Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

تهجين في الموقع كروميجيني في أداة لتشخيص سرطان الرأس والرقبة ذات الصلة بفيروس الورم الحليمي البشري

Published: June 14, 2019 doi: 10.3791/59422
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1, 1, 1, 2, 2,3, 1,2
1Department of Pathology, Georges Pompidou European Hospital, Assistance publique - Hôpitaux de Paris (APHP), Paris Descartes University, 2Paris Cardiovascular Research Center (PARCC), Institut national de la santé et de la recherche médicale (Inserm) U970, 3Laboratory of Immunology, Georges Pompidou European Hospital, APHP, Paris Descartes University

Summary

يعتبر فيروس الورم الحليمي البشري (HPV) RNA الكرومي في الموقع التهجين ليكون واحدا من المعايير الذهبية للكشف عن عدوى فيروس الورم الحليمي البشري النشط داخل الأورام. وهو يسمح بتصور التعبير فيروس الورم الحليمي البشري E6-E7 mRNA مع التعريب والتقييم شبه الكمي للإشارة.

Abstract

عدوى فيروس الورم الحليمي البشري (HPV) هي عامل خطر رئيسي لنوع فرعي من سرطان الخلايا الحرشفية البلعومية (OPSCC)، الذي يميل إلى أن يكون مرتبطاً بنتيجة أفضل من مكتب خدمات الرقابة على الكحول والتبغ. يمكن أن يسمح التهجين المُهجن في الموقع (CISH) من الحمض النووي الريبي الفيروسي HPV بالتقييم شبه الكمي للنسخ الفيروسية للبروتينات الأنجينية E6 وE7 وتصور في الموقع بدقة مكانية جيدة. تسمح هذه التقنية بتشخيص عدوى نشطة مع تصور نسخ فيروس الورم الحليمي البشري في الخلايا المصابة بفيروس الورم الحليمي البشري. ومن مزايا هذه التقنية تجنب التلوث من الخلايا المصابة بفيروس الورم الحليمي البشري غير اللابذية المجاورة للورم. وعموما، فإن أداء التشخيص الجيد لها قد اعتبر أن يكون المعيار الذهبي لتحديد عدوى فيروس الورم الحليمي البشري النشطة. منذ E6 و E7 تفاعل البروتين الفيروسي مع البروتينات الخلية pRb و p53 إلزامية لتحويل الخلايا، فيروس الورم الحليمي البشري RNA CISH هو ذات الصلة وظيفيا ويعكس بشكل حاد عدوى فيروس الورم الحليمي البشري النشطة. هذه التقنية ذات صلة سريريا ً أيضاً لأن مستويات النسخ "المنخفضة" أو "العالية" لفيروس الورم الحليمي البشري ساعدت على تحديد مجموعتين من التكهنات بين مرضى سرطان الرأس والرقبة الإيجابيين بفيروس الورم الحليمي البشري. هنا نقدم بروتوكول لدليل فيروس الورم الحليمي البشري RNA CISH تنفيذها على الشرائح البارافين المضمنة في الشكلين الثابتة (FFPE) مع مجموعة تم الحصول عليها من الشركة المصنعة. بدلاً من الوحي الكروموجيني، يمكن أيضاً أن يتم تهجين الحمض النووي الريبي في الموقع مع الوحي الفلورسنت (RNA FISH). ويمكن أيضا أن تكون جنبا إلى جنب مع المناعي التقليدي.

Introduction

فيروس الورم الحليمي البشري RNA CISH هو أداة قوية للكشف عن عدوى فيروس الورم الحليمي البشري النشطة، والتي قد تكون حاسمة في الآفات الحميدة أو الخبيثة في مواقع مختلفة مثل البلعوم أو عنق الرحم. قد يساعد الكشف عن عدوى فيروس الورم الحليمي البشري النشطة في تشخيص الآفة الناجمة عن فيروس الورم الحليمي البشري، وبالتالي يؤثر على علاجه وتشخيصه.

فيروس الورم الحليمي البشري هو العدوى المنقولة جنسيا الأكثر شيوعا، وأكثر من 100 الأنماط الجينية الفيروسية وقد وصفت1. ومن المعروف من الناحية التخطيطية، الأنماط الجينية المنخفضة الخطورة مثل النمطين الجينيين 6 و 11، أنها تحفز الثآليل التناسلية، وداء الورم الحليمي التنفسي المتكرر، والآفات الحميدة الأخرى، في حين أن الأنماط الجينية عالية الخطورة مثل الأنماط الجينية 16 و18 هي المسؤولة عن معظم سرطانات عنق الرحم والسرطان الشرجي وتلعب دورا في ONCOGENESIS HNSCC في نسب متغيرة كما هو الحال في البيانات الوبائية الإقليمية2.

تتوفر عدة أدوات للكشف عن عدوى فيروس الورم الحليمي البشري. كما عدوى فيروس الورم الحليمي البشري عالية المخاطر يؤدي إلى التعبير عن البروتينات السرطانية الفيروسية E6 و E73، وينظر على نطاق واسع الكشف عن النسخ E6 و E7 كمعيار الذهب لتحديد عدوى فيروس الورم الحليمي البشري النشطة4. يمكن إجراء فيروس الورم الحليمي البشري RNA CISH على عينات FFPE التي يتم الحصول عليها بسهولة تامة من المرضى الذين يعانون من مختلف الأمراض المرتبطة بفيروس الورم الحليمي البشري. وقد تم تقييم أدائه اعلى في النيوبلج داخل الظهارة الحرشفية في عنق الرحم، وفتحه، والمهبل، وفي سرطان الخلايا الحرشفية الغازيةفي عنق الرحم، والقناة الأنجستية، والجهاز العلوي 5: يحقق حساسية أكثر من 98٪ بين فيروس الورم البلميري الحمض النووي (PCR) الحالات الإيجابية. هذا هو أفضل قليلا من p16 المناعية (93%) وفيروس الورم الحليمي البشري في التهجين في الموقع (DNA ISH: 97٪)، والتي هي أكثر شيوعا. في مجموعة أخرى من 57 مريضاً يعانون من سرطان الخلايا الحرشفية (SCC) الناشئة عن منطقة الرأس والرقبة، ومنطقة الأعضاء التناسلية، والجلد، والمسالك البولية، بالمقارنة مع فيروس الورم الحليمي البشري الحمض النووي يش، حققت فيروس الورم الحليمي البشري RNA CISH حساسية أفضل (100% مقابل 88%) والتحديد (87% مقابل 74%)6.

P16 المناعية هو علامة غير مباشرة تعكس اضطراب دورة الخلية التي قد تكون سبب (ولكن ليس حصرا) من قبل عدوى فيروس الورم الحليمي البشري4،7. هذا الاختبار الفعال من حيث التكلفة يمتلك حساسية جيدة وقيمة تنبؤية سلبية ويوصى به كعلامة بديلة للعدوى بفيروس الورم الحليمي البشري عالية الخطورة في سرطان البلعوم (OPC) من قبل كلية علماء الأمراض الأمريكية (CAP) والاتحاد الدولي مكافحة السرطان (UICC)8.

على الرغم من أن هذه الورقة تركز فقط على الكشف عن فيروس الورم الحليمي البشري في HNSCC، فيروس الورم الحليمي البشري RNA CISH ذات الصلة سريريا في مختلف الظروف الأخرى التي تنطوي على عدوى فيروس الورم الحليمي البشري. على سبيل المثال، قد تحسن هذه التقنية دقة تشخيص الآفات داخل الظهارية الحرشفية منخفضة الدرجة في عنق الرحم (LSIL، المعروف سابقا باسم الورم داخل الظهارة عنق الرحم، الصف 1 [CIN1]) للحالات الغامضة مورفولوجيا9. وفيما يتعلق بـ SCC البلعوم، يسمح فيروس الورم الحليمي البشري RNA CISH بتحديد SCC المرتبط بفيروس الورم الحليمي البشري، الذي يوصف بأنه متميز عن SCC البلعوم غير المرتبط بفيروس الورم الحليمي البشري في الطبعة الثامنة الأخيرة من تصنيف TNM لسرطان الرأس والرقبة (الاتحاد من أجل السرطان الدولي) التحكم [UICC])10. منذ فيروس الورم الحليمي البشري ذات الصلة SCC يعرض أفضل التكهن مع بقاء أطول وتعزيز العلاج الإشعاعي وحساسية العلاج الكيميائي من فيروس الورم الحليمي البشري غير ذات الصلة SCC11،12،13، قد يؤثر الكشف عن عدوى فيروس الورم الحليمي البشري إدارة المرضى14,15. إلى جانب ذلك، يمكن استخدام فيروس الورم الحليمي البشري RNA CISH لتشخيص سرطان الأنف متعدد الفينوتيش اتوبيس فيروس الورم الحليمي البشري مع إشارة أعلى من فيروس الورم الحليمي البشري DNA CISH16. تشير عدة تحليلات متعددة المتغيرات إلى أن الكشف عن النسخ من E6 و E7 يرتبط مع أفضل التكهن في SCC البلعوم عموما7،15،17،18 وفي مجموعة فرعية من p16 إيجابية البلعوم SCC19،20.

هنا نقدم بروتوكول لدليل فيروس الورم الحليمي البشري RNA CISH التي أجريت على الشرائح FFPE مع مجموعة تم الحصول عليها من الشركة المصنعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ويتبع البروتوكول المبادئ التوجيهية الأخلاقية، وقد وافقت عليه اللجنة الأخلاقية (اللجنة المعنية بحماية الأشخاص في إيل دو فرانس- 2، #2015-09-04).

1. إعداد المواد

  1. إعداد 1x العازلة غسل
    1. إعداد 3 لتر من 1X غسل العازلة عن طريق إضافة 2.94 L من الماء المقطر وزجاجة واحدة (60 مل) من العازلة غسيل (50X) (انظر جدولالمواد) إلى carboy كبيرة. اخلطجيداً.
      ملاحظة: قد يتم تحضير العازل الغسيل 1x في وقت مسبق وتخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى شهر واحد.
  2. إعداد الكواشف المضادة للبقع
    1. إعداد 50٪ هيماتوكسيلين.
      1. في غطاء الدخان، إضافة 100 مل من الهيماتوكسيلين جيل الأول (انظر جدولالمواد) إلى 100 مل من الماء المقطر في طبق تلطيخ.
        ملاحظة: يمكن إعادة استخدام محلول تلطيخ الهيماتوكسيلين بنسبة 50% لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
    2. إعداد 0.02٪ (ث / الخامس) مياه الأمونيا (الكاشف bluing).
    3. في غطاء الدخان، إضافة 1.43 مل من هيدروكسيد الأمونيوم 1 N إلى 250 مل من الماء المقطر في اسطوانة تخرج أو حاوية أخرى. ختم الاسطوانة مع فيلم البارافين. اخلط محتوياته جيداً لـ 3x-5x.
      ملاحظة: بالنسبة لكمية المقسّر، من المهم استخدام هيدروكسيد الأمونيوم. قد تكون مستعدة الكواشف في وقت مسبق. تأكد من بقاء جميع الحاويات مغطاة.
  3. إعداد 1x كاشف استرجاع الهدف
    1. في كوب كبير، إضافة 70 مل من 10X كاشف استرجاع الهدف (انظر جدولالمواد) إلى 630 مل من الماء المقطر.
    2. ضع الكأس على لوحة تسخين مع محرض مغناطيسي. تغطية مع رقائق الألومنيوم.
    3. تُغلى محتوياتها عند درجة حرارة 100 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة.
      ملاحظة: لا تدعه يغلي لأكثر من 30 دقيقة.
  4. توازن الكواشف
    1. تأكد من أن الفرن التهجين على و في 40 درجة مئوية. ضع ورق الترطيب الرطب في الجزء السفلي من الدرج.
      ملاحظة: هناك حاجة إلى فرن تهجين (انظر جدولالمواد) للخطوات 3.4 إلى 4.2.
    2. إزالة الكواشف التضخيم (AMP1-AMP6، انظر جدولالمواد) من الثلاجة والاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة، على الأقل 30 دقيقة قبل خطوة الحضانة ذات الصلة.
    3. قبل كل استخدام، قم بتسخين الهدف و/أو مسبارات التحكم لمدة 10 دقائق على الأقل عند 40 درجة مئوية في الفرن أو في حمام مائي أو حاضنة.

2. تعزيز التصاق وdeparaffinization في غطاء محرك السيارة الدخان

ملاحظة: بدء تشغيل البروتوكول مع 3-5 ميكرومتر سميكة عينات النسيجية المثبتة على الشرائح غير الملطخة.

  1. من أجل تعزيز التصاق، خبز الشرائح في 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة أو في 40 درجة مئوية بين عشية وضحاها في الفرن.
  2. اشحن حامل الشريحة بشرائح نسيجية غير مُلطخة. تزج رف الشريحة لمدة 5 دقائق في الإكسلين الطازجة الواردة في طبق تلطيخ، مع التحريض في بعض الأحيان. تكرار مع الزيلين الطازجة.
  3. تزج رف الشريحة لمدة 3 دقائق في الإيثانول الطازج 100٪ الواردة في طبق تلطيخ، مع التحريض المستمر. كرر مع الإيثانول الطازج 100٪.
  4. دعي الشرائح جافة لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: لا إعادة استخدام الكواشف deparaffinization للجفاف من الشرائح بعد الاسبار.

3. قبل المعالجة الأنسجة

ملاحظة: هذه الخطوات اتباع "القياسية" قبل المعالجة التوصية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لعينات الرأس والرقبة. قد يحتاج توقيت القسمين 3.1 و3.2 إلى تعديل حسب الأنسجة التي تم التلاعب بها.

  1. حصار نشاط البيروكسيداز
    1. أضف 4-6 قطرات من بيروكسيد الهيدروجين (انظر جدولالمواد) إلى كل شريحة واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. اغسل يُغسل الشرائح 2 x لمدة 2 دقيقة في الماء المقطر في درجة حرارة الغرفة.
  2. كسر من RNA / الأنسجة الحدود
    1. مع مخلب، وإزالة رقائق الألومنيوم من الغليان 1X الهدف استرداد كاشف (TTR1X) من القسم 1.3 والتوقف عن التحريك. اغمر رف الشريحة ببطء وبعناية فائقة لمدة 15 دقيقة.
      ملاحظة: يجب أن يستمر الغليفي أثناء هذه الخطوة.
      تحذير: استخدم المخلب للتلاعب بورق الألومنيوم ورف الشريحة وذلك لتجنب إصابات الحروق. تأكد من ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة، مثل القفازات ومعطف المختبر.
    2. مع مخلب، نقل على الفور رف الشريحة الساخنة إلى حمام الماء المقطر ويغسل لمدة 2 دقيقة.
      ملاحظة: تأكد من أن العينات لا تبرد في TTR1x.
    3. اغسل الشرائح في الإيثانول الطازج 100٪ لمدة 2 دقيقة.
    4. دع الشرائح تجف في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
  3. إنشاء الحواجز
    1. مع قلم حاجز hydrophobic (انظر جدولالمواد)، رسم حاجز حول العينة. دعه يجف لمدة 5 دقائق على الأقل.
      ملاحظة: السماح للحاجز لتجف حقاً. إذا كان يبلى خلال الإجراء، لا تتردد في رسمه مرة أخرى. تجنب لمس الأنسجة مع القلم. يمكن إيقاف البروتوكول بين عشية وضحاها هنا.
  4. هضم البروتياز
    1. ضع الشرائح على رف الشرائح وأضف ~ 4 قطرات من Protease Plus لكل عينة (انظر جدولالمواد).
    2. غطي صينية التحكم بالرطوبة بغطاء وأدخلها في فرن التهجين لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
      ملاحظة: لمنع التبخر، تأكد من أن مقبض الباب بدوره هو تماما تحولت إلى موقف القفل.
    3. قم بإزالة الصينية من الفرن وإزالة رف الشريحة.
    4. شريحة واحدة في وقت واحد، وإزالة بسرعة أي السائل الزائد ووضع الشريحة في رف الشريحة مغمورة في طبق تلطيخ مليئة بالماء المقطر.
    5. اغسل يُغسل الشرائح 2 x لمدة 2 دقيقة في الماء المقطر في درجة حرارة الغرفة. إثارة باستمرار.

4. تشغيل المناسة

ملاحظة: لا تدع المقاطع تجف بين خطوات الحضانة.

  1. تهجين من ال [فبّو] تحقيق
    ملاحظة: تأكد من أن المسبارات مُحَفَّرَة لحل أي ترسيب قبل الاستخدام. لهذه الخطوة، بدلا من مسبار فيروس الورم الحليميالبشري، قد تستخدم أيضا peptidyl-prolyl isomerase B (PPIB) للسيطرة الإيجابية أو ديهيدروديكولينات ريدكتيز (DAPB) للسيطرة السلبية (انظر جدولالمواد).
    1. انقر فوق الشرائح و/أو قم بتحريكها لإزالة أي سائل زائد ووضعها في حامل الشرائح. أضف ~4 قطرات من مسبار فيروس الورم الحليمي البشري لتغطية كل قسم بالكامل.
    2. يُغطّى الصينية بغطاء ثم تُدرج في الفرن لمدة 2 ساعة في درجة حرارة 40 درجةمئوية.
      ملاحظة: لمنع التبخر، تأكد من أن nob بدوره تماما تحولت إلى موقف القفل.
    3. قم بإزالة الصينية من الفرن وإزالة رف الشريحة.
    4. شريحة واحدة في وقت واحد، وإزالة بسرعة أي السائل الزائد ووضع الشريحة في رف الشريحة مغمورة في طبق تلطيخ مليئة 1X العازلة غسل.
    5. اغسل الشرائح في 1x العازلة غسل لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع التحريض المستمر. كرر هذا مع 1X الطازجة العازلة غسل.
  2. تهجين من AMP1، AMP2، AMP3، وAMP4
    ملاحظة: تتضمن هذه الخطوات التهجين في فرن التهجين وAMP1-AMP4 من مجموعة شراء (انظر جدولالمواد).
    1. انقر فوق و/أو انقر لإزالة أي سائل زائد من الشرائح ووضعها في حامل الشرائح. إضافة ~ 4 قطرات من AMP1 لتغطية كل قسم بالكامل.
    2. يُغطّى الصينية بغطاء ثم تُدرج في الفرن لمدّة 30 دقيقة على درجة حرارة 40 درجةمئوية.
    3. قم بإزالة الصينية من الفرن وإزالة رف الشريحة.
    4. شريحة واحدة في وقت واحد، وإزالة بسرعة أي السائل الزائد ووضع الشريحة في رف الشريحة مغمورة في طبق تلطيخ مليئة 1X العازلة غسل.
    5. اغسل الشرائح في 1x العازلة غسل لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع التحريض المستمر. كرر هذا مع 1X الطازجة العازلة غسل.
    6. كرر الخطوات 4.2.1–4.2.5، ولكن استخدم ~ 4 قطرات من AMP2 بدلا ً من AMP1 واحتضان لمدة 15 دقيقة عند 40 °C. اغسل الشرائح 2 x لمدة 2 دقيقة، في كلتا المرتين في مخزن غسيل طازج.
    7. كرر الخطوات 4.2.1–4.2.5، ولكن استخدم ~ 4 قطرات من AMP3 بدلا من AMP1 واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 40 ° C. اغسل الشرائح 2 x لمدة 2 دقيقة، في كلتا المرتين في مخزن غسيل طازج.
    8. كرر الخطوات 4.2.1–4.2.5، ولكن استخدم ~ 4 قطرات من AMP4 بدلا من AMP1 واحتضان لمدة 15 دقيقة عند 40 ° C. اغسل الشرائح 2 x لمدة 2 دقيقة، في كلتا المرتين في مخزن غسيل طازج.
  3. تهجين AMP5 وAMP6
    ملاحظة: هذه الخطوات لا تشمل التهجين في الفرن ولكن التهجين في درجة حرارة الغرفة. يأتي AMP5 وAMP6 من المجموعة التي تم شراؤها (انظر جدول المواد).
    1. انقر فوق الشرائح و/أو قم بتحريكها لإزالة أي سائل زائد ووضعها في حامل الشرائح. إضافة ~ 4 قطرات من AMP5 لتغطية كل قسم بالكامل.
    2. تغطى الصينية بغطاء وتحضن لمدة 30 دقيقة فى درجة حرارةالغرفة.
    3. شريحة واحدة في وقت واحد، وإزالة بسرعة أي السائل الزائد ووضعها في رف الشريحة مغمورة في طبق تلطيخ مليئة 1X العازلة غسل.
    4. اغسل الشرائح في 1x العازلة غسل لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع التحريض المستمر. كرر هذا مع 1X الطازجة العازلة غسل.
    5. كرر الخطوات من 4.3.1 إلى 4.3.4، ولكن استخدم ~ 4 قطرات من AMP6 بدلا ً من AMP5 واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الشرائح 2 x لمدة 2 دقيقة، في كلتا المرتين في مخزن غسيل طازج.

5. الكشف عن إشارة مع 3،3'-ديامينوبنزيدين

تحذير: ثنائي أمينوبنزيدين (DAB) سام. اتبع الاحتياطات المناسبة وإرشادات السلامة عند التخلص من هذه المادة الكيميائية والتعامل معها.

  1. اخلط يُمزج حجم الكميات المتساوية من DAB-A وDAB-B (انظر جدولالمواد) في أنبوب مناسب الحجم عن طريق توزيع نفس العدد من قطرات كل حل. جعل ~ 120 μL من الركيزة DAB لكل قسم (~ 2 قطرات من كل كاشف / المجموع من 4). اخلطها جيداً لـ 3x–5x.
  2. خذ كل شريحة، واحدة في كل مرة، من رف الشريحة واضغط و/ أو نفض الغبار لإزالة السائل الزائد قبل وضعه في رف الشريحة.
  3. ماصة ~ 120 μL من DAB على كل قسم الأنسجة. تأكد من تغطية الأقسام، واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. تخلص من الـ DAB المتبقية وفقاً للتنظيم المحلي وأدخل الشريحة في رف منزلق مغمور في طبق تلطيخ مملوء بمياه الصنبور.

6. مكافحة البقع

  1. حرك رف الشريحة إلى طبق تلطيخ يحتوي على محلول تلطيخ الهيماتوكسيلين بنسبة 50% لتركه يرتاح لمدة 30 في درجة حرارة الغرفة. لاحظ أن الشرائح ستصبح أرجوانية.
  2. نقل فورا رف الشريحة مرة أخرى إلى طبق تلطيخ يحتوي على مياه الصنبور، وغسل الشرائح 3X -5X عن طريق تحريك الرف صعودا وهبوطا.
  3. استمر في تكرار خطوة الغسيل مع ماء الصنبور الطازج حتى تصبح الشرائح واضحة، في حين تبقى الأقسام أرجوانية.
  4. استبدل ماء الصنبور في طبق تلطيخ مع 0.02٪ ماء الأمونيا. حرك الحامل إلى أعلى وأسفل 2x–3x. لاحظ أن قسم الأنسجة يجب أن يتحول إلى اللون الأزرق.
  5. استبدل ماء الأمونيا بمياه الصنبور. اغسل الشرائح 3x–5x.

7. الجفاف

  1. حرك رف الشريحة إلى طبق تلطيخ يحتوي على 70٪ من الإيثانول في غطاء الدخان والسماح لها بقية لمدة 2 دقيقة مع التحريض في بعض الأحيان.
  2. حرك رف الشريحة إلى أول طبق تلطيخ يحتوي على الإيثانول 100٪ والسماح لها بقية لمدة 2 دقيقة مع التحريض في بعض الأحيان.
  3. حرك رف الشريحة إلى طبق تلطيخ الثاني الذي يحتوي على 100٪ الإيثانول والسماح لها بقية لمدة 2 دقيقة مع التحريض في بعض الأحيان.
  4. حرك رف الشريحة إلى طبق تلطيخ يحتوي على الزيلين واتركه يرتاح لمدة 5 دقائق مع التحريض العرضي.

8. تصاعد الشريحة

  1. إزالة الشرائح من رف الشرائح ووضعها شقة مع المقاطع التي تواجه حتى في غطاء محرك السيارة الدخان.
  2. قم بتركيب شريحة واحدة في كل مرة بإضافة قطرة واحدة من وسيط ة التركيب قائم على الزلين إلى كل شريحة ووضع غطاء 24 مم × 50 مم على القسم بعناية. تجنب الوقوع في أي فقاعات الهواء.
  3. الهواء الجافة الشرائح ل ≥ 5 دقيقة.

9- تقييم العينات

  1. فحص أقسام الأنسجة تحت المجهر برايتفيلد القياسية في 20X-40x التكبير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كما هو موضح هنا، في سرطان الخلايا الحرشفية الرأس والرقبة، يمكن اعتبار حالة إيجابية في وجود تلطيخ بونتيفورم البني في السيتوبلازم أو في نوى الخلايا السرطانية. في معظم الدراسات، تعتبر الإشارة إما "إيجابية" أو "لم يتم الكشف عنها"14. وقد تم الإبلاغ عن أساليب تنصف حجم الإشارة ولكنها تفتقر إلى التوحيد بين الأفرقة. على سبيل المثال، في بعض الدراسات، تم تسجيل الإشارات على أنها 1+ مع 1-3 نقاط لكل خلية ورم، 2+ مع 4-9 نقاط لكل خلية ورم، أو 3+ مع 10 نقاط أو أكثر لكل خلية ورم6؛ في التحليلات بعد الأوّل، تم أخذ إشارات 2+ و3+ فقط، التي كان من الأسهل تفسيرها، في الاعتبار. في دراسة أخرى، تم تقسيم النتائج إلى اثنين من الدرجات: الجيش الملكي النيبالي CISH "عالية" وRNA CISH "منخفضة". وقد تم تعريف RNA CISH درجة "عالية" من قبل أكثر من 50٪ من الخلايا السرطانية الملطخة، أو عن طريق تلطيخ تغطي أكثر من 80٪ من سطح الخلية(النواة والسيتوبلازم) في ما لا يقل عن 30٪ من الخلايا السرطانية، كما لوحظ مع هدف 20X (الشكل 1)21.

وفيما يتعلق بالضوابط الإيجابية، ينبغي أن تكون إشارة PPIB مرئية كنقاط دقيقة داخل نوى الخلية عند تكبير 20x-40x. أما بالنسبة للشرائح التحكم السلبي، نقطة واحدة إلى كل 10 خلايا تعرض الخلفية الدبتل في حقل المجهر 20X مقبول.

Figure 1
الشكل 1: أمثلة على تلطيخ الحمض النووي الريبي (RNA CISH) "المنخفض" و "العالي". (ألف وباء ) RNA CISH "منخفضة" درجة تلطيخ في سرطان الخلايا الحرشفية البلعوم. لوحظ تصبغ في أقل من 50٪ من الخلايا السرطانية ويغطي أقل من 80٪ من سطح الخلية. (C و D)RNA CISH "عالية" درجة تلطيخ في سرطان الخلايا الحرشفية البلعوم. لوحظ تلطيخ في أكثر من 50٪ من الخلايا السرطانية، وفي هذه الحالة، سطح تلطيخ يتجاوز 80٪ في أكثر من 30٪ من الخلايا السرطانية. وقد تم تعديل هذا الرقم من أوغسطين وآخرون21الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HPV RNA CISH التي أجريت مع عدة شراؤها هو أداة قوية للكشف عن النسخ الفيروسية ويشير إلى عدوى فيروس الورم الحليمي البشري النشطة. يتم تنفيذها يدويًا، وخطوات البروتوكول سهلة المتابعة بشكل عام، والمجموعة التي تم شراؤها ملائمة. تسمح هذه التقنية بتلطيخ 19 عينة نسيجية بالإضافة إلى شريحة تحكم واحدة في آن واحد، وتستمر المقاييس حوالي 8 ساعة. ومن الأهمية بمكان عدم السماح للعينات بالجفاف بين الخطوات ما لم يذكر خلاف ذلك. قد تحتاج حالة ما قبل المعالجة إلى تعديلها اعتمادا على الأنسجة التي تم التلاعب بها.

يتم الكشف عن إشارة التعبير فيروس الورم الحليمي البشري E6-E7 mRNA مع دقة مكانية دقيقة، وبالتالي استبعاد أي تلوث من الخلايا غير الورمية المصابة بفيروس الورم المجاور للورم. الكشف عن فيروس الورم الحليمي البشري E6 و E7 RNA هو ذو صلة وظيفيا منذ هذه النصوص مطلوبة لتحويل الخلايا الناجمة عن فيروس الورم الحليمي البشري من خلال تفاعلها مع P53 الخلوية والبروتينات pRb4. لذلك، في الآفات السابقة للسرطان من عنق الرحم، فيروس الورم الحليمي البشري RNA CISH قد تساعد على التمييز الآفات داخل الظهارة منخفضة الدرجة (LSIL) من الآفات داخل الظهارة العالية (HSIL) وفقا لتوطين الإشارة: في معظم حالات LSIL، وفيرة وتوصف نوى منتشر ة في جميع أنحاء سمك الظهارية، مما يدل على مرحلة إنتاجية. HSIL المعرض إما وفرة نوى الخلايا الملطخة منتشر في طبقة سطحية، تتعايش مع إشارات تنقيط النووية والسيتوبلازما قوية في الطبقة السفلى (في الآفات المعروفة سابقا باسم CIN2)، أو تلطيخ النووية القوية مع النقاط السيتوبلازمية في جميع أنحاء سمك ظهارة، مما يدل على المرحلة التحويلية من عدوى فيروس الورم الحليمي البشري (في الآفات المعروفة سابقا باسم CIN3)22.

على الرغم من أنه لا توجد حتى الآن أي توصية قياسية للتقييم شبه الكمي للإشارة، فإن بعض المؤلفين يفيدون بوجود أهمية سريرية منذ أن سمح التقييم شبه الكمي لنصوص فيروس الورم الحليمي البشري E6 وE7 بتحديد اثنين من التكهنات مجموعات بين المرضى المصابينبفيروس الورم الحليمي البشري 21 . وقد تم الزعم أن الكشف عن الحمض النووي فيروس الورم الحليمي البشري دون E6 و E7 النسخ أو مع مستويات منخفضة فقط من E6 و E7 سوف تكون غير ذات صلة وظيفيا، وأنه ينبغي تجميع هؤلاء المرضى مع مرضى السرطان فيروس الورم الحليمي البشري السلبية21، 23.

وفيما يتعلق بالقيود المفروضة على هذا الإجراء، يُعتقد أن بعض التهجين غير المحدد قد يحدث في بعض الحالات، حيث أن Dreyer et al.23 RNA CISH قد لا تكون مناسبة للتمييز بين نسخ الحمض النووي الريبي E6/E7 والفيروسية الحمض النووي، كما يتضمن البروتوكول 100 درجة مئوية خطوة المعالجة الحرارية، والتي يشتبه في السماح لdenaturation الحمض النووي الفيروسية23. ويدعم هذا من خلال مراقبة نوعين من الإشارات في الحالات الإيجابية، وهي تلطيخ قوية أساسا المترجمة في نوى الخلية الورم، فضلا عن إشارة دقيقة في السيتوبلازم. كما أن التحقيق المستخدم في هذا البروتوكول يربط على وجه التحديد النمطين الجيني ينمي فيروس الورم الحليمي البشري 16 و 18، والتي تشارك في الغالبية العظمى من HNSCC4ذات الصلة بفيروس الورم الحليمي البشري 4 ، قد غاب عن الحالات المرتبطة بفيروس الورم الحليمي البشري في بعض الأحيان من قبل RNA CISH، إما بسبب بعض الأنماط الجينية لفيروس الورم الحليمي البشري التي ليست المدرجة في التحقيق، أو بسبب طفرات أو حذف من مواقع ملزمة التمهيدي. وأخيراً، فإن هذه الطريقة تتطلب كواشف وأجهزة مكلفة ولا يمكن الوصول إليها بسهولة في الممارسة الروتينية.

وبالنسبة لكل عينة، هناك حاجة إلى ما مجموعه ثلاثة أقسام: قسم لإجراء فحص فيروس الورم الحليمي البشري، وواحد للتحكم الإيجابي، وواحد للتحكم السلبي. بما أنّ [رنا] جزيء هشّة ويمكن تدهورت مع مرور الوقت في [فّب] عينات, النوعية من النصوص أن يكون فحصت ل كلّ عينة, يستعمل إيجابيّة تحكم تحقيقات مثل [بب], [دنا-ديركت] [رنا] [بولمرس] [إيي] [سوبونيت] [ربب1] ([بولّر2ا]), أو [بولبيقويتين-ك] ([أوبك]) ، وهي جينات التدبير المنزلي البشرية. وعلاوة على ذلك، عندما يكون هناك نهج شبه كمي، يجب تطبيع إشارة إلى التدبير المنزلي الجينات التحقيق السيطرة21. ويمكن العثور على التحكم الإيجابي الموصى به لكل الأنسجة في تعليمات الشركة المصنعة. ومع ذلك، تؤكد دراسة حديثة أن التعبير MRNA يمكن أن تدرس بقوة في كل من العينات المحتملة والاسترجاعية، وتبين مستويات ميرنا مماثلة بين عينات من 2004 ومن 2008. هذا هو لصالح السلامة النسبية من مرنا مع مرور الوقت24. ال موصى به التحقيق السيطرة السلبية المستخدمة لتجنب تلطيخ غير محدد هو ترميز الجينات البكتيرية لDAPB.

هنا وصفت ال [كروميجن] في موقعيّة تهجين من HPV [رنا] بما أنّ ينجز يدويّا. ويمكن أيضا أن يتم تنفيذ هذه التقنية مع وضع العلامات الفلورسنت و / أو جنبا إلى جنب مع المناعيالتقليدية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

CB: المجالس، والحلقات الدراسية: MSD، BMS، استرازينيكا، روش

Acknowledgments

ويشكر المؤلفون قسم علم الأمراض في هوبيتال يوروبين جورج بومبيدو ونكر (لورين تشامبول، إلودي ميشيل، وجيزيل لوليل)؛ ال [هتمولوج] منصة من [برك], [هوبيتل] [إيورن] [جورج] [بومبيدوو] ([كورين] [لسفرّ]); فيرجينيا كلارك للغة يحرّر; أليكساندرا البكيان لمساهمتها.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hematoxylin solution, Gill No. 1 Merck GHS132
HybEZ Oven (110v) Advanced Cell Diagnostics Inc. 321710
HybEZ slide rack Advanced Cell Diagnostics Inc. 300104
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen Advanced Cell Diagnostics Inc. 310018
RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN Advanced Cell Diagnostics Inc. 322310 This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B
RNAscope 3-Plex Negative Control Probe Advanced Cell Diagnostics Inc. 320871 DAPB
RNAscope 3-Plex Positive Control Probe Advanced Cell Diagnostics Inc. 320861 PPIB
RNAscope H202 & Protease Plus Reagent Advanced Cell Diagnostics Inc. 322330 Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1
RNAscope Probe- HPV16/18 Advanced Cell Diagnostics Inc. 311121
RNAscope Target Retrieval Reagents Advanced Cell Diagnostics Inc. 322000
RNAscope Wash Buffer Reagents Advanced Cell Diagnostics Inc. 310091 Wash Buffer 50X x4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lowy, D. R., Schiller, J. T. Reducing HPV-associated cancer globally. Cancer Prevention Research.(Philadelphia, PA). 5 (1), 18-23 (2012).
  2. Laban, S., Hoffmann, T. K. Human Papillomavirus Immunity in Oropharyngeal Cancer: Time to Change the Game? Clinical Cancer Research. 24 (3), 505-507 (2018).
  3. Wiest, T., Schwarz, E., Enders, C., Flechtenmacher, C., Bosch, F. X. Involvement of intact HPV16 E6/E7 gene expression in head and neck cancers with unaltered p53 status and perturbed pRb cell cycle control. Oncogene. 21 (10), 1510-1517 (2002).
  4. Ndiaye, C., et al. HPV DNA, E6/E7 mRNA, and p16INK4a detection in head and neck cancers: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Oncology. 15 (12), 1319-1331 (2014).
  5. Mills, A. M., Dirks, D. C., Poulter, M. D., Mills, S. E., Stoler, M. H. HR-HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization. The American Journal of Surgical Pathology. 41 (5), 607-615 (2017).
  6. Mendez-Pena, J. E., Sadow, P. M., Nose, V., Hoang, M. P. RNA chromogenic in situ hybridization assay with clinical automated platform is a sensitive method in detecting high-risk human papillomavirus in squamous cell carcinoma. Human Pathology. 63, 184-189 (2017).
  7. Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV driven oropharyngeal cancers: Comparing p16 based algorithms with the RNAscope HPV-test. Oral Oncology. 62, 101-108 (2016).
  8. Lewis, J. S., et al. Human Papillomavirus Testing in Head and Neck Carcinomas: Guideline From the College of American Pathologists. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 142 (5), 559-597 (2018).
  9. Mills, A. M., Coppock, J. D., Willis, B. C., Stoler, M. H. HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization in the Diagnosis of Cervical Low-grade Squamous Intraepithelial Lesions (LSIL). The American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 192-200 (2018).
  10. El-Naggar, A., Chan, J. K. C., Grandis, J. R., Takata, T., Slootweg, P. J. WHO Classification of Head and Neck Tumours. , International Agency for Research on Cancer. Lyon, France. (2017).
  11. Ang, K. K., et al. Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer. The New England Journal of Medicine. 363 (1), 24-35 (2010).
  12. Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
  13. Outh-Gauer, S., et al. Immunotherapy in head and neck cancers: a new challenge for immunologists, pathologists and clinicians. Cancer Treatment Reviews. 65, 54-64 (2018).
  14. Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV-driven head and neck cancer with a single test in routine clinical practice. Modern Pathology. 28 (12), 1518-1527 (2015).
  15. Bishop, J. A., et al. Detection of Transcriptionally Active High-risk HPV in Patients With Head and Neck Squamous Cell Carcinoma as Visualized by a Novel E6/E7 mRNA In Situ Hybridization Method. The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1874-1882 (2012).
  16. Hsieh, M. -S., Lee, Y. -H., Jin, Y. -T., Huang, W. -C. Strong SOX10 expression in human papillomavirus-related multiphenotypic sinonasal carcinoma: report of 6 new cases validated by high-risk human papillomavirus mRNA in situ hybridization test. Human Pathology. 82, 264-272 (2018).
  17. Shi, W., et al. Comparative Prognostic Value of HPV16 E6 mRNA Compared With In Situ Hybridization for Human Oropharyngeal Squamous Carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 27 (36), 6213-6221 (2009).
  18. Kuo, K. -T., et al. The biomarkers of human papillomavirus infection in tonsillar squamous cell carcinoma—molecular basis and predicting favorable outcome. Modern Pathology. 21 (4), 376-386 (2008).
  19. Augustin, J., et al. Evaluation of the efficacy of the four tests (p16 immunochemistry, PCR, DNA and RNA In situ Hybridization) to evaluate a Human Papillomavirus infection in head and neck cancers: a cohort of 348 French squamous cell carcinomas. Human Pathology. , (2018).
  20. Jung, A. C., et al. Biological and clinical relevance of transcriptionally active human papillomavirus (HPV) infection in oropharynx squamous cell carcinoma. International Journal of Cancer. 126 (8), 1882-1894 (2009).
  21. Augustin, J., et al. HPV RNA CISH score identifies two prognostic groups in a p16 positive oropharyngeal squamous cell carcinoma population. Modern Pathology. , (2018).
  22. Evans, M. F., et al. HPV E6/E7 RNA In Situ Hybridization Signal Patterns as Biomarkers of Three-Tier Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade. PLOS ONE. 9 (3), e91142 (2014).
  23. Dreyer, J. H., Hauck, F., Oliveira-Silva, M., Barros, M. H. M., Niedobitek, G. Detection of HPV infection in head and neck squamous cell carcinoma: a practical proposal. Virchows Archiv. 462 (4), 381-389 (2013).
  24. Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. , (2017).

Tags

علم الوراثة، العدد 148، تهجين الكروموجينيفي الموقع، فيروس الورم الحليمي البشري، النسخ، التحليل شبه الكمي، سرطان الرأس والرقبة، E6، E7، الجيش الملكي النيبالي، سرطان الخلايا الحرشفية
تهجين في الموقع كروميجيني في أداة لتشخيص سرطان الرأس والرقبة ذات الصلة بفيروس الورم الحليمي البشري
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Outh-Gauer, S., Augustin, J.,… More

Outh-Gauer, S., Augustin, J., Mandavit, M., Grard, O., Denize, T., Nervo, M., Lépine, C., Rassy, M., Tartour, E., Badoual, C. Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis. J. Vis. Exp. (148), e59422, doi:10.3791/59422 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter