Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Genetics

Evaluering av en Universal nestet omvendt transkripsjon polymerase Kjedere reaksjon for påvisning av Lyssaviruses

doi: 10.3791/59428 Published: May 2, 2019
* These authors contributed equally

Summary

En pan-lyssavirus nestede omvendt transkripsjon polymerase kjedere reaksjon er utviklet for å oppdage spesielt alle kjente lyssaviruses. Godkjenningen benytter rabiat hjerne eksemplar av annerledes dyr Art viste det denne metoden har en følsomheten og spesifisitet ekvivalent å gullet målestokk fluorescerende antistoff test og det kan brukes for praksis rabiat diagnosis.

Abstract

For å oppdage rabies virus og andre medlems arter i slekten Lyssavirus i familien Rhabdoviridae, den pan-Lyssavirus nestede omvendt transkripsjon polymerase KJEDERE reaksjon (nestede RT-PCR) ble utviklet for å oppdage den bevarte regionen av nucleoprotein (N) gen av lyssaviruses. Metoden gjelder omvendt transkripsjon (RT) ved hjelp av viral RNA som mal og oligo (dT)15 og tilfeldige hexamers som primere for å syntetisere viral komplementær DNA (cDNA). Deretter blir viral cDNA brukt som en mal for å forsterke en 845 BP N gen fragment i første runde PCR ved hjelp av ytre primere, etterfulgt av andre-runde nestede PCR å forsterke den endelige 371 BP fragment ved hjelp av indre primere. Denne metoden kanne merker annerledes genetisk klader av rabiat viruser (RABV). Det godkjenningen, benytter 9 624 hjerne prøver fra åtte hjemmemarked dyr Art inne 10 år av klinisk rabiat diagnoser og overvåking inne Porselen, viste det metoden har 100% følsomheten og 99,97% spesifisitet inne sammenligningen med det direkte fluorescerende antistoff test (FAT), gull standardmetoden anbefalt av verdenshelseorganisasjon (WHO) og World Organization for Animal Health (OIE). I tillegg kan metoden også spesielt forsterke den målrettede N gen fragment av 15 andre godkjente og to romanen lyssavirus arter i 10nde rapporten fra den internasjonale komiteen på taksonomi av virus (ICTV) som evalueres av en etterligne påvisning av syntetisert N gen plasmider av alle lyssaviruses. Metoden skaffer en bekvem alternativ å Basin for rabiat diagnosis og er blitt anerkjent som nasjonal målestokk (GB/T36789-2018) av Porselen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Rabiat er en Worldwide zoonotiske sykdommen forårsaket av viruser innen slekten Lyssavirus1. Lyssaviruses (familie Rhabdoviridae) er single-negative-strandet RNA virus med en ca 12 kb Genova som koder fem proteiner: N, Phosphoprotein (P), matrise protein (M), glykoprotein (G), og det store proteinet eller polymerase (L). Basert på nukleotid sekvenser av det N Gene, genetisk avstand, og antigen mønstre, lyssaviruses ha blitt delt i 16 arter, omfatter klassisk rabiat virus (RABV) og det rabiat-i slekt viruser (RRV): Lagos bat virus (LBV), Duvenhage virus (DUVV ), Mokola virus (MOKV), europeiske bat lyssavirus 1 (EBLV-1), European bat lyssavirus 2 (EBLV-2), australsk bat lyssavirus (ABLV), Aravan virus (ARAV), Ikoma virus (IKOV), Bokeloh bat lyssavirus (BBLV), Gannoruwa bat lyssavirus (GBLV), Irkut virus (IRKV), Khujand virus (KHUV), Vest kaukasisk bat virus (WCBV), Shimoni bat virus (SHIBV), og Lleida bat lyssavirus (LLEBV)2. Nylig har to ekstra lyssaviruses blitt identifisert: Kotalahti bat lyssavirus (KBLV) isolert fra en Brandt ' s bat (Myotis brandtii) i Finland i 20173 og Taiwan bat lyssavirus (TWBLV) isolert fra en japansk pipistrelle ( Pipistrellus abramus) i Taiwan i Kina i 2016 – 20174.

Alle pattedyr er mottakelige for rabies; men ingen brutto Patognomonisk lesjoner eller spesifikke kliniske tegn tillater sin identifisering, og diagnosen kan bare gjøres i laboratoriet5. Den mest brukte metoden for rabies diagnose er fettet, som regnes som gullstandarden av både WHO og OIE5,6. Likevel, FAT kan produsere upålitelige resultater på degradert/autolysert hjernevev prøver. I tillegg kan den ikke brukes til å analysen biologiske væskeprøver som spinalvæske (CSF), spytt og urin, og dermed i stor grad utelukker sitt arbeid i antemortem diagnose7. Alternativ konvensjonelle diagnostiske tester, for eksempel rabies vev kultur infeksjon test (RTCIT) og musen inoculation test (MIT), krever flere dager6, en stor ulempe når en rask diagnose er viktig.

Ulike molekylære diagnostiske tester (f. eks, påvisning av viral RNA av RT-PCR, den PCR-enzym-tilknyttede immunosorbentanalyse analysen [PCR-ELISA], in situ hybridisering, og sanntids PCR) brukes som raske og følsomme teknikker for rabies diagnose8. RT-PCR er nå anbefalt av OIE for rutinemessig rabies diagnose, og en heminested (HN) PCR er beskrevet i OIE manual for diagnostiske tester og vaksiner for terrestriske dyr å oppdage alle lyssaviruses5. Her beskriver vi en pan-lyssavirus nestet RT-PCR, som gjør at den spesifikke og følsomme deteksjon av alle 18 lyssavirus arter kan sammenlignes med eller overstiger som oppnås ved FAT. Prinsippet for metoden er en RT av målet RNA (bevarte regionen i det lyssavirus N-genet) til cDNA, etterfulgt av forsterkning av cDNA med to runder med PCR. CDNA gjennomgår den første-runde PCR med ytre primere for å forsterke en 845 BP fragment; deretter bruker den andre-runde PCR det første runde PCR-produktet som en mal for å forsterke et 371 BP-fragment med indre primere. De to runder med PCR øker følsomheten til analysen betraktelig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bruken av mus i denne protokollen ble godkjent av administrative Committee on Animal velferd ved Institutt for militær veterinærmedisin, Academy of Military Medical Sciences, Kina (laboratorium Animal Care og use Committee Authorization, tillate nummer JSY-DW-2010-02). Alle institusjonelle og nasjonale retningslinjer for Stell og bruk av forsøksdyr ble fulgt.

1. RNA-ekstraksjon

  1. Pakk RNA fra rabies-mistenkt hjernevev, hud biopsier, spytt eller CSF eller fra RABV-smittet cellekultur, ved hjelp av guanidiniumklorid isothiocyanate-fenol-kloroform-baserte utvinningsmetoder eller kommersielt tilgjengelige viral RNA utvinning kits. Bruk den klargjorte RNA umiddelbart eller oppbevar den ved-80 ° c til nødvendig.

2. omvendt transkripsjon av viral RNA

  1. Fjern RT-reagensene som er listet opp i tabell 1 fra fryseren, Oppbevar dem på is, og Tin dem og Vortex dem før bruk.
  2. Forbered 12 μL av RT reaksjons miks i et 0,2 mL PCR-rør med reagensene listet opp i tabell 1. Tillat for pipettering variasjoner ved å utarbeide et volum av Master Mix minst en reaksjons størrelse større enn nødvendig.
  3. Tilsett 8 μL prøve, positiv kontroll RNA eller negativ kontroll til RT reaksjons blanding innenfor en PCR arbeidsstasjon i et mal rom. RT positiv kontroll er RNA ekstrahert fra celle kulturen infisert med fast RABV belastning CVS-11 (Challenge virus standard-11) og lagret ved-80 ° c. Den negative kontrollen inneholder RNase-Free ddH2O.
  4. Bland innholdet i RT rørene ved virvlingen; deretter sentrifuge kort.
  5. Legg reaksjons rørene inn i en termisk cycler. Definer cDNA med følgende betingelser: 42 ° c i 90 min, 95 ° c i 5 min og 4 ° c på vent. Sett reaksjons volumet til 20 μL. Start RT-kjøringen.

3. første runde PCR

  1. Hold PCR-reagensene oppført i tabell 2 på is i et rent rom før bruk. deretter, tine og Vortex dem.
  2. Klargjør den første runden PCR-blandingen i et 0,2 mL PCR-rør med reagensene oppført i tabell 2.
  3. Legg til en 2 μL prøve av cDNA eller plasmider i den første runden PCR mix i en PCR arbeidsstasjon i et mal rom. PCR-positiv kontroll er CVS-11 cDNA forberedt som nevnt i trinn 2,3 for den ovennevnte RT-metoden. PCR negativ kontroll er ddH2O.
  4. Overfør de forseglede rørene til en PCR termisk cycler og sykle ved hjelp av parametrene listet opp i tabell 3.

4. andre-runde PCR

  1. Klargjør den andre runde PCR-blandingen i et 0,2 mL PCR-rør ved hjelp av reagensene listet opp i Tabell 4.
  2. Tilsett 2 μL av første-runde PCR-produkt i den andre-runde PCR-miksen. I tillegg inkluderer ddH2O som en negativ kontroll over den andre-runde PCR.
  3. Utfør PCR termisk sykling med de samme parametrene som angitt i trinn 3,4.

5. analyse av PCR produkter av elektroforese på Agarose gels

  1. Forbered en 1,5% agarose gel ved å legge 1,5 g agarose til 100 mL Tris-acetate-EDTA (TAE) og oppløse den grundig ved å varme den i en mikrobølgeovn.
  2. Legg til etidiumbromid bromide (EB) (ved en endelig konsentrasjon på 0,01%) eller en annen kommersiell EB substitusjon. Hell gelen i mold og la den stivne ved omgivelsestemperatur i minst 30 min.
  3. Klargjør laste prøvene ved å blande 5 μL av hvert PCR-produkt med 1 μL 6 ganger laste buffer.
  4. Last prøvene og egnet DNA markør separat inn i brønnene og kjøre gel for ca 30-45 min ved 120 V til fargestoff linjen er ca 75%-80% ned gel.
  5. Slå av strømmen, koble elektrodene fra strømkilden, og deretter forsiktig fjerne gel fra gel boksen.
  6. Bruk en UV gel dokumentere enhet for å visualisere og fotografere DNA fragmenter.

6. karakterisering av nestet RT-PCR

  1. 6,1. spesifisitet og følsomhet for påvisning av 18 lyssaviruses plasmider
    1. Bestill 18 kommersielle plasmider som inneholder hele N-genet for hver lyssavirus (16 ICTV-arter og to roman arter) for PCR.
    2. Beregn kopierings nummeret til plasmider ved hjelp av Avogadro nummer (NA) og følgende formel.
      [(g/μL plasmider DNA)/(plasmider lengde i BP x 660)] x 6,022 x 1023 = antall molekyler/μL
    3. Forbered lager løsninger (2,24 x 109 molekyler/μL) av alle 18 plasmider i ddH2O.
    4. Utfør 9 10 serie fortynninger av alle 18 plasmider i ddH2O. fortynne 10 μL av hvert plasmider lager med 90 ΜL av ddH2O. Vortex og sentrifuge kort.
    5. Utfør PCR forsterkning som beskrevet i avsnittene 3-5.
    6. Analysere spesifisitet og følsomheten til nestede PCR ved å oppdage en rekke lyssavirus plasmider.
  2. Fastsettelse av d etection l imit
    1. Innstille det titer av det rabiat virus belastning CVS-11 cellen kulturen å 105,5 TCID50/ml (virus TITER besluttet alt etter OIE håndbok)5.
    2. Utfør 5 10 seriell fortynninger av CVS-11 (lagerløsning er 105,5 TCID50/ml) som beskrevet i trinn 6.1.4.
    3. Utfør RNA-ekstraksjon og nestede RT-PCR forsterknings prosedyrer for alle virale fortynninger som beskrevet i avsnitt 1-5.
  3. Sammenlign ison av den NESTET RT-PCR med "gull standard" fat
    1. Test alle kliniske prøver av nestede RT-PCR, og deretter, Bekreft resultatene med FAT5 og N genet sekvensering9.
    2. Bruk normalisert data for en statistisk analyse med SAS 9,1. Bruk Kappa test og McNemar ' s chi-kvadrat test for en statistisk sammenligning av diagnostiske tester (SAS-kommandoen: prosedyre freq; tabell/enig). Beregn sikkerhets intervallene forutsatt abinomial fordeling.
  4. Evaluering av effekten ved testing av degradert prøver
    1. Utsett to bekreftede kliniske hjerne vevsprøver av rabiat hunder ved 37 ° c.
    2. Analysen de to prøvene på hver dag av eksponering ved 37 ° c ved nestede RT-PCR, FAT og MIT5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Resultater av nestede RT-PCR for å oppdage 18 lyssavirus arter er vist i figur 1. Alle PCR-positive kontroller viste den forventede 845 BP i første-og 371 BP i andre runde presiseringer uten band i negativ kontroll. Alle 18 lyssaviruses produserte de forventede 845 og/eller 371 BP band, noe som indikerer at den nestede RT-PCR oppdaget alle 18 lyssaviruses. Seksten lyssaviruses plasmider hadde effektiv forsterkning i to runder av PCR, men to, nemlig ARAV og IKOV, hadde forsterkning i enten den første-eller andre-runde PCR. Følsomheten av metoden varierte i påvisning av ulike lyssavirus plasmider, med grenser fra 2,24 x 100 til 2,24 x 105 molekyler/μL, som vist i tabell 6. Disse forskjellene kan tilskrives de uoverensstemmelser mellom primere og maler på grunn av viral sekvens mangfold. Videre, følsomheten av oppdager rabiat virus CVS-11 inne cellen kulturen var 102,5 TCID50/ml.

Totalt 9 624 hjernevev fra kliniske eksemplarer ble testet av nestede RT-PCR sammenlignet med FAT og resultatene er oppsummert i Tabell 7, som viser at nestede RT-PCR hadde en 100% følsomhet (CI, 97,75% til 100%) og en 99,97% spesifisitet (CI, 99,91% til 99,99%). Samsvar mellom de to metodene var 99,07%. Tre tester som var positive ved nestede RT-PCR, men negative av FAT var av svært forfalt klinisk materiale. Disse tre prøvene ble bekreftet som RABV positive av N gen sekvensering.

Sammenligning av testresultatene i påvisning av de to hjernen prøvene inkubert ved 37 ° c (trinn 6.4.1 av protokollen) indikerte at den nestede RT-PCR kan effektivt oppdage virus i forfalt hjernevev i minst 17 dager postdegradation, som er for en lengre periode sammenlignet med bare 7 dager av FAT og ikke engang 1 dag av MIT. Dette resultatet viser at nestet RT-PCR er mer følsom i påvisning av dårligere prøver enn FAT og MIT.

For ytterligere å validere den nestede RT-PCR, ble 10 rabies laboratorier i Kina invitert til å gjennomføre tester på et sett med prøver. Av disse ble åtte laboratorier gitt et sett av 10 blindet dyr hjernevev fra laboratoriet vårt, inkludert RABV positive og negative prøver. De to andre laboratoriene brukte sine egne prøver. Alle prøvene hadde blitt arkivert og bekreftet av FAT tidligere. Alle 10 laboratorier oppnådde resultater av nestede RT-PCR i 100% samsvar med FAT, uten falske negativer eller falske positiver (tabell 8), som indikerer at den nestede RT-PCR hadde en høy spesifisitet og reproduserbarhet.

Komponenter Volum per reaksjon (μL)
dNTPs (2,5 mM) 4
Tilfeldig primer (50 μM) 1,5 for alle
Oligo (dT) 15 (50 μM) 0,5 for alle
M-MLV buffer (5x) 4
M-MLV revers transkriptase (200 IU/μL) 1
RNasin (40 IU/μL) 1
Totalt volum 12

Tabell 1: Reagenser av omvendt transkripsjon for cDNA syntese .

Komponenter Volum per reaksjon (μL)
dNTPs (10 mM) 1
Ex-Taq (5 U/μL) 0,3 for alle
Taq buffer (10x) 5
N127 (20 μM) 1
N829 (20 μM) 1
dd H2O 39,7 for alle
Totalt volum 48 for alle

Tabell 2: Reagenser over den første-runde PCR.

Temperatur Tid Sykluser
94 ° c 2 min 1
94 ° c 30 s 35 for alle
56 ° c 30 s 35 for alle
72 ° c 40 s 35 for alle
72 ° c 10 min 1
4 ° c

Tabell 3: C sjoner parametere for den første- og andre runde PCR.

Komponenter Volum per reaksjon (μL)
dNTPs (10 mM) 1
Ex-Taq (5 U/μL) 0,3 for alle
Taq buffer (10x) 5
N371F (20 μM) 1
N371R (20 μM) 1
dd H2O 39,7 for alle
Totalt volum 48 for alle

Tabell 4: Reagenser over den andre-runde PCR.

Primer navn Detaljer Retning Sekvens (5 '-3 ') Nukleotid posisjon Produktstørrelse
N127 Den første runden PCR Frem ATGTAACNCCTCTACAATGG -19 ~ 0 845bp
N829 Den første runden PCR Omvendt GCCCTGGTTCGAACATTCT 807 ~ 825 845bp
N371F Den andre runden PCR Frem ACAATGGAKKCTGACAARATTG -6 ~ 15 371bp
N371R Den andre runden PCR Omvendt CCTGYYWGAGCCCAGTTVCCYTC 345 ~ 367 371bp

Tabell 5: Primer s equences av den første- og andre-runde PCR . Grunnleggende baser: N (A/T/C/G), K (G/T), R (A/G), Y (C/T), WV (G/A/C).

Lyssavirus arter Belastning Mal plasmider (molekyler/μL)
RABV GQ 918139.1 2,24 x 101
LBV EU-293110.1 2,24 x 102
MOKV KF 155005.1 2,24 x 101
DUVV EU-293119.1 2,24 x 101
EBLV-1 EF 157976.1 2,24 x 101
EBLV-2 KF 155004.1 2,24 x 101
ABLV GU 992312.1 2,24 x 100
IRKV NC_020809.1 2,24 x 101
WCBV NC_025377.1 2,24 x 101
KHUV NC_025385.1 2,24 x 103
ARAV NC_020808.1 2,24 x 102
SHIBV NC_025365.1 2,24 x 101
BBLV NC_025251.1 2,24 x 101
IKOV NC_018629.1 2,24 x 105
LLEBV NC_031955.1 2,24 x 103
GBLV NC_031988.1 2,24 x 105
KBLV MF 960865.1 2,24 x 101
TWBLV MF 472710.1 2,24 x 101

Tabell 6: Deteksjons grensen for NESTET RT-PCR o f 18 l yssavirus es.

Standard metode og resultat RT-nPCR
Positive
RT-nPCR
Negative
Korrelasjon (%)
Fett Positive
Negative
162 for alle
3
0
9459 for alle
99,07 for alle

Tabell 7: Korrelasjon mellom NESTET RT-PCR og fat i feltet påvisning av RABVs i kliniske prøver.

Table 8
Tabell 8: Valideringsresultatene av NESTEDE RT-PCR ved 10 laboratorier.

Figure 1
Figur 1 : Påvisning av 18 lyssavirus es av NESTET RT-PCR. (A) resultatet av den første runden PCR. (B) resultatet av den andre-runde PCR. M = DL 2000 DNA-markør. Lanes 1 – 18 = RABV, LBV, MOKV, DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, ARAV, IKOV, BBLV, GBLV, IRKV, KHUV, LLEBV, SHIBV, WCBV, KBLV, og TWBLV, henholdsvis. Lane 19 = PCR positiv kontroll; Lane 20 = negativ kontroll for den første runden PCR; Lane 21 = negativ kontroll for den andre-runde PCR. Et positivt PCR-resultat viser et band på 845 BP i første runde og 371 BP i den andre-runde PCR. Amplicon av ARAV er ikke synlig i første runde, men synlig i den andre-runde PCR (Lane 8), mens amplicon av IKOV er synlig i første runde, men ikke synlig i den andre-runde PCR (Lane 9). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Sammenligning med primer sekvenser viser differensial nukleotider i primer regioner av 18 lyssavirus arter. N127 og N829 var ytre primere, N371F og N371R var indre primere. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Aktuelle, RABV er en større lyssavirus ansvarlig for nær alle human og dyr Rabiat inne Porselen, likeledes idet inne annet land. Dessuten, en IRKV variant var for det første kjennemerke fra en Murina leucogaster bat inne det Jilin område inne nordøst porselen inne 201210, og den har blitt rapportere å anledning en hundene ' død inne det Liaoning område inne 201711. Sist, en roman lyssavirus, TWBLV, ble også identifisert fra en japansk pipistrelle bat i Taiwan, Kina i 2017. Disse resultatene tyder på at effektiv påvisning av andre lyssaviruses er også viktig å hindre smitte over av bat-borne lyssaviruses. I denne forbindelse er Pan-lyssavirus nestede RT-PCR rettet mot den mest bevarte N-genet regionen er et svært nyttig verktøy, og resultatene har vist at det effektivt kan oppdage alle 16 ICTV-godkjente og to romanen lyssavirus arter identifisert så langt, inkludert genetisk avvikende RABVs og IRKV i Kina (data om IRKV-belastninger vises ikke). Det er imidlertid også interessant å merke seg at ARAV bare ble oppdaget av den andre runden PCR-primere, mens IKOV ble oppdaget bare av første runde PCR-primere (figur 1). Å undersøke årsaken til dette avviket, sekvens sammenligning av alle 18 lyssaviruses innenfor de fire primer regionene ble gjennomført, med resultatene viser at 3 ' end nukleotid T av ytre primer N829 i første runde PCR og den andre nukleotid T på 3 ' slutten av indre primer N371F i den andre-runde PCR var ikke identisk med de tilsvarende posisjonene til ARAV (G) og IKOV (A) (figur 2). Når T av primer N829 ble endret til G av ARAV og T av primer N371F endret til A av IKOV, begge virusene ble vellykket oppdaget i PCR (data ikke vist). Dette resultatet demonstrerer den kritiske rollen til 3 ' end eller nær-end nukleotider av primere i den vellykkede forsterkning av målet regionen.

Å vurdere følsomhet og spesifisitet av metoden i påvisning av rabies virus for klinisk diagnose og overvåkning, 9 624 dyr hjernevev prøvene ble testet i de siste 10 årene av FAT og nestede RT-PCR parallelt. Av det 165 prøvene det testet rabiat positiv av nestet RT-PCR, 162 var oppdaget idet positiv av det Basin; Derfor viser de to metodene 99,07% samsvar. RABVs oppdaget i disse 165 prøvene kunne klassifiseres i ulike linjene i asiatisk, arktisk-relatert, og Cosmopolitan klader12,13, som indikerer at nestede RT-PCR kan dekke ulike genetiske klader av RABVs. Tre svært forfalt kliniske prøver ble testet positivt av nestede RT-PCR, men negativt av FAT. Dette resultatet er konsistent med evalueringen av effekten i å teste to degradert prøver som vist i delen representative resultater, noe som indikerer at nestet RT-PCR er mer følsom enn FAT i påvisning av virus i svært forfalt eksemplarer.

Ytelsen til nestede RT-PCR ble ytterligere bekreftet ved deltakelse i International Laboratory sammenligning test (ILCT) organisert av EUs referanse laboratorium for rabies ved det franske byrået for mat, miljø og yrkesmessig Helse & Safety ( ANSES) i 2010, ved hjelp av et sett av 12 prøver (en hver av RABV, EBLV-1, EBLV-2, og ABLV som positive kontroller, en negativ kontroll, og syv blindet prøver). I testen har nestet RT-PCR identifisert alle lyssaviruses med en 100% konsistens. Inne 2018, metoden var anerkjent som nasjonal målestokk av rabiat diagnoser (GB/T36789-2018) av det nasjonal teknisk standardisering komité av dyr sunnhet av Porselen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Studien ble støttet av National Key forskning og utvikling plan (Grant no. 2016YFD0500401) og National Natural Science Foundation i Kina (Grant no. 31302043).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 × TAE Various Various
6 × loading buffer TakaRa 9156
Agarose US Everbright® Inc A-2015-100g
ddH2O Various Various
DL 2,000 Marker Takara 3427A
dNTPs (10 mM) TakaRa 4019
dNTPs (2.5 mM) TakaRa 4030
Electrophoresis System Tanon EPS300
Ex-Taq (5 U/μL) TakaRa RR001
Gel Imaging System UVITEC Fire Reader
Microcentifuge tubes Various Various
M-MLV reverse transcriptase (200 IU/µL) TakaRa 2641A 
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermoscientific ND1000
Oligo (dT)15 TakaRa 3805
PCR Machine BIO-RAD T100
PCR Tubes Various Various
Phusion High-Fidelity DNA Polymearase NEW ENGLAND BioLabs M0530S
Pipettors Various Various
Random Primer TakaRa 3801
RNase Inhibitor (40 IU/µL) TakaRa 2313A
RNase-free ddH2O TakaRa 9102
Taq Buffer (10×) TakaRa 9152A
Tips Various Various
Vortex mixer Various Various

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hemachudha, T., Laothamatas, J., Rupprecht, C. E. Human rabies: a disease of complex neuropathogenetic mechanisms and diagnostic challenges. Lancet Neurology. 1, (2), 101-109 (2002).
  2. Amarasinghe, G. K., Arechiga Ceballos, N. G. Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2018. Archives of Virology. 163, (8), 2283-2294 (2018).
  3. Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland. Transboundary and Emerging Diseases. 65, (3), 593-596 (2018).
  4. Hu, S. C., et al. Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 24, (4), 782-785 (2018).
  5. World Organization for Animal Health (OIE). Chapter 2.1.17 - Rabies (infection with rabies virus and other lyssaviruses). Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2018. Available from: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_RABIES.pdf 2-14 (2018).
  6. Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. Laboratory techniques in rabies. World Health Organization. 74-195 (2018).
  7. Mani, R. S., et al. Utility of real-time Taqman PCR for antemortem and postmortem diagnosis of human rabies. Journal of Medical Virology. 86, (10), 1804-1812 (2014).
  8. Fooks, A. R., et al. Emerging technologies for the detection of rabies virus: challenges and hopes in the 21st century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 3, (9), 530 (2009).
  9. Jiang, Y., et al. An outbreak of pig rabies in Hunan province, China. Epidemiology and Infection. 136, (4), 504-508 (2008).
  10. Liu, Y., et al. Analysis of the complete genome of the first Irkut virus isolate from China: comparison across the Lyssavirus genus. Molecular Phylogenetics and Evolution. 69, (3), 687-693 (2013).
  11. Chen, T., et al. Possible Transmission of Irkut Virus from Dogs to Humans. Biomedical and Environmental Sciences. 31, (2), 146-148 (2018).
  12. Feng, Y., et al. Disease outbreaks caused by steppe-type rabies viruses in China. Epidemiology and Infection. 143, (6), 1287-1291 (2015).
  13. Feng, Y., et al. Livestock rabies outbreaks in Shanxi province, China. Archives of Virology. 161, (10), 2851-2854 (2016).
Evaluering av en Universal nestet omvendt transkripsjon polymerase Kjedere reaksjon for påvisning av Lyssaviruses
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Y., Xu, W., Guo, H., Gong, W., He, B., Tu, Z., Tu, C., Feng, Y. Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses. J. Vis. Exp. (147), e59428, doi:10.3791/59428 (2019).More

Wang, Y., Xu, W., Guo, H., Gong, W., He, B., Tu, Z., Tu, C., Feng, Y. Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses. J. Vis. Exp. (147), e59428, doi:10.3791/59428 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter