופית אחת בכל פעם, להסיר במהירות כל נוזל עודף ולמקם את השקופית במדף שקופית שקוע בתוך צלחת מכתים מלא מאגר שטיפת 1x.
    5. שטוף את השקופיות ב-1x מאגר לשטוף עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר עם עצבנות מתמדת. חזור על הפעולה עם מאגר כביסה של 1x טרי.
    6. חזור על שלבים 4.2.1 – 4.2.5, אך השתמש ב-~ 4 טיפות של AMP2 במקום AMP1 ו-דגירה עבור 15 דקות ב 40 ° c. שטוף את השקופיות 2x עבור 2 דקות, שתי הפעמים במאגר לשטוף טרי.
    7. חזור על שלבים 4.2.1 – 4.2.5, אבל להשתמש ~ 4 טיפות של AMP3 במקום AMP1 ו-הדגירה עבור 30 דקות ב 40 ° c. שטוף את השקופיות 2x עבור 2 דקות, שתי הפעמים במאגר לשטוף טרי.
    8. חזור על שלבים 4.2.1 – 4.2.5, אך השתמש ב-~ 4 טיפות של AMP4 במקום AMP1 ו-דגירה עבור 15 דקות ב 40 ° c. שטוף את השקופיות 2x עבור 2 דקות, שתי הפעמים במאגר לשטוף טרי.
  3. הכלאה של AMP5 ו AMP6
    הערה: שלבים אלה אינם כוללים היברידיזציה בתנור אך הכלאה בטמפרטורת החדר. AMP5 ו AMP6 באים מערכת נרכש (לראות את הטבלה של חומרים).
    1. הקש ו/או גלול את השקופיות כדי להסיר כל נוזל עודף ולמקם אותן במדף השקופיות. הוסף ~ 4 טיפות של AMP5 כדי לכסות לחלוטין כל מקטע.
    2. מכסים את המגש עם מכסה ומכחדטה עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. שקופית אחת בכל פעם, להסיר במהירות כל נוזל עודף ולמקם אותו במדף שקופית שקוע בתוך צלחת מכתים מלא מאגר שטיפת 1x.
    4. שטוף את השקופיות ב-1x מאגר לשטוף עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר עם עצבנות מתמדת. חזור על הפעולה עם מאגר כביסה של 1x טרי.
    5. חזור על שלבים 4.3.1 – 4.3.4, אבל להשתמש ~ 4 טיפות של AMP6 במקום AMP5 ו דגירה עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר. שטוף את השקופיות 2x עבור 2 דקות, שתי הפעמים במאגר לשטוף טרי.

5. זיהוי אותות עם 3, 3 '-diaminobenzidine

זהירות: Diaminobenzidine (טיפה) הוא רעיל. עקוב אחר אמצעי הזהירות המתאימים והנחיות בטיחות בעת סילוק וטיפול זה כימית.

  1. מערבבים כמויות שוות של "שווי-A" ו-"מיקס" (ראו את טבלת החומרים) בצינור בגודל מתאים על ידי הרכבת אותו מספר טיפות של כל פתרון. הפוך ~ 120 μL של המצע הסיביות למקטע (~ 2 טיפות של כל מגיב/סך של 4). מערבבים היטב עבור 3x – 5x.
  2. קח כל שקופית, אחת בכל פעם, מארון השקופיות והקש ו/או קפיצי כדי להסיר את הנוזל העודף לפני הצבתו במדף השקופיות.
  3. הפיפטה ~ 120 μL של שיטה על כל מקטע של רקמה. ודא שהמקטעים מכוסים ומודגרות למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. היפטר מהתוספת הנותרת בהתאם לתקנה המקומית והכנס את השקופית לארון שקופיות שקוע בצלחת הצביעת המלאה במי ברז.

6. כתמים נגד

  1. הזז את מתלה השקופיות למנה מכתיבת המכילה 50% מהמטאוקסילין הפתרון, תן לו לנוח ב -30 שנות טמפרטורת החדר. שים לב שהשקופיות יהפכו לסגולים.
  2. העבר מיד את מתלה השקופיות חזרה למנה מכתימה המכילה מי ברז, ושטוף את השקופיות 3x – 5x על-ידי הזזת המארז למעלה ולמטה.
  3. המשיכו לחזור על שלב הכביסה עם מי ברז טריים עד שהשקופיות ברורות, ואילו מקטעים נשארים סגולים.
  4. החליפו את מי הברז בצלוחית הצביעת עם 0.02% אמוניה. הזז את המארז למעלה ולמטה 2x – 3x. שים לב שסעיף הרקמה אמור להפוך לכחול.
  5. החליפו את מי האמוניה במים מהברז. שטוף את השקופיות 3x – 5x.

7. התייבשות

  1. הזז את מתלה השקופיות למנה מכתימה המכילה 70% אתנול במכסה המנוע והנח לו 2 דקות בעצבנות מזדמנת.
  2. הזז את מתלה השקופיות למנה מכתים ראשונה המכילה 100% אתנול והנח לו לנוח 2 דקות עם עצבנות מזדמנת.
  3. הזז את מתלה השקופיות למנה מכתימה שנייה המכילה 100% אתנול והנח לו 2 דקות עם עצבנות מזדמנת.
  4. הזז את מתלה השקופיות למנה מכתימה המכילה את קסילין והנח לו לנוח 5 דקות עם עצבנות מזדמנת.

8. הרכבה שקופית

  1. הסר את השקופיות מארון התקשורת של השקופית והנח אותן שטוחות עם המקטעים הפונים למעלה במכסה המנוע.
  2. טעינת שקופית אחת בכל פעם על-ידי הוספת 1 טיפה של מדיום הרכבה מבוסס xylene לכל שקופית והצבת בזהירות 24 מ"מ x 50 מ"מ שמיכות על המקטע. הימנע מהשמנה של בועות אוויר.
  3. האוויר יבש את השקופיות עבור ≥ 5 דקות.

9. הערכה לדוגמא

  1. בדוק את מקטעי הרקמה תחת מיקרוסקופ רגיל ברייטפילד בהגדלה של 20x-40x.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כפי שמתואר כאן, בראש וצוואר קרצינומה של תאים קשקשיים, מקרה עשוי להיחשב חיובית בנוכחות של כתמים בצבע חום ומכתים בציטופלסמה או בגרעינים של תאים סרטניים. ברוב המחקרים, האות נחשב כ"חיובי" או "לא מזוהה"14. , דווחו שיטות למחצה של האות. אך חוסר סטנדרטיזציה בין צוותים לדוגמה, במחקרים מסוימים, האותות הבקיע כמו 1 + עם 1 – 3 נקודות לכל תא גידול, 2 + עם 4 – 9 נקודות לכל תא גידול, או 3 + עם 10 נקודות או יותר עבור תא הגידול6; בניתוחים שלאחר ההודעה, רק 2 + ו-3 + אותות, שהיו קלים יותר לפענוח, נלקחו בחשבון. במחקר אחר, התוצאות חולקו לשני ציונים: RNA CISH "גבוה" ו-RNA CISH "נמוך". RNA CISH "גבוהה" הציון הוגדר על ידי יותר מ 50% של תאים סרטניים ויטראז ', או על ידי צביעת כיסוי יותר מ 80% משטח התא (הגרעין והציטופלסמה) ב 30% לפחות של תאים סרטניים, כפי שנצפתה עם מטרה 20x (איור 1)21.

בנוגע לפקדים חיוביים, האות PPIB צריך להיות גלוי כנקודות בתוך גרעיני התא בהגדלה של 20x-40x. באשר עבור שקופיות בקרה שלילית, נקודה אחת לכל 10 תאים המציגים רקע מכתים לעיל לשדה מיקרוסקופ 20x מקובל.

Figure 1
איור 1: דוגמאות של "נמוך" ו-"גבוהה" כתמים בצורת RNA CISH. (A and B) RNA CISH "נמוך" הציון מכתים ב קרצינומה של תאים לוע קשקשיים. כתמים הוא נצפתה תחת 50% של תאים סרטניים מכסה פחות מ 80% משטח התא. (C ו -D) RNA cish "גבוהה" כתמים הציון לוע קשקשיים תא קרצינומה. כתמים הוא נצפתה יותר מ 50% של תאים סרטניים, במקרה זה, המשטח מכתים עולה 80% ביותר מ 30% מתאי הגידול. דמות זו השתנתה מאוגוסטין ואח '21אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HPV RNA CISH ביצע עם ערכת רכש הוא כלי רב עוצמה לאיתור תעתיקים ויראלי וזה מעיד על זיהום HPV פעיל. ביצוע ידני, השלבים של הפרוטוקול הם קלים לביצוע באופן כללי, והערכה שנרכשה היא נוחה. טכניקה זו מאפשרת כתמים של 19 דגימות היסטולוגית בתוספת שקופית אחת בקרה בבת אחת, ואת החישוב נמשך סביב 8 h. חשוב לא לתת לדגימות להתייבש בין שלבים אלא אם כן צוין אחרת. תנאי הטיפול הטרום צריך להיות מותאם בהתאם לרקמות מניפולציות.

