Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Genetics

Evaluering af en universel indlejret reverse transkription polymerase kædereaktion til påvisning af Lyssavira

doi: 10.3791/59428 Published: May 2, 2019
* These authors contributed equally

Summary

En pan-lyssavirus indlejret reverse transkription polymerase kædereaktion er blevet udviklet til at påvise specifikt alle kendte Lyssavira. Validering ved hjælp af rabies hjernen prøver af forskellige dyrearter viste, at denne metode har en følsomhed og specificitet svarende til den gyldne standard fluorescerende antistof test og kunne anvendes til rutinemæssig rabies diagnose.

Abstract

Til påvisning af rabiesvirus og andre medlems arter af slægten lyssavirus i familien Rhabdoviridaeblev den pan-lyssavirus indlejrede reverse transkription polymerasekæde reaktion (indlejret RT-PCR) udviklet til at detektere det konserverede område nukleoprotein (N)-genet af Lyssavira. Metoden anvender omvendt transkription (RT) ved hjælp af viral RNA som skabelon og oligo (DT)15 og tilfældige hexamerer som primere til at syntetisere den virale komplementære DNA (cDNA). Derefter bruges den virale cDNA som en skabelon til at forstærke et 845 BP N-genfragment i første runde PCR ved hjælp af ydre grundere, efterfulgt af anden runde indlejret PCR for at forstærke det endelige 371 BP-fragment ved hjælp af indvendige grundere. Denne metode kan detektere forskellige genetiske clader af rabiesvirus (RABV). Valideringen, ved hjælp af 9.624 hjerne prøver fra otte husdyrarter i 10 års kliniske rabies diagnoser og overvågning i Kina, viste, at metoden har 100% følsomhed og 99,97% specificitet i forhold til den direkte fluorescerende antistof test (FAT), den guld standardmetode, der anbefales af Verdenssundhedsorganisationen (WHO) og Verdensorganisationen for Dyresundhed (OIE). Desuden kunne metoden også specifikt forstærke det målrettede N-genfragment af 15 andre godkendte og to nye lyssavirus arter i den tiende rapport fra den internationale komité for taksonomi for vira (ICTV), vurderet ved en efterligner påvisning af syntetiserede N gen plasmider af alle Lyssavira. Metoden giver et praktisk alternativ til FAT for rabies diagnose og er blevet godkendt som en national standard (GB/T36789-2018) i Kina.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Rabies er en verdensomspændende zoonotisk sygdom forårsaget af vira i slægten lyssavirus1. Lyssavira (familien Rhabdoviridae) er enkelt-negative-strandede RNA-vira med et ca. 12 kb genom, der koder fem proteiner: N, phosphoprotein (P), matrix protein (M), glykoprotein (G) og det store protein eller polymerase (L). Baseret på nukleotidsekvenser af N-genet, genetisk afstand og antigen mønstre er lyssavirusset inddelt i 16 arter, der omfatter klassisk rabiesvirus (RABV) og rabies relaterede vira (RRV): Lagos bat-virus (LBV), Duvenhage-virus (DUVV ), Mokola virus (MOKV), European bat lyssavirus 1 (EBLV-1), European bat lyssavirus 2 (EBLV-2), Australian bat lyssavirus (ABLV), Aravan virus (ARAV), Ikoma virus (IKOV), Bokeloh bat lyssavirus (BBLV), Gannoruwa bat lyssavirus (GBLV), Irkut virus (IRKV), Khujand virus (KHUV), West kaukasisk bat-virus (WCBV), Shimoni bat-virus (SHIBV) og Lleida bat lyssavirus (LLEBV)2. For nylig er to yderligere Lyssavira blevet identificeret: Kotalahti bat lyssavirus (KBLV) isoleret fra en Brandts bat (Myotis brandtii) i Finland i 20173 og Taiwan bat LYSSAVIRUS (twblv) isoleret fra en japansk Pipistrelle ( Pipistrellus abramus) i Taiwan, Kina i 2016 – 20174.

Alle pattedyr er modtagelige for rabies; dog er det ikke muligt at identificere grove patognomoniske læsioner eller specifikke kliniske tegn, og diagnosen kan kun fremstilles i laboratoriet5. Den mest udbredte metode til rabies diagnose er fedtet, der betragtes som guldstandarden af både WHO og OIE5,6. Ikke desto mindre kan FAT producere upålidelige resultater på forringede/autolyzed hjernevæv prøver. Desuden kan det ikke bruges til at måle biologiske væskeprøver såsom cerebrospinalvæsken (CSF), spyt og urin, hvilket i vid udstrækning udelukker dens beskæftigelse i antemortem diagnose7. Alternative konventionelle diagnostiske tests, såsom rabies vævskultur infektion test (RTCIT) og mus inokulering test (MIT), kræver flere dage6, en stor ulempe, når en hurtig diagnose er afgørende.

Forskellige molekylære diagnostiske tests (f. eks. påvisning af viral RNA ved RT-PCR, PCR-enzym-linked immunosorbent assay [PCR-ELISA], in situ-hybridisering og real-time PCR) anvendes som hurtige og følsomme teknikker til rabies diagnose8. RT-PCR anbefales nu af OIE til rutinemæssig rabies diagnose, og en heminested (HN) PCR er beskrevet i OIE'S manual for diagnostiske tests og vacciner til landdyr for at detektere alle Lyssavira5. Her beskriver vi en pan-lyssavirus indlejret RT-PCR, som giver mulighed for specifik og følsom påvisning af alle 18 lyssavirus arter, der kan sammenlignes med eller overstiger det, der opnås ved FAT. Princippet i metoden er en RT af målet RNA (bevaret region af lyssavirus N genet) i cDNA, efterfulgt af amplifikation af cDNA ved to runder af PCR. CDNA gennemgår den første runde PCR med ydre primere for at forstærke et 845 BP-fragment; derefter bruger den anden runde PCR det første runde PCR-produkt som en skabelon til at forstærke et 371 BP-fragment med indvendige grundere. De to PCR-runder øger analysens følsomhed betydeligt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Brugen af mus i denne protokol blev godkendt af den administrative Komité for dyrevelfærd for Institut for militær veterinærmedicin, Akademiet for militære medicinske videnskaber, Kina (laboratorium Animal Care og use Udvalget autorisation, tillade nummer JSY-DW-2010-02). Alle institutionelle og nationale retningslinjer for pasning og anvendelse af forsøgsdyr blev fulgt.

1. RNA-ekstraktion

  1. Ekstrakt RNA fra rabies-mistænkt hjernevæv, hud biopsier, spyt, eller CSF eller fra RABV-inficerede cellekultur, ved hjælp af guanidinium isothiocyanat-phenol-chloroform-baserede ekstraktionsmetoder eller kommercielt tilgængelige viral RNA ekstraktion kits. Brug straks det tilberedte RNA, eller Opbevar det ved-80 °C, indtil det er nødvendigt.

2. omvendt transkription af viral RNA

  1. Fjern de RT-reagenser, der er anført i tabel 1 , fra fryseren, Opbevar dem på is, og tø og vortex dem før brug.
  2. Der tilberedes 12 μL RT reaktionsblanding i et 0,2 mL PCR-rør med reagenserne i tabel 1. Giver mulighed for pipette Rings variationer ved at tilberede en volumen masterblanding med mindst én reaktions størrelse, der er større end krævet.
  3. Tilsæt 8 μL prøve, positiv kontrol RNA eller negativ kontrol til RT-reaktionsblandingen i en PCR-arbejdsstation i et skabelonrum. RT positiv kontrol er RNA ekstraheret fra cellekulturen inficeret med fast RABV stamme CVS-11 (Challenge virus standard-11) og opbevares ved-80 °C. Den negative kontrol indeholder RNase-fri ddH2O.
  4. Bland indholdet af RT-rørene ved vortexing; derefter centrifugeres kortvarigt.
  5. Læg reaktions rørene i en termisk cycler. Konfigurer cDNA-syntese programmet med følgende betingelser: 42 °C i 90 min, 95 °C i 5 min og 4 °C i venteposition. Indstil reaktions volumen til 20 μL. Start RT-kørslen.

3. første runde PCR

  1. Opbevar de PCR-reagenser, der er opført i tabel 2 , på is i et rent rum indtil brug; derefter tø og vortex dem.
  2. Forbered den første runde PCR-blanding i et 0,2 mL PCR-rør med de reagenser, der er anført i tabel 2.
  3. Tilsæt en 2 μL prøve af cDNA eller plasmid til den første runde PCR-blanding i en PCR-arbejdsstation i et skabelonrum. PCR-positiv kontrol er CVS-11 cDNA fremstillet som nævnt i trin 2,3 for ovenstående RT-metode. Den PCR negative kontrol er ddH2O.
  4. De forseglede rør overføres til en PCR-termisk variator og en cyklus med de parametre, der er angivet i tabel 3.

4. anden runde PCR

  1. Den anden runde PCR-blanding forberedes i et 0,2 mL PCR-rør ved hjælp af de reagenser, der er anført i tabel 4.
  2. Der tilsættes 2 μL første runde PCR-produkt til den anden runde PCR-blanding. Desuden omfatter ddH2O som en negativ kontrol af den anden runde PCR.
  3. Udfør PCR termisk cykling med de samme parametre som angivet i trin 3,4.

5. analyse af PCR-produkterne ved elektroforese på Agrose gels

  1. Forbered en 1,5% agopstået gel ved at tilsætte 1,5 g af agopstod til 100 mL Tris-acetat-EDTA (TAE) og opløse det grundigt ved at opvarme det i en mikrobølgeovn.
  2. Tilsæt ethidium bromid (EB) (ved en endelig koncentration på 0,01%) anden kommerciel EB-substitution. Hæld gelen i formen og lad den størkne ved omgivelsestemperatur i mindst 30 min.
  3. Belastnings prøverne tilberedes ved at blande 5 μL af hvert PCR-produkt med 1 μL 6x belastnings buffer.
  4. Prøverne og den passende DNA-markør skal indlæses separat i brøndene og køre gelen i ca. 30-45 minutter ved 120 V, indtil farvelinjen er ca. 75%-80% ned ad gelen.
  5. Sluk for strømmen, Afbryd elektroderne fra strømkilden, og fjern forsigtigt gelen fra gelboksen.
  6. Brug en UV-gel-dokumentation til at visualisere og fotografere DNA-fragmenter.

6. karakterisering af indlejret RT-PCR

  1. 6,1. specificitet og følsomhed ved påvisning af 18 Lyssavira plasmider
    1. Bestil 18 kommercielle plasmider, der indeholder det fulde N-gen af hver lyssavirus (16 ICTV-arter og to nye arter) til PCR.
    2. Kopi nummeret på plasmid beregnes ved hjælp af Avogadros nummer (NA) og følgende formel.
      [(g/μL plasmid-DNA)/(plasmid-længde i BP x 660)] x 6,022 x 1023 = antal molekyler/μl
    3. Forbered stamopløsninger (2,24 x 109 molekyler/μl) af alle 18 plasmider i DDH2O.
    4. Udfør 9 10-dobbelte serielle fortyndinger af alle 18 plasmider i ddH2O. Fortynd 10 μl af hver plasmid-bestand med 90 ΜL DDH2O. vortex og centrifugeres kortvarigt.
    5. Udfør PCR-forstærkning som beskrevet i afsnit 3-5.
    6. Analysér specificiteten og følsomheden af den indlejrede PCR ved at detektere en række lyssaviruplasmider.
  2. Bestemmelse af d etection l IMIT
    1. Juster titeren af rabiesvirus stammen CVS-11 cellekultur til 105,5 tcid50/ml (virus titer bestemt i henhold til OIE manual)5.
    2. Udfør 5 10-dobbelte serielle fortyndinger af CVS-11 (stamopløsning er 105,5 tcid50/ml) som beskrevet i trin 6.1.4.
    3. Udfør RNA-ekstraktion og indlejrede RT-PCR-amplifikationsprocedurer for alle virale fortyndinger som beskrevet i afsnit 1-5.
  3. Compar Ison of den INDLEJRET RT-PCR med "Gold standard" fedt
    1. Test alle kliniske prøver med indlejret RT-PCR, og bekræft derefter resultaterne med FAT5 -og N-gensekvensering9.
    2. Brug normaliserede data til en statistisk analyse med SAS 9,1. Brug Kappa test og Mcnemars Chi-kvadrerede test til en statistisk sammenligning af de diagnostiske tests (SAS Command: PROC freq; tabel/agree). Beregn konfidensintervaller ved at antage abinomial fordeling.
  4. Evaluering af effekten ved testning af forringede prøver
    1. Eksponere to bekræftede kliniske hjernevævs prøver af rabiate hunde ved 37 °c.
    2. Analyse af de to prøver på hver eksponerings dag ved 37 °C ved indlejret RT-PCR, FAT og MIT5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Resultater af indlejret RT-PCR til påvisning af 18 lyssavirus arter er vist i figur 1. Alle PCR-positive kontroller viste det forventede 845 BP i første-og 371 BP i den anden runde-forstærkning uden et bånd i den negative kontrol. Alle 18 Lyssavira producerede de forventede 845 og/eller 371 BP-bånd, hvilket indikerer, at den indlejrede RT-PCR detekterede alle 18 Lyssavira. Seksten Lyssavira plasmider havde effektiv forstærkning i to runder af PCR, men to, nemlig arav og ikov, havde forstærkning i enten den første eller anden runde PCR. Metodens følsomhed varierede ved påvisning af forskellige lyssaviruplasmider med grænser, der spænder fra 2,24 x 100 til 2,24 x 105 molekyler/μl, som vist i tabel 6. Disse forskelle kan tilskrives mismatch mellem grundere og skabeloner på grund af viral sekvens mangfoldighed. Desuden var følsomheden ved påvisning af rabiesvirus CVS-11 i cellekultur 102,5 tcid50/ml.

I alt 9.624 hjernevæv fra kliniske prøver blev testet af indlejret RT-PCR sammenlignet med FAT, og resultaterne er opsummeret i tabel 7, som viser, at indlejret RT-PCR havde en 100% følsomhed (CI, 97,75% til 100%) og en 99,97% specificitet (CI, 99,91% til 99,99%). I overensstemmelse mellem de to metoder var 99,07%. Tre tests, som var positive ved indlejrede RT-PCR, men negative af FAT, var af stærkt forrådnede kliniske materialer. Disse tre prøver blev bekræftet som RABV-positive ved N-gensekvensering.

En sammenligning af test ydeevnen ved påvisning af de to hjerne prøver, der inkures ved 37 °C (trin 6.4.1 i protokollen), indikerede, at den indlejrede RT-PCR effektivt kunne detektere virus i nedbrudt hjernevæv i mindst 17 dage efter nedbrydning, hvilket er for en længere tid sammenlignet med kun 7 dage af FAT og ikke engang 1 dag af MIT. Dette resultat viser, at indlejret RT-PCR er mere følsom ved påvisning af forringede prøver end FAT og MIT.

For yderligere at validere den indlejrede RT-PCR blev 10 rabies laboratorier i Kina opfordret til at gennemføre tests på et sæt eksemplarer. Af disse, otte laboratorier blev leveret et sæt af 10 blindede animalsk hjernevæv fra vores laboratorium, herunder RABV positive og negative prøver. De to andre laboratorier brugte deres egne enheder. Alle eksemplarer var blevet arkiveret og bekræftet af FAT tidligere. Alle 10 laboratorier opnåede resultater ved indlejret RT-PCR i 100% overensstemmelse med FAT, uden falsk-negativer eller falsk-positiver (tabel 8), hvilket indikerer, at den indlejrede RT-PCR havde en høj specificitet og reproducerbarhed.

Komponenter Volumen pr. reaktion (μL)
dNTP'er (2,5 mM) 4
Tilfældig primer (50 μM) 1,5 af
Oligo (dT) 15 (50 μM) 0,5 af
M-MLV-buffer (5x) 4
M-MLV omvendt transkriptase (200 IE/μL) 1
RNasin (40 IE/μL) 1
Samlet volumen 12

Tabel 1: Reagenser af omvendt transkription for cDNA-syntese .

Komponenter Volumen pr. reaktion (μL)
dNTP'er (10 mM) 1
Ex-Taq (5 e/μL) 0,3 af
Taq-buffer (10x) 5
N127 (20 μM) 1
N829 (20 μM) 1
DD H2O 39,7 af
Samlet volumen 48 af

Tabel 2: Reagenser til at den første runde PCR.

Temperatur Tid Cykler
94 °C i 2 min. 1
94 °C kun 30 s 35 af
56 °C kun 30 s 35 af
72 °C 40 s 35 af
72 °C 10 min. 1
4 °C

Tabel 3: C ycling parametre af den første- og anden runde PCR.

Komponenter Volumen pr. reaktion (μL)
dNTP'er (10 mM) 1
Ex-Taq (5 e/μL) 0,3 af
Taq-buffer (10x) 5
N371F (20 μM) 1
N371R (20 μM) 1
DD H2O 39,7 af
Samlet volumen 48 af

Tabel 4: Reagenser til at den anden runde PCR.

Navn på primer Detaljer Retning Sekvens (5 '-3 ') Nukleotid position Produktstørrelse
N127 Den første runde PCR Frem HAR du set på en -19 ~ 0 845bp
N829 Den første runde PCR Omvendt GCCCTGGTTCGAACATTCT 807 ~ 825 845bp
N371F Den anden runde PCR Frem Fra Aarhus, fordi du indsendte en redigering. -6 ~ 15 371bp
N371R Den anden runde PCR Omvendt HAR du mere at gøre? 345 ~ 367 371bp

Tabel 5: Primer s equenser af den første- og anden runde PCR . Degenererede baser: N (A/T/C/G), K (G/T), R (A/G), Y (C/T), WV (G/A/C).

Lyssavirus-arter Stamme Skabelon plasmid (molekyler/μL)
"Meget mere" GQ 918139.1 2,24 x 101
LBV EU-293110.1 2,24 x 102
Af MOKV KF 155005.1 2,24 x 101
Af DUVV EU-293119.1 2,24 x 101
EBLV-1 EF 157976.1 2,24 x 101
EBLV-2 KF 155004.1 2,24 x 101
ABLV GU 992312.1 2,24 x 100
Af IRKV NC_020809.1 2,24 x 101
WCBV NC_025377.1 2,24 x 101
HAR du NC_025385.1 2,24 x 103
ARAV NC_020808.1 2,24 x 102
Af SHIBV NC_025365.1 2,24 x 101
BBLV NC_025251.1 2,24 x 101
Af IKOV NC_018629.1 2,24 x 105
LLEBV NC_031955.1 2,24 x 103
Fra GBLV NC_031988.1 2,24 x 105
KBLV MF 960865.1 2,24 x 101
TWBLV MF 472710.1 2,24 x 101

Tabel 6: Detektionsgrænse på INDLEJRET RT-PCR o f 18 l yssavirus es.

Standard metode og resultat RT-nPCR
Positive
RT-nPCR
Negative
Korrelation (%)
Fedt Positive
Negative
162 af
3
0
9459 af
99,07 af

Tabel 7: Sammen Hæng mellem INDLEJRET RT-PCR og fat i den påvisning af RABVs i kliniske prøver.

Table 8
Tabel 8: Valideringsresultater af INDLEJRET RT-PCR ved 10 laboratorier.

Figure 1
Figur 1 : Påvisning af 18 lyssavirus er ved INDLEJRET RT-PCR. A) resultatet af den første runde PCR. B) resultatet af den anden runde-PCR. M = DL 2000 DNA markør. Lanes 1 – 18 = RABV, LBV, MOKV, DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, ARAV, IKOV, BBLV, GBLV, IRKV, KHUV, LLEBV, SHIBV, WCBV, KBLV og TWBLV. Lane 19 = PCR-positiv kontrol; Lane 20 = negativ kontrol for den første runde PCR; Lane 21 = negativ kontrol for den anden runde PCR. Et positivt PCR-resultat viser et bånd ved 845 BP i første runde og 371 BP i den anden runde PCR. Uancv af arav er ikke synlig i første runde, men synlig i den anden runde PCR (Lane 8), mens uancv af ikov er synlig i første runde, men ikke synlig i den anden runde PCR (Lane 9). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Sammenligning med primer sekvenser viser differentialnukleotider i primer regioner af 18 lyssavirus arter. N127 og N829 var ydre grundere, N371F og N371R var indre grundere. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I øjeblikket, RABV er en stor lyssavirus ansvarlig for næsten alle menneskers og dyrs rabies i Kina, samt i andre lande. Desuden blev en IRKV variant først identificeret fra en Murina leucogaster bat i Jilin provinsen i det nordøstlige Kina i 201210, og det er blevet rapporteret at forårsage en hunds død i Liaoning-provinsen i 201711. Senest blev en roman lyssavirus, TWBLV, også identificeret fra en japansk Pipistrelle bat i Taiwan, Kina i 2017. Disse resultater tyder på, at effektiv påvisning af andre Lyssavira er også vigtigt at forhindre afsmitning af bat-bårne Lyssavira. I denne forbindelse er den pan-lyssavirus indlejrede RT-PCR, der er rettet mod den mest konserveres N-genregion, et meget nyttigt værktøj, og resultaterne har vist, at den effektivt kan detektere alle 16 ICTV-godkendte og to nye lyssavirus arter, der er identificeret indtil nu, herunder genetisk divergerende RABVs og IRKV i Kina (data om IRKV-stammen ikke påvist). Det er dog også interessant at bemærke, at ARAV kun blev detekteret af den anden runde PCR-primere, mens IKOV kun blev detekteret ved første runde PCR-primere (figur 1). For at undersøge årsagen til denne uoverensstemmelse blev der gennemført en sekvens sammenligning af alle 18 Lyssavira inden for de fire primer-regioner, og resultaterne viste, at 3 ' ende nukleotid T af den ydre primer N829 i den første runde PCR og den anden nukleotid T ved 3 ' slutningen af indre primer N371F i den anden runde PCR var ikke identiske med de tilsvarende positioner af ARAV (G) og IKOV (A) (figur 2). Når T af primer N829 blev ændret til G af ARAV og T af primer N371F ændret til A af IKOV, begge vira blev med held påvist i PCR (data ikke vist). Dette resultat viser den afgørende rolle, som de 3 ' ende eller nær-ende nukleotider af primere i en vellykket forstærkning af målregionen.

For at vurdere følsomheden og specificiteten af metoden til påvisning af rabiesvirus til klinisk diagnose og overvågning blev 9.624 dyre hjerne vævsprøver i de sidste 10 år testet af FAT og indlejret RT-PCR parallelt. Af de 165 prøver, der testede rabies positivt ved indlejret RT-PCR, blev 162 påvist som positive af FAT; Derfor viser de to metoder 99,07% overensstemmelse. De rabvs detekterede i disse 165 prøver kunne klassificeres i forskellige slægter i asiatiske, arktiske-relaterede, og Cosmopolitan clader12,13, hvilket indikerer, at indlejrede RT-PCR kan dække de forskellige genetiske clader af rabvs. Tre meget forrådnede kliniske prøver blev testet positive ved indlejret RT-PCR, men negativt af FAT. Dette resultat er i overensstemmelse med evalueringen af effekten ved testning af to nedbrudte prøver som vist i afsnittet med repræsentative resultater, hvilket indikerer, at indlejret RT-PCR er mere følsom end FAT i påvisning af vira i stærkt forrådnede prøver.

Ydeevnen af indlejret RT-PCR blev yderligere bekræftet ved deltagelse i den internationale laboratorie sammenlignings test (ILCT), der blev arrangeret af EU-reference laboratoriet for rabies i det franske agentur for fødevare-, miljø-og bedrifts sundheds & sikkerhed ( ANSES) i 2010, ved hjælp af et sæt af 12 prøver (en hver af RABV, EBLV-1, EBLV-2, og ABLV som positive kontroller, en negativ kontrol, og syv blindede prøver). I testen identificerede indlejret RT-PCR alle Lyssavira med en 100% konsistens. I 2018 blev metoden godkendt som national standard for rabies diagnoser (GB/T36789-2018) af Kinas nationale tekniske Standardiseringskomité for Dyresundhed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Undersøgelsen blev støttet af den nationale centrale forsknings-og udviklings plan (Grant No. 2016YFD0500401) og den nationale naturvidenskabelige fond i Kina (Grant No. 31302043).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 × TAE Various Various
6 × loading buffer TakaRa 9156
Agarose US Everbright® Inc A-2015-100g
ddH2O Various Various
DL 2,000 Marker Takara 3427A
dNTPs (10 mM) TakaRa 4019
dNTPs (2.5 mM) TakaRa 4030
Electrophoresis System Tanon EPS300
Ex-Taq (5 U/μL) TakaRa RR001
Gel Imaging System UVITEC Fire Reader
Microcentifuge tubes Various Various
M-MLV reverse transcriptase (200 IU/µL) TakaRa 2641A 
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermoscientific ND1000
Oligo (dT)15 TakaRa 3805
PCR Machine BIO-RAD T100
PCR Tubes Various Various
Phusion High-Fidelity DNA Polymearase NEW ENGLAND BioLabs M0530S
Pipettors Various Various
Random Primer TakaRa 3801
RNase Inhibitor (40 IU/µL) TakaRa 2313A
RNase-free ddH2O TakaRa 9102
Taq Buffer (10×) TakaRa 9152A
Tips Various Various
Vortex mixer Various Various

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hemachudha, T., Laothamatas, J., Rupprecht, C. E. Human rabies: a disease of complex neuropathogenetic mechanisms and diagnostic challenges. Lancet Neurology. 1, (2), 101-109 (2002).
  2. Amarasinghe, G. K., Arechiga Ceballos, N. G. Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2018. Archives of Virology. 163, (8), 2283-2294 (2018).
  3. Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland. Transboundary and Emerging Diseases. 65, (3), 593-596 (2018).
  4. Hu, S. C., et al. Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 24, (4), 782-785 (2018).
  5. World Organization for Animal Health (OIE). Chapter 2.1.17 - Rabies (infection with rabies virus and other lyssaviruses). Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2018. Available from: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_RABIES.pdf 2-14 (2018).
  6. Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. Laboratory techniques in rabies. World Health Organization. 74-195 (2018).
  7. Mani, R. S., et al. Utility of real-time Taqman PCR for antemortem and postmortem diagnosis of human rabies. Journal of Medical Virology. 86, (10), 1804-1812 (2014).
  8. Fooks, A. R., et al. Emerging technologies for the detection of rabies virus: challenges and hopes in the 21st century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 3, (9), 530 (2009).
  9. Jiang, Y., et al. An outbreak of pig rabies in Hunan province, China. Epidemiology and Infection. 136, (4), 504-508 (2008).
  10. Liu, Y., et al. Analysis of the complete genome of the first Irkut virus isolate from China: comparison across the Lyssavirus genus. Molecular Phylogenetics and Evolution. 69, (3), 687-693 (2013).
  11. Chen, T., et al. Possible Transmission of Irkut Virus from Dogs to Humans. Biomedical and Environmental Sciences. 31, (2), 146-148 (2018).
  12. Feng, Y., et al. Disease outbreaks caused by steppe-type rabies viruses in China. Epidemiology and Infection. 143, (6), 1287-1291 (2015).
  13. Feng, Y., et al. Livestock rabies outbreaks in Shanxi province, China. Archives of Virology. 161, (10), 2851-2854 (2016).
Evaluering af en universel indlejret reverse transkription polymerase kædereaktion til påvisning af Lyssavira
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Y., Xu, W., Guo, H., Gong, W., He, B., Tu, Z., Tu, C., Feng, Y. Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses. J. Vis. Exp. (147), e59428, doi:10.3791/59428 (2019).More

Wang, Y., Xu, W., Guo, H., Gong, W., He, B., Tu, Z., Tu, C., Feng, Y. Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses. J. Vis. Exp. (147), e59428, doi:10.3791/59428 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter