Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Kromogent in situ hybridisering SS ett verktyg för HPV-relaterade huvud och hals cancer diagnos

Published: June 14, 2019 doi: 10.3791/59422
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1, 1, 1, 2, 2,3, 1,2
1Department of Pathology, Georges Pompidou European Hospital, Assistance publique - Hôpitaux de Paris (APHP), Paris Descartes University, 2Paris Cardiovascular Research Center (PARCC), Institut national de la santé et de la recherche médicale (Inserm) U970, 3Laboratory of Immunology, Georges Pompidou European Hospital, APHP, Paris Descartes University

Summary

Humant papillom virus (HPV) RNA-kromogent in situ hybridisering anses vara en av de gyllene normerna för aktiv humant papillom virus infektion detektion inom tumörer. Det möjliggör visualisering av HPV E6-E7 mRNA uttryck med lokalisering och semikvantitativ utvärdering av dess signal.

Abstract

Infektion med humant papillom virus (HPV) är en stor riskfaktor för en subtyp av orofaryngeal skivepitelcancer (OPSCC), som tenderar att associeras med ett bättre resultat än alkohol-och tobaksrelaterade OPSCC. Kromogent in situ hybridisering (CISH) av HPV viral RNA kan möjliggöra semikvantitativ utvärdering av virus avskrifter av de onkogena proteiner E6 och E7 och en in situ visualisering med en god rumslig upplösning. Denna teknik gör det möjligt att diagnostisera en aktiv infektion med visualisering av HPV-transkription i de tumoral HPV-infekterade cellerna. En fördel med denna teknik är att undvika kontaminering från nonneoplastiska HPV-infekterade celler i anslutning till tumören. Sammantaget, dess goda diagnos föreställningar har det anses vara den gyllene standarden för aktiv HPV-infektion identifiering. Eftersom E6 och E7 viral protein interaktion med cell proteiner pRb och p53 är obligatoriskt för cell Transformation, HPV RNA CISH är funktionellt relevant och akut återspeglar aktiv onkogen HPV-infektion. Denna teknik är kliniskt relevant liksom eftersom "låg" eller "hög" HPV transkription nivåer hjälpte identifiering av två prognos grupper bland HPV-relaterade P16-positiva huvud-och hals cancer patienter. Här presenterar vi protokollet för manuell HPV RNA CISH utförs på formmalin-fast paraffin-inbäddade (FFPE) dia bilder med ett kit som erhållits från tillverkaren. Istället för kromogen uppenbarelse kan RNA i situ hybridisering också utföras med fluorescerande uppenbarelse (RNA FISH). Det kan också kombineras med konventionell immunofärgning.

Introduction

HPV RNA CISH är ett kraftfullt verktyg för detektion av aktiv HPV-infektion, vilket kan visa sig avgörande i godartade eller maligna lesioner på olika platser såsom orofarynx eller livmoder halsen. Upptäckten av en aktiv HPV-infektion kan stödja diagnosen av en HPV-inducerad lesion och därmed påverka dess behandling och prognos.

HPV är den vanligast förekommande sexuellt överförbara infektionen, och över 100 viral genotyper har beskrivits1. Schematiskt, låg risk genotyper såsom genotyper 6 och 11 är kända för att inducera genitala vårtor, recidiverande respiratorisk papillomatos, och andra godartade lesioner, medan högrisk genotyper såsom genotyper 16 och även 18 är ansvariga för de flesta livmoder hals cancer och anal cancer och spela en roll i HNSCC onkogenes i varierande proportioner som redovisas av regionala epidemiologiska data2.

Det finns flera verktyg för detektion av HPV-infektion. Eftersom en högrisk-HPV-infektion leder till ett uttryck för viral onkogena proteiner E6 och E73, är upptäckten av E6 och E7 transkriptioner allmänt ses som den gyllene standarden för aktiv HPV-infektion identifiering4. HPV RNA CISH kan utföras på FFPE prover som är ganska lätt erhålls från patienter som lider av olika HPV-relaterade sjukdomar. Dess prestanda har utvärderats i skivepitelcancer intraepitelial neoplasi i livmoder halsen, anus, och slidan, och i invasiv skivepitelcancer i livmoder halsen, anus, och den övre aeromag-tarmkanalen5: det uppnår en känslighet på över 98% av HPV DNA-polymeras kedje reaktion (PCR)-positiva fall. Detta är något bättre än P16 immunofärgning (93%) och HPV DNA in situ hybridisering (DNA ISH: 97%), som är mer vanligt förekommande. I en annan kohort av 57 patienter med skivepitelcancer (SCC) som uppkommer från huvud-och hals regionen, underlivet, huden och urinvägarna, jämfört med HPV DNA ISH, uppnådde HPV RNA CISH bättre känslighet (100% mot 88%) och specificitet (87% jämfört med 74%)6.

P16 immunofärgning är en indirekt markör reflekterande cell cykel störningar som kan orsakas (men inte uteslutande) av HPV-infektion4,7. Detta kostnads effektiva test besitter god känslighet och ett negativt prediktivt värde och rekommenderas som en surrogat markör för högrisk-HPV-infektion i orofarynxcancer (OPC) av College of American patologer (CAP) och av unionen för internationella Cancer Control (UICC)8.

Även om detta papper fokuserar enbart på detektion av HPV i HNSCC, HPV RNA CISH är kliniskt relevant i olika andra tillstånd som involverar HPV-infektion. Till exempel, denna teknik kan förbättra noggrannheten av diagnosen låggradig skivepitelcancer intraepiteliala lesioner i livmoder halsen (LSIL, tidigare känd som cervikal intraepitelial neoplasi, grad 1 [CIN1]) för morfologiskt tvetydiga fall9. När det gäller orofaryngeal SCC, HPV RNA CISH möjliggör identifiering av HPV-relaterad SCC, märkt som skiljer sig från HPV-relaterade orofaryngeal SCC i den senaste åttonde upplagan av TNM klassificering av huvud-och hals cancer (i unionen för internationella cancer Kontroll [UICC])10. Eftersom HPV-relaterad SCC uppvisar en bättre prognos med längre överlevnad och förbättrad strål behandling och kemoterapi känslighet än HPV-obesläktad SCC11,12,13, kan detektion av HPV-infektion påverka patient hantering14,15. Dessutom kan HPV RNA CISH användas för diagnosticering av HPV-relaterad multifenotypisk sinonasal cancer med en högre signal än HPV-DNA CISH16. Flera multivariat analyser tyder på att detektion av E6-och E7-transkriptioner är korrelerad med en bättre prognos i orofaryngeal SCC totalt7,15,17,18 och i subgrupp av P16-positiva orofaryngeal SCC19,20.

Här presenterar vi protokollet för manuell HPV RNA CISH utförs på FFPE dia bilder med ett kit som erhållits från tillverkaren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollet följer etiska rikt linjer och godkändes av etik kommittén (Comité-de-Protection-des-personnes Ile-de-France-II, #2015-09-04).

1. beredning av materialen

  1. Beredning av 1x tvättbuffert
    1. Förbered 3 L av 1x tvättbuffert genom att lägga till 2,94 L destillerat vatten och en flaska (60 mL) tvättbuffert (50x) (se tabell över material) till en stor Carboy. Blanda väl.
      Anmärkning: 1x tvättbuffert kan förberedas i förväg och lagras i rums temperatur i upp till 1 månad.
  2. Beredning av motfärgningsreagenser
    1. Förbered 50% hematoxylin.
      1. I en draghuv, tillsätt 100 mL av Gills hematoxylin I (se tabell över material) till 100 ml destillerat vatten i en Färgnings mat rätt.
        Anmärkning: den 50% hematoxylin färgning lösning kan återanvändas i upp till 1 vecka.
    2. Förbered 0,02% (w/v) ammoniakvatten (bluing reagens).
    3. Tillsätt 1,43 mL 1 N ammoniumhydroxid i draghuv till 250 mL destillerat vatten i en graderad cylinder eller en annan behållare. Täta cylindern med paraffin film. Blanda dess innehåll väl för 3x – 5x.
      Anmärkning: för kvantitativ kvantitering är det viktigt att använda ammoniumhydroxid. Reagenserna kan förberedas i förväg. Se till att alla behållare förblir täckta.
  3. Beredning av 1x mål återvinning reagens
    1. I en stor bägare, tillsätt 70 mL 10x målhämtningsreagens (se material tabell) till 630 ml destillerat vatten.
    2. Placera bägaren på en värme platta med magnet omrörare. Täck den med aluminiumfolie.
    3. Koka upp innehållet vid 100 ° c i 10 – 15 min.
      Låt den inte koka i mer än 30 min.
  4. Reagensjämvikt
    1. Se till att hybridiserings ugnen är på och vid 40 ° c. Placera våt befuktningspapperet längst ned i facket.
      Obs: en hybridiserings ugn (se material tabell) behövs för steg 3,4 till 4,2.
    2. Ta bort förstärknings reagenserna (AMP1 – AMP6, se material tabellen) från kyl skåpet och förvara dem i rums temperatur, minst 30 min före det aktuella inkubations steget.
    3. Värm mål-och/eller kontrollproberna i minst 10 min vid 40 ° c i ugnen eller i ett vatten bad eller en inkubator före varje användning.

2. adhesionshöjande och deparaffinisering i draghuv

Obs: starta protokollet med 3 – 5 μm tjocka histologiska prover monterade på ofärgade dia bilder.

  1. För att öka vidhäftningen, baka glasen vid 60 ° c i 1 h eller vid 40 ° c över natten i en ugn.
  2. Ladda bild hållaren med ofärgade histologiska bilder. Sänk ned glid stativet i 5 minuter i färsk xylen som finns i en Färgnings mat rätt, med tillfällig agitation. Upprepa med färsk xylen.
  3. Sänk ned glid stativet i 3 minuter i färsk 100% etanol som finns i en Färgnings mat rätt, med ständig agitation. Upprepa med färsk 100% etanol.
  4. Låt glasen torka i 2 min i rums temperatur.
    Anmärkning: Återanvänd inte deparaffiniseringsreagenser för uttorkning av bilderna efter analysen.

3. förbehandling med vävnad

Anmärkning: dessa steg följer "standard" förbehandling rekommendation enligt tillverkarens instruktioner för huvud och hals prover. Tidpunkten för avsnitten 3,1 och 3,2 kan behöva justeras beroende på den manipulerade vävnaden.

  1. Blockad av peroxidasaktivitet
    1. Tillsätt 4 – 6 droppar väteperoxid (se material tabell) till varje bild och inkubera dem i 10 min i rums temperatur.
    2. Tvätta glasen 2x i 2 min i destillerat vatten vid rums temperatur.
  2. Skador på RNA/vävnads gränser
    1. Med en klo, ta bort aluminiumfolie från den kokande 1x mål återvinning reagens (TTR1x) från avsnitt 1,3 och sluta omrörning. Sänk ned glid stativet långsamt och mycket försiktigt i 15 minuter. Täck bägaren igen med aluminiumfolie.
      Obs: Simmering måste kvarstå under detta steg.
      Varning: Använd klo att manipulera aluminiumfolie och glid rack för att undvika Bränn skador. Se till att använda lämplig personlig skyddsutrustning, såsom handskar och en labbrock.
    2. Med klo, omedelbart överföra hot Slide rack till ett destillerat vatten bad och tvätta den i 2 min.
      Obs: kontrol lera att proverna inte svalnat i TTR1x.
    3. Tvätta glasen i färsk 100% etanol i 2 min.
    4. Låt glasen torka i rums temperatur i 2 min.
  3. Barriär skapande
    1. Med en hydrofoba barriär penna (se material tabellen), dra en barriär runt provet. Låt den torka ut i minst 5 min.
      Obs: Låt barriären verkligen torka ut. Om det slits ut under förfarandet, tveka inte att dra den igen. Undvik att vidröra vävnaden med pennan. Protokollet kan pausas över natten här.
  4. Proteas mat smältning
    1. Placera bilderna på glid stället och tillsätt ~ 4 droppar protease plus per prov (se material tabellen).
    2. Täck luft fuktighets kontroll brickan med ett lock och sätt in den i hybridiserings ugnen i 30 min vid 40 ° c.
      Anmärkning: för att förhindra avdunstning, se till att Vrid ratten är helt vriden till lås positionen.
    3. Ta bort facket från ugnen och ta bort glid stativet.
    4. En bild i taget, snabbt ta bort överflödig vätska och placera bilden i ett glid rack nedsänkt i en Färgnings mat rätt fylld med destillerat vatten.
    5. Tvätta glasen 2x i 2 min i destillerat vatten vid rums temperatur. Agitera hela tiden.

4. köra analysen

Obs: Låt inte avsnitten torka ut mellan inkubations stegen.

  1. Hybridisering av HPV-sonden
    Obs: se till att sonderna är förvärmda för att lösa upp eventuell nederbörd före användning. För detta steg, i stället för HPV-sond, kan peptidylprolyl Isomeras B (ppib) för positiv kontroll eller dihydrodipicolinate reduktas (dapb) för negativ kontroll (se material tabell) också användas.
    1. Knacka och/eller snärta på bilderna för att avlägsna överflödig vätska och placera dem i glid stället. Tillsätt ~ 4 droppar HPV-sond för att helt täcka varje avsnitt.
    2. Täck brickan med ett lock och sätt in den i ugnen i 2 h vid 40 ° c.
      Anmärkning: för att förhindra avdunstning, se till att Vrid Nob är helt vriden till lås positionen.
    3. Ta bort facket från ugnen och ta bort glid stativet.
    4. En bild i taget, snabbt ta bort överflödig vätska och placera bilden i ett glid rack nedsänkt i en Färgnings mat rätt fylld med 1x tvättbuffert.
    5. Tvätta glasen i 1x tvättbuffert i 2 min vid rums temperatur med konstant agitation. Upprepa detta med färska 1x tvättbuffert.
  2. Hybridisering av AMP1, AMP2, AMP3 KISEL och AMP4
    Anmärkning: dessa steg inkluderar hybridisering i hybridiserings ugnen och AMP1-AMP4 från den köpta Kit (se material tabell).
    1. Knacka och/eller svep för att ta bort överflödig vätska från bilderna och placera dem i glid stället. Tillsätt ~ 4 droppar AMP1 att helt täcka varje avsnitt.
    2. Täck brickan med ett lock och sätt in den i ugnen i 30 min vid 40 ° c.
    3. Ta bort facket från ugnen och ta bort glid stativet.
    4. En bild i taget, snabbt ta bort överflödig vätska och placera bilden i ett glid rack nedsänkt i en Färgnings mat rätt fylld med 1x tvättbuffert.
    5. Tvätta glasen i 1x tvättbuffert i 2 min vid rums temperatur med konstant agitation. Upprepa detta med färska 1x tvättbuffert.
    6. Upprepa steg 4.2.1 – 4.2.5, men Använd ~ 4 droppar AMP2 i stället för AMP1 och inkubera i 15 min vid 40 ° c. Tvätta glasen 2x i 2 min, båda gångerna i färsk tvättbuffert.
    7. Upprepa steg 4.2.1 – 4.2.5, men Använd ~ 4 droppar AMP3 kisel istället för AMP1 och inkubera i 30 min vid 40 ° c. Tvätta glasen 2x i 2 min, båda gångerna i färsk tvättbuffert.
    8. Upprepa steg 4.2.1 – 4.2.5, men Använd ~ 4 droppar AMP4 i stället för AMP1 och inkubera i 15 min vid 40 ° c. Tvätta glasen 2x i 2 min, båda gångerna i färsk tvättbuffert.
  3. Hybridisering av AMP5 och AMP6
    Obs: dessa steg omfattar inte hybridisering i ugnen men hybridisering vid rums temperatur. AMP5 och AMP6 kommer från det köpta paketet (se material tabellen).
    1. Knacka och/eller snärta på bilderna för att avlägsna överflödig vätska och placera dem i glid stället. Tillsätt ~ 4 droppar AMP5 att helt täcka varje avsnitt.
    2. Täck brickan med ett lock och inkubera i 30 min i rums temperatur.
    3. En bild i taget, snabbt ta bort överflödig vätska och placera den i ett glid rack nedsänkt i en Färgnings rätt fylld med 1x tvättbuffert.
    4. Tvätta glasen i 1x tvättbuffert i 2 min vid rums temperatur med konstant agitation. Upprepa detta med färska 1x tvättbuffert.
    5. Upprepa steg 4.3.1 – 4.3.4, men Använd ~ 4 droppar AMP6 i stället för AMP5 och inkubera i 15 minuter i rums temperatur. Tvätta glasen 2x i 2 min, båda gångerna i färsk tvättbuffert.

5. signal detektering med 3, 3 '-diaminobenzidin

FÖRSIKTIGHET: Diaminobenzidine (DAB) är giftigt. Följ lämpliga försiktighets-och säkerhets rikt linjer vid kasse ring och hantering av kemikalien.

  1. Blanda lika volymer av DAB-A och DAB-B (se material tabellen) i ett lämpligt dimensionerade rör genom att fördela samma antal droppar av varje lösning. Gör ~ 120 μL DAB-substrat per avsnitt (~ 2 droppar av varje reagens/totalt 4). Blanda det väl för 3x-5x.
  2. Ta varje bild, en i taget, från glid stället och knacka och/eller svep för att ta bort överflödig vätska innan du placerar den i glid stället.
  3. Pipettera ~ 120 μL av DAB på varje vävnads sektion. Se till att avsnitten är täckta och inkubera i 10 minuter i rums temperatur.
  4. Kassera resterande DAB enligt lokala föreskrifter och sätt in bilden i ett glid rack nedsänkt i en Färgnings mat rätt fylld med kran vatten.

6. motfärgning

  1. Flytta bilden rack till en Färgnings mat rätt som innehåller 50% hematoxylin färgning lösning låt det vila i 30 s i rums temperatur. Observera att bilderna blir lila.
  2. Överför omedelbart glid stativet tillbaka till en Färgnings mat rätt som innehåller kran vatten och tvätta bilderna 3x – 5x genom att flytta racket uppåt och nedåt.
  3. Fortsätt att upprepa tvätt steget med friskt kran vatten tills bilderna är klara, medan avsnitten förblir lila.
  4. Byt ut kran vattnet i infärgningsskålen med 0,02% ammoniakvatten. Flytta racket upp och ner 2x-3x. Observera att vävnads sektionen ska bli blå.
  5. Byt ut ammoniakvattnet med kran vatten. Tvätta bilderna 3x – 5x.

7. uttorkning

  1. Flytta glid stativet till en infärgningsskål som innehåller 70% etanol i rök huven och låt det vila i 2 min med tillfällig agitation.
  2. Flytta glid stativet till en första Färgnings mat rätt som innehåller 100% etanol och låt det vila i 2 min med tillfällig agitation.
  3. Flytta glid stativet till en andra Färgnings mat rätt som innehåller 100% etanol och låt det vila i 2 min med tillfällig agitation.
  4. Flytta glid stället till en färgskål som innehåller xylen och låt det vila i 5 minuter med tillfällig agitation.

8. Skjut monterings

  1. Ta bort bilderna från glid stativet och lägg dem Plant med de sektioner som är vända uppåt i rök huven.
  2. Montera en bild i taget genom att lägga till 1 droppe av ett xylenbaserat monterings medium på varje bild och placera försiktigt en 24 mm x 50 mm täckslip över sektionen. Undvik att fånga upp luft bubblor.
  3. Lufttorka glasen i ≥ 5 min.

9. utvärdering av provet

  1. Undersök vävnads avsnitten under en standard brightfield Mikroskop på 20x-40x förstoring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som beskrivs här, i huvud och hals skivepitelcancer, kan ett fall anses positivt i närvaro av brunt punctiform färgning i cytoplasman eller i kärnor av tumör celler. I de flesta studier betraktas signalen som antingen "positiv" eller "inte identifierad"14. Metoder för semikvantifiering av signalen har rapporter ATS men saknar standardisering mellan lag. Till exempel, i vissa studier, signalerna gjordes som 1 + med 1-3 prickar per tumör cell, 2 + med 4-9 punkter per tumör cell, eller 3 + med 10 prickar eller mer per tumör cell6; i post hoc-analyserna beaktades endast 2 + och 3 + signaler, som var lättare att tolka. I en annan studie, resultaten delades in i två poäng: RNA CISH "hög" och RNA CISH "låg". RNA CISH "hög" poäng definierades av mer än 50% av färgade cancer celler, eller genom färgning som täcker mer än 80% av cellytan (Nucleus och cytoplasman) i minst 30% av cancer cellerna, som observerats med en 20x mål (figur 1)21.

När det gäller positiva kontroller bör PPIB-signalen synas som punktuell prickar inom cell kärror vid 20x – 40x förstoring. När det gäller negativa kontroll bilder, en prick till varje 10 celler som visar bakgrund DAB färgning per 20x Mikroskop fält är acceptabelt.

Figure 1
Figur 1: exempel på "låg" och "hög" RNA-CISH-färgning. (A och B) RNA CISH "låg" poäng färgning i orofaryngeal skivepitelcancer cell carcinomas. Färgning observeras i under 50% av tumör cellerna och täcker mindre än 80% av cellytan. (C och D) RNA cish "High" score färgning i orofaryngeal skivepitelcancer. Färgning observeras i mer än 50% av tumör cellerna och, i detta fall, infärgnings ytan överstiger 80% i mer än 30% av tumör cellerna. Denna siffra har ändrats från Augustin et al.21vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HPV RNA CISH utförs med ett köpt kit är ett kraftfullt verktyg för att upptäcka virus avskrifter och det tyder på aktiv HPV-infektion. Utförs manuellt, stegen i protokollet är övergripande lätt att följa, och det köpta kit är bekvämt. Denna teknik tillåter färgning av 19 histologiska prover plus en kontroll bild på en gång, och analysen varar runt 8 h. Det är viktigt att inte låta proverna torka ut mellan stegen om inte annat anges. Förbehandlings tillståndet kan behöva justeras beroende på den manipulerade vävnaden.

HPV E6-E7 mRNA uttrycks signal detekteras med en exakt rumslig upplösning, vilket utesluter all kontaminering från HPV-infekterade nonneoplastiska celler i anslutning till tumören. Detektion av HPV E6 och E7 RNA är funktionellt relevant eftersom dessa transkriptioner behövs för HPV-inducerad cell omvandling genom deras interaktion med de cellulära p53-och pRb-proteinerna4. Därför, i precancerösa lesioner i livmoder halsen, HPV-RNA CISH kan hjälpa diskriminera låggradig intraepitelial lesioner (LSIL) från höggradig intraepitelial lesioner (HSIL) enligt lokalisering av signalen: i de flesta fall av LSIL, riklig diffust färgade kärnor är märkta hela epitelial tjocklek, vilket tyder på en produktiv fas. HSIL uppvisar antingen rikligt diffust färgade cell kärnor i det ytliga skiktet, samexisterar med starka nukleära och cytoplasmatiska interpunktera signaler i det undre skiktet (i lesioner som tidigare kallades Cin II), eller stark nukleär färgning med cytoplasmatiska prickar hela epitelet, vilket indikerar den transformerande fasen av HPV-infektion (i lesioner som tidigare kallades Cin 3)22.

Även om det ännu inte finns någon standard rekommendation för semikvantitativ utvärdering av signalen, rapporterar vissa författare en klinisk relevans eftersom den semikvantitativa utvärderingen av HPV E6-och E7-transkriptioner har gjort det möjligt att identifiera två prognostiska grupper av HPV-relaterade patienter med HNSCC21. Det har antagits att detektion av HPV-DNA utan E6-och E7-transkriptioner eller med endast låga halter av E6-och E7-avskrifter skulle vara funktionellt irrelevant och att sådana patienter bör slås samman med HPV-negativa cancer patienter21. med 23.

När det gäller begränsningar av detta förfarande, är det postulat att några icke-specifika kors hybridiseringar kan hända i vissa fall, som en hypotes av Dreyer et al.23 RNA cish kanske inte lämpar sig för diskriminering mellan E6/E7 RNA-avskrifter och viral DNA, eftersom protokollet innehåller en 100 ° c Värmebehandlings steg, som misstänks möjliggöra viral DNA-denaturering23. Detta stöds av observation av två typer av signaler i positiva fall, nämligen stark färgning främst lokaliserad i tumör cell kärnor, samt en fin granulär signal i cytoplasman. Eftersom den sond som används i detta protokoll specifikt binder HPV-genotyperna 16 och 18, som är involverade i en stor majoritet av HPV-relaterade HNSCC4, kan enstaka HPV-associerade fall MISSAS av RNA cish, antingen på grund av vissa HPV-genotyper som inte som ingår i sonden, eller på grund av mutationer eller borttagningar av primer bindnings ställen. Slutligen kräver denna metod kostsamma reagenser och enheter och är inte lätt tillgänglig i rutinmässig praxis.

För varje prov, behövs totalt tre avsnitt: en för att utföra HPV-analysen, en för den positiva kontrollen, och en för den negativa kontrollen. Eftersom RNA är en bräcklig molekyl och kan försämras med tiden i FFPE-prover, måste kvaliteten på transkriptioner kontrol leras för varje prov, med hjälp av positiva kontroll prober som ppib, DNA-riktad RNA-polymeras II subenhet RPB1 (Polr2a), eller polyubiquitin-C (UBC) , som är mänskliga hus hållning gener. Dessutom, när det finns en semikvantitativ metod, måste signalen normaliseras till den hus hållning gen kontroll sonden21. Den rekommenderade positiva kontrollen för varje vävnad kan finnas i tillverkarens anvisningar. En nyligen genomförda studie bekräftar dock att mRNA-uttryck kan studeras på ett robust, både i prospektiva och retrospektiva prover, som visar jämförbara mRNA-nivåer mellan prover från 2004 och från 2008. Detta är till förmån för den relativa integriteten av mRNA över tid24. Den rekommenderade negativa kontroll sonden som används för att undvika ospecifik färgning är den bakterie gen som kodar för DAPB.

Här beskrivs kromogena in situ hybridisering av HPV-RNA som utförs manuellt. Denna teknik kan också utföras med fluorescerande märkning och/eller i kombination med konventionell immunofärgning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

CB: styrelser, seminarier: MSD, BMS, AstraZeneca, Roche

Acknowledgments

Författarna tackar Institutionen för patologi Hopital européen Georges Pompidou och Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel och Gisèle legall); Histologiplattformen av PARCC, Hopital européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre); Virginia Clark för språk redigering; Alexandra Elbakyan för hennes bidrag.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hematoxylin solution, Gill No. 1 Merck GHS132
HybEZ Oven (110v) Advanced Cell Diagnostics Inc. 321710
HybEZ slide rack Advanced Cell Diagnostics Inc. 300104
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen Advanced Cell Diagnostics Inc. 310018
RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN Advanced Cell Diagnostics Inc. 322310 This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B
RNAscope 3-Plex Negative Control Probe Advanced Cell Diagnostics Inc. 320871 DAPB
RNAscope 3-Plex Positive Control Probe Advanced Cell Diagnostics Inc. 320861 PPIB
RNAscope H202 & Protease Plus Reagent Advanced Cell Diagnostics Inc. 322330 Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1
RNAscope Probe- HPV16/18 Advanced Cell Diagnostics Inc. 311121
RNAscope Target Retrieval Reagents Advanced Cell Diagnostics Inc. 322000
RNAscope Wash Buffer Reagents Advanced Cell Diagnostics Inc. 310091 Wash Buffer 50X x4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lowy, D. R., Schiller, J. T. Reducing HPV-associated cancer globally. Cancer Prevention Research.(Philadelphia, PA). 5 (1), 18-23 (2012).
  2. Laban, S., Hoffmann, T. K. Human Papillomavirus Immunity in Oropharyngeal Cancer: Time to Change the Game? Clinical Cancer Research. 24 (3), 505-507 (2018).
  3. Wiest, T., Schwarz, E., Enders, C., Flechtenmacher, C., Bosch, F. X. Involvement of intact HPV16 E6/E7 gene expression in head and neck cancers with unaltered p53 status and perturbed pRb cell cycle control. Oncogene. 21 (10), 1510-1517 (2002).
  4. Ndiaye, C., et al. HPV DNA, E6/E7 mRNA, and p16INK4a detection in head and neck cancers: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Oncology. 15 (12), 1319-1331 (2014).
  5. Mills, A. M., Dirks, D. C., Poulter, M. D., Mills, S. E., Stoler, M. H. HR-HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization. The American Journal of Surgical Pathology. 41 (5), 607-615 (2017).
  6. Mendez-Pena, J. E., Sadow, P. M., Nose, V., Hoang, M. P. RNA chromogenic in situ hybridization assay with clinical automated platform is a sensitive method in detecting high-risk human papillomavirus in squamous cell carcinoma. Human Pathology. 63, 184-189 (2017).
  7. Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV driven oropharyngeal cancers: Comparing p16 based algorithms with the RNAscope HPV-test. Oral Oncology. 62, 101-108 (2016).
  8. Lewis, J. S., et al. Human Papillomavirus Testing in Head and Neck Carcinomas: Guideline From the College of American Pathologists. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 142 (5), 559-597 (2018).
  9. Mills, A. M., Coppock, J. D., Willis, B. C., Stoler, M. H. HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization in the Diagnosis of Cervical Low-grade Squamous Intraepithelial Lesions (LSIL). The American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 192-200 (2018).
  10. El-Naggar, A., Chan, J. K. C., Grandis, J. R., Takata, T., Slootweg, P. J. WHO Classification of Head and Neck Tumours. , International Agency for Research on Cancer. Lyon, France. (2017).
  11. Ang, K. K., et al. Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer. The New England Journal of Medicine. 363 (1), 24-35 (2010).
  12. Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
  13. Outh-Gauer, S., et al. Immunotherapy in head and neck cancers: a new challenge for immunologists, pathologists and clinicians. Cancer Treatment Reviews. 65, 54-64 (2018).
  14. Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV-driven head and neck cancer with a single test in routine clinical practice. Modern Pathology. 28 (12), 1518-1527 (2015).
  15. Bishop, J. A., et al. Detection of Transcriptionally Active High-risk HPV in Patients With Head and Neck Squamous Cell Carcinoma as Visualized by a Novel E6/E7 mRNA In Situ Hybridization Method. The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1874-1882 (2012).
  16. Hsieh, M. -S., Lee, Y. -H., Jin, Y. -T., Huang, W. -C. Strong SOX10 expression in human papillomavirus-related multiphenotypic sinonasal carcinoma: report of 6 new cases validated by high-risk human papillomavirus mRNA in situ hybridization test. Human Pathology. 82, 264-272 (2018).
  17. Shi, W., et al. Comparative Prognostic Value of HPV16 E6 mRNA Compared With In Situ Hybridization for Human Oropharyngeal Squamous Carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 27 (36), 6213-6221 (2009).
  18. Kuo, K. -T., et al. The biomarkers of human papillomavirus infection in tonsillar squamous cell carcinoma—molecular basis and predicting favorable outcome. Modern Pathology. 21 (4), 376-386 (2008).
  19. Augustin, J., et al. Evaluation of the efficacy of the four tests (p16 immunochemistry, PCR, DNA and RNA In situ Hybridization) to evaluate a Human Papillomavirus infection in head and neck cancers: a cohort of 348 French squamous cell carcinomas. Human Pathology. , (2018).
  20. Jung, A. C., et al. Biological and clinical relevance of transcriptionally active human papillomavirus (HPV) infection in oropharynx squamous cell carcinoma. International Journal of Cancer. 126 (8), 1882-1894 (2009).
  21. Augustin, J., et al. HPV RNA CISH score identifies two prognostic groups in a p16 positive oropharyngeal squamous cell carcinoma population. Modern Pathology. , (2018).
  22. Evans, M. F., et al. HPV E6/E7 RNA In Situ Hybridization Signal Patterns as Biomarkers of Three-Tier Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade. PLOS ONE. 9 (3), e91142 (2014).
  23. Dreyer, J. H., Hauck, F., Oliveira-Silva, M., Barros, M. H. M., Niedobitek, G. Detection of HPV infection in head and neck squamous cell carcinoma: a practical proposal. Virchows Archiv. 462 (4), 381-389 (2013).
  24. Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. , (2017).

Tags

Genetik kromogent in situ hybridisering HPV transkription semikvantitativ analys huvud-och hals cancer E6 E7 RNA skivepitelcancer
Kromogent in situ hybridisering SS ett verktyg för HPV-relaterade huvud och hals cancer diagnos
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Outh-Gauer, S., Augustin, J.,… More

Outh-Gauer, S., Augustin, J., Mandavit, M., Grard, O., Denize, T., Nervo, M., Lépine, C., Rassy, M., Tartour, E., Badoual, C. Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis. J. Vis. Exp. (148), e59422, doi:10.3791/59422 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter