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Genetics

L'hybridation in situ chromogénique est un outil pour le diagnostic du cancer de la tête et du cou lié au VPH

Published: June 14, 2019 doi: 10.3791/59422
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1, 1, 1, 2, 2,3, 1,2
1Department of Pathology, Georges Pompidou European Hospital, Assistance publique - Hôpitaux de Paris (APHP), Paris Descartes University, 2Paris Cardiovascular Research Center (PARCC), Institut national de la santé et de la recherche médicale (Inserm) U970, 3Laboratory of Immunology, Georges Pompidou European Hospital, APHP, Paris Descartes University

Summary

L'hybridation in situ de l'ARN de papillomavirus humain (HPV) est considérée comme l'une des normes d'or pour la détection active d'infection par le papillomavirus humain dans les tumeurs. Il permet la visualisation de l'expression de l'ARNm HPV E6-E7 avec la localisation et l'évaluation semi-quantitative de son signal.

Abstract

L'infection par le virus du papillome humain (VPH) est un facteur de risque majeur pour un sous-type de carcinome épistologique oropharyngé (OPSCC), qui tend à être associé à de meilleurs résultats que l'OPSCC lié à l'alcool et au tabac. L'hybridation in situ chromogénique (CISH) de l'ARN viral du VPH pourrait permettre l'évaluation semi-quantitative des transcriptions virales des protéines oncogènes E6 et E7 et une visualisation in situ avec une bonne résolution spatiale. Cette technique permet de diagnostiquer une infection active avec la visualisation de la transcription du VPH dans les cellules infectées par le VPH tumoral. Un avantage de cette technique est l'évitement de la contamination des cellules non-néoplastiques HPV-infectées adjacentes à la tumeur. Dans l'ensemble, ses bons résultats en matière de diagnostic ont été considérés comme l'étalon-or pour l'identification active de l'infection par le VPH. Étant donné que l'interaction des protéines virales E6 et E7 avec les protéines cellulaires pRb et p53 est obligatoire pour la transformation cellulaire, l'ARN HPV CISH est fonctionnellement pertinent et reflète vivement l'infection oncogène active par le VPH. Cette technique est également pertinente sur le plan clinique puisque des niveaux de transcription du VPH « faibles » ou « élevés » ont aidé à identifier deux groupes de pronostic chez les patients atteints d'un cancer de la tête et du cou positif au VPH. Ici, nous présentons le protocole pour l'ARN HPV manuel CISH effectué sur formaline-fixe paraffine-embedded (FFPE) diapositives avec un kit obtenu auprès du fabricant. Au lieu de la révélation chromogénique, l'hybridation in situ d'ARN peut également être exécutée avec la révélation fluorescente (RNA FISH). Il peut également être combiné avec l'immunostaining conventionnel.

Introduction

L'ARN VPH CISH est un outil puissant pour la détection de l'infection active par le VPH, qui peut s'avérer cruciale dans les lésions bénignes ou malignes à divers endroits tels que l'oropharynx ou le col utérin. La détection d'une infection active au VPH peut appuyer le diagnostic d'une lésion induite par le VPH et, par conséquent, influencer son traitement et son pronostic.

Le VPH est l'infection sexuellement transmissible la plus fréquente, et plus de 100 génotypes viraux ont été décrits1. Schématiquement, on sait que les génotypes à faible risque comme les génotypes 6 et 11 induisent des verrues génitales, une papillomatose respiratoire récurrente et d'autres lésions bénignes, tandis que les génotypes à haut risque tels que les génotypes 16 et 18 sont responsables de la plupart des cancers du col de l'utérus. et les cancers anaux et jouent un rôle dans l'oncogenèse HNSCC dans des proportions variables comme expliqué par les données épidémiologiques régionales2.

Plusieurs outils sont disponibles pour la détection de l'infection par le VPH. Comme une infection à haut risque du VPH conduit à l'expression des protéines oncogènes virales E6 et E73, la détection des transcriptions E6 et E7 est largement considérée comme l'étalon-or pour l'identification active de l'infection par le VPH4. L'ARN VPH CISH peut être effectué sur des échantillons de FFPE qui sont assez facilement obtenus auprès de patients souffrant de diverses maladies liées au VPH. Sa performance a été évaluée dans la néoplasie intraépithéliale squamous dans le col de l'utérus, l'anus, et le vagin, et dans le carcinome épidermoïde invasif dans le col de l'utérus, l'anus, et le tractus aérodigestif supérieur5: il atteint une sensibilité de plus de 98% parmi les cas positifs de réaction en chaîne de polymérase d'ADN de HPV (PCR) C'est légèrement mieux que p16 immunostaining (93%) et l'hybridation in situ de l'ADN du VPH (DNA ISH : 97 %), qui sont plus couramment utilisées. Dans une autre cohorte de 57 patients présentant le carcinome épidermoïde (CSC) résultant de la région de tête et de cou, de la région génitale, de la peau, et de l'appareil urinaire, comparé à l'ISH d'ADN de HPV, l'ARN de HPV CISH a réalisé une meilleure sensibilité (100% contre 88%) et la spécificité (87% contre 74%)6.

L'immunostaining P16 est un marqueur indirect reflétant la perturbation du cycle cellulaire qui peut être causée (mais pas exclusivement) par l'infection par le VPH4,7. Ce test rentable possède une bonne sensibilité et une valeur prédictive négative et est recommandé comme marqueur de substitution de l'infection à haut risque par le cancer du VPH dans le cancer de l'oropharynx (OPC) par le College of American Pathologists (CAP) et par l'Union for International Lutte contre le cancer (UICC)8.

Bien que cet article se concentre uniquement sur la détection du VPH dans HNSCC, HPV ARN CISH est cliniquement pertinent dans diverses autres conditions qui impliquent l'infection par le VPH. Par exemple, cette technique peut améliorer l'exactitude du diagnostic des lésions intraépithéliales squamous de qualité inférieure du col de l'utérus (LSIL, autrefois connu sous le nom de néoplasie intraépithélial cervicale, catégorie 1 [CIN1]) pour les cas morphologiquement ambigus9. En ce qui concerne le CSC oropharyngé, le CISH de l'ARN Du VPH permet l'identification du CSC lié au VPH, étiqueté comme distinct du CSC oropharyngé sans lien avec le VPH, lors de la huitième édition récente de la Classification TNM du cancer de la tête et du cou (de l'Union for International Cancer Contrôle [UICC])10. Étant donné que le SCC lié au VPH présente un meilleur pronostic avec une survie plus longue et une sensibilité accrue à la radiothérapie et à la chimiothérapie que le CSC11,12,13, la détection de l'infection par le VPH peut avoir un impact gestion du patient14,15. En outre, hPV ARN CISH peut être utilisé pour le diagnostic du carcinome multiphénotypic multiphénotypic avec un signal plus élevé que l'ADN hPV CISH16. Plusieurs analyses multivariées suggèrent que la détection des transcriptions E6 et E7 est corrélée avec un meilleur pronostic dans le SCC oropharyngé global7,15,17,18 et dans le sous-groupe de p16-positive oropharyngeal SCC19,20.

Ici, nous présentons le protocole pour l'ARN HPV manuel CISH effectué sur les diapositives FFPE avec un kit obtenu auprès du fabricant.

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Protocol

Le protocole suit des directives éthiques et a été approuvé par le Comité d'éthique (Comité-de-Protection-des-Personnes Ile-de-France-II, #2015 09-04).

1. Préparation des matériaux

  1. Préparation d'un tampon de lavage 1x
    1. Préparer 3 L de 1x tampon de lavage en ajoutant 2,94 L d'eau distillée et une bouteille (60 ml) de tampon de lavage (50x) (voir la table des matériaux) à un grand carboy. Bien mélanger.
      REMARQUE : Le tampon de lavage 1x peut être préparé à l'avance et conservé à température ambiante jusqu'à 1 mois.
  2. Préparation des réactifs de contre-staining
    1. Préparer 50% d'hématoxylin.
      1. Dans un capot de fumée, ajouter 100 ml d'hématoxyline I de Gill (voir la Table des Matériaux)à 100 ml d'eau distillée dans un plat de coloration.
        REMARQUE : La solution de coloration à 50 % d'hématoxylin peut être réutilisée jusqu'à 1 semaine.
    2. Préparer 0,02 % (w/v) d'ammoniac (réactif de rougissement).
    3. Dans le capot de fumée, ajouter 1,43 ml d'hydroxyde d'ammonium de 1 N à 250 ml d'eau distillée dans un cylindre gradué ou un autre récipient. Sceller le cylindre avec du film de paraffine. Bien mélanger son contenu pour 3x-5x.
      REMARQUE : Pour la quantitation d'analyse, il est essentiel d'utiliser de l'hydroxyde d'ammonium. Les réactifs peuvent être préparés à l'avance. Assurez-vous que tous les conteneurs restent couverts.
  3. Préparation d'un réactif de récupération de cible 1x
    1. Dans un grand bécher, ajouter 70 ml de réactif de récupération cible de 10x (voir la Table des Matériaux)à 630 ml d'eau distillée.
    2. Placer le bécher sur une plaque chauffante à l'agitateur magnétique. Couvrir de papier d'aluminium.
    3. Faire bouillir son contenu à 100 oC pendant 10 à 15 min.
      REMARQUE : Ne le laissez pas bouillir pendant plus de 30 min.
  4. Équilibration de réactif
    1. Assurez-vous que le four d'hybridation est allumé et à 40 oC. Placer du papier humidificateur humide au fond du plateau.
      REMARQUE : Un four d'hybridation (voir la Table des Matériaux)est nécessaire pour les étapes 3.4 à 4.2.
    2. Retirez les réactifs d'amplification (AMP1-AMP6, voir la Table des Matériaux) du réfrigérateur et conservez-les à température ambiante, au moins 30 minutes avant l'étape d'incubation pertinente.
    3. Avant chaque utilisation, réchauffez la cible et/ou contrôlez les sondes pendant au moins 10 minutes à 40 oC dans le four ou dans un bain d'eau ou un incubateur.

2. Amélioration de l'adhérence et deparaffinisation dans le capot de fumée

REMARQUE : Démarrez le protocole avec des échantillons histologiques de 3 à 5 m d'épaisseur montés sur des lames non tachées.

  1. Afin d'améliorer l'adhérence, faire cuire les lames à 60 oC pendant 1 h ou à 40 oC pendant la nuit dans un four.
  2. Chargez le porte-diapositives avec des toboggans histologiques non tachés. Immerger le porte-lames pendant 5 min dans du xylène frais contenu dans un plat de coloration, avec une agitation occasionnelle. répéter avec du xylène frais.
  3. Immerger le porte-glissière pendant 3 min dans de l'éthanol frais à 100 % contenu dans un plat de coloration, avec une agitation constante. Répéter l'opération avec de l'éthanol frais à 100 %.
  4. Laisser sécher les lames pendant 2 min à température ambiante.
    REMARQUE : Ne réutilisez pas les réactifs de déparaffinisation pour déshydrater les lames après l'échange.

3. Prétraitement des tissus

REMARQUE : Ces étapes suivent la recommandation de prétraitement « standard » selon les instructions du fabricant pour les échantillons de tête et de cou. Le moment des sections 3.1 et 3.2 peut devoir être ajusté en fonction du tissu manipulé.

  1. Blocus de l'activité peroxidase
    1. Ajouter 4 à 6 gouttes de peroxyde d'hydrogène (voir la Table des matériaux)à chaque lame et les incuber pendant 10 min à température ambiante.
    2. Laver les lames 2x pendant 2 min dans de l'eau distillée à température ambiante.
  2. Rupture des limites de l'ARN/tissu
    1. À l'ifon, retirer le papier d'aluminium du réactif de récupération de la cible 1x (TTR1x) de la section 1.3 et cesser de remuer. Immerger le porte-diapositives lentement et très soigneusement pendant 15 min. Couvrir à nouveau le bécher avec le papier d'aluminium.
      REMARQUE : Le frémissement doit persister pendant cette étape.
      CAUTION : Utilisez la griffe pour manipuler le papier d'aluminium et le porte-glissière afin d'éviter les brûlures. Assurez-vous de porter un équipement de protection individuelle approprié, comme des gants et une blouse de laboratoire.
    2. Avec la griffe, transférer immédiatement le porte-lames chauds dans un bain d'eau distillé et le laver pendant 2 min.
      REMARQUE : Assurez-vous que les échantillons ne refroidissent pas dans le TTR1x.
    3. Laver les lames dans de l'éthanol frais à 100 % pendant 2 min.
    4. Laisser sécher les lames à température ambiante pendant 2 min.
  3. Création de barrière
    1. Avec un stylo barrière hydrophobe (voir la Table des Matériaux), dessinez une barrière autour de l'échantillon. Laisser sécher au moins 5 min.
      REMARQUE : Laissez la barrière se dessécher. S'il s'use pendant la procédure, n'hésitez pas à le dessiner à nouveau. Évitez de toucher le tissu avec le stylo. Le protocole peut être mis en pause pendant la nuit ici.
  4. Digestion de protéase
    1. Placez les diapositives sur le porte-glissière et ajoutez 4 gouttes de Protease Plus par échantillon (voir la Table des Matériaux).
    2. Couvrir le plateau de contrôle de l'humidité avec un couvercle et l'insérer dans le four d'hybridation pendant 30 min à 40 oC.
      REMARQUE : Pour éviter l'évaporation, assurez-vous que le bouton de virage est complètement tourné vers la position de verrouillage.
    3. Retirer le plateau du four et retirer la grille.
    4. Une glissade à la fois, retirez rapidement tout excès de liquide et placez-la dans un porte-glissière immergé dans un plat de coloration rempli d'eau distillée.
    5. Laver les lames 2x pendant 2 min dans de l'eau distillée à température ambiante. Agiter constamment.

4. Exécution de l'asdition

REMARQUE : Ne laissez pas les sections sécher entre les étapes d'incubation.

  1. Hybridation de la sonde HPV
    REMARQUE : Assurez-vous que les sondes sont préchaudes pour dissoudre toute précipitation avant leur utilisation. Pour cette étape, au lieu de la sonde HPV, peptidyl-prolyl isomerase B (PPIB) pour le contrôle positif ou la réductase de dihydrodipicolinate (DAPB) pour le contrôle négatif (voir la Table des Matériaux) peut également être utilisé.
    1. Appuyez et/ou faites glisser les diapositives pour enlever tout excès de liquide et placez-les dans le porte-glissière. Ajouter 4 gouttes de sonde HPV pour couvrir entièrement chaque section.
    2. Couvrir le plateau d'un couvercle et l'insérer dans le four pendant 2 h à 40 oC.
      REMARQUE : Pour éviter l'évaporation, assurez-vous que le nob de virage est complètement tourné vers la position de verrouillage.
    3. Retirer le plateau du four et retirer la grille.
    4. Une glissade à la fois, retirez rapidement tout excès de liquide et placez-la dans un porte-glissière immergé dans un plat de coloration rempli de tampon de lavage 1x.
    5. Laver les lames dans un tampon de lavage 1x pendant 2 min à température ambiante avec une agitation constante. Répétez cette opération avec un tampon de lavage 1x frais.
  2. Hybridation des AMP1, AMP2, AMP3 et AMP4
    REMARQUE : Ces étapes comprennent l'hybridation dans le four d'hybridation et l'AMP1-AMP4 à partir du kit acheté (voir la Table des matériaux).
    1. Appuyez et/ou faites un mouvement pour enlever tout excès de liquide des lames et placez-les dans le porte-glissière. Ajouter 4 gouttes d'AMP1 pour couvrir entièrement chaque section.
    2. Couvrir le plateau d'un couvercle et l'insérer dans le four pendant 30 min à 40 oC.
    3. Retirer le plateau du four et retirer la grille.
    4. Une glissade à la fois, retirez rapidement tout excès de liquide et placez-la dans un porte-glissière immergé dans un plat de coloration rempli de tampon de lavage 1x.
    5. Laver les lames dans un tampon de lavage 1x pendant 2 min à température ambiante avec une agitation constante. Répétez cette opération avec un tampon de lavage 1x frais.
    6. Répétez les étapes 4.2.1 à 4.2.5, mais utilisez 4 gouttes d'AMP2 au lieu d'AMP1 et incubez pendant 15 min à 40 oC. Laver les lames 2x pendant 2 min, les deux fois dans un tampon de lavage frais.
    7. Répétez les étapes 4.2.1 à 4.2.5, mais utilisez 4 gouttes d'AMP3 au lieu d'AMP1 et incubez pendant 30 min à 40 oC. Laver les lames 2x pendant 2 min, les deux fois dans un tampon de lavage frais.
    8. Répétez les étapes 4.2.1 à 4.2.5, mais utilisez 4 gouttes d'AMP4 au lieu d'AMP1 et incubez pendant 15 min à 40 oC. Laver les lames 2x pendant 2 min, les deux fois dans un tampon de lavage frais.
  3. Hybridation des AMP5 et AMP6
    REMARQUE : Ces étapes n'incluent pas l'hybridation dans le four, mais l'hybridation à température ambiante. AMP5 et AMP6 proviennent du kit acheté (voir la Table des Matériaux).
    1. Appuyez et/ou faites glisser les diapositives pour enlever tout excès de liquide et placez-les dans le porte-glissière. Ajouter 4 gouttes d'AMP5 pour couvrir entièrement chaque section.
    2. Couvrir le plateau d'un couvercle et incuber pendant 30 min à températureambiante.
    3. Une glissade à la fois, retirez rapidement tout excès de liquide et placez-le dans un porte-glissière immergé dans un plat de coloration rempli de tampon de lavage 1x.
    4. Laver les lames dans un tampon de lavage 1x pendant 2 min à température ambiante avec une agitation constante. Répétez cette opération avec un tampon de lavage 1x frais.
    5. Répétez les étapes 4.3.1 à 4.3.4, mais utilisez 4 gouttes d'AMP6 au lieu d'AMP5 et incubez pendant 15 min à température ambiante. Laver les lames 2x pendant 2 min, les deux fois dans un tampon de lavage frais.

5. Détection de signal avec 3,3'-diaminobenzidine

CAUTION: Diaminobenzidine (DAB) est toxique. Respectez les précautions et les directives de sécurité appropriées lors de l'élimination et de la manipulation de ce produit chimique.

  1. Mélangez des volumes égaux de DAB-A et DAB-B (voir la Table des Matériaux)dans un tube de taille appropriée en distribuant le même nombre de gouttes de chaque solution. Faire 120 l de substrat DAB par section (2 gouttes de chaque réactif/total de 4). Bien mélanger pour 3x-5x.
  2. Prenez chaque diapositive, une à la fois, à partir du porte-glissière et appuyez sur et/ou faites glisser pour enlever l'excès de liquide avant de le placer dans le porte-glissière.
  3. Pipette 120 L de DAB sur chaque section de tissu. Assurez-vous que les sections sont couvertes et incuber pendant 10 min à température ambiante.
  4. Disposer le DAB restant conformément à la réglementation locale et insérer la glissière dans un porte-glissière immergé dans un plat de coloration rempli d'eau du robinet.

6. Contre-attaque

  1. Déplacer la grille à glissière dans un plat de coloration contenant 50% de solution de coloration à l'hématoxylin laisser reposer pendant 30 s à température ambiante. Notez que les diapositives deviendront violettes.
  2. Transférez immédiatement la grille à la maquette dans un plat de coloration contenant de l'eau du robinet, et lavez les lames 3x-5x en déplaçant le rack de haut en bas.
  3. Continuez à répéter l'étape de lavage avec de l'eau du robinet fraîche jusqu'à ce que les lames soient claires, tandis que les sections restent pourpres.
  4. Remplacer l'eau du robinet dans le plat de coloration avec 0,02% d'ammoniac. Déplacez le rack vers le haut et vers le bas 2x-3x. Notez que la section tissulaire doit devenir bleue.
  5. Remplacer l'eau d'ammoniac par de l'eau du robinet. Laver les lames 3x-5x.

7. Déshydratation

  1. Déplacez le porte-lames vers un plat de coloration contenant 70 % d'éthanol dans le capot de fumée et laissez-le reposer pendant 2 min avec une agitation occasionnelle.
  2. Déplacer le porte-lames vers un premier plat de coloration contenant 100 % d'éthanol et laisser reposer pendant 2 min avec une agitation occasionnelle.
  3. Déplacer le porte-lames vers un deuxième plat de coloration contenant 100 % d'éthanol et laisser reposer pendant 2 min avec une agitation occasionnelle.
  4. Déplacer la grille à glissière dans un plat de coloration contenant du xylène et laisser reposer pendant 5 min avec une agitation occasionnelle.

8. Montage de glissière

  1. Retirez les glissières du porte-glissière et déposez-les à plat avec les sections faisant face dans le capot de fumée.
  2. Montez une diapositive à la fois en ajoutant 1 goutte d'un support de montage à base de xylène à chaque glissière et en plaçant soigneusement une glissière de 24 mm x 50 mm sur la section. Évitez de piéger les bulles d'air.
  3. Séchez les lames à l'air pendant 5 min.

9. Évaluation de l'échantillon

  1. Examinez les sections de tissu sous un microscope de champ lumineux standard au grossissement de 20x-40x.

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Representative Results

Comme décrit ici, dans le cancer de cellules squamous de tête et de cou, un cas peut être considéré positif en présence de la coloration punctiforme brune dans le cytoplasme ou dans les noyaux des cellules de tumeur. Dans la plupart des études, le signal est considéré comme « positif » ou « non détecté »14. Des méthodes de semi-quantification du signal ont été signalées mais manquent de normalisation entre les équipes. Par exemple, dans certaines études, les signaux ont été notés comme 1 avec 1/3 points par cellule tumorale, 2 avec 4 à 9 points par cellule tumorale, ou 3 avec 10 points ou plus par cellule tumorale6; dans les analyses post hoc, seuls les signaux de 2 et 3, qui étaient plus faciles à interpréter, ont été pris en compte. Dans une autre étude, les résultats ont été divisés en deux scores : ARN CISH « élevé » et ARN CISH « faible ». Le score « élevé » de CISH d'ARN a été défini par plus de 50% des cellules cancéreuses souillées, ou par la coloration couvrant plus de 80% de la surface cellulaire (noyau et cytoplasme) dans au moins 30% des cellules cancéreuses, comme observé avec un objectif de 20x (figure 1)21.

En ce qui concerne les contrôles positifs, le signal PPIB devrait être visible sous forme de points ponctuation dans les noyaux cellulaires à grossissement de 20x à 40x. En ce qui concerne les diapositives de contrôle négatif, un point à chaque 10 cellules affichant la coloration DAB de fond par champ de microscope 20x est acceptable.

