Summary
È stata sviluppata una reazione a catena della polimerasi della trascrizione inversa nidificata di Pan-Lyssavirus per rilevare in modo specifico tutti i Lyssaviruses conosciuti. La validazione utilizzando campioni di cervello di rabbia di diverse specie animali ha mostrato che questo metodo ha una sensibilità e una specificità equivalenti al test anticorpale fluorescente standard oro e potrebbe essere utilizzato per la diagnosi di rabbia di routine.
Abstract
Per rilevare il virus della rabbia e altre specie membro del genere Lyssavirus all'interno della famiglia Rhabdoviridae, la reazione a catena della polimerasi di trascrizione inversa di Pan-Lyssavirus (RT-PCR nidificata) è stata sviluppata per rilevare la regione conservata del gene nucleoproteico (N) di Lyssaviruses. Il metodo applica la trascrizione inversa (RT) utilizzando RNA virale come modello e oligo (dT)15 e esameri casuali come primer per sintetizzare il DNA complementare virale (cDNA). Quindi, il cDNA virale viene utilizzato come modello per amplificare un frammento di gene 845 BP N nella PCR del primo round utilizzando primer esterni, seguiti da PCR nidificata del secondo round per amplificare il frammento finale 371 BP utilizzando primer interni. Questo metodo può rilevare diverse cladi genetiche di virus della rabbia (RABV). La validazione, utilizzando 9.624 campioni cerebrali di otto specie animali domestiche in 10 anni di diagnosi di rabbia clinica e di sorveglianza in Cina, ha mostrato che il metodo ha 100% di sensibilità e 99,97% di specificità rispetto alla fluorescenza diretta test anticorpale (FAT), il metodo standard Gold raccomandato dall'organizzazione mondiale della sanità (OMS) e dall'organizzazione mondiale per la salute animale (OIE). Inoltre, il metodo potrebbe anche amplificare in modo specifico il frammento di gene N mirato di 15 altre specie di Lyssavirus approvate e due nuove nel 10 ° rapporto del Comitato internazionale sulla tassonomia dei virus (ICTV) come valutato da un rilevamento mimico di sintetizzato N plasmidi genici di tutti i Lyssaviruses. Il metodo fornisce una comoda alternativa al FAT per la diagnosi della rabbia ed è stato approvato come standard nazionale (GB/T36789-2018) della Cina.
Introduction
La rabbia è una malattia zoonotica a livello mondiale causata da virus all'interno del genere Lyssavirus1. I Lyssaviruses (famiglia Rhabdoviridae) sono virus RNA a singolo-negativo-filamento con un genoma di circa 12 KB che codifica cinque proteine: N, fosfoproteina (P), proteina di matrice (M), glicoproteina (G), e la grande proteina o polimerasi (L). Sulla base delle sequenze nucleotidiche del gene N, della distanza genetica e dei modelli antigenici, i Lyssavirus sono stati suddivisi in 16 specie, comprendenti il virus della rabbia classica (RABV) e i virus correlati alla rabbia (RRV): virus bat di Lagos (LBV), Virus Duvenhage (DUVV ), Il Virus Mokola (MOKV), il bat europeo Lyssavirus 1 (EBLV-1), l'European bat Lyssavirus 2 (EBLV-2), bat lyssavirus australiano (ABLV), virus Aravan (ARAV), virus Ikoma (IKOV), Bokeloh bat Lyssavirus (BBLV), Gannoruwa bat Lyssavirus (GBLV), virus Irkut (IRKV), Virus Khujand (KHUV), virus della bat caucasica occidentale (WCBV), virus bat Shimoni (SHIBV) e Lleida bat Lyssavirus (LLEBV)2. Recentemente, sono stati identificati altri due Lyssavirus: Kotalahti bat Lyssavirus (KBLV) isolato da una mazza di Brandt (Myotis Brandtii) in Finlandia nel 20173 e Taiwan bat Lyssavirus (twblv) isolato da un pipistrello giapponese ( Pipistrellus Abramus) a Taiwan, Cina nel 2016 – 20174.
Tutti i mammiferi sono suscettibili alla rabbia; Tuttavia, nessuna lesione patognomonica lorda o segni clinici specifici ne consentono l'identificazione, e la diagnosi può essere fatta solo nel laboratorio5. Il metodo più diffuso per la diagnosi della rabbia è il grasso, che è considerato come il gold standard sia dall'OMS che dall'OIE5,6. Tuttavia, il FAT può produrre risultati inaffidabili su campioni di tessuto cerebrale degradato/autolizzato. Inoltre, non può essere utilizzato per il dosaggio di campioni di fluidi biologici come il liquido cerebrospinale (CSF), la saliva e l'urina, precludendo in gran parte il suo impiego nella diagnosi prima della morte7. Test diagnostici convenzionali alternativi, come il test di infezione della coltura del tessuto della rabbia (RTCIT) e il test di inoculo del topo (MIT), richiedono diversi giorni6, un grave inconveniente quando è essenziale una diagnosi rapida.
Vari test diagnostici molecolari (ad esempio, la rilevazione di RNA virale da RT-PCR, il saggio immunosorbente PCR-Linked [PCR-ELISA], l'ibridazione in situ e la PCR in tempo reale) sono utilizzati come tecniche rapide e sensibili per la diagnosi della rabbia8. La RT-PCR è ora raccomandata dall'OIE per la diagnosi della rabbia di routine e una PCR heminested (HN) è descritta nel manuale dell'OIE di test diagnostici e vaccini per animali terrestri per rilevare tutti i Lyssavirus5. Qui descriviamo un pan-Lyssavirus annidato RT-PCR, che consente il rilevamento specifico e sensibile di tutte le 18 specie di Lyssavirus paragonabile o superiore a quella ottenuta dal FAT. Il principio del metodo è una RT dell'RNA bersaglio (regione conservata del gene Lyssavirus N) in cDNA, seguita dall'amplificazione del cDNA da due cicli di PCR. Il cDNA subisce la PCR del primo round con primer esterni per amplificare un frammento di 845 BP; quindi, la PCR di secondo ciclo utilizza il prodotto PCR al primo round come modello per amplificare un frammento di 371 BP con primer interni. I due cicli di PCR aumentano significativamente la sensibilità del saggio.
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Protocol
L'uso di topi in questo protocollo è stato approvato dal comitato amministrativo per il benessere degli animali dell'Istituto di medicina veterinaria militare, l'Accademia delle scienze mediche militari, Cina (laboratorio di cura degli animali e l'autorizzazione del Comitato di uso, permesso numero JSY-DW-2010-02). Sono state seguite tutte le linee guida istituzionali e nazionali per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.
1. estrazione dell'RNA
- Estratto di RNA dalla rabbia-sospetto tessuto cerebrale, biopsie cutanee, saliva, o CSF o da coltura cellulare infetta da RABV, utilizzando metodi di estrazione a base di isotiocianato di guanidinio-fenolo-cloroformio o kit di estrazione di RNA virale commercialmente disponibili. Utilizzare immediatamente l'RNA preparato o conservarlo a-80 ° c fino a quando richiesto.
2. trascrizione inversa dell'RNA virale
- Rimuovere i reagenti RT elencati nella tabella 1 dal congelatore, tenerli sul ghiaccio e scongelarli e vortici prima dell'uso.
- Preparare 12 μL di miscela di reazione RT in un tubo PCR da 0,2 mL con i reagenti elencati nella tabella 1. Consentire le variazioni di pipettaggio preparando un volume di mix master almeno una dimensione di reazione maggiore del necessario.
- Aggiungere 8 μL di campione, RNA di controllo positivo o controllo negativo alla miscela di reazione RT all'interno di una workstation PCR in una stanza modello. Il controllo positivo RT è RNA estratto dalla coltura cellulare infetta con ceppo RABV fisso CVS-11 (Challenge virus standard-11) e conservato a-80 ° c. Il controllo negativo contiene ddH2O senza RNasi.
- Mescolare il contenuto dei tubi RT con vortexing; quindi, centrifugare brevemente.
- Caricare i tubi di reazione in un termociclatore. Impostare il programma di sintesi cDNA con le seguenti condizioni: 42 ° c per 90 min, 95 ° c per 5 min e 4 ° c in attesa. Impostare il volume di reazione a 20 μL. avviare la corsa RT.
3. PCR al primo turno
- Conservare i reagenti PCR elencati nella tabella 2 sul ghiaccio in una stanza pulita fino all'uso; poi, scongelare e vortice loro.
- Preparare la miscela PCR al primo round in un tubo PCR da 0,2 mL con i reagenti elencati nella tabella 2.
- Aggiungere un campione di 2 μL di cDNA o plasmide nel mix PCR del primo round all'interno di una workstation PCR in una stanza modello. Il controllo positivo PCR è CVS-11 cDNA preparato come menzionato nel passaggio 2,3 per il metodo RT sopra indicato. Il controllo negativo PCR è ddH2O.
- Trasferire i tubi sigillati in un ciclatore termico PCR e pedalare utilizzando i parametri elencati nella tabella 3.
4. PCR di secondo turno
- Preparare la miscela di PCR di secondo ciclo in un tubo PCR da 0,2 mL utilizzando i reagenti elencati nella tabella 4.
- Aggiungere 2 μL di prodotto PCR al primo round nel mix di PCR del secondo round. Inoltre, includere ddH2O come controllo negativo della PCR di secondo ciclo.
- Eseguire il ciclo termico della PCR utilizzando gli stessi parametri indicati nel passaggio 3,4.
5. analisi dei prodotti PCR mediante elettroforesi sui gel di agarose
- Preparare un gel di agarosio 1,5% aggiungendo 1,5 g di agarosio a 100 mL di tris-acetato-EDTA (TAE) e sciogliendolo accuratamente riscaldandolo in un forno a microonde.
- Aggiungere il bromuro di etidium (EB) (ad una concentrazione finale di 0,01%) o un'altra sostituzione commerciale EB. Versare il gel nello stampo e lasciarlo a solidificare a temperatura ambiente per almeno 30 min.
- Preparare i campioni di carico miscelando 5 μL di ciascun prodotto PCR con 1 μL di tampone di carico 6x.
- Caricare i campioni e l'apposito marcatore di DNA separatamente nei pozzetti ed eseguire il gel per circa 30-45 min a 120 V fino a quando la linea colorante è circa il 75%-80% verso il basso il gel.
- Spegnere l'alimentazione, scollegare gli elettrodi dalla fonte di alimentazione, quindi rimuovere con cautela il gel dalla scatola del gel.
- Utilizzare un gel UV che documenta il dispositivo per visualizzare e fotografare i frammenti di DNA.
6. caratterizzazione della RT-PCR nidificata
-
6,1. specificità e sensibilità per la rilevazione di 18 plasmidi di Lyssavirus
- Ordina 18 plasmidi commerciali contenenti il gene N completo di ogni Lyssavirus (16 specie di ICTV e due nuove specie) per la PCR.
- Calcola il numero di copie del plasmide usando il numero di Avogadro (NA) e la seguente formula.
[(g/μL di DNA plasmide)/(plasmide length in BP x 660)] x 6,022 x 1023 = numero di molecole/μl - Preparare le soluzioni di scorta (2,24 x 109 molecole/μl) di tutti i 18 plasmidi in DDH2O.
- Eseguire diluizioni seriali a 9 10 volte di tutti i 18 plasmidi in ddH2o. Diluire 10 μl di ogni plasmide con 90 μl di DDH2o. Vortex e centrifugare brevemente.
- Eseguire l'amplificazione PCR come descritto nelle sezioni 3-5.
- Analizzare la specificità e la sensibilità della PCR nidificata rilevando una serie di plasmidi Lyssavirus.
-
Determinazione della d l' accertamento l IMIT
- Regolare il titolo del ceppo di virus della rabbia CVS-11 coltura cellulare a 105,5 TCID50/ml (virus titolo determinato secondo il manuale OIE)5.
- Eseguire diluizioni seriali a 5 10 volte di CVS-11 (la soluzione stock è 105,5 tcid50/ml) come descritto nel punto 6.1.4.
- Eseguire l'estrazione dell'RNA e le procedure di amplificazione di RT-PCR nidificate di tutte le diluizioni virali come descritto nelle sezioni 1-5.
-
Compar ISON di il RT-PCR nidificata con il grasso "Gold standard"
- Testare tutti i campioni clinici mediante RT-PCR nidificata, quindi confermare i risultati con il sequenziamento del gene FAT5 e N9.
- Utilizzare i dati normalizzati per un'analisi statistica con SAS 9,1. Utilizzare il test Kappa e il test chi quadrato di McNemar per un confronto statistico dei test diagnostici (comando SAS: PROC FREQ; tabella/Accetto). Calcola gli intervalli di confidenza assumendo la distribuzione abinomiale.
-
Valutazione dell'efficacia nel test dei campioni degradati
- Esporre due campioni clinici confermati di tessuto cerebrale di cani rabbidi a 37 ° c.
- Analisi dei due campioni in ogni giorno di esposizione a 37 ° c mediante RT-PCR nidificata, FAT e MIT5.
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Representative Results
I risultati della RT-PCR nidificata per rilevare 18 specie di Lyssavirus sono mostrati nella Figura 1. Tutti i controlli positivi della PCR hanno mostrato l'atteso 845 BP nel primo-e 371 BP nelle amplificazioni del secondo round senza banda nel controllo negativo. Tutti i 18 Lyssavirus hanno prodotto le bande attese 845 e/o 371 BP, indicando che la RT-PCR nidificata ha rilevato tutti i 18 Lyssavirus. Sedici Lyssavirus plasmidi avevano un'amplificazione efficiente in due cicli di PCR, ma due, vale a dire Arav e Ikov, avevano un'amplificazione sia nella PCR del primo o del secondo round. La sensibilità del metodo variava nella rilevazione di diversi plasmidi di Lyssavirus, con limiti che vanno da 2,24 x 100 a 2,24 x 105 molecole/μl, come mostrato nella tabella 6. Queste differenze possono essere attribuite ai disallineamenti tra i primer e i modelli a causa della diversità della sequenza virale. Inoltre, la sensibilità di rilevazione del virus della rabbia CVS-11 nella coltura cellulare era 102,5 tcid50/ml.
Un totale di 9.624 tessuti cerebrali da campioni clinici sono stati testati da RT-PCR nidificato in confronto con il FAT e i risultati sono riepilogati nella tabella 7, che mostra che la RT-PCR nidificata ha una sensibilità del 100% (CI, 97,75% a 100%) e una specificità del 99,97% (CI, 99,91% al 99,99%). La conformità tra i due metodi era 99,07%. Tre test positivi per RT-PCR nidificati ma negativi per il FAT erano di materiale clinico altamente decaduto. Questi tre esemplari sono stati confermati come RABV positivo dal sequenziamento del gene N.
Il confronto delle prestazioni di prova nel rilevamento dei due campioni cerebrali incubati a 37 ° c (passo 6.4.1 del protocollo) ha indicato che la RT-PCR nidificata potrebbe rilevare efficacemente il virus nei tessuti cerebrali decaduto per almeno 17 giorni dopo la degradazione, che è per un periodo di tempo più lungo se confrontato con solo 7 giorni dal FAT e nemmeno 1 giorno dal MIT. Questo risultato mostra che la RT-PCR nidificata è più sensibile nel rilevamento di campioni degradati rispetto al FAT e al MIT.
Per convalidare ulteriormente la RT-PCR nidificata, 10 laboratori di rabbia in Cina sono stati invitati a condurre test su una serie di esemplari. Di questi, Otto laboratori sono stati forniti un insieme di 10 tessuti di cervello animale accecato dal nostro laboratorio, compresi RABV campioni positivi e negativi. Gli altri due laboratori utilizzavano i propri esemplari. Tutti i campioni erano stati archiviati e confermati dal FAT in precedenza. Tutti i 10 laboratori hanno ottenuto risultati mediante RT-PCR nidificata nel 100% secondo il FAT, senza falsi negativi o falsi positivi (tabella 8), indicando che la RT-PCR nidificata presentava un'elevata specificità e riproducibilità.
| Componenti | Volume per reazione (μL) |
| dNTPs (2,5 mM) | 4 |
| Primer Random (50 μM) | 1,5 a |
| Oligo (dT) 15 (50 μm) | 0,5 a |
| Tampone M-MLV (5x) | 4 |
| M-MLV trascrittasi inversa (200 UI/μL) | 1 |
| RNasin (40 UI/μL) | 1 |
| Volume totale | 12 |
Tabella 1: Reagenti di trascrizione inversa per sintesi cDNA .
| Componenti | Volume per reazione (μL) |
| dNTPs (10 mM) | 1 |
| Ex-Taq (5 U/μL) | 0,3 a |
| Tampone Taq (10x) | 5 |
| N127 (20 μM) | 1 |
| N829 (20 μM) | 1 |
| DD H2O | 39,7 a |
| Volume totale | 48 a |
Tabella 2: Reagenti di la PCR del primo round.
| temperatura | ora | Cicli |
| 94 ° c | 2 min di | 1 |
| 94 ° c | 30 s di | 35 a |
| 56 ° c | 30 s di | 35 a |
| 72 ° c | 40 s | 35 a |
| 72 ° c | a 10 minuti | 1 |
| 4 ° c | ∞ |
Tabella 3: C parametri di riciclaggio il primo e PCR di secondo ciclo.
| Componenti | Volume per reazione (μL) |
| dNTPs (10 mM) | 1 |
| Ex-Taq (5 U/μL) | 0,3 a |
| Tampone Taq (10x) | 5 |
| N371F (20 μM) | 1 |
| N371R (20 μM) | 1 |
| DD H2O | 39,7 a |
| Volume totale | 48 a |
Tabella 4: Reagenti di la PCR di secondo ciclo.
| Nome del primer | Dettagli | indicazioni stradali | Sequenza (5'-3') | Posizione del nucleotide | Dimensioni del prodotto | |
| N127 | Il primo ciclo di PCR | avanti | Altro da ATGTAACNCCTCTACAATGG | -19 ~ 0 | di 845bp | |
| N829 | Il primo ciclo di PCR | fare retromarcia | Altro da GCCCTGGTTCGAACATTCT | 807 ~ 825 | di 845bp | |
| N371F | Il secondo ciclo di PCR | avanti | Altro da ACAATGGAKKCTGACAARATTG | -6 ~ 15 | 371bp di | |
| N371R | Il secondo ciclo di PCR | fare retromarcia | Altro da CCTGYYWGAGCCCAGTTVCCYTC | 345 ~ 367 | 371bp di | |
Tabella 5: Primer s equenze di il primo e secondo round PCR . Basi degenerate: N (A/T/C/G), K (G/T), R (A/G), Y (C/T), WV (G/A/C).
| Specie di Lyssavirus | tensione | Plasmide modello (molecole/μL) |
| Di RABV | GQ 918139.1 | 2,24 x 101 |
| Lbv | EU 293110.1 | 2,24 x 102 |
| Il MOKV | 155005.1 KF | 2,24 x 101 |
| Il DUVV | EU 293119.1 | 2,24 x 101 |
| EBLV-1 | EF 157976.1 | 2,24 x 101 |
| EBLV-2 | 155004.1 KF | 2,24 x 101 |
| ABLV | 992312.1 di GU | 2,24 x 100 |
| Di IRKV | NC_020809.1 | 2,24 x 101 |
| Di WCBV | NC_025377.1 | 2,24 x 101 |
| Di KHUV | NC_025385.1 | 2,24 x 103 |
| Arav | NC_020808.1 | 2,24 x 102 |
| Di SHIBV | NC_025365.1 | 2,24 x 101 |
| Di BBLV | NC_025251.1 | 2,24 x 101 |
| Di IKOV | NC_018629.1 | 2,24 x 105 |
| Di LLEBV | NC_031955.1 | 2,24 x 103 |
| Di GBLV | NC_031988.1 | 2,24 x 105 |
| KBLV | MF 960865.1 | 2,24 x 101 |
| Di TWBLV | MF 472710.1 | 2,24 x 101 |
Tabella 6: Limite di rilevazione di RT-PCR nidificata o f 18 l di yssavirus es.
| Metodo e risultato standard | RT-nPCR costruttivo |
RT-nPCR negativo |
Correlazione (%) | |
| grasso | costruttivo negativo |
162 a 3 |
0 9459 a |
99,07 a |
Tabella 7: Correlazione tra RT-PCR nidificata e il FAT nel rilevazione di RABVs in campioni clinici.
Tabella 8: Risultati di convalida di RT-PCR nidificati 10 laboratori.
Figura 1 : Rilevazione di 18 di Lyssavirus oni con RT-PCR nidificata. A) il risultato della PCR del primo round. B) il risultato della PCR di secondo ciclo. M = marcatore DNA DL 2000. Corsie 1 – 18 = RABV, LBV, MOKV, DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, ARAV, IKOV, BBLV, GBLV, IRKV, KHUV, LLEBV, SHIBV, WCBV, KBLV, e TWBLV, rispettivamente. Corsia 19 = controllo positivo PCR; corsia 20 = controllo negativo per la PCR al primo turno; corsia 21 = controllo negativo per la PCR di secondo ciclo. Un risultato positivo della PCR mostra una banda a 845 BP nel primo round e 371 BP nella PCR del secondo round. L'amplicon dell'ARAV non è visibile nel primo round, ma visibile nella PCR del secondo round (corsia 8), mentre l'amplicon di IKOV è visibile nel primo round, ma non visibile nella PCR del secondo round (corsia 9). Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 2 : Il confronto con le sequenze di primer Mostra i nucleotidi differenziali nelle regioni di primer di 18 specie di Lyssavirus. N127 e N829 erano primer esterni, N371F e N371R erano primers interni. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
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Discussion
Attualmente, RABV è un importante Lyssavirus responsabile di quasi tutte le rabbia umana e animale in Cina, così come in altri paesi. Inoltre, una variante IRKV è stata identificata per la prima volta da un pipistrello Murina leucogaster nella provincia di Jilin nella cina nordorientale nel 201210, ed è stato segnalato per causare la morte di un cane nella provincia di Liaoning nel 201711. Più recentemente, un romanzo Lyssavirus, TWBLV, è stato anche identificato da un pipistrello giapponese a Taiwan, Cina nel 2017. Questi risultati suggeriscono che il rilevamento efficace di altri Lyssavirus è anche importante per prevenire la ricaduta dei Lyssavirus di bat-Borne. A questo proposito, il Pan-Lyssavirus nidificato RT-PCR bersagliando la regione del gene N più conservata è uno strumento molto utile, e i risultati hanno dimostrato che può rilevare efficacemente tutte le 16 specie di Lyssavirus approvate da ICTV e due nuove individuate finora, tra cui e IRKV in Cina geneticamente divergenti (dati sulla deformazione IRKV non mostrati). Tuttavia, è anche interessante notare che l'ARAV è stato rilevato solo dai primer PCR del secondo round, mentre IKOV è stato rilevato solo dai primer PCR del primo round (Figura 1). Per indagare la causa di questa discrepanza, è stato condotto il confronto di sequenza di tutti i 18 Lyssavirus all'interno delle quattro regioni di primer, con i risultati che dimostrano che il 3' end nucleotide t di primer esterno N829 nella PCR del primo round e il secondo nucleotide t al 3' fine del primer interno N371F nella PCR del secondo round non erano identiche alle corrispondenti posizioni di ARAV (G) e IKOV (A) (Figura 2). Una volta che il T di primer N829 è stato cambiato in G di ARAV e la T di primer N371F cambiato in a di IKOV, entrambi i virus sono stati rilevati con successo in PCR (dati non mostrati). Questo risultato dimostra il ruolo critico dei 3 "nucleotidi end o near-end dei primer nell'amplificazione di successo della regione bersaglio.
Per valutare la sensibilità e la specificità del metodo nella rilevazione del virus della rabbia per la diagnosi e la sorveglianza clinica, 9.624 campioni di tessuto cerebrale animale sono stati testati negli ultimi 10 anni dal FAT e dalla RT-PCR nidificata in parallelo. Dei 165 campioni che hanno testato la rabbia positiva da RT-PCR nidificata, 162 sono stati rilevati come positivi dal FAT; Pertanto, i due metodi mostrano 99,07% di conformità. I RABV rilevati in questi 165 campioni potevano essere classificati in diverse linee di lignaggi in Asia, Artico, e cladi cosmopoliti12,13, indicando che la RT-PCR nidificata può coprire le varie cladi genetiche di rabvs. Tre esemplari clinici altamente decadute sono stati testati positivamente dalla RT-PCR nidificata ma negativa dal FAT. Questo risultato è coerente con la valutazione dell'efficacia nel testare due campioni degradati come mostrato nella sezione dei risultati rappresentativi, indicando che la RT-PCR nidificata è più sensibile del FAT nella rilevazione di virus in esemplari altamente decaduto.
La performance della RT-PCR nidificata è stata ulteriormente confermata dalla partecipazione al test internazionale di confronto del laboratorio (ILCT) organizzato dal laboratorio di riferimento dell'UE per la rabbia presso l'Agenzia francese per la salute & sicurezza alimentare, ambientale e occupazionale ( ANSES) in 2010, utilizzando un set di 12 campioni (uno ciascuno di RABV, EBLV-1, EBLV-2, e ABLV come controlli positivi, un controllo negativo, e sette accecati campioni). Nel test, la RT-PCR nidificata ha identificato con successo tutti i Lyssavirus con una consistenza del 100%. In 2018, il metodo è stato approvato come standard nazionale di Rabies Diagnoses (GB/T36789-2018) dal Comitato nazionale di normalizzazione tecnica della salute animale della Cina.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Lo studio è stato sostenuto dal piano nazionale di ricerca e sviluppo chiave (Grant No. 2016YFD0500401) e dalla Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (Grant n. 31302043).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 × TAE | Various | Various | |
| 6 × loading buffer | TakaRa | 9156 | |
| Agarose | US Everbright® Inc | A-2015-100g | |
| ddH2O | Various | Various | |
| DL 2,000 Marker | Takara | 3427A | |
| dNTPs (10 mM) | TakaRa | 4019 | |
| dNTPs (2.5 mM) | TakaRa | 4030 | |
| Electrophoresis System | Tanon | EPS300 | |
| Ex-Taq (5 U/μL) | TakaRa | RR001 | |
| Gel Imaging System | UVITEC | Fire Reader | |
| Microcentifuge tubes | Various | Various | |
| M-MLV reverse transcriptase (200 IU/µL) | TakaRa | 2641A | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermoscientific | ND1000 | |
| Oligo (dT)15 | TakaRa | 3805 | |
| PCR Machine | BIO-RAD | T100 | |
| PCR Tubes | Various | Various | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymearase | NEW ENGLAND BioLabs | M0530S | |
| Pipettors | Various | Various | |
| Random Primer | TakaRa | 3801 | |
| RNase Inhibitor (40 IU/µL) | TakaRa | 2313A | |
| RNase-free ddH2O | TakaRa | 9102 | |
| Taq Buffer (10×) | TakaRa | 9152A | |
| Tips | Various | Various | |
| Vortex mixer | Various | Various |
References
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