Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

הערכה של סרטן המעי הגס סיכון ושכיחות על ידי שרפרף DNA זיהוי שלמות

Published: June 8, 2020 doi: 10.3791/59426

ERRATUM NOTICE

Summary

ערכת האבחון המוצגת חליל-DNA היא שיטת חיסכון בזמן וידידותי למשתמש כדי לקבוע את ההסתברות האמינה של נוכחות של נגעים סרטן המעי הגס.

Abstract

בימינו, שרפרף DNA יכול להיות מבודד ומנותח על ידי מספר שיטות. שרידים ארוכים של דנ א בצואה ניתן להבחין על ידי הספק qPCR, המספק סבירות אמינה לנוכחות של נגעים טרום הנאופלסטית או נאופלסטית המעי הגס. שיטה זו, המכונה DNA ארוך הזריחה (FL-DNA), הוא הליך מהיר, פולשני שהוא שיפור על מערכת המניעה העיקרית. שיטה זו מבוססת על הערכה של שלמות ה-DNA צואה על ידי הגברה כמותית של יעדים ספציפיים של דנ א גנומית. בפרט, הערכה של שברי DNA יותר מ 200 bp מאפשר זיהוי של חולים עם נגעים המעי הגס עם ספציפיות מאוד. עם זאת, מערכת זו וכל בדיקות ה-DNA שרפרף הזמין כרגע להציג כמה בעיות כלליות שצריך להיות ממוען (למשל, את התדר שבו יש בדיקות צריך להתבצע מספר אופטימלי של שרפרף שנאסף בכל נקודת זמן עבור כל אדם). עם זאת, היתרון העיקרי של FL-DNA היא האפשרות להשתמש בו בשיתוף עם מבחן המשמש כיום בתוכנית ההקרנה CRC, המכונה כימיקלים מבוססי חיסוני בדיקת דם סמוי (iFOBT). אכן, שתי בדיקות ניתן לבצע על אותו מדגם, הפחתת עלויות והשגת חיזוי טוב יותר של נוכחות בסופו של דבר של נגעים המעי הגס.

Introduction

סרטן המעי הגס (CRC) נובע תהליך רב שלב שבו האפיתל בריא לאט מתפתחת לתוך אדנומות או פוליפים, אשר התקדמות קרצינומות ממאירים לאורך זמן1,2. למרות שיעור השכיחות הגבוה של CRC, מגמה כלפי מטה באחוז מקרי המוות נצפתה בעשור האחרון3. אכן, כלים אבחון מוקדם שאומצה תוכניות הקרנה הובילו גילוי מוקדם והסרה של אדנומות טרום הנאופלסטית או פוליפים4. עם זאת, בשל המגבלות הטכניות השונות, אף אחת מהשיטות הללו אינה אופטימלית. ואכן, כדי לשפר את הרגישות והספציפיות, הוצעו בדיקות דנ א שרפרף רבות בלבד או בשילוב עם בדיקות אבחון5שגרתיות 5,6.

בדרך כלל, רירית בריאה שופך את זרם הצואה האפוציטים, בעוד רירית החולה מפילינג הקולונציטים בלתי אפוטוטיות. שברים של 200 bp או יותר באורך לאפיין את ה-DNA לא אפוטוטית. ה-DNA הזה נקרא DNA ארוך (L-DNA) והפך utilizable ביוקרה לאבחנה מוקדמת CRC. ה-dna יכול להיות מבודד מדגימת צואה וכימות על ידי qpcr באמצעות בדיקת מחוץ למערכת האבחון של מבחנה-dna בערכה7,8,9,10,11,12.

הבדיקה מורכבת משני שאומר לאיתור שברי FL-DNA החל 138 bp כדי 339 bp. כל שיטת הזמן מאפשרת הגברה של FL-DNA (משפחה) כמו גם ספייק-DNA (HEX). כדי להבטיח הגברה אופטימלית של כל השברים, הבדיקה חולקה לשתי שמות (בשם "A" ו-"B"). השיטת A מזהה שני אזורים של אקסון 14 של גן הנגמ ש (NM_001127511) וחלק של אקסון 7 של הגן TP53 (NM_001276760). שיטת B מזהה קטע של אקסון 14 של הנגמ ש (NM_001127511) ושני אזורים של אקסון 5 ו-8 של הגן TP53 (NM_001276760). ההסכמה אינה מבדילה בין האזורים שזוהו. ה-DNA של הדקר מתאים ל-DNA הoncorהלופון הסלמון מאפשר אימות כי ההליך נעשה כראוי ובודק את הנוכחות האפשרית של מעכבי, אשר עשוי להניב תוצאות שליליות שווא. הריכוז חליל-DNA מוערך על ידי קוונפיקציה מוחלטת באמצעות שיטת העקומה הסטנדרטית והוא מתבטא כ ng/התגובה.

השיטה FL-dna היא לא פולשנית וזולה שרפרף DNA מבחן, כי, בשילוב עם מבוסס מבחינה כימית חיסוני בדיקת דם סמוי (ifobt), משמש כיום תוכניות הקרנת crc ומאפשר תחזיות טוב יותר של CRC ו/או בסיכון גבוה הנגעים אדנומה12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

המטופלים גויסו בבית החולים הקונטולוו רומאנולו לולו סטודיו e לה דה טוורי (IRST) של מלנדולה (FC, איטליה) בין 2013 ל 2015. חולים נרשמו היו לתוך פרוטוקול IRSTB002, אושרה על ידי ועדת האתיקה של IRST-IRCCS AVR (25/10/2012, ver .1). כל השיטות בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות רלוונטיות. הסכמה מושכלת בכתב הושגה מכל המטופלים.

1. חילוץ דנ א מצואה

  1. השתמשו בערכה להכנת דגימות צואה (ראו טבלת חומרים). בחר וטפל בחומר הצואה על-ידי ביצוע החילוץ בהתאם להוראות היצרן. להגביר את הדנ א הטהור ישירות או לאחסן ב-20 ° c לניתוח הבא.

2. הכנת בקרה חיובית, סטנדרטים, ספייק-DNA, ודגימות קליניות

  1. הכנת תקנים ודגימות
    1. כדי להכין את השליטה החיובית, סטנדרטים, ספייק-ב-DNA, ואת כל הדגימות הקליניות, צנטריפוגה מראה של שליטה חיובית, תקנים, ו-DNA-ב, לאחר מכן להשעות מחדש כל מגיב על ידי הוספת כמות נכונה של מים שסופקו (ראה להלן). ואז, מערבולת בזהירות את השליטה החיובית, סטנדרטי, ו-DNA-in-in, ולאחר מכן צנטריפוגה עבור 10 s. כדי להשיג השעיה מלאה של ריאגנטים יבש, לאחסן את ריאגנטים נוזלי בטמפרטורת החדר (RT) עבור 30 דקות לפני השימוש.
      1. השליטה החיובית היא דנ א אנושי בפורמט יבש. השהה מחדש כל נורית עם 750 μL של מים.
      2. ה-DNA של הדקר הוא סלמון (Oncorהלופון keta) dna, אשר משמש כפקד פנימי אקסוסוגני כדי לאמת את הנוכחות האפשרית של מעכבי בדגימות DNA שחולצו מצואה. השהה מחדש כל נורית עם 100 μL של מים.
    2. כדי להכין את עקומת התקן, ליצור ארבעה 1:5 מדלל החל מהפתרון במניה. הנקודות הסטנדרטיות חייב להיות 10 ng/התגובה, 2 ng/התגובה, 0.4 ng/התגובה, ו 0.08 ng/התגובה.
  2. הכנת ה-DNA של הדקר הראשונה
    1. הכן את בקרת ה-DNA של הדקר ישירות לפני השימוש.
    2. הכן את 1 x ספייק בקרת דנ א על ידי ערבוב 5 μL של FL-DNa ספייק עם 20 μL של מים סטריליים. מספר של 1 x ספייק דגימות בקרת DNA יהיה מוכן על פי מספר הדגימות שיש לנתח, בתוספת שליטה חיובית.
  3. הכנת דגימות
    1. מערבבים 75 μL של דגימות (דגימות קליניות או בקרה חיובית) עם 25 μL של 1 x ספייק-ב-DNA, מניב נפח כולל של 100 μL.

3. הגברה ונחישות של הערך FL-DNA באמצעות qPCR Easy PGX

הערה: תערובות הגברה מלאות המכילות את התחל והבדיקות הספציפיות המכוונות ל-dna האנושי והשליטה הפנימית מסופקים בתבנית ליטליבית ב -8 רצועות היטב לתמהיל fl-dna mix a ו-fl-dna mix B. תקנים, שליטה חיובית ושלילית, והדגימות חייבות להיות מוגברה עם תערובות ליטו דגימות קליניות רק צריך להיות מוגבר רק בשכפול עם שני מתערבב ליקומי.

  1. עיין בטבלת החומרים של הכלי ותוכנת ההפעלה של qpcr.
    1. פתח את תוכנת ההפעלה והגדר את הלוחית והפרופיל התרמי:
      1. הגדר את הצלחת כפי שמוצג בטבלה 1.
        1. הגדר את סוג הבאר עבור כל שמונת המיקומים בעמודה 1 כרגיל.
        2. הגדר את סוג הבאר עבור הבארות A2 ו-B2 כ- Ntc.
        3. הגדר את סוג הבאר עבור C2 ו-D2 (הפקדים החיוביים) כבלתי ידועים.
        4. הגדר את סוג הבאר עבור כל המיקומים האחרים כבלתי ידועים.
        5. בחר את כל המיקומים 96, ולהוסיף את משפחה צבע הקסדצימאלי. לחץ על לוח סנכרון.
      2. הגדר את הפרופיל התרמי לפי טבלה 2.
    2. צנטריפוגה את המספר הדרוש של רצועות עבור 10 s כדי להביא את התוכן לתחתית הצינור.
    3. להסיר בעדינות את חותמות מן הרצועות, תוך כדי לשים לב לשמור את התוכן, ולהוסיף את הרצועות המתאימות: שליטה שלילית: 20 μL של מים; לדוגמה: 20 μL של דנ א; עקומת סטנדרטי: 20 μL של תקן 1, 2, 3 או 4; שליטה חיובית: 20 μL של שליטה חיובית.
    4. סגור בקפידה את כל הרצועות באמצעות 8 רצועה כמוסות אופטיות שטוחות ומערבולת לכמה שניות.
    5. צנטריפוגה את הרצועות עבור 10 ולטעון אותם לתוך המכשיר. . אז תתחיל לרוץ

4. ניתוח נתונים

הערה: ניתן לבצע ניתוח נתונים באופן אוטומטי או ידני בהתאם לתוכנה (ראה טבלת חומרים).

  1. בסוף ההפעלה, בחר עמודות A, C, E, G עבור "משפחה: FL-DNA-A" ו "HEX: IC", ועמודות B, D, F, H עבור "המשפחה: FL-DNA-B" ו-"hex: IC".
  2. הגדר את הפרטים הבאים עבור כמות ההתחלתי של כמויות: 10 ng/התגובה עבור בארות A1 ו-B1, 2 ng/תגובה עבור C1 ו-D1, 0.4 ng/התגובה עבור E1 ו F1, ו 0.08 ng/התגובה עבור G1 ו-H1.
  3. הגדר ערכי הזריחה של הסף ל 150 משפחה (FL-dna A ו-FL-dna B) ו-HEX (IC) ערוצים.
  4. בתיבה תוצאות טבלה, לחץ על אפשרויות עמודה | בחר הכל | אישור כדי לקבל את התוצאות בשני הערוצים עם cq המתאים שלהם (∆ R) ו ∆ r הערכים האחרונים.
    הערה: ערכים אלה מסופקים על-ידי תוכנת הכלי של מכשיר ה-PCR בזמן אמת. ΔR האחרון מתייחס לערך הזריחה המנורמל למחזור ההגברה האחרון.
  5. בתיבה תוצאת טבלה, לחץ לחיצה ימנית על הטבלה כדי לפתוח את התפריט תלוי ההקשר ולחץ על שלח ל-Excel כדי לייצא את הנתונים הגולמיים.
  6. בדוק את ערכי התקנים כדי לאמת את ההתאמה של העקומה הסטנדרטית.
  7. עבור כל שילוב FL-DNA, לבדוק את R2 ["r ² (∆ R)" עמודה] ויעילות ["יעילות (%)" עמודה] ערכים. אם הם נמצאים בטווח מקובל, ניתן להמשיך בניתוח בהתאם להוראות היצרן (שולחן 3).
  8. אם תוצאות ערוץ ה-משפחה אינן נמצאות בטווח הצפוי, השמט נקודה אחת של העקומה הרגילה והפעל מחדש את ההפעלה.
  9. קבע את ערכי הפקדים השליליים והחיוביים עם הנוסחה הבאה, בהתחשב בערכים "No Cq" כאפס:
    Equation 1
    Equation 2
  10. השווה בין הערכים המתקבלים לאלה המדווחים בטבלה 4.
  11. אם שולטת התגובה הם בטווח של ערכים צפויים, להמשיך עם ניתוח של דגימות.
    הערה: ודא שערכי Cq שהתקבלו מופקים מתגובת הגברה אמיתית (עקומת פלואורסצנטית מסיבית) ולא מחפץ (עקומת פלואורסצנטית לינארית).
  12. כדי לנתח את ההתאמה של המדגם עבור כל שילוב FL-DNA, להשוות את ערכי Cq של ערוץ HEX. אם הערך הוא ≥ 16, המשך בניתוח הדגימות. אם הערך הוא < 16 או שאין Cq, סביר להניח שהסיבה לכך היא שגיאה מחוץ לספייק-DNA. לכן, לא ניתן לנתח את הדגימות.
  13. חשב את הממוצע של ערכי Cq בערוץ "HEX" של הפקד החיובי באמצעות הנוסחה הבאה:
    Equation 3
  14. חשב את הממוצע של ערכי Cq בערוץ "HEX" של המדגם הכפול באמצעות הנוסחה הבאה:
    Equation 4
  15. חשב את הערכים ∆ CqHEX בהתאם לנוסחה הבאה:
    Equation 5
  16. השווה את ערכי ∆ CqHEX של הדגימות עם אלה שדווחו בטבלה 5.
  17. עבור כל תערובת (Mix A ו-Mix B), השווה את ערכי ה-Cq של ערוץ המשפחה עם אלה המדווחים בטבלה 6.
  18. כדי לקבוע את ערך FL-DNA של כל דוגמה מתאימה, השתמש בנוסחה הבאה, בהתחשב בערכי "No Cq" כאפס:
    Equation 6
    Equation 2
    הערה: הסיכון לסרטן המעי הגס ושכיחות היא פונקציה של הערכות iFOBT ו-FL-DNA על פי התוצאות nomogram Fagan שהתקבלו על ידי Rengucci ואח '12 (שולחן 7).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

זרימת העבודה של פרוטוקול זה מוצגת באיור 1. זרימת העבודה מספקת שני צעדי בקרה ופעולות שונות בהתאם לתוצאות שלב אלה. ראשית, אם מדגם מציג פקדים לא מתאימים, יש לחזור על הגברה. שנית, אם הגברה מעכבות, יש לעבד את המדגם מההתחלה או לסווג כערך לא יקר.

איור 2 מציג את עקומות הזריחה המיוצרים על ידי דגימות חיוביות ושליליות. (א) מוצג דוגמה למדגם חיובי מתאים. האות לדוגמה בערוץ ה-HEX נמצאת בטווח המקובל. האות החיובי הוא מעל הסף בערוץ משפחתי. (ב) המוצג הוא דוגמה למדגם שלילי/לא חיובי מתאים. האות לדוגמה נמצא בטווח המקובל בערוץ ה-HEX. אות הבקרה השלילית נמצא מתחת לסף בערוץ המשפחה. (ג) המוצג הוא דוגמה למדגם שאינו מתאים. האות לדוגמה אינו נמצא בטווח המקובל בערוץ ה-HEX; לפיכך, ניתן להניח עיכוב פוטנציאלי. , יש לחזור על הדגימה. החל מהחילוץ

Figure 1
איור 1: זרימת עבודה עבור כימות FL-DNA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: עקומות פלואורסצנטית המציגה את הגברה של מיקס A (או לערבב B) היעד גנים (ערוץ משפחה) ושליטה פנימית (הערוץ HEX). (א) FL-DNA דוגמה חיובית. (ב) FL-DNA דגימה שלילית. (ג) עיכוב של הגברה מדגם. עקומה אדומה: בקרה חיובית; עקומה ירוקה: שליטה שלילית; עקומה שחורה: דגימה קלינית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

1 2 3 4 מיכל 5 6 7 8 9 10 11 12 X
קצת תקן 1 מים DNA2 DNA4 DNA6 DNA8 DNA10 DNA12 DNA14 DNA16 DNA18 DNA20 1 חליל-דנ א Mix
B תקן 1 מים DNA2 DNA4 DNA6 DNA8 DNA10 DNA12 DNA14 DNA16 DNA18 DNA20 2 חליל-דנ א לערבב B
C חדר סטנדרט 2 POS DNA2 DNA4 DNA6 DNA8 DNA10 DNA12 DNA14 DNA16 DNA18 DNA20 3 חליל-דנ א Mix
D חדר סטנדרט 2 POS DNA2 DNA4 DNA6 DNA8 DNA10 DNA12 DNA14 DNA16 DNA18 DNA20 4 חליל-דנ א לערבב B
E חדר סטנדרט 3 DNA1 DNA3 DNA5 DNA7 DNA9 DNA11 DNA13 DNA15 DNA17 DNA19 DNA21 מיכל 5 חליל-דנ א Mix
F חדר סטנדרט 3 DNA1 DNA3 DNA5 DNA7 DNA9 DNA11 DNA13 DNA15 DNA17 DNA19 DNA21 6 חליל-דנ א לערבב B
G חדר סטנדרט 4 DNA1 DNA3 DNA5 DNA7 DNA9 DNA11 DNA13 DNA15 DNA17 DNA19 DNA21 7 חליל-דנ א Mix
H חדר סטנדרט 4 DNA1 DNA3 DNA5 DNA7 DNA9 DNA11 DNA13 DNA15 DNA17 DNA19 DNA21 8 חליל-דנ א לערבב B

טבלה 1: הגדרת צלחת עם התפלגות של בקרה, עקומה, ודגימות. עמודה X מציינת את המספר המוטבע בחלק העליון של הרצועה.

צעד טמפרטורה וזמן
התחלה חמה (1 מחזור) 95 ° c עבור 5 דקות
הגברה (40 מחזורים) 95 ° c עבור 15 ס
54 ° c עבור 15 ס
60 ° צ' עבור 45 s (איסוף נתונים)

טבלה 2: פרופיל תרמי עבור הגברה DNA.

Table 3
טבלה 3: טווח ערכי הערוץ HEX ו -משפחה של התקנים כדי לוודא את ההתאמה של העקומה הסטנדרטית.

Table 4
טבלה 4: מגוון ערכי הערוץ HEX ו -משפחה של פקדים חיוביים ושליליים כדי לוודא את ההתאמה של ההפעלה.

Table 5
טבלה 5: מגוון ערכי הערוץ HEX ו -משפחה של דגימות כדי לוודא את ההתאמה של ניתוח לדוגמה.

Table 6
טבלה 6: מערבבים ומערבבים B הערכים של ערוץ משפחתי כדי לוודא התאמה של ניתוח FL-DNA.

Table 7
טבלה 7: הערכת סיכון לסרטן כפונקציה של הערכים iFOBT ו-FL-DNA. על פי מערכת היחסים בין iFOBT ו חליל-DNA ערכים, הטבלה מעריכה את ההסתברות של נגעים המעי הגס נאופלסטי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מחקרים קודמים הוכיחו כי שלמות DNA ניתוח של שרפרפים שחולצו על ידי גישות ידניות וחצי אוטומטי יכול לייצג כלי אלטרנטיבי לגילוי מוקדם של נגעים המעי הגס7,8,9,10,11,12. מולקולרית, בדיקות ההקרנה לא פולשנית פותחו במהלך השנים לאיתור של סרטן המעי הגס, אבל הדיפוזיה הנרחבת של שיטות אלה מוגבלת בשל הגישות גוזלת זמן וללא עלות נמוכה לעומת בדיקות אחרות ההקרנה.

גישה זו זולה יחסית ולא צורכת זמן רב מדי. זה גם יש מוגברת דיוק בזיהוי נגעים המעי הגס עקב הליך חדש המחייב כמה צעדים ידניים. הגישה המתוארת כאן היא מהירה עם פחות צעדים ידניים, והוא יכול להתבצע בקלות על דגימות רבות בשבוע. חילוץ ה-DNA אינו מציג בעיות מסוימות, ניתן לבצע באמצעות שלבים ידניים קל או שימוש במכשיר אוטומטי. במקרה האחרון, יש צורך לקבוע את כלי החילוץ האוטומטי של ה-DNA, ומאפשר את התוצאות הנוזלים ביותר. הצעד הקריטי ביותר של חילוץ ה-DNA הוא אוסף של צואה ושיטה של האחסון שלה לפני חילוץ ה-DNA. מומלץ להשאיר את הצואה קפואה ולהמשיך בחילוץ בהקדם האפשרי.

בעיה קריטית נוספת מיוצגת על-ידי מעכבי אפשריים של תגובות הגברה. החילוץ צואה אינו מסוגל לטהר את ה-DNA גנומית, כמו זיהומים לסכן את תגובת הגברה נכונה. בהקשר זה, הפרוטוקול דורש השימוש של ספייק-ב-DNA לאימות נוכחות/העדר של מעכבי התגובה.

עד לאחרונה, בדיקת דם סמוי בצואה היא הגישה העיקרית המשמשת לזיהוי נגעים המעי הגס בתוכניות הקרנה; למרות שהוא מציג גבולות במונחים של דיוק. אסטרטגיה חלופית לאבחון של סרטן המעי הגס מבוססת על ניתוח של דנ א מתאי פילינג מופרשים בצואה. מספר גישות הוערכו בשנה האחרונה, אך אף אחת מהן אינה זמינה לשימוש בתוכניות סינון.

הערך FL-DNA שלמות יכול להיות חלופה שימושית, אשר בשילוב עם ערך ההקרנה התקן ifobt, יכול לחזות את הנוכחות של גידולים ו/או בסיכון גבוה אדנומות11,12 על ידי fagan גישה10 (טבלה 7). גישה זו מעריכה את ההסתברות המשולבת של נוכחות נאופלסטית של הנגעים, שיפור הדיוק האבחוני לעומת הגישה הסטנדרטית המשמשת לבדה.

מידע זה עשוי לעזור מטפלים בתכנון בדיקות אבחון בנוסף קולונוסקופיה המתאים והתאמה אישית של המעקב שלה. אכן, ערכת ה-DNA חליל מפשט את השלבים הידניים ומבטיח תוצאות יציבות ועקביות. עם זאת, בעיות מסוימות נשארות כדי להבהיר כדי לשפר את דיוק האבחון של השיטה. לדוגמה, התדירות שבה יש לבצע את הבדיקות ומספר דגימות צואה שיש לנתח בנקודות זמן ספציפיות לכל אדם יש לבחור בקפידה. בהינתן כי בדיקה זו יש לבצע במקביל עם iFOBT, שיטה הדורשת איסוף כל שנתיים, כפי שהוא סטנדרטי בפרוטוקולים סינון רבים, יש צורך לאמת את האפקטיביות של בדיקה זו כתחליף או חלופה לבדיקות ההקרנה הנוכחית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

מאורה מנאגי הוא עובד במשרה מלאה of Diatech פרמקוגנטיקה srl.

Acknowledgments

למחברים אין ותודות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL and 2 mL polypropylene twist-lock tubes (DNase-, RNase-, DNA-, PCR inhibitor-free) Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR
Absolute Ethanol (quality of analytical degree) Reagent required for DNA extraction
Benchtop centrifuge  Maximum speed of 20000 x g. Instrument required for DNA extraction
EasyPGX analysis software version 2.0.0 Diatech Pharmacogenetics RT800-SW Analysis software 
EasyPGX centrifuge/vortex 8-well strips Diatech Pharmacogenetics RT803 Instrument recommended for the Real Time PCR assay
EasyPGX qPCR instrument 96  Diatech Pharmacogenetics RT800-96 Instrument recommended for the Real Time PCR assay
EasyPGX ready FL-DNA Diatech Pharmacogenetics RT029 Kit required for the Real Time PCR assay
Micropipettes (volumes from 1 to 1.000 µL) Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR
Powder-free disposable gloves Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR
QIAamp Fast DNA Stool Qiagen 51604 Kit recommended for the DNA extraction and purification from stool
Sterile filter tips DNase-, RNase-free (volumes from 1 to 1.000 µL) Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR
Thermal block e.g. EasyPGX dry block Diatech Pharmacogenetics RT801 Instrument required for DNA extraction
Vortex e.g. EasyPGX centrifuge/vortex 1.5 ml  Diatech Pharmacogenetics RT802 Instrument required for DNA extraction

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fearon, E. R. Molecular Genetics of Colorectal Cancer. Annual Review of Pathology. 6, 479-507 (2011).
  2. Sears, C. L., Garrett, W. S. Microbes, Microbiota, and Colon Cancer. Cell Host and Microbe. 15, 317-328 (2014).
  3. SEER Stat Fact Sheets: Colon and Rectum Cancer. National Cancer Institute. , Available from: http://seer.cancer.gov/statfacts/html/colorect.html (2019).
  4. Levin, B., et al. Screening and Surveillance for the Early Detection of Colorectal Cancer and Adenomatous Polyps, 2008: A Joint Guideline From the American Cancer Society, the US Multi-Society Task Force on Colorectal Cancer, and the American College of Radiology. Gastroenterology. 134, 1570-1595 (2008).
  5. Bosch, L. J., et al. Molecular tests for colorectal cancer screening. Clinical Colorectal Cancer. 10, 8-23 (2011).
  6. Ahlquist, D. A. Molecular detection of colorectal neoplasia. Gastroenterology. 138, 2127-2139 (2010).
  7. Calistri, D., et al. Fecal multiple molecular tests to detect colorectal cancer in stool. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 1, 377-383 (2003).
  8. Calistri, D., et al. Detection of colorectal cancer by a quantitative fluorescence determination of DNA amplification in stool. Neoplasia. 6, 536-540 (2004).
  9. Calistri, D., et al. Quantitative fluorescence determination of long-fragment DNA in stool as a marker for the early detection of colorectal cancer. Cellular Oncology. 31, 11-17 (2009).
  10. Calistri, D., et al. Fecal DNA for noninvasive diagnosis of colorectal cancer in immunochemical fecal occult blood test-positive individuals. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 19, 2647-2654 (2010).
  11. De Maio, G., et al. Circulating and stool nucleic acid analysis for colorectal cancer diagnosis. World Journal of Gastroenterology. 20, 957-967 (2014).
  12. Rengucci, C., et al. Improved stool DNA integrity method for early colorectal cancer diagnosis. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 23, 2553-2560 (2014).

Tags

סרטן מחקר סוגיה 160 שרפרף DNA שלמות סרטן המעי הגס נגעים בסיכון גבוה אדנומות המעי הגס אבחון שיטת סרטן המעי הגס qPCR חליל-DNA iFOBT

Erratum

Formal Correction: Erratum: Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection
Posted by JoVE Editors on 09/28/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection. An affiliation was updated.

The first affiliation was updated from:

Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST)

to:

Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy

הערכה של סרטן המעי הגס סיכון ושכיחות על ידי שרפרף DNA זיהוי שלמות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rengucci, C., De Maio, G., Menghi,More

Rengucci, C., De Maio, G., Menghi, M., Benzi, F., Calistri, D. Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection. J. Vis. Exp. (160), e59426, doi:10.3791/59426 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter