Este artículo presenta un protocolo modular para lipidómica tisular y transcriptómica, y lipidómica plasmática en modelos de ratones de enfermedades neurológicas dirigidos a lípidos subyacentes a la inflamación subyacente y la actividad neuronal, lípidos de membrana, mensajeros aguas abajo y enzimas / receptores subyacentes de ARNm función lipídica subyacente. Se describen los procedimientos de muestreo, procesamiento de muestras, extracción y cuantificación.
Los lípidos sirven como la interfaz principal para los insultos cerebrales o estímulos conducentes a enfermedades neurológicas y son un reservorio para la síntesis de lípidos con diversas funciones de señalización o ligando que pueden subrayar la aparición y progresión de enfermedades. A menudo cambiando a nivel presintomático, los lípidos son una fuente emergente de dianas farmacológicas y biomarcadores. Muchas enfermedades neurológicas exhiben neuroinflamación, neurodegeneración y excitabilidad neuronal como características comunes, parcialmente moduladas por sistemas específicos de señalización lipídica. La interdependencia e interrelación de la síntesis de varios lípidos provoca un análisis multilipídico, multienzimático y multirreceptor para derivar los puntos en común y las especificidades de los contextos neurológicos y acelerar el desentrañamiento de los aspectos mecanicistas del inicio y la progresión de la enfermedad. La atribución de roles lipídicos a distintas regiones del cerebro avanza en la determinación del fenotipo molecular lipídico y la morfología asociada con una enfermedad neurológica.
Aquí se presenta un protocolo modular adecuado para el análisis de lípidos de membrana y señales lipídicas aguas abajo junto con ARNm de enzimas y mediadores subyacentes a su funcionalidad, extraídos de regiones cerebrales discretas que son relevantes para una enfermedad neurológica y / o condición en particular. Para garantizar un perfil lipidómico comparativo preciso, los flujos de trabajo y los criterios operativos se optimizaron y estandarizaron para: i) muestreo cerebral y disección de regiones de interés, ii) coextracción de múltiples señales lipídicas y lípidos de membrana, iii) extracción dual de lípidos / ARNm, iv) cuantificación por cromatografía líquida monitoreo de reacciones múltiples (LC / MRM) y v) perfil estándar de ARNm. Este flujo de trabajo es susceptible de las bajas cantidades de tejido obtenidas mediante el muestreo de las subregiones cerebrales funcionalmente discretas (es decir, mediante punzonado cerebral), evitando así el sesgo en el análisis multimolecular debido a la heterogeneidad del tejido y / o la variabilidad animal. Para revelar las consecuencias periféricas de las enfermedades neurológicas y establecer lecturas moleculares traslacionales de los estados de enfermedad neurológica, también se persiguen y describen el muestreo de órganos periféricos, el procesamiento y su posterior análisis lipidómico, así como la lipidómica plasmática. El protocolo se demuestra en un modelo de ratón con epilepsia aguda.
Los recientes avances en la función de los lípidos y su papel en la aparición y progresión de enfermedades neurológicas abren nuevos lugares de investigación y desarrollo de nuevas dianas terapéuticas y elucidación del mecanismo de la enfermedad1. Las diferencias documentadas en la composición de lípidos en diferentes regiones del cerebro, enfatizadas por las técnicas modernas de imágenes moleculares, como las imágenes de espectrometría de masas y el perfil avanzado de espectrometría de masas, cambian el paradigma de la investigación de lípidos de todo el cerebro hacia regiones cerebrales funcionalmente distintas y discretas. El hecho de que la composición lipídica varíe en diferentes regiones del cerebro provoca una nueva conceptualización tanto de la sensibilidad a los lípidos de la membrana como de la señalización lipídica aguas abajo en respuesta a un insulto o estímulo cerebral a través de las regiones cerebrales funcionalmente distintas. Por lo tanto, los protocolos de lípidos requieren nuevos desarrollos para abordar el desafío de las bajas cantidades de tejido para una detección y cuantificación de mayor resolución espacial y, al mismo tiempo, el análisis de múltiples componentes lipídicos de las membranas celulares y las vías de señalización. Además, la determinación de enzimas, ligandos lipídicos y receptores implicados en la regulación de sus niveles y función es primordial para dilucidar las vías de señalización afectadas en una enfermedad neurológica y guiar nuevas investigaciones mecanicistas en un contexto fisiopatológico.
Además del aumento de la resolución espacial cerebral, hay dos dificultades principales que desafían el desarrollo de nuevos enfoques neurolipidómicos. En primer lugar, las moléculas de señalización lipídica son típicamente de muy baja abundancia en comparación con los lípidos constitutivos de membrana. En segundo lugar, el lipidoma exhibe una alta heterogeneidad estructural, difícil de diseccionar utilizando un único enfoque analítico. Por lo tanto, los métodos de extracción y análisis se adaptan a diferentes categorías de lípidos y se realizan comúnmente en distintas muestras de tejido.2. Métodos lipidómicos de escopeta3 son excelentes herramientas para revelar rápidamente un amplio perfil de lípidos de membrana, mientras que el aumento de la sensibilidad y la selectividad ofrecidas por los métodos espectrométricos de masas de descubrimiento y cuantificación dirigidos se aprovechan para la investigación de lípidos de señalización de baja abundancia, incluidos: i) lípidos inflamatorios y ii) lípidos involucrados en la modulación de la actividad neuronal, como endocannabinoides (eCB), lípidos vinculados a aminoácidos, etc.4,5. Para abarcar los cambios lipídicos tanto a nivel de membrana celular como de señalización que ocurren en las regiones cerebrales de los modelos de enfermedades neurológicas, generalmente la extracción y el análisis de lípidos se llevan a cabo en distintas muestras de tejido, obtenidas de distintos lotes de animales o de diferentes hemisferios, o diseccionando una región de tejido más grande en múltiples piezas. Cuando los niveles de ARNm de los receptores enzimáticos también son de interés, su investigación generalmente requiere la obtención de una muestra de tejido distinta. Por ejemplo, la investigación de lípidos de membrana, cannabinoides endógenos y ARNm requeriría tres muestras de tejido diferentes (por ejemplo, dos muestras para los dos métodos de extracción de lípidos -lípidos de membrana y lípidos de señalización- y dos métodos posteriores de análisis de lípidos- y una muestra para el análisis de ARNm). La investigación de lípidos inflamatorios y cannabinoides endógenos requiere dos muestras de tejido distintas, métodos de extracción y métodos de análisis, respectivamente. Otro ejemplo es la investigación del ARNm y de cualquier categoría de lípidos en una muestra de punzón cerebral o microdisección láser que, en consecuencia, requiere que dos animales distintos obtengan dos muestras por (sub)región cerebral. En tales casos se produce con frecuencia un grado sustancial de variabilidad y/o escasa reproducibilidad de los resultados, originándose en la variabilidad biológica y/o la heterogeneidad tisular. Guiados por estas limitaciones prácticas del análisis multimolecular, que ocurren particularmente a alta resolución espacial en el cerebro, se diseñó un protocolo neurolipidómico de tres módulos que abarca: 1) coextracción y coanálisis por LC / MRM de lípidos inflamatorios (por ejemplo, eicosanoides (eiCs)) y lípidos involucrados en la modulación de la actividad neuronal, como eCBs2; 2) co-extracción de fosfolípidos (PL) y eCB con posterior análisis multiescanal LC/MRM y precursor/neutral de pérdida2; y 3) extracción dual de (fosfo)lípidos de membrana y eCBs, así como ARNm, con posterior análisis de secuenciación LC/MRM y qPCR o ARN6. Dependiendo de la cuestión biológica a abordar en una enfermedad neurológica y la región cerebral de interés, se puede aplicar una combinación del primer y segundo protocolo, o el primer y el tercer protocolo, en la misma muestra de tejido para tejidos que pesan alrededor de 4 mg. El primer y tercer protocolo se pueden aplicar de forma independiente para tejidos de alrededor de 2 mg. El segundo protocolo se puede aplicar para tejidos que pesan tan poco como 0,5 mg. Independientemente del módulo de protocolo neurolipidómico seleccionado, el muestreo de tejido y el procesamiento preanalítico, el aislamiento cerebral y la disección de la región, así como el procedimiento para sacrificar el modelo animal están estandarizados e idénticos para los tres módulos del protocolo. En nuestra investigación de enfermedades neurológicas, los órganos periféricos que son relevantes para las consecuencias patológicas de la enfermedad siempre se recopilan y analizan utilizando estos protocolos modulares. Además, la sangre se muestrea regularmente para lipidómica plasmática para servir como una herramienta de lectura de enfermedades neurológicas con vistas a posibles aplicaciones traslacionales. El protocolo de lipidómica modular aquí presentado es muy versátil: escalable a cantidades de tejido más grandes y fácilmente aplicable para prácticamente cualquier tipo de tejido y enfermedad. Para la aplicación del protocolo modular (Figura 1) en las enfermedades neurológicas, cualquier modelo estandarizado de roedores de inicio y progresión de trastornos neurológicos, como la lesión cerebral traumática, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer o la epilepsia son susceptibles.
Estos protocolos se han aplicado ampliamente para estudiar los cambios en el lipidoma tisular y/o el transcriptoma en la fase aguda de la epilepsia en el modelo de epilepsia inducida por ácido kínico (KA)2,7, modelo ampliamente utilizado en estudios preclínicos debido a la semejanza con la epilepsia del lóbulo temporal humano (TLE)8,9,10,11. Utilizando estos protocolos, se evaluó el potencial terapéutico de fármacos como la Palmitoiletanolamida (PEA)12,13 en el mismo modelo de ratón de epilepsia. El estudio identificó cambios en los lípidos y el ARNm a alta y baja resolución espacial en el cerebro y la periferia, en el punto temporal de las intensidades máximas de convulsiones agudas (a los 60 minutos de inducción posterior a la incautación) y en el tratamiento subcrónico y agudo con PEA en cuatro puntos de tiempo diferentes (20, 60, 120 y 180 min) después de la inducción de la convulsión ka, una ventana de tiempo que cubre la fase aguda de la epilepsia. El plasma, los cerebros y los órganos periféricos de ratones no tratados inyectados con KA, ratones tratados con PEA aguda y subcrónicamente, así como ratones de control de vehículos y vehículos PEA, se recolectaron en cada punto de tiempo12,13 y se investigaron con este análisis molecular. Los datos moleculares se correlacionaron con fenotipos conductuales obtenidos por puntuación de convulsiones, así como con datos derivados de inmunohistoquímica sobre procesos neurodegenerativos, con el fin de desentrañar la progresión de la fase de epilepsia aguda y el potencial de la PEA para aliviarla.
La metodología neurolipidómica y transcriptómica descrita aquí es un medio viable para investigar cualquier enfermedad o desarrollo saludable a alta y baja resolución espacial en el cerebro y los órganos periféricos. Debido a los procedimientos optimizados de muestreo y manejo de plasma, el análisis lipidómico plasmático también se puede llevar a cabo a partir de los mismos animales sacrificados para lipidómica tisular y transcriptómica, mejorando así la confiabilidad de los correlatos moleculares de la san…
The authors have nothing to disclose.
Dedicamos este artículo a la Dra. Ermelinda Lomazzo. Durante la finalización de este manuscrito, la Dra. Ermelinda Lomazzo falleció. Ella es la encarnación de la pasión por la ciencia y el compromiso desinteresado en el trabajo en equipo para cumplir un propósito de investigación significativo. Ella siempre soñó con contribuir significativamente al mayor bienestar de los humanos. Su naturaleza de buen corazón nunca se vio comprometida por los caminos extenuantes de la ciencia y la vida. Ella permanecerá invaluable, y para siempre, en nuestros corazones.
Julia M. Post fue financiada por el Programa Focus para la Neurociencia Traslacional (FTN) en el Centro Médico Universitario de la Universidad Johannes Gutenberg de Maguncia y actualmente está financiada por el proyecto SPP-2225 EXIT a LB. Raissa Lerner fue parcialmente financiada por el proyecto DZHK 81X2600250 a LB y Lipidomics Core Facility. La financiación parcial para estos estudios fue proporcionada por el Lipidomics Core Facility, el Instituto de Química Fisiológica y los fondos intramuros (a LB) del Centro Médico Universitario de la Universidad Johannes Gutenberg de Maguncia.
12(S)-HETE | Biomol | Cay10007248-25 | Lipid Std |
12(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay334570-25 | Lipid Std |
1200 series LC System | Agilent | Instrumentation/LCMS | |
2100 Bioanalyzer | Agilent | Instrumentation/qPCR | |
5(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay 334230 | Lipid Std |
ABI 7300 Real-Time PCR cycler | Applied Biosystems | Instrumentation/qPCR | |
Acetonitrile LC-MS Chroma Solv | Honeywell | 9814920 | Solvent/LCMS |
amber eppendorf tubes | Eppendorf | Sample Prep. | |
Analyst 1.6.2 Software | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
Analytical balance | Mettler Toledo | Instrumentation/Sample prep. | |
Arachidonic Acid-d8 MS Standard | Biomol | Cay-10007277 | Lipid Std |
Bessmann Tissue Pulverizer | Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands) | Instrumentation/Sample prep. | |
Bino | Zeiss | Microscopy | |
cleaved Caspase 3 antibody | Cellsignaling | 9661S | Microscopy |
Cryostat, Leica CM3050 S | Leica Biosystems | Instrumentation/Sample prep. | |
CTC HTC PAL autosampler | CTC Analytics AG | Instrumentation/LCMS | |
Dumont Curved Forceps Dumoxel #7 | FST | 11271-30 | Surgical Tools |
Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2) | FST | 11252-00 | Surgical Tools |
EDTA 1000 A Röhrchen | Kabe Labortechnik | 078001 | Sample Prep. |
EP-1 EconoPump | BioRAD | 700BR07757 | Instrumentation/Sample prep. |
Fine Forceps Mirror Finish | FST | 11412-11 | Surgical Tools |
Fine Iris Scissors straight sharp | FST | 14094-11 | Surgical Tools |
Fine Scissor Tungsten Carbide straight | FST | 14568-09 | Surgical Tools |
Iris Spatulae | FST | 10094-13 | Surgical Tools |
Kainic acid | Abcam | ab120100 | Epileptic drug |
Lipid View software | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
LPC 17:0 | Avanis Polaris | 855676P | Lipid Std |
LPC 18:0 | Avanis Polaris | 855775P | Lipid Std |
Luna 2,5µm C18(2)- HAST 100A LC column | Phenomenex | 00D-4446-B0 | Instrumentation/LCMS |
Magnifying lamp | Maul GmbH | Instrumentation/Sample prep. | |
Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9% | Honeywell | 9814920 | Solvent/LCMS |
Motic Camara | Motic | Microscopy | |
MTBE | Honeywell | 34875-1L | Solvent/LCMS |
MultiQuant 3.0 quantitation software package | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermo Scientific | Instrumentation/qPCR | |
PA 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840857P | Lipid Std |
PA 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1404 | Lipid Std |
Palmitoyl Ethanolamide | Biomol | Cay90350-100 | Lipid Std |
Palmitoyl Ethanolamide-d5 | Biomol | Cay9000573-5 | Lipid Std |
PC 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850457P | Lipid Std |
PC 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850457P | Lipid Std |
PC 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1004 | Lipid Std |
PE 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850757P | Lipid Std |
PE 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1104 | Lipid Std |
PG 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840457P | Lipid Std |
PG 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1204 | Lipid Std |
PI 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1504 | Lipid Std |
Precelleys 24 | Peqlab | Instrumentation/Sample prep. | |
Precellys Keramik-Kügelchen | Peqlab | 91-pcs-ck14p | Sample Prep. |
Precellys Stahlkugeln 2,8mm | Peqlab | 91-PCS-MK28P | Sample Prep. |
Precellys-keramik-kit 1,4 mm | VWR | 91-PCS-CK14 | Sample Prep. |
Prostaglandin D2 | Biomol | Cay 12010 | Lipid Std |
Prostaglandin D2-d4 | Biomol | Cay 312010 | Lipid Std |
Prostaglandin E2 | Biomol | Cay10007211-1 | Lipid Std |
Prostaglandin E2-d9 | Biomol | Cay10581-50 | Lipid Std |
PS 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1304 | Lipid Std |
Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS | AB SCIEX | AU111609004 | Instrumentation/LCMS |
Real Time PCR System | Appliert Biosystem | Instrumentation/qPCR | |
Resolvin D1 | Biomol | Cay10012554-11 | Lipid Std |
Rneasy Mini Kit – RNAase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | Sample Prep. |
Security Guard precolumn | Phenomenex | Instrumentation/LCMS | |
Shandon coverplates | Thermo Fisher | 72110017 | Microscopy |
Shandon slide rack and lid | Thermo Fisher | 73310017 | Microscopy |
SM 18:0 | Avanis Polaris | 860586P | Lipid Std |
SM d18:1/12:0 | Avanis Polaris | LM-2312 | Lipid Std |
Standard Forceps straight Smooth | FST | 11016-17 | Surgical Tools |
Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern | FST | 14130-17 | Surgical Tools |
T3000 Thermocycler | Biometra | Instrumentation/qPCR | |
Thromboxane B2 | Biomol | Cay19030-5 | Lipid Std |
Thromboxane B2-d4 | Biomol | Cay319030-25 | Lipid Std |
Tissue Lyser II | Qiagen/ Retsch | 12120240804 | Instrumentation/Sample prep. |
Tissue Tek | Sakura Finetek | 4583 | Microscopy |
Toluidinblau | Roth | 0300.2 | Microscopy |
Vapotherm | Barkey | 4004734 | Instrumentation/Sample prep. |
Wasser LC-MS Chroma Solv | VWR | 9814920 | Solvent/LCMS |