Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Genetics

Evaluatie van een universele geneste omgekeerde transcriptie polymerase chain reactie voor de opsporing van Lyssaviruses

doi: 10.3791/59428 Published: May 2, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Een pan-Lyssavirus geneste omgekeerde transcriptie polymerase chain reactie is ontwikkeld om specifiek te detecteren alle bekende lyssaviruses. Validatie met behulp van rabiës hersenen monsters van verschillende diersoorten bleek dat deze methode een gevoeligheid en specificiteit gelijkwaardig is aan de gouden standaard fluorescerende antilichaam test en kan worden gebruikt voor routine hondsdolheid diagnose heeft.

Abstract

Voor het opsporen van rabiësvirus en andere lid soorten van het geslacht Lyssavirus binnen de familie Rhabdoviridae, de pan-Lyssavirus geneste omgekeerde transcriptie polymerase chain reaction (geneste RT-PCR) werd ontwikkeld om de geconserveerde regio te detecteren van het nucleoproteïne (N) gen van lyssaviruses. De methode past omgekeerde transcriptie (RT) toe gebruikend Viral RNA als malplaatje en oligo (dT)15 en willekeurige hexamers als inleidingen om het virale bijkomende DNA (cDNA) te synthetiseren. Dan, wordt virale cDNA gebruikt als malplaatje om een fragment van het gen van 845 BP N in eerste ronde PCR te versterken gebruikend buiten inleidingen, die door tweede-ronde geneste PCR worden gevolgd om def. 371 te versterken BP fragment gebruikend binnenprimers. Deze methode kan detecteren verschillende genetische bekleed van rabiës virussen (RABV). De validatie, met behulp van 9.624 hersen specimens uit acht huisdier soorten in 10 jaar van klinische rabiës diagnoses en surveillance in China, bleek dat de methode 100% gevoeligheid en 99,97% specificiteit in vergelijking met de directe fluorescerende de test van het antilichaam (vet), de gouden standaardmethode die door de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) en de Wereldorganisatie voor dierlijke gezondheid (OIE) wordt geadviseerd. Bovendien kan de methode ook specifiek versterken de beoogde N-gen fragment van 15 andere goedgekeurde en twee nieuwe Lyssavirus soorten in het 10e verslag van het Internationaal Comite voor de taxonomie van virussen (ICTV), zoals geëvalueerd door een na te bootsen detectie van gesynthetiseerde N de plasmiden van het gen van al lyssaviruses. De methode biedt een handig alternatief voor vet voor rabiës diagnose en is goedgekeurd als een nationale norm (GB/T36789-2018) van China.

Introduction

Rabiës is een wereldwijde zoönose die wordt veroorzaakt door virussen binnen het geslacht Lyssavirus1. Lyssaviruses (familie Rhabdoviridae) zijn enig-negatief-gestrande virussen van RNA met een ongeveer 12 KB genoom dat vijf proteïnen codeert: N, Phosphoprotein (P), matrijsproteïne (M), glycoproteïne (G), en het grote proteïne of de polymerase (L). Op basis van nucleotide sequenties van het N gen, genetische afstand, en antigene patronen, de lyssaviruses zijn onderverdeeld in 16 soorten, bestaande uit klassieke rabiësvirus (RABV) en de rabiës-gerelateerde virussen (RRV): Lagos bat virus (LBV), Duvenhage virus (DUVV ), Mokola virus (MOKV), Europese knuppel Lyssavirus 1 (EBLV-1), Europese knuppel Lyssavirus 2 (EBLV-2), Australische knuppel Lyssavirus (ABLV), Aravan virus (Frédéric), Ikoma virus (IKOV), Bokeloh knuppel Lyssavirus (BBLV), Gannoruwa knuppel Lyssavirus (GBLV), Irkoet virus (IRKV), Khujand virus (KHUV), het westen Kaukasische knuppel virus (WCBV), Shimoni het virus van de knuppel (SHIBV), en de knuppel Lyssavirus van Lleida (LLEBV)2. Onlangs zijn twee extra lyssaviruses geïdentificeerd: Kotalahti bat Lyssavirus (KBLV) geïsoleerd van een brandt ' bat (Myotis brandtii) in Finland in 20173 en Taiwan bat Lyssavirus (TWBLV) geïsoleerd van een Japanse vleermuis ( Pipistrellus abramus) in Taiwan, China in 2016 – 20174.

Alle zoogdieren zijn vatbaar voor rabiës; echter, geen grove Pathognomonisch laesies of specifieke klinische symptomen mogelijk zijn identificatie, en de diagnose kan alleen worden gemaakt in het laboratorium5. De meest gebruikte methode voor hondsdolheid diagnose is het vet, dat wordt beschouwd als de gouden standaard door zowel de WHO en de OIE5,6. Niettemin, het vet kan produceren onbetrouwbare resultaten op gedegradeerde/autolyzed hersenweefsel monsters. Bovendien, het kan niet worden gebruikt om biologische vloeistoffen monsters zoals hersenvocht (CB), speeksel, en urine Assay, waardoor grotendeels uitschakeling zijn werkgelegenheid in antemortem diagnose7. Alternatieve conventionele diagnostische tests, zoals de hondsdolheid weefselkweek infectie test (RTCIT) en de muis inenting test (MIT), vereisen enkele dagen6, een groot nadeel wanneer een snelle diagnose van essentieel belang is.

Diverse moleculaire kenmerkende tests (b.v., de opsporing van viraal RNA door RT-PCR, PCR-enzym-verbonden immunosorbent assay [PCR-ELISA], in situ kruising, en PCR in real time) worden gebruikt als snelle en gevoelige technieken voor hondsdolheid diagnose8. RT-PCR wordt nu geadviseerd door OIE voor routine hondsdolheid diagnose, en een heminested (hn) PCR wordt beschreven in het OIE handboek van kenmerkende tests en vaccins voor aardse dieren om al lyssaviruses5te ontdekken. Hier beschrijven we een pan-Lyssavirus geneste RT-PCR, die het mogelijk maakt de specifieke en gevoelige detectie van alle 18 Lyssavirus soorten vergelijkbaar met of hoger dan die verkregen door het vet. Het principe van de methode is een RT van het doel RNA (geconserveerd gebied van het Lyssavirus N gen) in cDNA, gevolgd door de versterking van de cDNA door twee rondes van PCR. De cDNA ondergaat de eerste ronde PCR met buitenste primers om een 845 BP fragment te versterken; dan, gebruikt tweede-ronde PCR het eerste-ronde PCR product als malplaatje om een 371 BP fragment met binneninleidingen te versterken. De twee rondes van PCR verhogen beduidend de gevoeligheid van de analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Het gebruik van muizen in dit protocol werd goedgekeurd door het administratief Comite voor het welzijn van dieren van het Instituut voor militaire veterinaire geneeskunde, de Academie voor militaire medische wetenschappen, China (laboratorium Dierzorg en het gebruik Comite vergunning, vergunning aantal JSY-DW-2010-02). Alle institutionele en nationale richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren werden gevolgd.

1. de extractie van RNA

  1. Extract RNA van rabiës-vermoedelijk hersenweefsel, huid biopten, speeksel, of CSF of uit RABV-geïnfecteerde cel cultuur, met behulp van guanidinium isothiocyanaat-fenol-chloroform-gebaseerde extractie methoden of commercieel beschikbare virale RNA extractie Kits. Gebruik onmiddellijk het voor bereide RNA of bewaar het bij-80 °C tot vereist.

2. omgekeerde transcriptie van de virale RNA

  1. Verwijder de RT reagentia vermeld in tabel 1 uit de vriezer, bewaar ze op het ijs, en ontdooien en Vortex ze voor gebruik.
  2. Bereid 12 µ L van RT reactie mix in een 0,2 mL PCR buis met de reagentia vermeld in tabel 1. Laat toe om variaties te pipetteren door een volume van Master mix voor te bereiden ten minste één reactie grootte groter dan nodig is.
  3. Voeg 8 µ L steekproef, positieve controle RNA of negatieve controle aan de RT reactie mengeling binnen een PCR werkstation in een malplaatjeruimte toe. De RT positieve controle is RNA geëxtraheerd uit de cel cultuur geïnfecteerd met vaste RABV stam CVS-11 (Challenge virus Standard-11) en opgeslagen op-80 ° c. De negatieve controle bevat ASE-vrije ddH2O.
  4. Meng de inhoud van de RT tubes door vortexen; dan, centrifugeer kort.
  5. Laad de reactie buizen in een thermische fietser. Stel het cDNA synthese programma in met de volgende voorwaarden: 42 °C voor 90 min, 95 °C voor 5 min, en 4 °C in de wacht. Stel het reactievolume in op 20 µ L. Start de RT run.

3. eerste ronde PCR

  1. Houd de PCR Reagentia vermeld in tabel 2 op ijs in een schone ruimte tot het gebruik; dan, ontdooien en Vortex ze.
  2. Bereid de eerste ronde PCR-mix in een 0,2 mL PCR-buis samen met de in tabel 2vermelde reagentia.
  3. Voeg een 2 µ L steekproef van cDNA of plasmide in de eerste ronde PCR mengeling binnen een PCR werkstation in een malplaatjeruimte toe. De PCR positieve controle is CVS-11 cDNA voorbereid zoals vermeld in stap 2,3 voor de bovengenoemde RT methode. De PCR negatieve controle is ddH2O.
  4. Breng de verzegelde buizen over naar een PCR-thermische fietser en voer de in tabel 3vermelde parameters uit.

4. tweede-ronde PCR

  1. Bereid de tweede ronde PCR-mix in een 0,2 mL PCR-buis met gebruikmaking van de in tabel 4vermelde reagentia.
  2. Voeg toe 2 µ L van eerste-ronde PCR product in de tweede-ronde PCR mengeling. Bovendien omvatten ddH2O als negatieve controle van tweede-ronde PCR.
  3. Voer PCR het thermische cirkelen uit gebruikend de zelfde parameters zoals die in stap 3,4 worden gegeven.

5. analyse van de PCR producten door elektroforese op agarose gels

  1. Bereid een 1,5% agarose gel voor door 1,5 g van agarose aan 100 mL van tris-acetaat-EDTA (TAE) toe te voegen en het grondig op te lossen door het in een microgolfoven te verwarmen.
  2. Voeg ethidium bromide (EB) toe (bij een eindconcentratie van 0,01%) of een andere commerciële EB substitutie. Giet de gel in de mal en laat het te stollen bij omgevingstemperatuur gedurende ten minste 30 min.
  3. Bereid de ladings steekproeven voor door 5 µ L van elk PCR product met 1 µ L van 6x ladings buffer te mengen.
  4. Laad de monsters en de geschikte DNA-marker afzonderlijk in de putten en voer de gel voor ongeveer 30-45 min op 120 V tot de kleurstof lijn is ongeveer 75%-80% vaststelling van de gel.
  5. Zet de stroom uit, koppel de elektroden uit de stroombron, en vervolgens zorgvuldig verwijderen van de gel uit de gel box.
  6. Gebruik een UV-Gel documenteren apparaat te visualiseren en te fotograferen de DNA-fragmenten.

6. karakterisering van genestelde RT-PCR

  1. 6,1. specificiteit en gevoeligheid voor de detectie van 18 lyssaviruses plasmiden
    1. Bestel 18 commerciële plasmiden die het volledige N gen van elke Lyssavirus (16 ICTV soorten en twee nieuwe soorten) voor PCR bevatten.
    2. Bereken het exemplaaraantal van de plasmide gebruikend het aantal van Avogadro (Na) en de volgende formule.
      [(g/µ L plasmide DNA)/(plasmide lengte in BP x 660)] x 6,022 x 1023 = aantal moleculen/µ l
    3. Bereid voorraad oplossingen (2,24 x 109 moleculen/µ l) van alle 18 plasmiden in ddH2O.
    4. Voer 9 10-voudige seriële verdunningen van alle 18 plasmiden in ddH2o. Verdun 10 µ l van elke plasmide voorraad met 90 µ l van ddH2o. Vortex en centrifugeer kort.
    5. Voer PCR versterking uit zoals beschreven in de punten 3-5.
    6. Analyseer de specificiteit en de gevoeligheid van geneste PCR door een reeks van Lyssavirus plasmiden te ontdekken.
  2. Bepaling van d etection Laeremans IMIT
    1. Pas de titer van de hondsdolheid virusstam CVS-11 Cell Culture tot 105,5 TCID50/ml (virus TITER bepaald volgens de OIE handleiding)5.
    2. Voer 5 10-voudige seriële verdunningen van CVS-11 (stockoplossing is 105,5 TCID50/ml) zoals beschreven in stap 6.1.4.
    3. Voer de extractie van RNA en genestelde RT-PCR versterkings procedures van alle virale verdunningen uit zoals beschreven in secties 1-5.
  3. Compar koor van het genesteld RT-PCR met de "Gold Standard" Fat
    1. Test alle klinische monsters door geneste RT-PCR, en bevestig vervolgens de resultaten met de FAT5 en N Gene sequencing9.
    2. Gebruik genormaliseerde gegevens voor een statistische analyse met SAS 9,1. Gebruik de Kappa test en McNemar Chi-kwadraat test voor een statistische vergelijking van de diagnostische tests (SAS commando: proc freq; tabel/agree). Bereken betrouwbaarheidsintervallen uitgaande van abinomial distributie.
  4. Evaluatie van de werkzaamheid bij het testen van gedegradeerde monsters
    1. Expose twee bevestigde klinische hersenweefsel monsters van hondsdolle honden op 37 ° c.
    2. Test de twee steekproeven op elke dag van blootstelling bij 37 °C door genestelde RT-PCR, het vet, en MIT5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De resultaten van genestelde RT-PCR om 18 Lyssavirus soorten te ontdekken worden getoond in Figuur 1. Alle PCR positieve controles toonden verwachte 845 BP in eerste-en 371 BP in de tweede-ronde versterking met geen band in de negatieve controle. Alle 18 lyssaviruses produceerde de verwachte 845 en/of 371 BP bands, wat aangeeft dat de geneste RT-PCR alle 18 lyssaviruses gedetecteerd. Zestien lyssaviruses plasmiden hadden efficiënte versterking in twee rondes van PCR, maar twee, namelijk Frédéric en IKOV, hadden versterking in of eerste-of tweede-ronde PCR. De gevoeligheid van de methode varieerde in de detectie van verschillende Lyssavirus plasmiden, met grenzen variërend van 2,24 x 100 tot 2,24 x 105 moleculen/µ l, zoals weergegeven in tabel 6. Deze verschillen kunnen worden toegeschreven aan de mismatchen tussen de primers en sjablonen als gevolg van virale sequentie diversiteit. Bovendien, de gevoeligheid van het opsporen van rabiësvirus CVS-11 in de cel cultuur was 102,5 TCID50/ml.

Een totaal van 9.624 hersenweefsels van klinische specimens werden getest door geneste RT-PCR in vergelijking met het vet en de resultaten zijn samengevat in tabel 7, waaruit blijkt dat genesteld RT-PCR had een 100% gevoeligheid (CI, 97,75% tot 100%) en een specificiteit van 99,97% (CI, 99,91% tot 99,99%). De overeenstemming tussen de twee methoden was 99,07%. Drie tests die door genestelde RT-PCR maar negatief door het vet positief waren waren van hoogst verrotte klinisch materiaal. Deze drie specimens werden bevestigd als RABV positief door N gen sequencing.

De vergelijking van de Testprestaties in de opsporing van de twee hersenen specimens die bij 37 °C worden uitgebroed (stap 6.4.1 van het Protocol) wees erop dat geneste RT-PCR effectief virus in rotte hersenen weefsels minstens 17 dagen postdegradation kon ontdekken, die voor een langere periode van tijd in vergelijking met slechts 7 dagen door het vet en zelfs niet 1 dag door het MIT. Dit resultaat toont aan dat genestelde RT-PCR gevoeliger is in de opsporing van gedegradeerde monsters dan het vet en het MIT.

Om verder te valideren de geneste RT-PCR, 10 rabiës laboratoria in China werden uitgenodigd om tests uit te voeren op een set van specimens. Van deze, acht laboratoria werden voorzien van een set van 10 verblinde dierlijke hersenweefsels uit ons laboratorium, met inbegrip van RABV positieve en negatieve specimens. De andere twee laboratoria gebruikten hun eigen specimens. Alle specimens waren gearchiveerd en bevestigd door het vet eerder. Alle 10 laboratoria verkregen resultaten door genestelde RT-PCR in 100% overeenstemming met het vet, zonder vals-negatieven of vals-positieven (lijst 8), die erop wijst dat geneste RT-PCR een hoge specificiteit en reproduceerbaarheid had.

Onderdelen Volume per reactie (µ L)
dNTPs (2,5 mM) 4
Willekeurige primer (50 μM) 1,5
Oligo (dT) 15 (50 μM) 0,5
M-MLV buffer (5x) 4
M-MLV omgekeerde transcriptase (200 IU/µ L) 1
RNasin (40 IU/µ L) 1
Totaal volume 12

Tabel 1: Reagentia van omgekeerde transcriptie voor cDNA synthese .

Onderdelen Volume per reactie (µ L)
dNTPs (10 mM) 1
Ex-Taq (5 U/l) 0,3
Taq buffer (10x) 5
N127 (20 μM) 1
N829 (20 μM) 1
DD H2O 39,7
Totaal volume 48

Tabel 2: Reagentia van de eerste ronde PCR.

Temperatuur Tijd Cycli
94 °C 2 min 1
94 °C 30 s 35
56 °C 30 s 35
72 °C 40 s 35
72 °C 10 min 1
4 °C

Tabel 3: C ycling parameters van de eerste- en de tweede-ronde PCR.

Onderdelen Volume per reactie (µ L)
dNTPs (10 mM) 1
Ex-Taq (5 U/l) 0,3
Taq buffer (10x) 5
N371F (20 μM) 1
N371R (20 μM) 1
DD H2O 39,7
Totaal volume 48

Tabel 4: Reagentia van de tweede ronde PCR.

Primer naam Details Richting Opeenvolging (5 "-3") Nucleotide positie Product grootte
N127 De eerste ronde PCR Vooruit ATGTAACNCCTCTACAATGG -19 ~ 0 845bp
N829 De eerste ronde PCR Omgekeerde GCCCTGGTTCGAACATTCT 807 ~ 825 845bp
N371F De tweede ronde PCR Vooruit ACAATGGAKKCTGACAARATTG -6 ~ 15 371bp
N371R De tweede ronde PCR Omgekeerde CCTGYYWGAGCCCAGTTVCCYTC 345 ~ 367 371bp

Tabel 5: (Opmeer ) equences van de eerste- en de tweede ronde PCR . Degenereer basissen: N (A/T/C/G), K (G/T), R (A/G), Y (C/T), WV (G/A/C).

Lyssavirus soorten Stam De plasmide van de malplaatje (molecules/µ L)
RABV GQ 918139.1 2,24 x 101
Lbv EU 293110.1 2,24 x 102
MOKV (155005.1 2,24 x 101
DUVV EU 293119.1 2,24 x 101
EBLV-1 EF 157976.1 2,24 x 101
EBLV-2 (155004.1 2,24 x 101
ABLV GU 992312.1 2,24 x 100
IRKV NC_020809.1 2,24 x 101
WCBV NC_025377.1 2,24 x 101
KHUV NC_025385.1 2,24 x 103
Frédéric NC_020808.1 2,24 x 102
SHIBV NC_025365.1 2,24 x 101
BBLV NC_025251.1 2,24 x 101
IKOV NC_018629.1 2,24 x 105
LLEBV NC_031955.1 2,24 x 103
GBLV NC_031988.1 2,24 x 105
KBLV MF 960865.1 2,24 x 101
TWBLV MF 472710.1 2,24 x 101

Tabel 6: Detectielimiet van genesteld RT-PCR o f 18 l yssavirus es.

Standaardmethode en resultaat RT-nPCR
Positieve
RT-nPCR
Negatieve
Correlatie (%)
Vet Positieve
Negatieve
162
3
0
9459
99,07

Tabel 7: Correlatie tussen genesteld RT-PCR en het vet in het detectie van RABVs in klinische specimens.

Table 8
Tabel 8: Validatieresultaten van geneste RT-PCR door 10 laboratoria.

Figure 1
Figuur 1 : Detectie van 18 Lyssavirus es van geneste RT-PCR. (A) het resultaat van de eerste ronde PCR. Bhet resultaat van de tweede-ronde PCR. M = DL 2000 de teller van DNA. Rijstroken 1 – 18 = RABV, LBV, MOKV, DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, Frédéric, IKOV, BBLV, GBLV, IRKV, KHUV, LLEBV, SHIBV, WCBV, KBLV, en TWBLV, respectievelijk. Steeg 19 = PCR positieve controle; steeg 20 = negatieve controle voor eerste-ronde PCR; Lane 21 = negatieve controle voor de tweede-ronde PCR. Een positief PCR resultaat toont een band bij 845 BP in de eerste ronde en 371 BP in tweede-ronde PCR. Amplicon van Frédéric is niet zichtbaar in de eerste ronde, maar zichtbaar in tweede-ronde PCR (steeg 8), terwijl amplicon van IKOV in de eerste ronde zichtbaar is, maar niet zichtbaar in tweede-ronde PCR (steeg 9). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2 : Vergelijking met primer sequenties toont de differentiële nucleotiden in primer regio's van 18 Lyssavirus soorten. N127 en N829 waren buiten primers, N371F en N371R waren innerlijke primers. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Momenteel, is RABV een belangrijke Lyssavirus verantwoordelijk voor bijna al menselijke en dierlijke hondsdolheid in China, evenals in andere landen. Bovendien werd een IRKV variant eerst geïdentificeerde van a Murina leucogaster knuppel in de provincie Jilin in noordoostelijk China in 201210, en het is gemeld om de dood van een hond in de provincie Liaoning in 201711te veroorzaken. Onlangs, werd een roman Lyssavirus, TWBLV, ook geïdentificeerde van een Japanse vleermuis knuppel in Taiwan, China in 2017. Deze resultaten suggereren dat de effectieve opsporing van andere lyssaviruses is ook belangrijk om te voorkomen dat de spill-over van de bat-Borne lyssaviruses. In dit verband is de pan-Lyssavirus genesteld RT-PCR gericht op de meest geconserveerde N-gen regio is een zeer nuttig instrument, en de resultaten hebben aangetoond dat het effectief kan detecteren alle 16 ICTV-goedgekeurde en twee nieuwe Lyssavirus soorten tot nu toe geïdentificeerd, met inbegrip genetisch uiteenlopende RABVs en IRKV in China (gegevens over IRKV stam niet getoond). Nochtans, is het ook interessant om op te merken dat Frédéric slechts door de tweede-ronde PCR inleidingen werd ontdekt, terwijl IKOV slechts door eerste-ronde PCR inleidingen werd ontdekt (Figuur 1). Om de oorzaak van deze discrepantie te onderzoeken, werd de opeenvolgings vergelijking van alle 18 lyssaviruses binnen de vier inleidings gebieden geleid, met de resultaten die aantonen dat het 3 ' eind nucleotide T van buiten Inleiding N829 in eerste-ronde PCR en tweede nucleotide T bij 3 ' het eind van binnen inleidings N371F in tweede-ronde PCR was niet identiek aan de overeenkomstige posities van Frédéric (G) en IKOV (A) (Figuur 2). Zodra T van inleiding N829 werd veranderd in G van Frédéric en T van inleiding N371F veranderd in A van IKOV, werden beide virussen met succes ontdekt in PCR (gegevens niet getoond). Dit resultaat toont de kritieke rol van de 3 ' end of near-end nucleotiden van primers in de succesvolle versterking van de doelregio.

Om de gevoeligheid en de specificiteit van de methode in de opsporing van rabiësvirus voor klinische diagnose en toezicht te evalueren, werden de 9.624 dierlijke steekproeven van het hersenenweefsel getest in de laatste 10 jaar door het vet en genestelde RT-PCR parallel. Van de 165 monsters die hondsdolheid positief getest door geneste RT-PCR, 162 werden gedetecteerd als positief door het vet; Daarom, de twee methoden tonen 99,07% overeenstemming. De RABVs gedetecteerd in deze 165 monsters kunnen worden ingedeeld in verschillende geslachten in de Aziatische, arctische-gerelateerde, en kosmopolitische bekleed12,13, wat aangeeft dat genesteld RT-PCR kan de verschillende genetische bekleed van RABVs te dekken. Drie hoogst verrotte klinische specimens werden getest positief door geneste RT-PCR maar negatief door het vet. Dit resultaat is in overeenstemming met de evaluatie van de werkzaamheid in het testen van twee gedegradeerde monsters zoals aangegeven in de representatieve resultaten sectie, waaruit blijkt dat genesteld RT-PCR is gevoeliger dan het vet in de opsporing van virussen in zeer vervallen specimens.

De prestaties van genestelde RT-PCR werden verder bevestigd door deelname aan de International Laboratory vergelijkende test (ILCT), georganiseerd door het EU-referentielaboratorium voor rabiës bij het Franse Agentschap voor voedsel-, milieu-en bedrijfs gezondheid & veiligheid ( ANSEs) in 2010, gebruikend een reeks van 12 steekproeven (één elk van RABV, EBLV-1, EBLV-2, en ABLV als positieve controles, één negatieve controle, en zeven verblinde steekproeven). In de test, geneste RT-PCR met succes geïdentificeerd alle lyssaviruses met een 100% consistentie. In 2018, werd de methode goedgekeurd als nationale norm van de diagnoses van de hondsdolheid (GB/T36789-2018) door de nationale technische Normalisatiecommissie van dierlijke gezondheid van China.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De studie werd gesteund door het nationale belangrijkste onderzoek en ontwikkelings plan (toelage nr. 2016YFD0500401) en de nationale stichting van de natuurwetenschappen van China (toelage nr. 31302043).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 × TAE Various Various
6 × loading buffer TakaRa 9156
Agarose US Everbright® Inc A-2015-100g
ddH2O Various Various
DL 2,000 Marker Takara 3427A
dNTPs (10 mM) TakaRa 4019
dNTPs (2.5 mM) TakaRa 4030
Electrophoresis System Tanon EPS300
Ex-Taq (5 U/μL) TakaRa RR001
Gel Imaging System UVITEC Fire Reader
Microcentifuge tubes Various Various
M-MLV reverse transcriptase (200 IU/µL) TakaRa 2641A 
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermoscientific ND1000
Oligo (dT)15 TakaRa 3805
PCR Machine BIO-RAD T100
PCR Tubes Various Various
Phusion High-Fidelity DNA Polymearase NEW ENGLAND BioLabs M0530S
Pipettors Various Various
Random Primer TakaRa 3801
RNase Inhibitor (40 IU/µL) TakaRa 2313A
RNase-free ddH2O TakaRa 9102
Taq Buffer (10×) TakaRa 9152A
Tips Various Various
Vortex mixer Various Various

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hemachudha, T., Laothamatas, J., Rupprecht, C. E. Human rabies: a disease of complex neuropathogenetic mechanisms and diagnostic challenges. Lancet Neurology. 1, (2), 101-109 (2002).
  2. Amarasinghe, G. K., Arechiga Ceballos, N. G. Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2018. Archives of Virology. 163, (8), 2283-2294 (2018).
  3. Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland. Transboundary and Emerging Diseases. 65, (3), 593-596 (2018).
  4. Hu, S. C., et al. Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 24, (4), 782-785 (2018).
  5. World Organization for Animal Health (OIE). Chapter 2.1.17 - Rabies (infection with rabies virus and other lyssaviruses). Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2018. Available from: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_RABIES.pdf 2-14 (2018).
  6. Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. Laboratory techniques in rabies. World Health Organization. 74-195 (2018).
  7. Mani, R. S., et al. Utility of real-time Taqman PCR for antemortem and postmortem diagnosis of human rabies. Journal of Medical Virology. 86, (10), 1804-1812 (2014).
  8. Fooks, A. R., et al. Emerging technologies for the detection of rabies virus: challenges and hopes in the 21st century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 3, (9), 530 (2009).
  9. Jiang, Y., et al. An outbreak of pig rabies in Hunan province, China. Epidemiology and Infection. 136, (4), 504-508 (2008).
  10. Liu, Y., et al. Analysis of the complete genome of the first Irkut virus isolate from China: comparison across the Lyssavirus genus. Molecular Phylogenetics and Evolution. 69, (3), 687-693 (2013).
  11. Chen, T., et al. Possible Transmission of Irkut Virus from Dogs to Humans. Biomedical and Environmental Sciences. 31, (2), 146-148 (2018).
  12. Feng, Y., et al. Disease outbreaks caused by steppe-type rabies viruses in China. Epidemiology and Infection. 143, (6), 1287-1291 (2015).
  13. Feng, Y., et al. Livestock rabies outbreaks in Shanxi province, China. Archives of Virology. 161, (10), 2851-2854 (2016).
Evaluatie van een universele geneste omgekeerde transcriptie polymerase chain reactie voor de opsporing van Lyssaviruses
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Y., Xu, W., Guo, H., Gong, W., He, B., Tu, Z., Tu, C., Feng, Y. Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses. J. Vis. Exp. (147), e59428, doi:10.3791/59428 (2019).More

Wang, Y., Xu, W., Guo, H., Gong, W., He, B., Tu, Z., Tu, C., Feng, Y. Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses. J. Vis. Exp. (147), e59428, doi:10.3791/59428 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter