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Genetics

原位杂交的色原性杂交是HPV相关头颈部癌症诊断的工具

doi: 10.3791/59422 Published: June 14, 2019

Summary

人皮疹病毒(HPV)RNA原位染色体杂交被认为是肿瘤内活性人皮疹病毒感染检测的黄金标准之一。它允许通过定位和半定量评估其信号来可视化HPV E6-E7 mRNA表达。

Abstract

人皮球瘤病毒 (HPV) 感染是食管鳞状细胞癌 (OPSCC) 亚型的主要危险因素,该病毒往往与与酒精和烟草相关的 OPSCC 更好的结果相关。HPV病毒RNA的原位杂交(CISH)可实现对致癌蛋白E6和E7病毒转录本的半定量评价,并具有良好的空间分辨率的原位可视化。此技术允许通过肿瘤HPV感染细胞中的HPV转录可视化来诊断活动感染。这种技术的一个优点是避免来自肿瘤附近的非肿瘤HPV感染细胞的污染。总体而言,其良好的诊断性能被认为是主动HPV感染鉴定的黄金标准。由于E6和E7病毒蛋白与细胞蛋白pRb和p3的相互作用是强制性的细胞转化,HPV RNA CISH在功能上相关,并敏锐地反映活性致源性HPV感染。这种技术在临床上也相关,因为"低"或"高"HPV转录水平有助于识别HPV相关p16阳性头颈部癌症患者中的两个预后组。在这里,我们介绍在正式固定石蜡嵌入 (FFPE) 幻灯片上执行的手动 HPV RNA CISH 的协议,该幻灯片使用从制造商处获得的工具包。RNA原位杂交也可以用荧光导光(RNA FISH)进行,而不是染色体性揭示。它也可以与传统的免疫染色相结合。

Introduction

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HPV RNA CISH 是检测活动 HPV 感染的有力工具,在诸如口腔或子宫颈等不同部位的良性或恶性病变中可能证明至关重要。活动HPV感染的检测可能支持HPV引起的病变的诊断,从而影响其治疗和预后。

HPV是最常见的性传播感染,超过100种病毒基因型已被描述为1。从原理上讲,低风险基因型(如基因型6和11)已知可诱发生殖器疣、复发性呼吸道性手皮瘤病和其他良性病变,而高风险基因型(如基因型16和18)是大多数宫颈癌的罪魁祸首和肛门癌,并在HNSCC的肿瘤发生发挥作用,比例变化,根据区域流行病学数据2。

有几种工具可用于检测 HPV 感染。由于高危HPV感染导致病毒致癌蛋白E6和E73的表达,E6和E7转录本的检测被广泛认为是主动HPV感染鉴定4的黄金标准。HPV RNA CISH 可在 FFPE 样本上执行,这些样本很容易从患有各种 HPV 相关疾病的患者身上获得。其性能在子宫颈、肛门和阴道的鳞状宫内肿瘤中,以及宫颈、肛门和上呼吸道的侵入性鳞状细胞癌中进行了评估:其灵敏度达到98%以上在HPVDNA聚合酶链反应(PCR)阳性病例中。这略好于p16免疫染色(93%)和HPVDNA原位杂交(DNA ISH:97%),这是更常用的。在另一组57例鳞状细胞癌(SCC)中,与HPV DNA ISH相比,HPV RNA CISH具有更好的敏感性(100%对88%)。和特异性(87%对74%)6 。

P16免疫染色是一种间接标记,反映细胞周期中断,这可能是由HPV感染4,7引起(但不完全) 引起的。这种具有成本效益的测试具有良好的灵敏度和负预测值,被美国病理学家学院(CAP)和国际联盟推荐为奥述林克斯癌症(OPC)高危HPV感染的代用品标志物。癌症控制(UICC)8.

虽然本文只关注HNSCC中HPV的检测,但HPV RNA CISH在涉及HPV感染的各种其他条件下与临床相关。例如,这种技术可以提高诊断的低级鳞状颅内病变的宫颈(LSIL,以前称为宫颈内皮瘤,1级[CIN1])的形态不明确的病例9的诊断的准确性。关于口管SCC,HPV RNA CISH允许识别HPV相关SCC,在最近第八版《头颈癌TNM分类》(国际癌症联盟)中,该SCC与HPV无关的口管SCC有别于HPV。控制 [UICC])10.由于HPV相关SCC表现出更好的预后,更长的生存期和增强的放疗和化疗敏感性比HPV无关SCC11,12,13,HPV感染的检测可能会影响病人管理14,15.此外,HPV RNA CISH可用于诊断HPV相关多表皮癌,其信号高于HPVDNACISH16。几个多变量分析表明,E6 和 E7 转录的检测与奥法林格 SCC 总体7、15、17、18 和p16阳性性食管SCC19、20的子组。

在这里,我们介绍在FFPE幻灯片上执行的手动HPV RNA CISH的协议,使用从制造商获得的工具包。

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Protocol

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该议定书遵循道德准则,并经道德委员会(第二次道德保护委员会,#2015-09-04)批准。

1. 材料的准备

  1. 准备 1x 洗涤缓冲液
    1. 通过在大型车童中加入 2.94 L 蒸馏水和一瓶(60 mL)洗涤缓冲液(50x)(参见材料表),制备 3 L 的 1x 洗涤缓冲液。混合好。
      注:1x洗涤缓冲液可提前准备,并在室温下储存长达1个月。
  2. 反染色试剂的制备
    1. 准备50%血氧林。
      1. 在烟气罩中,在染色盘中将 100 mL 的 Gill 血氧林 I(参见材料表)添加到 100 mL 的蒸馏水中。
        注:50%血氧林染色溶液可重复使用长达1周。
    2. 制备 0.02% (w/v) 氨水(蓝色试剂)。
    3. 在烟气罩中,在分级气缸或其他容器中加入 1.43 mL 的 1 N 氢氧化铵蒸馏水到 250 mL 蒸馏水。用石蜡薄膜密封气缸。将其内容物混合好 3x×5x。
      注:对于测定定量,使用氢氧化铵至关重要。试剂可以提前制备。确保所有容器都包括在内。
  3. 制备1x目标检索试剂
    1. 在大型烧杯中,将 70 mL 的 10x 目标回收试剂(参见材料表)添加到 630 mL 的蒸馏水中。
    2. 将烧杯放在带磁性搅拌器的加热板上。用铝箔盖住它。
    3. 将其内容物在100°C下煮沸10~15分钟。
      注意:不要让它沸腾超过30分钟。
  4. 试剂平衡
    1. 确保混合炉处于 40°C。将湿湿加湿纸放在托盘底部。
      注:步骤3.4至4.2需要杂交烤箱(见材料表)。
    2. 从冰箱中取出扩增试剂(AMP1_AMP6,见材料表),并在相关孵育步骤前至少30分钟将其保持在室温下。
    3. 每次使用前,在烤箱或水浴或培养箱中,在40°C下加热目标和/或控制探头至少10分钟。

2. 在烟罩中增强粘附和脱蜡

注: 在未染色的幻灯片上安装 3⁄5 μm 厚的组织学样本,以启动协议。

  1. 为了增强附着力,在60°C下烘烤幻灯片1小时或在40°C的烤箱中过夜。
  2. 使用未染色的组织学幻灯片为滑轨机架充电。将滑架浸入染色盘中,将滑架浸入新鲜二甲苯中 5 分钟,偶尔会搅拌。重复与新鲜的二甲苯。
  3. 将滑架浸入染色盘中,浸泡3分钟,搅拌不断,含有新鲜100%乙醇。重复使用新鲜的100%乙醇。
  4. 在室温下让幻灯片干燥 2 分钟。
    注:在测定后,请勿重复使用脱蜡试剂,以脱水幻灯片。

3. 组织预处理

注:这些步骤遵循"标准"预处理建议,根据制造商对头部和颈部样品的说明。第 3 . 1 节和 3 . 2 节的时间可能需要根据纵的组织进行调整。

  1. 过氧化物酶活性的阻断
    1. 在每个幻灯片中加入4~6滴过氧化氢(见材料表),并在室温下孵育10分钟。
    2. 在室温下将滑梯在蒸馏水中洗2次2分钟。
  2. RNA/组织边界断裂
    1. 用爪子从第 1.3 节的沸腾 1x 目标回收试剂 (TTR1x) 中取出铝箔,然后停止搅拌。缓慢小心地将滑架浸入 15 分钟,用铝箔再次盖住烧杯。
      注: 在此步骤中,沉浸必须持久。
      注意:使用爪子操纵铝箔和滑架,以避免烧伤。确保佩戴适当的个人防护装备,如手套和实验室外套。
    2. 用爪子,立即将热滑架转移到蒸馏水浴中,洗2分钟。
      注:确保样品在 TTR1x 中不会冷却。
    3. 用新鲜的100%乙醇清洗幻灯片2分钟。
    4. 让幻灯片在室温下干燥 2 分钟。
  3. 障碍创建
    1. 使用疏水屏障笔(见材料表),在样品周围画一个屏障。至少5分钟晾干。
      注:让屏障真正干涸。如果在手术过程中磨损,请不要犹豫,再次绘制它。避免用笔触摸组织。协议可以在这里过夜暂停。
  4. 蛋白酶消化
    1. 将幻灯片放在滑架上,每个样品添加约 4 滴蛋白酶加(参见材料表)。
    2. 用盖子盖住湿度控制托盘,在 40°C 下将其插入杂交炉 30 分钟。
      注:为防止蒸发,请确保转向旋钮完全转向锁定位置。
    3. 从烤箱中取出托盘并拆下滑轨架。
    4. 一次一张幻灯片,快速去除多余的液体,并将幻灯片放入浸没在装满蒸馏水的染色盘中。
    5. 在室温下将滑梯在蒸馏水中洗2次2分钟。不断搅拌。

4. 运行测定

注意:不要让部分在孵化步骤之间干涸。

  1. HPV 探针的杂交
    注:确保探头预热,以溶解任何沉淀在使用前。对于此步骤,也可以使用用于阳性对照的肽酰二醇二醇二甲酰二甲苯乙酯乙酰乙酰乙酰乙酰乙酰乙酰乙酰乙酰乙酯酶(DAPB)进行阴性对照(参见材料表)。
    1. 点击和/或轻拂幻灯片以清除多余的液体并将其放入滑架中。加入+4滴HPV探针,完全覆盖每个部分。
    2. 用盖子盖住托盘,在40°C下将其插入烤箱2小时。
      注:为防止蒸发,请确保转向 nob 完全转向锁定位置。
    3. 从烤箱中取出托盘并拆下滑轨架。
    4. 一次一张幻灯片,快速去除多余的液体,并将幻灯片放入浸没在装有 1x 洗涤缓冲液的染色盘中。
    5. 在室温下用1倍洗涤缓冲液清洗幻灯片2分钟,持续搅拌。用新鲜的1x洗涤缓冲液重复此操作。
  2. AMP1、AMP2、AMP3 和 AMP4 的混合
    注:这些步骤包括杂交炉中的杂交和购买的套件中的 AMP1_AMP4(参见材料表)。
    1. 点击和/或轻拂以去除幻灯片上多余的液体,并将其放入滑架中。添加 +4 滴AMP1以完全覆盖每个部分。
    2. 用盖子盖住托盘,在40°C下将其插入烤箱30分钟。
    3. 从烤箱中取出托盘并拆下滑轨架。
    4. 一次一张幻灯片,快速去除多余的液体,并将幻灯片放入浸没在装有 1x 洗涤缓冲液的染色盘中。
    5. 在室温下用1倍洗涤缓冲液清洗幻灯片2分钟,持续搅拌。用新鲜的1x洗涤缓冲液重复此操作。
    6. 重复步骤 4.2.1~4.2.5,但使用 +4 滴的 AMP2而不是 AMP1,在40°C下孵育15分钟。在新鲜洗涤缓冲液中两次,将幻灯片洗 2 次 2 分钟。
    7. 重复步骤 4.2.1~4.2.5,但使用 +4 滴AMP3代替 AMP1,在40°C下孵育30分钟。在新鲜洗涤缓冲液中两次,将幻灯片洗 2 次 2 分钟。
    8. 重复步骤 4.2.1~4.2.5,但使用 +4 滴AMP4代替 AMP1,在40°C下孵育15分钟。在新鲜洗涤缓冲液中两次,将幻灯片洗 2 次 2 分钟。
  3. AMP5 和 AMP6 的混合
    注:这些步骤不包括烤箱中的杂交,而是室温下的混合。AMP5 和 AMP6 来自购买的套件(参见材料表)。
    1. 点击和/或轻拂幻灯片以清除多余的液体并将其放入滑架中。添加 +4 滴AMP5完全覆盖每个部分。
    2. 用盖子盖住托盘,在室温下孵育30分钟。
    3. 一次一张幻灯片,快速去除多余的液体,并将其放入浸没在装有 1x 洗涤缓冲液的染色盘中。
    4. 在室温下用1倍洗涤缓冲液清洗幻灯片2分钟,持续搅拌。用新鲜的1x洗涤缓冲液重复此操作。
    5. 重复步骤 4.3.1~4.3.4,但使用 +4 滴AMP6而不是 AMP5,在室温下孵育15分钟。在新鲜洗涤缓冲液中两次,将幻灯片洗 2 次 2 分钟。

5. 信号检测与3,3'-二氨基苯胺

注意:二甲苯丁(DAB)是有毒的。在处置和处理此化学品时,请遵循相应的预防措施和安全准则。

  1. 通过分配相同数量的溶液,将相同数量的 DAB-A 和 DAB-B(参见材料表)混合到适当大小的管中。每节制作+120 μL的DAB基板(每节2滴/共4滴)。混合好3x×5x。
  2. 从滑轨架上取每张幻灯片(每次一张),然后点击和/或轻弹以去除多余的液体,然后再将其放入滑轨机架中。
  3. 移液器 #120 μL DAB 到每个组织部分。确保覆盖各部分,并在室温下孵育10分钟。
  4. 根据当地法规处理剩余的 DAB,并将幻灯片插入浸入装满自来水的染色盘中的滑架中。

6. 反染色

  1. 将滑架移到含有 50% 血氧素染色溶液的染色盘上,使其在室温下休息 30 s。请注意,幻灯片将变为紫色。
  2. 立即将滑轨移回含有自来水的染色盘,并通过上下移动滑片清洗 3x-5x。
  3. 继续用新鲜的自来水重复洗涤步骤,直到幻灯片清晰,而部分保持紫色。
  4. 用0.02%氨水代替染色盘中的自来水。上下移动机架 2x×3x。请注意,组织部分应变为蓝色。
  5. 用自来水代替氨水。清洗幻灯片 3x×5x。

7. 脱水

  1. 将滑架移到烟罩中含有 70% 乙醇的染色盘,让滑架在偶尔搅拌时休息 2 分钟。
  2. 将滑架移到含有 100% 乙醇的第一个染色盘上,让它在偶尔搅拌时休息 2 分钟。
  3. 将滑架移到包含 100% 乙醇的第二个染色盘上,让它在偶尔搅拌时休息 2 分钟。
  4. 将滑架移到含有二甲苯的染色盘上,让它在偶尔搅拌时休息 5 分钟。

8. 滑动安装

  1. 从滑轨架上取下幻灯片,将幻灯片平放,并将部分朝上放在烟机罩中。
  2. 通过在每个幻灯片上添加 1 滴基于二甲苯的安装介质,并小心地在部分上放置 24 mm x 50 mm 盖玻片,一次安装一个滑轨。避免捕获任何气泡。
  3. 对滑轨进行气干,等待约 5 分钟。

9. 抽样评价

  1. 以 20x-40 倍的放大倍率在标准明场显微镜下检查组织部分。

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Representative Results

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如此所述,在头颈部鳞状细胞癌中,在细胞质或肿瘤细胞核中存在棕色双核状染色的情况下,可被视为阳性病例。在大多数研究中,信号被认为是"正"或"未检测到"14。信号半量化的方法已经报告,但团队之间缺乏标准化。例如,在一些研究中,信号被评分为 1+,每个肿瘤细胞 1+3 个点,每个肿瘤细胞 4+9 个点 2+,或者每个肿瘤细胞610 个或更多点 3+;在事后分析中,只考虑了2+和3+信号,这些信号更容易解释。在另一项研究中,结果分为两个分数:RNA CISH"高"和RNACISH"低"。RNA CISH"高"评分的定义是超过50%的染色癌细胞,或染色覆盖超过80%的细胞表面(细胞核和细胞质)在至少30%的癌细胞,如观察20倍目标(图1)21。

关于正对照,PPIB信号应以20x~40倍放大倍率在细胞核内作为点可见。至于负控制幻灯片,每20倍显微镜场每显示背景DAB染色的10个细胞一个点是可以接受的。

Figure 1
图1:"低"和"高"RNA CISH染色的例子。(AB)RNA CISH"低"分染色在食道鳞状细胞癌中。在50%以下的肿瘤细胞中观察到染色,并覆盖不到80%的细胞表面。(CD) RNA CISH "高"分染色在食道癌鳞状细胞癌中。在超过50%的肿瘤细胞中观察到染色,在这种情况下,超过30%的肿瘤细胞的染色表面超过80%。这个数字已被修改从奥古斯丁等人21请点击这里查看这个数字的较大版本。

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Discussion

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HPV RNA CISH 使用购买的试剂盒执行,是检测病毒记录组的强大工具,它表明 HPV 感染活跃。手动执行,协议的步骤整体上易于遵循,并且购买的工具包很方便。该技术允许一次染色19个组织学样本和一个控制幻灯片,测定持续约8小时。除非另有说明,否则不要让样品在步骤之间干燥,这一点至关重要。预处理条件可能需要根据操纵的组织进行调整。

HPV E6-E7 mRNA 表达信号以精确的空间分辨率检测,从而排除了与肿瘤相邻的 HPV 感染的非肿瘤细胞的任何污染。HPV E6和E7 RNA的检测在功能上是相关的,因为这些转录本是HPV诱导细胞转化所必需的,通过它们与细胞p53和pRb蛋白4的相互作用。因此,在子宫颈癌前病变中,HPV RNA CISH 可以帮助根据信号的定位区分低等级的皮内病变 (LSIL) 和高级内皮病变 (HSIL): 在大多数 LSIL 病例中,丰度扩散染色的核在整个上皮厚度上贴上标签,表示生产阶段。HSIL要么在表面层中表现出丰富的扩散染色细胞核,要么与下层(在以前称为CIN2的病变中)与强大的核和细胞质点点信号共存,要么用细胞质点进行强核染色整个上皮厚度,表明HPV感染的转化阶段(在病变前称为CIN3)22 。

虽然目前还没有信号半定量评估的标准建议,但一些作者报告临床相关性,因为HPV E6和E7成绩单的半定量评估已经允许识别两个预后组在HPV相关的HNSCC患者21。据推测,没有E6和E7成绩单或只有低水平E6和E7成绩单的HPVDNA检测在功能上是无关紧要的,并且这些患者应该与HPV阴性癌症患者合二为一, 23.

关于这个程序的限制 , 假设在某些情况下可能发生一些非特异叉杂交 , 如 Dreyer 等人的假设 , 23RNA CISH 可能不适合区分 E6 / E7 RNA 转录本和病毒脱氧核糖核酸,因为协议包括100°C热处理步骤,这被怀疑允许病毒DNA变性23。在阳性情况下观察两种类型的信号,即主要在肿瘤细胞核中局部的强染色,以及细胞质中的细粒度信号,都支持这一点。由于该协议中使用的探针特别结合HPV基因型16和18,这涉及绝大多数HPV相关的HNSCC4,偶尔HPV相关病例可能会错过RNA CISH,要么因为某些HPV基因型不包含在探针中,或由于引基因结合位点的突变或删除。最后,这种方法需要昂贵的试剂和设备,在日常实践中不容易获得。

对于每个样本,总共需要三个部分:一个用于执行HPV测定,一个用于阳性对照,一个用于阴性对照。由于RNA是一种易碎的分子,并且可能随着时间的推移在FFPE样品中随时间而恶化,因此必须使用PPIB、DNA定向RNA聚合酶II亚单位RPB1(Polr2a)或多聚素素-C(UBC)等正对照探针来检查每个样品的转录本的质量,这是人类家政基因。此外,当有半定量方法时,信号必须归一化为内务基因控制探针21。每个组织推荐的正控制可在制造商的说明中找到。然而,最近的一项研究证实,mRNA表达可以在前瞻性和回顾性样本中进行强有力的研究,显示2004年和2008年样本之间的可比mRNA水平。这有利于mRNA在时间24上的相对完整性。用于避免非特异性染色的推荐负控制探针是DAPB的细菌基因编码。

这里,HPV RNA的原位杂交被描述为手动执行。该技术也可以与荧光标记和/或结合传统的免疫染色执行。

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Disclosures

CB:董事会、研讨会:MSD、BMS、阿斯利康、罗氏

Acknowledgments

作者感谢欧洲霍皮塔兰·乔治·蓬皮杜和内克尔病理学系(劳里安·尚博勒、埃洛迪·米歇尔和吉塞勒·勒格尔);PARCC组织学平台,欧洲霍皮塔·乔治·蓬皮杜(科林娜·莱萨弗雷);弗吉尼亚克拉克语言编辑;亚历山德拉·埃尔巴基扬为她的贡献。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hematoxylin solution, Gill No. 1 Merck GHS132
HybEZ Oven (110v) Advanced Cell Diagnostics Inc. 321710
HybEZ slide rack Advanced Cell Diagnostics Inc. 300104
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen Advanced Cell Diagnostics Inc. 310018
RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN Advanced Cell Diagnostics Inc. 322310 This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B
RNAscope 3-Plex Negative Control Probe Advanced Cell Diagnostics Inc. 320871 DAPB
RNAscope 3-Plex Positive Control Probe Advanced Cell Diagnostics Inc. 320861 PPIB
RNAscope H202 & Protease Plus Reagent Advanced Cell Diagnostics Inc. 322330 Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1
RNAscope Probe- HPV16/18 Advanced Cell Diagnostics Inc. 311121
RNAscope Target Retrieval Reagents Advanced Cell Diagnostics Inc. 322000
RNAscope Wash Buffer Reagents Advanced Cell Diagnostics Inc. 310091 Wash Buffer 50X x4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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原位杂交的色原性杂交是HPV相关头颈部癌症诊断的工具
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Outh-Gauer, S., Augustin, J., Mandavit, M., Grard, O., Denize, T., Nervo, M., Lépine, C., Rassy, M., Tartour, E., Badoual, C. Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis. J. Vis. Exp. (148), e59422, doi:10.3791/59422 (2019).More

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