Figure 1
Figure 1 : Exemples de coloration CISH à ARN « faible » et « élevé ». (A et B) ARN CISH "faible" score coloration dans les carcinomes épisomiques oropharyngés. La coloration est observée dans moins de 50% des cellules tumorales et couvre moins de 80% de la surface cellulaire. (C et D) ARN CISH "high" score coloration in oropharyngeal squamous cell carcinomas. La coloration est observée dans plus de 50% des cellules tumorales et, dans ce cas, la surface de coloration dépasse 80% dans plus de 30% des cellules tumorales. Ce chiffre a été modifié à partir d'Augustin et coll.21Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

L'ARN VPH CISH effectué avec un kit acheté est un outil puissant pour la détection des transcriptions virales et il indique une infection active au VPH. Exécutées manuellement, les étapes du protocole sont globalement faciles à suivre, et le kit acheté est pratique. Cette technique permet la coloration de 19 échantillons histologiques plus une diapositive de contrôle à la fois, et l'analyse dure environ 8 h. Il est essentiel de ne pas laisser les échantillons sécher entre les étapes, sauf indication contraire. La condition de prétraitement peut devoir être ajustée en fonction du tissu manipulé.

Le signal d'expression de l'ARNm HPV E6-E7 est détecté avec une résolution spatiale précise, excluant ainsi toute contamination par les cellules non néoplastiques infectées par le VPH adjacentes à la tumeur. La détection de l'ARN HPV E6 et E7 est fonctionnellement pertinente puisque ces transcriptions sont nécessaires pour la transformation cellulaire induite par le VPH par leur interaction avec les protéines cellulaires p53 et pRb4. Par conséquent, dans les lésions précancéreuses du col utérin, l'ARN HPV CISH peut aider à discriminer les lésions intraépithéliales de qualité inférieure (LSIL) des lésions intraépithéliales de haute qualité (HSIL) selon la localisation du signal : dans la plupart des cas de LSIL, abondante les noyaux souillés diffusement sont étiquetés tout au long de l'épaisseur épithéliale, ce qui indique une phase productive. HSIL présentent soit des noyaux de cellules souillées diffusement abondants dans la couche superficielle, coexistant avec des signaux de ponctuement nucléaires et cytoplasmiques forts dans la couche inférieure (dans les lésions autrefois connues sous le nom de CIN2), ou de fortes taches nucléaires avec des points cytoplasmiques tout au long de l'épaisseur de l'épithélium, indiquant la phase transformatrice de l'infection par le VPH (dans les lésions autrefois connues sous le nom de CIN3)22.

Bien qu'il n'y ait pas encore de recommandation standard pour l'évaluation semi-quantitative du signal, certains auteurs font état d'une pertinence clinique puisque l'évaluation semi-quantitative des relevés de notes du VPH E6 et E7 a permis l'identification de deux pronostiques parmi les patients HNSCC liés au HPV21. Il a été postulé que la détection de l'ADN du VPH sans transcriptions E6 et E7 ou avec seulement de faibles niveaux de transcriptions E6 et E7 serait fonctionnellement non pertinente et que ces patients devraient être mis en commun avec des patients atteints de cancer du VPH négatif21, 23.

En ce qui concerne les limites de cette procédure, on postule que quelques hybridations croisées non spécifiques pourraient se produire dans certains cas, comme l'a émis l'hypothèse Dreyer et coll.23 RNA CISH peut ne pas convenir à la discrimination entre les transcriptions d'ARN E6/E7 et les relevés d'ARN viraux L'ADN, comme le protocole comprend une étape de traitement thermique de 100 oC, qui est soupçonné de permettre la dénaturation virale de l'ADN23. Ceci est soutenu par l'observation de deux types de signaux dans les cas positifs, à savoir la coloration forte principalement localisée dans les noyaux de cellules tumorales, ainsi qu'un signal granulaire fin dans le cytoplasme. Comme la sonde utilisée dans ce protocole lie spécifiquement les génogétypes 16 et 18 du VPH, qui sont impliqués dans une grande majorité des cas hNSCC4liés au HPV, des cas occasionnels associés au VPH peuvent être manqués par l'ARN CISH, soit en raison de certains génotypes du VPH qui ne sont pas inclus dans la sonde, ou en raison de mutations ou de suppressions de sites de liaison d'amorce. Enfin, cette méthode nécessite des réactifs et des appareils coûteux et n'est pas facilement accessible dans la pratique courante.

Pour chaque échantillon, un total de trois sections sont nécessaires : une pour effectuer l'évaluation du VPH, une pour le contrôle positif et une pour le contrôle négatif. Comme l'ARN est une molécule fragile et pourrait se détériorer au fil du temps dans les échantillons FFPE, la qualité des transcriptions doit être vérifiée pour chaque échantillon, en utilisant des sondes de contrôle positif tels que PPIB, ARN dirigé par l'ADN polymérase II sous-unité RPB1 (Polr2a), ou polyubiquiitin-C (UBC) , qui sont des gènes d'entretien ménager humain. En outre, lorsqu'il y a une approche semi-quantitative, le signal doit être normalisé à la sonde de contrôle génétique d'entretien ménager21. Le contrôle positif recommandé pour chaque tissu peut être trouvé dans les instructions du fabricant. Cependant, une étude récente confirme que l'expression de l'ARNm peut être rigoureusement étudiée à la fois dans des échantillons prospectifs et rétrospectifs, montrant des niveaux comparables d'ARNm entre les échantillons de 2004 et de 2008. Ceci est en faveur de l'intégrité relative de l'ARNm au fil du temps24. La sonde de contrôle négatif recommandée utilisée pour éviter les taches non spécifiques est le codage du gène bactérien pour Le DAPB.

Ici, l'hybridation in situ chromogénique de l'ARN du VPH est décrite comme effectuée manuellement. Cette technique peut également être exécutée avec l'étiquetage fluorescent et/ou combiné avec l'immunostaining conventionnel.

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Disclosures

CB: conseils d'administration, séminaires: MSD, BMS, Astrazeneca, Roche

Acknowledgments

Les auteurs remercient le département de pathologie de l'Hopital Européen Georges Pompidou et Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel et Gisèle Legall); la plate-forme d'histologie du PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre); Virginia Clark pour l'édition linguistique; Alexandra Elbakyan pour sa contribution.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hematoxylin solution, Gill No. 1 Merck GHS132
HybEZ Oven (110v) Advanced Cell Diagnostics Inc. 321710
HybEZ slide rack Advanced Cell Diagnostics Inc. 300104
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen Advanced Cell Diagnostics Inc. 310018
RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN Advanced Cell Diagnostics Inc. 322310 This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B
RNAscope 3-Plex Negative Control Probe Advanced Cell Diagnostics Inc. 320871 DAPB
RNAscope 3-Plex Positive Control Probe Advanced Cell Diagnostics Inc. 320861 PPIB
RNAscope H202 & Protease Plus Reagent Advanced Cell Diagnostics Inc. 322330 Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1
RNAscope Probe- HPV16/18 Advanced Cell Diagnostics Inc. 311121
RNAscope Target Retrieval Reagents Advanced Cell Diagnostics Inc. 322000
RNAscope Wash Buffer Reagents Advanced Cell Diagnostics Inc. 310091 Wash Buffer 50X x4

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References

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Génétique Numéro 148 hybridation in situ chromogénique VPH transcription analyse semi-quantitative cancer de la tête et du cou E6 E7 ARN carcinome épidermoïde
L'hybridation in situ chromogénique est un outil pour le diagnostic du cancer de la tête et du cou lié au VPH
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Outh-Gauer, S., Augustin, J., Mandavit, M., Grard, O., Denize, T., Nervo, M., Lépine, C., Rassy, M., Tartour, E., Badoual, C. Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis. J. Vis. Exp. (148), e59422, doi:10.3791/59422 (2019).

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