HPV E6-E7 mRNA ביטוי האות מזוהה עם רזולוציה מרחבית מדויקת, ובכך לפסול את כל הזיהום מ-HPV נגועים תאים שאינם נאופלתים בסמוך לגידול. זיהוי של HPV E6 ו E7 RNA הוא רלוונטי מבחינה פונקציונלית מאז התעתיקים הללו נחוצים לשינוי התאים HPV המושרה באמצעות האינטראקציה שלהם עם p53 הסלולר וחלבונים pRb4. לכן, בנגעים טרום סרטניים של צוואר הרחם, HPV RNA CISH עשוי לעזור להפלות בדרגה נמוכה נגעים האפיתל (LSIL) מ בדרגה גבוהה נגעים האפיתל (HSIL) על פי לוקליזציה של האות: ברוב המקרים של LSIL, שופע גרעינים ויטראז ' מסומנים בעובי האפיתל, ומציינים שלב פורה. HSIL התערוכה או שופע גרעיני תא מוכתם באופן שטחי בשכבה שטחית, מקוקיים עם חזק הגרעינית cytoplasmic אותות בשכבה התחתונה (נגעים בעבר המכונה CIN2), או כתמים גרעיניים חזקה עם נקודות cytoplasmic במהלך העובי של האפיתל, המציין את השלב הטרנספורמטיבי של זיהום HPV (בנגעים בעבר הידוע בשם CIN3)22.

למרות שיש עדיין לא המלצה סטנדרטית עבור הערכה כמותית למחצה של האות, כמה סופרים לדווח על רלוונטיות קלינית מאז הערכה כמותית למחצה של HPV E6 ו E7 התעתיקים אפשרה זיהוי של שני התחזיות קבוצות בין מטופלים הקשורים HPV הקשורות21. זה כבר היסוד כי גילוי של ה-DNA HPV ללא E6 ו E7 התעתיקים או עם רמות נמוכות בלבד של E6 ו E7 התעתיקים יהיה לא רלוונטי מבחינה פונקציונלית וכי חולים כאלה צריך להיות במאגר עם חולים HPV-שליליים סרטן21, . עשריםואחד

לגבי מגבלות של הליך זה, זה היסוד כי כמה ימינליות cross לא ספציפיים עלול לקרות במקרים מסוימים, כפי שיערו על ידי Dreyer et.23 RNA cish לא יכול להיות מתאים לאפליה בין E6/E7 התעתיקים של RNA ו ויראלי דנ א, כמו הפרוטוקול כולל 100 מעלות צלזיוס הטיפול בחום, אשר חשוד לאפשר הנגיף DNA ויראלי23. זה נתמך על ידי התבוננות של שני סוגים של אותות במקרים חיוביים, כלומר כתמים חזקים בעיקר מקומי גרעיני תאי הגידול, כמו גם אות משובח בצורה פרטנית בציטופלסמה. כמו החללית בשימוש בפרוטוקול זה נקשר במיוחד HPV גנוסוגים 16 ו -18, אשר מעורבים ברוב המכריע של הקשורות HPV הקשורים4, מדי פעם מקרים hpv-הקשורים עלול להחמיץ RNA cish, או בגלל גנוסוגים מסוימים של hpv כי הם לא כלולים בגשוש, או בגלל מוטציות או מחיקות של אתרי כריכה פריימר. לבסוף, שיטה זו דורשת ריאגנטים ומכשירים יקרים ואינה נגישה בקלות בתרגול שגרתי.

עבור כל דוגמה, סך של שלושה סעיפים נחוצים: אחד כדי לבצע את שיטת ה-HPV, אחד עבור השליטה החיובית, ואחד עבור השליטה השלילית. כמו RNA הוא מולקולה שברירית ועלול להתדרדר לאורך זמן בדגימות FFPE, את האיכות של התעתיקים יש לבדוק עבור כל מדגם, באמצעות שליטה חיובית בדיקות כגון PPIB DNA בבימויו של רנ א פולימראז II RPB1 (Polr2a), או polyubiquitin-C (UBC) , שהם גנים של משק הגוף האנושי. יתר על כן, כאשר יש גישה כמותית למחצה, האות חייב להיות מנורמל כדי בקרת הגן הגנים בדיקה21. ניתן למצוא את השליטה החיובית המומלצת עבור כל רקמה בהוראות היצרן. עם זאת, מחקר שנערך לאחרונה מאשרת כי ביטוי mrna יכול להיות מכבש למד הן בדוגמאות פוטנציאליים ו רטרוספקטיבי, מראה רמות mrna דומה בין דגימות מ 2004 ו-2008. זה לטובת היושרה היחסית של mRNA לאורך זמן24. הבדיקה המומלצת הבקרה השלילית משמש כדי למנוע כתמים לא ספציפיים הוא קידוד גן חיידקי עבור דף.

כאן כרומוגניים באתרו היברידיזציה של HPV RNA מתואר כפי שבוצעה באופן ידני. טכניקה זו עשויה להתבצע גם באמצעות תיוג פלורסנט ו/או בשילוב עם כתמים חיסוני קונבנציונאלי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

CB: לוחות, סמינרים: MSD, עב מ, אסטרמקה, רושה

Acknowledgments

המחברים מודים למחלקה לפתולוגיה של הופטל יורוטן ז'ורז ' פומפידו ונקקר (לורייה שאמבולל, אלודי מישל, וגילג לפני); פלטפורמת היסטולוגיה של PARCC, הופטל יורוטן ז'ורז ' פומפידו (קורין Lesaffre); וירג קלארק לעריכת שפה; אלכסנדרה Elbakyan עבור התרומה שלה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hematoxylin solution, Gill No. 1 Merck GHS132
HybEZ Oven (110v) Advanced Cell Diagnostics Inc. 321710
HybEZ slide rack Advanced Cell Diagnostics Inc. 300104
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen Advanced Cell Diagnostics Inc. 310018
RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN Advanced Cell Diagnostics Inc. 322310 This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B
RNAscope 3-Plex Negative Control Probe Advanced Cell Diagnostics Inc. 320871 DAPB
RNAscope 3-Plex Positive Control Probe Advanced Cell Diagnostics Inc. 320861 PPIB
RNAscope H202 & Protease Plus Reagent Advanced Cell Diagnostics Inc. 322330 Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1
RNAscope Probe- HPV16/18 Advanced Cell Diagnostics Inc. 311121
RNAscope Target Retrieval Reagents Advanced Cell Diagnostics Inc. 322000
RNAscope Wash Buffer Reagents Advanced Cell Diagnostics Inc. 310091 Wash Buffer 50X x4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lowy, D. R., Schiller, J. T. Reducing HPV-associated cancer globally. Cancer Prevention Research.(Philadelphia, PA). 5 (1), 18-23 (2012).
  2. Laban, S., Hoffmann, T. K. Human Papillomavirus Immunity in Oropharyngeal Cancer: Time to Change the Game? Clinical Cancer Research. 24 (3), 505-507 (2018).
  3. Wiest, T., Schwarz, E., Enders, C., Flechtenmacher, C., Bosch, F. X. Involvement of intact HPV16 E6/E7 gene expression in head and neck cancers with unaltered p53 status and perturbed pRb cell cycle control. Oncogene. 21 (10), 1510-1517 (2002).
  4. Ndiaye, C., et al. HPV DNA, E6/E7 mRNA, and p16INK4a detection in head and neck cancers: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Oncology. 15 (12), 1319-1331 (2014).
  5. Mills, A. M., Dirks, D. C., Poulter, M. D., Mills, S. E., Stoler, M. H. HR-HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization. The American Journal of Surgical Pathology. 41 (5), 607-615 (2017).
  6. Mendez-Pena, J. E., Sadow, P. M., Nose, V., Hoang, M. P. RNA chromogenic in situ hybridization assay with clinical automated platform is a sensitive method in detecting high-risk human papillomavirus in squamous cell carcinoma. Human Pathology. 63, 184-189 (2017).
  7. Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV driven oropharyngeal cancers: Comparing p16 based algorithms with the RNAscope HPV-test. Oral Oncology. 62, 101-108 (2016).
  8. Lewis, J. S., et al. Human Papillomavirus Testing in Head and Neck Carcinomas: Guideline From the College of American Pathologists. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 142 (5), 559-597 (2018).
  9. Mills, A. M., Coppock, J. D., Willis, B. C., Stoler, M. H. HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization in the Diagnosis of Cervical Low-grade Squamous Intraepithelial Lesions (LSIL). The American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 192-200 (2018).
  10. El-Naggar, A., Chan, J. K. C., Grandis, J. R., Takata, T., Slootweg, P. J. WHO Classification of Head and Neck Tumours. , International Agency for Research on Cancer. Lyon, France. (2017).
  11. Ang, K. K., et al. Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer. The New England Journal of Medicine. 363 (1), 24-35 (2010).
  12. Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
  13. Outh-Gauer, S., et al. Immunotherapy in head and neck cancers: a new challenge for immunologists, pathologists and clinicians. Cancer Treatment Reviews. 65, 54-64 (2018).
  14. Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV-driven head and neck cancer with a single test in routine clinical practice. Modern Pathology. 28 (12), 1518-1527 (2015).
  15. Bishop, J. A., et al. Detection of Transcriptionally Active High-risk HPV in Patients With Head and Neck Squamous Cell Carcinoma as Visualized by a Novel E6/E7 mRNA In Situ Hybridization Method. The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1874-1882 (2012).
  16. Hsieh, M. -S., Lee, Y. -H., Jin, Y. -T., Huang, W. -C. Strong SOX10 expression in human papillomavirus-related multiphenotypic sinonasal carcinoma: report of 6 new cases validated by high-risk human papillomavirus mRNA in situ hybridization test. Human Pathology. 82, 264-272 (2018).
  17. Shi, W., et al. Comparative Prognostic Value of HPV16 E6 mRNA Compared With In Situ Hybridization for Human Oropharyngeal Squamous Carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 27 (36), 6213-6221 (2009).
  18. Kuo, K. -T., et al. The biomarkers of human papillomavirus infection in tonsillar squamous cell carcinoma—molecular basis and predicting favorable outcome. Modern Pathology. 21 (4), 376-386 (2008).
  19. Augustin, J., et al. Evaluation of the efficacy of the four tests (p16 immunochemistry, PCR, DNA and RNA In situ Hybridization) to evaluate a Human Papillomavirus infection in head and neck cancers: a cohort of 348 French squamous cell carcinomas. Human Pathology. , (2018).
  20. Jung, A. C., et al. Biological and clinical relevance of transcriptionally active human papillomavirus (HPV) infection in oropharynx squamous cell carcinoma. International Journal of Cancer. 126 (8), 1882-1894 (2009).
  21. Augustin, J., et al. HPV RNA CISH score identifies two prognostic groups in a p16 positive oropharyngeal squamous cell carcinoma population. Modern Pathology. , (2018).
  22. Evans, M. F., et al. HPV E6/E7 RNA In Situ Hybridization Signal Patterns as Biomarkers of Three-Tier Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade. PLOS ONE. 9 (3), e91142 (2014).
  23. Dreyer, J. H., Hauck, F., Oliveira-Silva, M., Barros, M. H. M., Niedobitek, G. Detection of HPV infection in head and neck squamous cell carcinoma: a practical proposal. Virchows Archiv. 462 (4), 381-389 (2013).
  24. Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. , (2017).

Tags

גנטיקה סוגיה 148 כרומוגניים היברידיזציה באתרו HPV תמלול ניתוח חצי כמותי ראש וצוואר סרטן E6 E7 RNA קרצינומה של תאים קשקשיים
כרומוגניים היברידיזציה באתרו הכלי עבור אבחון הקשורות HPV וסרטן צוואר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Outh-Gauer, S., Augustin, J.,… More

Outh-Gauer, S., Augustin, J., Mandavit, M., Grard, O., Denize, T., Nervo, M., Lépine, C., Rassy, M., Tartour, E., Badoual, C. Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis. J. Vis. Exp. (148), e59422, doi:10.3791/59422 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter