Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Chromogene in situ hybridisatie SS een hulpmiddel voor HPV-gerelateerde hoofd-en nek kankerdiagnose

Published: June 14, 2019 doi: 10.3791/59422
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1, 1, 1, 2, 2,3, 1,2
1Department of Pathology, Georges Pompidou European Hospital, Assistance publique - Hôpitaux de Paris (APHP), Paris Descartes University, 2Paris Cardiovascular Research Center (PARCC), Institut national de la santé et de la recherche médicale (Inserm) U970, 3Laboratory of Immunology, Georges Pompidou European Hospital, APHP, Paris Descartes University

Summary

Humaan papillomavirus (HPV) RNA chromogene in situ hybridisatie wordt beschouwd als een van de gouden normen voor actieve menselijke papillomavirus infectie detectie binnen tumoren. Het staat de visualisatie van HPV E6-E7 mRNA uitdrukking met localisatie en semiquantitative evaluatie van zijn signaal toe.

Abstract

Humaan papillomavirus (HPV) infectie is een belangrijke risicofactor voor een subtype van orofaryngeale plaveiselcel Cell carcinoom (OPSCC), die de neiging heeft te worden geassocieerd met een beter resultaat dan alcohol-en tabak-gerelateerde OPSCC. Chromogene in situ hybridisatie (CISH) van HPV virale RNA kan de semiquantitative evaluatie van virale transcripties van de oncogene eiwitten E6 en E7 en een in situ visualisatie met een goede ruimtelijke resolutie. Deze techniek maakt de diagnose van een actieve infectie met de visualisatie van de HPV-transcriptie in de tumorale HPV-geïnfecteerde cellen. Een voordeel van deze techniek is het vermijden van verontreiniging van nonneoplastic HPV-geïnfecteerde cellen grenzend aan de tumor. Globaal, heeft zijn goede diagnose prestaties het beschouwd als de gouden norm voor de actieve identificatie van de besmetting HPV te zijn. Sinds E6 en E7 virale eiwitinteractie met cel eiwitten pRb en p53 is verplicht voor cel transformatie, HPV RNA CISH is functioneel relevant en acuut weerspiegelt actieve oncogene HPV-infectie. Deze techniek is klinisch relevant en omdat "lage" of "hoge" HPV-transcriptie niveaus hielp de identificatie van twee prognose groepen onder HPV-gerelateerde P16-positieve hoofd-en nek kankerpatiënten. Hier presenteren we het protocol voorhand matige HPV-RNA CISH uitgevoerd op formaline-vaste paraffine-embedded (FFPE) dia's met een kit verkregen van de fabrikant. In plaats van chromogene revelatie, kan de kruising van RNA in situ ook met fluorescente revelatie (de vissen van RNA) worden uitgevoerd. Het kan ook worden gecombineerd met conventionele immunokleuring.

Introduction

HPV RNA CISH is een krachtig hulpmiddel voor de opsporing van actieve besmetting HPV, die van essentieel belang in goedaardige of kwaadaardige letsels op diverse plaatsen zoals orofarynx of de baarmoeder cervix kan blijken. De opsporing van een actieve HPV-infectie kan ondersteunen de diagnose van een HPV-geïnduceerde laesie en, daardoor, invloed zijn behandeling en prognose.

HPV is de meest voorkomende seksueel overdraagbare infectie, en meer dan 100 virale genotypen zijn beschreven1. Schematisch, laag-risico genotypen zoals genotypen 6 en 11 zijn gekend om genitale wratten, terugkomende Ademhalings papillomatosis, en andere goedaardige letsels te veroorzaken, terwijl de hoog-risico genotypen zoals genotypen 16 en ook 18 voor de meeste cervicale kanker verantwoordelijk zijn en anale kankers en spelen een rol in HNSCC oncogenese in variabele verhoudingen, zoals verantwoord door regionale epidemiologische gegevens2.

Verschillende tools zijn beschikbaar voor de opsporing van HPV-infectie. Als een hoog-risico HPV-infectie leidt tot de expressie van virale oncogene eiwitten E6 en E73, de detectie van E6 en E7 transcripten wordt alom gezien als de gouden standaard voor actieve HPV-infectie identificatie4. HPV RNA CISH kan worden uitgevoerd op FFPE monsters die vrij gemakkelijk zijn verkregen van patiënten die lijden aan verschillende HPV-gerelateerde ziekten. De prestaties zijn geëvalueerd in plaveiselcel epitheliale neoplasie in de baarmoederhals, de anus, en de vagina, en in invasieve plaveiselcel cel carcinoom in de baarmoederhals, de anus, en de bovenste aerodigestive Tract5: het bereikt een gevoeligheid van meer dan 98% onder de polymerasekettingreactie van DNA van HPV (PCR)-positieve gevallen. Dit is iets beter dan P16 immunokleuring (93%) en HPV DNA in situ kruising (het ISH van DNA: 97%), wat meer algemeen worden gebruikt. In een andere cohort van 57 patiënten met plaveiselcel cel carcinoom (SCC) die voortvloeien uit het hoofd-en nek-gebied, de genitale regio, de huid, en de urinewegen, in vergelijking met HPV-DNA-ISH, HPV RNA CISH bereikt een betere gevoeligheid (100% versus 88%) en specificiteit (87% versus 74%)6.

P16 immunokleuring is een indirecte marker reflecterende cel cyclus verstoring die kunnen worden veroorzaakt (maar niet uitsluitend) door HPV-infectie4,7. Deze kosteneffectieve test bezit een goede gevoeligheid en een negatieve voorspellende waarde en wordt aanbevolen als een surrogaat marker van een hoog risico HPV-infectie in orofarynx Cancer (OPC) door het College van Amerikaanse patholoog (GLB) en door de Unie voor internationale De controle van kanker (UICC)8.

Hoewel dit document zich uitsluitend op de opsporing van HPV in HNSCC concentreert, is HPV RNA CISH klinisch relevant in diverse andere voorwaarden die besmetting HPV impliceren. Bijvoorbeeld, kan deze techniek de nauwkeurigheid van de diagnose van low-grade plaveiselcel epitheliale letsels van de cervix (LSIL, vroeger genoemd geworden cervicale epitheliale neoplasie, rang 1 [CIN1]) voor morfologisch dubbelzinnige gevallen9verbeteren. Wat orofaryngeale SCC, HPV RNA CISH maakt de identificatie van HPV-gerelateerde SCC, gelabeld als onderscheiden van HPV-niet-verbonden orofaryngeale SCC in de recente achtste editie van de TNM classificatie van hoofd-en nek kanker (van de Unie voor internationale kanker Controle [UICC])10. Sinds HPV-gerelateerde SCC vertoont een betere prognose met een langere overleving en verbeterde radiotherapie en chemotherapie gevoeligheid dan HPV-niet-verbonden SCC11,12,13, de opsporing van HPV-infectie kan gevolgen hebben geduldig beheer14,15. Bovendien, HPV RNA CISH kan voor de diagnose van HPV-verwant multifenotypic sinonasal carcinoom met een hoger signaal worden gebruikt dan HPV DNA CISH16. Verschillende multivariate analyses suggereren dat de detectie van E6 en E7 transcripten gecorreleerd is met een betere prognose in orofaryngeale SCC overall7,15,17,18 en in de subgroep van P16-positieve orofaryngeale SCC19,20.

Hier presenteren we het protocol voorhand matige HPV RNA CISH uitgevoerd op FFPE dia's met een kit verkregen van de fabrikant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Het protocol volgt ethische richtsnoeren en is goedgekeurd door het ethisch comité (Comité-de-Protection-des-personnes Ile-de-France-II, #2015-09-04).

1. voorbereiding van de materialen

  1. Voorbereiding van 1x Wash buffer
    1. Bereid 3 L van 1x was buffer door toevoeging van 2,94 L gedestilleerd water en een fles (60 mL) van Wash buffer (50x) (Zie de tabel van materialen) aan een grote carboy. Meng goed.
      Opmerking: de 1x wassen buffer kan van tevoren worden voorbereid en opgeslagen bij kamertemperatuur voor maximaal 1 maand.
  2. Bereiding van counterstaining reagentia
    1. Bereid 50% hematoxyline.
      1. In een rook kap, voeg 100 mL van Kieuw hematoxyline I (Zie de tabel van materialen) tot 100 ml gedestilleerd water in een kleuring schotel.
        Opmerking: de 50% hematoxyline kleuring oplossing kan worden hergebruikt voor maximaal 1 week.
    2. Bereid 0,02% (w/v) ammoniakwater (blauwsel reagens).
    3. Voeg in de rook kap 1,43 mL 1 N ammoniumhydroxide toe aan 250 mL gedestilleerd water in een afgestudeerde cilinder of een andere container. Seal de cilinder met paraffine folie. Meng de inhoud goed voor 3x-5x.
      Nota: voor analyse kwantificatie, is het essentieel om ammoniumhydroxyde te gebruiken. De reagentia kunnen van tevoren worden voorbereid. Zorg ervoor dat alle containers gedekt blijven.
  3. Voorbereiding van 1x target retrieval reagens
    1. In een grote beker, voeg 70 mL van 10x target retrieval reagens (Zie de tabel van materialen) tot 630 ml gedestilleerd water.
    2. Plaats het bekerglas op een verwarmingsplaat met een magneetroerder. Bedek het met aluminiumfolie.
    3. Kook de inhoud bij 100 °C voor 10 – 15 min.
      Let op: laat het niet koken voor meer dan 30 minuten.
  4. Reagens evenwicht
    1. Zorg ervoor dat de hybridisatie oven is op en op 40 ° c. Plaats natte bevochtigen papier aan de onderkant van de lade.
      Opmerking: een hybridisatie oven (Zie de tabel van materialen) is nodig voor de stappen 3,4 tot 4,2.
    2. Verwijder de versterking reagentia (AMP1-AMP6, zie de tabel van materialen) uit de koelkast en bewaar ze bij kamertemperatuur, ten minste 30 minuten voor de relevante incubatie stap.
    3. Verwarm vóór elk gebruik het doelwit en/of de controle sondes gedurende ten minste 10 min bij 40 °C in de oven of in een waterbad of incubator.

2. adhesie verbetering en deparaffinization in de rook kap

Nota: begin het protocol met 3-5 µm-dikke histologische steekproeven die op ongekleurde dia's worden opgezet.

  1. Om de hechting te verbeteren, bak de dia's bij 60 °C voor 1 h of bij 40 °C overnachting in een oven.
  2. Laad de dia rack met onbevlekt histologische dia's. Dompel de dia rek voor 5 min in verse xyleen in een kleuring schotel, met af en toe agitatie. Herhaal met verse xyleen.
  3. Dompel de dia rek voor 3 min in verse 100% ethanol in een kleuring schotel, met constante agitatie. Herhaal met verse 100% ethanol.
  4. Laat de dia's 2 minuten drogen bij kamertemperatuur.
    Opmerking: niet hergebruiken deparaffinization reagentia voor uitdroging van de dia's na de assay.

3. weefsel voor behandeling

Opmerking: deze stappen volgen de "standaard" voor behandeling aanbeveling volgens de instructies van de fabrikant voorhoofd-en nek monsters. De timing van de afdelingen 3,1 en 3,2 kan nodig zijn om te worden aangepast, afhankelijk van het gemanipuleerde weefsel.

  1. Blokkade van peroxidase activiteit
    1. Voeg 4 – 6 druppels waterstofperoxide (Zie de tabel van materialen) aan elke dia en broeden ze voor 10 min bij kamertemperatuur.
    2. Was de dia's 2x voor 2 min in gedistilleerd water bij kamertemperatuur.
  2. Breuk van RNA/weefsel grenzen
    1. Met een klauw, verwijder de aluminiumfolie van de kokende 1x target retrieval reagens (TTR1x) uit punt 1,3 en stop roeren. Dompel het schuif rek langzaam en zeer zorgvuldig voor 15 min. Bedek het bekerglas weer met de aluminiumfolie.
      Nota: het sudderen moet tijdens deze stap voortduren.
      Let op: gebruik de klauw om de aluminiumfolie en de dia rek te manipuleren om te voorkomen dat brandwonden. Zorg ervoor dat u een goede persoonlijke beschermingsmiddelen, zoals handschoenen en een lab jas dragen.
    2. Met de klauw, onmiddellijk de overdracht van de Hot Slide rack naar een gedistilleerd waterbad en was het voor 2 minuten.
      Opmerking: Zorg ervoor dat de monsters niet afkoelen in de TTR1x.
    3. Was de dia's in verse 100% ethanol voor 2 min.
    4. Laat de dia's 2 minuten drogen bij kamertemperatuur.
  3. Barrière creatie
    1. Met een hydrofobe barrière pen (Zie de lijst van materialen), teken een barrière rond het monster. Laat het uitdrogen op ten minste 5 minuten.
      Opmerking: laat de barrière om echt uitdrogen. Als het verslijt tijdens de procedure, aarzel dan niet om opnieuw te tekenen. Vermijd het aanraken van het weefsel met de pen. Het protocol kan hier 's nachts worden onderbroken.
  4. Protease spijsvertering
    1. Plaats de dia's op het rek van de dia en voeg ~ 4 dalingen van protease plus per steekproef toe (Zie de lijst van materialen).
    2. Bedek de luchtvochtigheid controle lade met een deksel en plaats deze in de hybridisatie oven voor 30 min bij 40 ° c.
      Opmerking: om verdamping te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat de draaiknop volledig naar de vergrendelpositie wordt gedraaid.
    3. Verwijder de lade uit de oven en verwijder de dia rek.
    4. Een dia op een moment, snel verwijderen overtollige vloeistof en plaats de dia in een dia rek ondergedompeld in een kleuring schotel gevuld met gedistilleerd water.
    5. Was de dia's 2x voor 2 min in gedistilleerd water bij kamertemperatuur. Schud constant.

4. het uitvoeren van de assay

Opmerking: laat geen secties uitdrogen tussen de incubatie stappen.

  1. Kruising van de sonde HPV
    Opmerking: Zorg ervoor dat de sondes zijn voorverwarmd om eventuele neerslag te ontbinden voorafgaand aan het gebruik. Voor deze stap, in plaats van HPV sonde, peptidyl-prolyl isomerase B (PPIB) voor positieve controle of dihydrodipicolinate REDUCTASE (DAPB) voor negatieve controle (Zie de lijst van materialen) kan ook worden gebruikt.
    1. Tik en/of veeg de dia's om overtollige vloeistof te verwijderen en plaats ze in de dia rek. Voeg ~ 4 druppels HPV-sonde om volledig te dekken elke sectie.
    2. Bedek de lade met een deksel en plaats deze in de oven voor 2 uur bij 40 °c.
      Nota: om verdamping te verhinderen, zorg ervoor de draai NOB volledig aan de slot positie wordt gedraaid.
    3. Verwijder de lade uit de oven en verwijder de dia rek.
    4. Een dia op een moment, snel verwijderen overtollige vloeistof en plaats de dia in een dia rek ondergedompeld in een kleuring schotel gevuld met 1x wassen buffer.
    5. Was de dia's in 1x was buffer voor 2 min bij kamertemperatuur met constante agitatie. Herhaal dit met verse 1x was buffer.
  2. Kruising van AMP1, AMP2, AMP3, en AMP4
    Nota: deze stappen omvatten kruising in de hybridisatie oven en AMP1-AMP4 van de gekochte uitrusting (Zie de lijst van materialen).
    1. Tik en/of veeg om overtollige vloeistof te verwijderen uit de dia's en plaats ze in de dia rek. Voeg ~ 4 druppels AMP1 volledig te dekken elke sectie.
    2. Bedek de lade met een deksel en plaats deze in de oven voor 30 min bij 40 ° c.
    3. Verwijder de lade uit de oven en verwijder de dia rek.
    4. Een dia op een moment, snel verwijderen overtollige vloeistof en plaats de dia in een dia rek ondergedompeld in een kleuring schotel gevuld met 1x wassen buffer.
    5. Was de dia's in 1x was buffer voor 2 min bij kamertemperatuur met constante agitatie. Herhaal dit met verse 1x was buffer.
    6. Herhaal stap 4.2.1 – 4.2.5, maar gebruik ~ 4 druppels AMP2 in plaats van AMP1 en incubeer gedurende 15 min bij 40 °c. Was de dia's 2x voor 2 min, beide keren in verse was buffer.
    7. Herhaal stap 4.2.1 – 4.2.5, maar gebruik ~ 4 druppels AMP3 in plaats van AMP1 en incubeer gedurende 30 min bij 40 °c. Was de dia's 2x voor 2 min, beide keren in verse was buffer.
    8. Herhaal stap 4.2.1 – 4.2.5, maar gebruik ~ 4 druppels AMP4 in plaats van AMP1 en incubeer gedurende 15 min bij 40 °c. Was de dia's 2x voor 2 min, beide keren in verse was buffer.
  3. Kruising van AMP5 en AMP6
    Nota: deze stappen omvatten geen kruising in de oven maar kruising bij kamertemperatuur. AMP5 en AMP6 komen uit de gekochte Kit (Zie de tabel van de materialen).
    1. Tik en/of veeg de dia's om overtollige vloeistof te verwijderen en plaats ze in de dia rek. Voeg ~ 4 druppels AMP5 volledig te dekken elke sectie.
    2. Bedek de lade met een deksel en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Een dia op een moment, snel verwijderen overtollige vloeistof en plaats deze in een dia rack ondergedompeld in een kleuring schotel gevuld met 1x wassen buffer.
    4. Was de dia's in 1x was buffer voor 2 min bij kamertemperatuur met constante agitatie. Herhaal dit met verse 1x was buffer.
    5. Herhaal stappen 4.3.1 – 4.3.4, maar gebruik ~ 4 druppels AMP6 in plaats van AMP5 en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Was de dia's 2x voor 2 min, beide keren in verse was buffer.

5. signaal detectie met 3, 3 '-diaminobenzidine

Let op: Diaminobenzidine (DAB) is giftig. Volg de nodige voorzorgsmaatregelen en veiligheidsrichtlijnen bij het verwijderen en hanteren van deze chemische stof.

  1. Meng gelijke volumes van DAB-A en DAB-B (Zie de tabel van materialen) in een passende grootte buis door het doseren van hetzelfde aantal druppels van elke oplossing. Maak ~ 120 µ L van schar substraat per sectie (~ 2 druppels van elk reagens/totaal van 4). Meng het goed voor 3x-5x.
  2. Neem elke dia, een voor een, van de dia rek en tik en/of flick om de overtollige vloeistof te verwijderen voordat u deze in de dia rek.
  3. Pipetteer ~ 120 l van schar op elke tissue sectie. Zorg ervoor dat de secties zijn gedekt, en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Gooi de resterende schar volgens de lokale regelgeving en steek de dia in een dia rek ondergedompeld in een kleuring schotel gevuld met leidingwater.

6. Counterstaining

  1. Verplaats de dia rek naar een kleuring schotel met 50% hematoxyline kleuring oplossing laat het rusten voor 30 s bij kamertemperatuur. Merk op dat de dia's paars zullen worden.
  2. Breng onmiddellijk de dia rack terug naar een kleuring schotel met leidingwater, en was de dia's 3x-5x door het verplaatsen van het rek op en neer.
  3. Houd het herhalen van de wassen stap met vers leidingwater tot de dia's zijn duidelijk, terwijl de secties blijven paars.
  4. Vervang het leidingwater in de kleur schaal met 0,02% ammoniakwater. Verplaats het rek op en neer 2x – 3x. Merk op dat de tissue sectie blauw moet draaien.
  5. Vervang het ammoniakwater met leidingwater. Was de dia's 3x-5x.

7. uitdroging

  1. Verplaats de dia rek naar een kleuring schotel met 70% ethanol in de rook kap en laat het rusten voor 2 minuten met af en toe agitatie.
  2. Verplaats de dia rek naar een eerste kleuring schotel met 100% ethanol en laat het rusten voor 2 min met af en toe agitatie.
  3. Verplaats de dia rek naar een tweede kleuring schotel met 100% ethanol en laat het rusten voor 2 min met af en toe agitatie.
  4. Verplaats de dia rek naar een kleuring schotel met xyleen en laat het rusten voor 5 min met af en toe agitatie.

8. Schuif montage

  1. Verwijder de dia's uit de dia rek en leg ze plat met de secties naar boven in de rook kap.
  2. Mount een dia op een moment door toevoeging van 1 druppel van een xyleen-gebaseerde montage medium aan elke dia en zorgvuldig plaatsen van een 24 mm x 50 mm dekglaasje over de sectie. Vermijd het vangen van luchtbellen.
  3. Lucht-droog de dia's voor ≥ 5 min.

9. sample evaluatie

  1. Onderzoek de weefselsecties onder een standaard helderveld Microscoop bij 20x-40x vergroting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Zoals hier beschreven, in hoofd en nek plaveiselcel cel kanker, een zaak kan worden beschouwd als positief in de aanwezigheid van bruine punctiform kleuring in het cytoplasma of in de kernen van tumorcellen. In de meeste studies, wordt het signaal beschouwd als ofwel "positief" of "niet gedetecteerd"14. Methoden van semiquantification van het signaal zijn gemeld, maar gebrek aan standaardisatie tussen teams. Bijvoorbeeld, in sommige studies, werden de signalen gescoord als 1 + met 1-3 dots per tumor cel, 2 + met 4-9 dots per tumor cel, of 3 + met 10 stippen of meer per tumor cel6; in de post-hoc-analyses werd rekening gehouden met slechts 2 + en 3 + signalen, die gemakkelijker te interpreteren waren. In een andere studie, werden de resultaten verdeeld in twee scores: RNA CISH "hoog" en RNA CISH "laag". RNA CISH "hoge" score werd gedefinieerd door meer dan 50% van de gekleurd kankercellen, of door vlekken die meer dan 80% van de cel oppervlak (kern en cytoplasma) in ten minste 30% van de kankercellen, zoals waargenomen met een 20x doelstelling (Figuur 1)21.

Ten aanzien van positieve controles, de PPIB signaal moet zichtbaar zijn als punctata stippen binnen de celkern op 20x-40x vergroting. Zoals voor negatieve controle dia's, één punt aan elke 10 cellen die achtergrond schar kleuring per 20x Microscoop gebied tonen is aanvaardbaar.

Figure 1
Figuur 1: voorbeelden van "low" en "High" RNA CISH kleuring. (A en B) RNA CISH "lage" Score kleuring in orofaryngeale plaveiselcel cel carcinoom. De kleuring wordt waargenomen in minder dan 50% van de tumorcellen en bestrijkt kleiner dan 80% van het oppervlak van de cel. (C en D) RNA CISH "hoge" Score kleuring in orofaryngeale plaveiselcel cel carcinoom. Kleuring wordt waargenomen in meer dan 50% van de tumorcellen en, in dit geval, de kleuring oppervlak groter is dan 80% in meer dan 30% van de tumorcellen. Dit cijfer is gewijzigd van Augustin et al.21gelieve Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HPV RNA CISH uitgevoerd met een gekochte Kit is een krachtig hulpmiddel voor de opsporing van virale transcripten en het geeft actieve HPV-infectie. Handmatig uitgevoerd, de stappen van het protocol zijn over het algemeen gemakkelijk te volgen, en de gekochte Kit is handig. Deze techniek kan de kleuring van 19 histologische monsters plus een controle dia in een keer, en de assay duurt ongeveer 8 uur. Het is van cruciaal belang niet te laten de monsters uitdrogen tussen de stappen, tenzij anders vermeld. De voor behandeling voorwaarde kan nodig zijn om te worden aangepast, afhankelijk van het gemanipuleerde weefsel.

HPV E6-E7 mRNA het signaal van de uitdrukking wordt ontdekt met een nauwkeurige ruimtelijke resolutie, daardoor uitsluitend om het even welke verontreiniging van HPV-besmette nonneoplastic cellen naast de tumor. Detectie van HPV E6 en E7 RNA is functioneel relevant, aangezien deze transcripten nodig zijn voor HPV-geïnduceerde cel transformatie door hun interactie met de cellulaire p53 en pRb eiwitten4. Daarom, in voorstadia laesies van de baarmoeder baarmoederhals, HPV RNA CISH kan helpen discrimineren low-grade epitheliale laesies (LSIL) van hoogwaardige epitheliale laesies (HSIL) volgens de lokalisatie van het signaal: in de meeste gevallen van LSIL, overvloedig diffuse bevlekte kernen zijn gelabeld door de epitheel dikte, wat aangeeft een productieve fase. HSIL vertonen of overvloedig diffuus gekleurd cel kernen in de oppervlakkige laag, naast elkaar bestaande met sterke nucleaire en cytoplasma interpunctie signalen in de onderste laag (in laesies voorheen bekend als CIN2), of sterke nucleaire vlekken met cytoplasma stippen door de dikte van het epitheel, met vermelding van de transformatieve fase van HPV-infectie (in laesies voorheen bekend als CIN3)22.

Hoewel er nog geen standaard aanbeveling voor de semiquantitative evaluatie van het signaal, sommige auteurs melden een klinische relevantie, omdat de semiquantitative evaluatie van HPV E6 en E7 transcripten heeft toegestaan de identificatie van twee prognostische groepen onder HPV-verwante HNSCC patiënten21. Het is gestipuleerd dat de opsporing van DNA HPV zonder E6 en E7 transcripten of met slechts lage niveaus van E6 en E7 transcripten functioneel onbelangrijk zou zijn en dat dergelijke patiënten met HPV-negatieve kankerpatiënten21zouden moeten worden gebundeld, 23.

Betreffende beperkingen van deze procedure, wordt het gestipuleerd dat een paar niet-specifieke dwars kruisingen in sommige gevallen zouden kunnen gebeuren, zoals hypothetische door Dreyer et al.23 RNA CISH kan niet voor onderscheid tussen E6/E7 transcripten van RNA en virale worden geschikt DNA, zoals het protocol omvat een 100 °C warmtebehandeling stap, die wordt vermoed te zorgen voor virale DNA denaturatie23. Dit wordt ondersteund door de observatie van twee soorten signalen in positieve gevallen, namelijk sterke kleuring voornamelijk gelokaliseerd in tumorcellen kernen, evenals een fijn korrelig signaal in het cytoplasma. Aangezien de sonde die in dit protocol wordt gebruikt specifiek HPV genotypen 16 en 18 bindt, die in een overgrote meerderheid van HPV-verwante HNSCC4betrokken zijn, kunnen de occasionele HPV-verwante gevallen door RNA CISH worden gemist, of wegens bepaalde HPV genotypen die niet opgenomen in de sonde, of als gevolg van mutaties of schrappingen van primer bindende sites. Tot slot vergt deze methode kostbare reagentia en apparaten en is niet gemakkelijk toegankelijk in routine praktijk.

Voor elk monster, een totaal van drie secties nodig zijn: een voor het uitvoeren van de HPV-Assay, een voor de positieve controle, en een voor de negatieve controle. Aangezien RNA een breekbare molecule is en in tijd in FFPE steekproeven zou kunnen verslechteren, moet de kwaliteit van transcripten voor elk steekproef worden gecontroleerd, gebruikend positieve controle sondes zoals PPIB, DNA-geleide RNA polymerase II subeenheid RPB1 (Polr2a), of polyubiquitin-C (UBC) , die menselijke huishoudelijke genen zijn. Bovendien, wanneer er een semiquantitative benadering, moet het signaal worden genormaliseerd om de huishoudelijke genen controle sonde21. De aanbevolen positieve controle voor elk weefsel kan worden gevonden in de instructies van de fabrikant. Nochtans, bevestigt een recente studie dat de mRNA uitdrukking zowel in prospectieve als retrospectieve steekproeven kan robuust worden bestudeerd, tonend vergelijkbare mRNA niveaus tussen steekproeven van 2004 en van 2008. Dit is ten gunste van de relatieve integriteit van mRNA over tijd24. De aanbevolen negatieve controle sonde gebruikt om onspecifieke kleuring te voorkomen is het bacteriële gen codering voor DAPB.

Hier wordt de chromogene in situ kruising van HPV RNA beschreven zoals manueel uitgevoerd. Deze techniek kan ook worden uitgevoerd met fluorescerende etikettering en/of gecombineerd met conventionele immunokleuring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

CB: boards, seminars: MSD, BMS, AstraZeneca, Roche

Acknowledgments

De auteurs danken het departement pathologie van Hopital Européen Georges Pompidou en de Chantal Chambolle, Elodie Michel en Gisèle Legalel; het platform van de histologie van PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre); Virginia Clark voor het bewerken van talen; Alexandra Elbakyan voor haar bijdrage.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hematoxylin solution, Gill No. 1 Merck GHS132
HybEZ Oven (110v) Advanced Cell Diagnostics Inc. 321710
HybEZ slide rack Advanced Cell Diagnostics Inc. 300104
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen Advanced Cell Diagnostics Inc. 310018
RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN Advanced Cell Diagnostics Inc. 322310 This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B
RNAscope 3-Plex Negative Control Probe Advanced Cell Diagnostics Inc. 320871 DAPB
RNAscope 3-Plex Positive Control Probe Advanced Cell Diagnostics Inc. 320861 PPIB
RNAscope H202 & Protease Plus Reagent Advanced Cell Diagnostics Inc. 322330 Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1
RNAscope Probe- HPV16/18 Advanced Cell Diagnostics Inc. 311121
RNAscope Target Retrieval Reagents Advanced Cell Diagnostics Inc. 322000
RNAscope Wash Buffer Reagents Advanced Cell Diagnostics Inc. 310091 Wash Buffer 50X x4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lowy, D. R., Schiller, J. T. Reducing HPV-associated cancer globally. Cancer Prevention Research.(Philadelphia, PA). 5 (1), 18-23 (2012).
  2. Laban, S., Hoffmann, T. K. Human Papillomavirus Immunity in Oropharyngeal Cancer: Time to Change the Game? Clinical Cancer Research. 24 (3), 505-507 (2018).
  3. Wiest, T., Schwarz, E., Enders, C., Flechtenmacher, C., Bosch, F. X. Involvement of intact HPV16 E6/E7 gene expression in head and neck cancers with unaltered p53 status and perturbed pRb cell cycle control. Oncogene. 21 (10), 1510-1517 (2002).
  4. Ndiaye, C., et al. HPV DNA, E6/E7 mRNA, and p16INK4a detection in head and neck cancers: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Oncology. 15 (12), 1319-1331 (2014).
  5. Mills, A. M., Dirks, D. C., Poulter, M. D., Mills, S. E., Stoler, M. H. HR-HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization. The American Journal of Surgical Pathology. 41 (5), 607-615 (2017).
  6. Mendez-Pena, J. E., Sadow, P. M., Nose, V., Hoang, M. P. RNA chromogenic in situ hybridization assay with clinical automated platform is a sensitive method in detecting high-risk human papillomavirus in squamous cell carcinoma. Human Pathology. 63, 184-189 (2017).
  7. Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV driven oropharyngeal cancers: Comparing p16 based algorithms with the RNAscope HPV-test. Oral Oncology. 62, 101-108 (2016).
  8. Lewis, J. S., et al. Human Papillomavirus Testing in Head and Neck Carcinomas: Guideline From the College of American Pathologists. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 142 (5), 559-597 (2018).
  9. Mills, A. M., Coppock, J. D., Willis, B. C., Stoler, M. H. HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization in the Diagnosis of Cervical Low-grade Squamous Intraepithelial Lesions (LSIL). The American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 192-200 (2018).
  10. El-Naggar, A., Chan, J. K. C., Grandis, J. R., Takata, T., Slootweg, P. J. WHO Classification of Head and Neck Tumours. , International Agency for Research on Cancer. Lyon, France. (2017).
  11. Ang, K. K., et al. Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer. The New England Journal of Medicine. 363 (1), 24-35 (2010).
  12. Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
  13. Outh-Gauer, S., et al. Immunotherapy in head and neck cancers: a new challenge for immunologists, pathologists and clinicians. Cancer Treatment Reviews. 65, 54-64 (2018).
  14. Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV-driven head and neck cancer with a single test in routine clinical practice. Modern Pathology. 28 (12), 1518-1527 (2015).
  15. Bishop, J. A., et al. Detection of Transcriptionally Active High-risk HPV in Patients With Head and Neck Squamous Cell Carcinoma as Visualized by a Novel E6/E7 mRNA In Situ Hybridization Method. The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1874-1882 (2012).
  16. Hsieh, M. -S., Lee, Y. -H., Jin, Y. -T., Huang, W. -C. Strong SOX10 expression in human papillomavirus-related multiphenotypic sinonasal carcinoma: report of 6 new cases validated by high-risk human papillomavirus mRNA in situ hybridization test. Human Pathology. 82, 264-272 (2018).
  17. Shi, W., et al. Comparative Prognostic Value of HPV16 E6 mRNA Compared With In Situ Hybridization for Human Oropharyngeal Squamous Carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 27 (36), 6213-6221 (2009).
  18. Kuo, K. -T., et al. The biomarkers of human papillomavirus infection in tonsillar squamous cell carcinoma—molecular basis and predicting favorable outcome. Modern Pathology. 21 (4), 376-386 (2008).
  19. Augustin, J., et al. Evaluation of the efficacy of the four tests (p16 immunochemistry, PCR, DNA and RNA In situ Hybridization) to evaluate a Human Papillomavirus infection in head and neck cancers: a cohort of 348 French squamous cell carcinomas. Human Pathology. , (2018).
  20. Jung, A. C., et al. Biological and clinical relevance of transcriptionally active human papillomavirus (HPV) infection in oropharynx squamous cell carcinoma. International Journal of Cancer. 126 (8), 1882-1894 (2009).
  21. Augustin, J., et al. HPV RNA CISH score identifies two prognostic groups in a p16 positive oropharyngeal squamous cell carcinoma population. Modern Pathology. , (2018).
  22. Evans, M. F., et al. HPV E6/E7 RNA In Situ Hybridization Signal Patterns as Biomarkers of Three-Tier Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade. PLOS ONE. 9 (3), e91142 (2014).
  23. Dreyer, J. H., Hauck, F., Oliveira-Silva, M., Barros, M. H. M., Niedobitek, G. Detection of HPV infection in head and neck squamous cell carcinoma: a practical proposal. Virchows Archiv. 462 (4), 381-389 (2013).
  24. Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. , (2017).

Tags

Genetica chromogene in situ hybridisatie HPV transcriptie semiquantitative analyse hoofd-en nek kanker E6 E7 RNA plaveiselcel Cell carcinoom
Chromogene in situ hybridisatie SS een hulpmiddel voor HPV-gerelateerde hoofd-en nek kankerdiagnose
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Outh-Gauer, S., Augustin, J.,… More

Outh-Gauer, S., Augustin, J., Mandavit, M., Grard, O., Denize, T., Nervo, M., Lépine, C., Rassy, M., Tartour, E., Badoual, C. Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis. J. Vis. Exp. (148), e59422, doi:10.3791/59422 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter