Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Genetics

Оценка универсального вложенного обратного транскрипционного цепной реакции для обнаружения Лисовивирусов

doi: 10.3791/59428 Published: May 2, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Пан-лиссавирус вложенной обратной транскрипции полимеразной цепной реакции была разработана для обнаружения конкретно все известные лисовивирусы. Проверка с использованием образцов мозга бешенства различных видов животных показали, что этот метод имеет чувствительность и специфичность эквивалентно золотой стандарт флуоресцентного теста на антитела и может быть использован для рутинной диагностики бешенства.

Abstract

Для обнаружения вируса бешенства и других видов членов рода Лиссавируса в пределах семейства рхабдовиридае, Пан-лиссавирус вложенного обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (ВЛОЖЕННЫЙ RT-СР) был разработан для обнаружения сохранялся регион нуклеопротеин (N) гена лисовивирусов. Метод применяет обратную транскрипцию (RT) с использованием вирусной РНК в качестве шаблона и олиго (dT)15 и случайных гексамеров в качестве праймеров для синтеза вирусной комплементарной ДНК (кДНК). Затем, вирусный cDNA используется в качестве шаблона для усиления 845 BP N фрагмент гена в первом раунде ЦР с использованием внешних праймеров, после второго раунда вложенного КЦР, чтобы усилить окончательный фрагмент 371 BP с использованием внутренней праймеров. Этот метод может обнаруживать различные генетические клады вирусов бешенства (RABV). Проверка, используя 9 624 образцов головного мозга от восьми видов домашних животных за 10 лет клинических диагнозов бешенства и эпиднадзора в Китае, показала, что метод имеет чувствительность 100% и специфичность 99,97% по сравнению с прямым флуоресцентным анализ на антитела (FAT), метод золотого стандарта, рекомендованный Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) и Всемирной организацией по охране здоровья животных (МЭБ). Кроме того, метод мог бы также специально усилить целевой N фрагмент гена 15 других утвержденных и двух новых видов лизсавирусов в 10-м докладе Международного комитета по таксономии вирусов (ICTV), как оценивается имитирующих обнаружение синтезированных N генных плазмид всех лизовивирусов. Метод обеспечивает удобную альтернативу FAT для диагностики бешенства и был одобрен как Национальный стандарт (GB/T36789-2018) Китая.

Introduction

Бешенство-это Всемирная зоонозная болезнь, вызываная вирусами в роду Lyssavirus1. Лисавирусы (Family рхабдовиридае)-ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫЕ РНК-вирусы с приблизительно 12 КБ генома, который кодирует пять белков: N, Фосфоровирус (P), матричный белок (M), гликопротеин (G), и большой белок или полимеразы (L). На основе нуклеотидных последовательностей гена N, генетического расстояния и антигенных паттернов, лиссавирусами были разделены на 16 видов, включая классический вирус бешенства (rabv) и вирусы, связанные с бешенством (RRV): Лагос-летучая мышь (LBV), вирус duvenhage (дувв ), Вирус мокола (МОКВ), Европейская летучая мышь (EBLV-1), Европейская летучая мышь-лиссавирус 2 Австралийский летучая мышь (АБК), вирус Аравана (АРАВ), вирус Икама (иков), Бокело Бат-лиссавирус (BBLV), Ганнорува Бат лиссавирус (ГБЛВ), вирус Иркут (ИРКВ), Худжанский вирус (ХУВ), вирус Западно-кавказской летучей мыши (WCBV), вирус Симони bat (SHIBV) и Ллеида Бат-лиссарус (ллеб)2. Недавно были выявлены два дополнительных лисовируса: Kotalahti летучая мышь (KBLV), изолированная от летучей мыши Брандт (Myotis brandtii) в финляндии в 20173 и Тайваньская летучая мышь ЛИССАВИРУС (twblv), изолированный от японского пистрелле ( Пьпипиреллус абрамы) на Тайване, Китай в 2016 – 20174.

Все млекопитающие подвержены бешенству; Однако, никакие грубые патогномонические поражения или специфические клинические знаки не разрешают свою идентификацию, и диагноз можно только сделать в лаборатории5. Наиболее широко используемым методом диагностики бешенства является жир, который считается золотым стандартом как для ВОЗ, так и для МЭБ5,6. Тем не менее, жир может производить ненадежные результаты на деградированных/аутолzed образцов мозговой ткани. Кроме того, он не может быть использован для анализа биологических образцов жидкости, таких как спинномозговой жидкости (ЛИКВОРА), слюны и мочи, тем самым в значительной степени исключая его занятости в антеморной диагностики7. Альтернативные обычных диагностических тестов, таких, как бешенство ткани культуры инфекции тест (РЦКМЭ) и тест инокуляции мыши (MIT), требуют несколько дней6, основным недостатком, когда быстрый диагноз имеет важное значение.

Различные молекулярные диагностические тесты (например, обнаружение вирусной РНК с помощью RT-ЦР, терапия с иммуноферментной инфекцией (ЦР-ИФА), гибридизация на месте и в режиме реального времени (СР), используются в качестве быстрых и чувствительных методов диагностики бешенства8. В настоящее время "RT-ЦР" рекомендуется МЭБ для рутинного диагностирования бешенства, а в руководстве по диагностическим испытаниям и вакцинам для наземных животных МЭБ описано описание всех лисивирусов5. Здесь мы описываем "Пан-лиссавирус", вложенный в-ЦР, что позволяет специфическое и чувствительное обнаружение всех 18 видов лиссавирусов, сопоставимых или превышающих полученные жиром. Принцип метода является RT целевой РНК (сохраняется область лизисавируса N гена) в кДНК, а затем усиление кДНК двумя раундами ЦР. CDNA подвергается в первом раунде КЦР с внешними праймеров, чтобы усилить фрагмент 845 BP; Затем, второй раунд ЦР использует в первом раунде продукта ЦР в качестве шаблона для усиления 371 BP фрагмент с внутренним праймеров. Два раунда ЦР значительно увеличивают чувствительность анализа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Использование мышей в этом протоколе был одобрен Административным комитетом по охране животных института военной ветеринарной медицины, Академия военно-медицинских наук, Китай (Лаборатория по уходу за животными и Комитета использования разрешения, разрешение номер JSY-DW-2010-02). Были соблюдены все институциональные и национальные руководящие принципы по уходу за лабораторными животными и их использованию.

1. РНК экстракция

  1. Экстракт РНК от бешенства подозреваемой ткани головного мозга, биопсия кожи, слюна, или ЛИКВОРА или от RABV-инфицированных клеток культуры, с использованием guanidиния изоцианата-фенола-хлороформ основе методов извлечения или коммерчески доступных наборов вирусной РНК экстракции. Используйте подготовленную РНК немедленно или храните ее при температуре-80 ° c, пока не требуется.

2. Обратная транскрипция вирусной РНК

  1. Удалите реагенты RT, перечисленные в таблице 1 , из морозильной камеры, держите их на льду и оттепели и вихря перед использованием.
  2. Подготовьте 12 мкКл в реакционной смеси RT в 0,2 мл трубки с реагентами, перечисленными в таблице 1. Разрешить для пипетин вариации путем подготовки объема мастер смеси по крайней мере один размер реакции больше, чем требуется.
  3. Добавьте 8 мкл образца, положительную управляю РНК или отрицательный контроль на реакцию RT в рамках рабочей станции ЦР в комнате шаблона. Положительный контроль RT — РНК, извлеченная из клеточной культуры, инфицированной фиксированным штаммом RABV CV-11 (стандарт вируса-11) и хранится при температуре-80 ° c. Отрицательный элемент управления содержит Нrase-Free ddH2O.
  4. Смешайте содержимое труб RT с помощью vortexing; то, центрифуга кратко.
  5. Загрузите реакционную трубу в Термоциклер. Настройка программы синтеза cDNA со следующими условиями: 42 ° c для 90 мин, 95 ° c в течение 5 минут и 4 °C на удержание. Установите громкость реакции до 20 мкл. Запустите RT Run.

3. Первый раунд ЦР

  1. Храните реагенты ЦР, перечисленные в таблице 2 , на льду в чистом помещении до использования; Затем, оттепель и вихрь их.
  2. Подготовьте в первом раунде ЦР-смесь в 0,2 мл трубки с реагентами, перечисленными в таблице 2.
  3. Добавьте 2 мкл образца кДНК или плазмида в первую круглую смесь ЦР в пределах рабочей станции ЦР в шаблоне комнаты. Положительный контроль КЦР-это CV-11 cDNA, подготовленный как упомянуто в шаге 2,3 для вышеуказанного метода RT. Отрицательный контроль ЦР ddH2O.
  4. Перенесите запечатанные трубы на тепловизионный Циклер и цикл, используя параметры, перечисленные в таблице 3.

4. Второй раунд ЦР

  1. Подготовьте второй раунд-смесь ЦР в 0,2 mL-трубке с использованием реагентов, перечисленных в таблице 4.
  2. Добавьте 2 мкл первого раунда продукта для ЦР в второй раунд. Кроме того, включите ddH2O как отрицательный контроль второго раунда ЦР.
  3. Выполните ЦР-тепловой Велоспорт, используя те же параметры, которые приведены в шаге 3,4.

5. анализ продукции ЦР электрофорез на гелях агарозы

  1. Подготовить 1,5% агарозы гель, добавив 1,5 g агарозы до 100 mL из трис-ацетат-ЭДТА (ТЭ) и растворять его тщательно, нагрев его в микроволновой печи.
  2. Добавить этидий бромид (EB) (при конечной концентрации 0,01%) или другого коммерческого EB замещения. Налейте гель в форму и оставить его закрепить при температуре окружающей среды, по крайней мере 30 мин.
  3. Подготовьте образцы погрузки, смешивая 5 мкл каждого продукта ЦР с 1 мкл 6X загрузочного буфера.
  4. Загрузите образцы и подходящий маркер ДНК отдельно в скважины и запустить гель для примерно 30-45 мин на 120 V, пока линия красителя составляет около 75%-80% вниз гель.
  5. Выключите питание, отключите электроды от источника питания, а затем осторожно удалите гель из коробки геля.
  6. Используйте УФ гель документирования устройство для визуализации и фотографии фрагментов ДНК.

6. характеристика вложенного РТ-СР

  1. 6,1. специфичность и чувствительность к обнаружению 18 лиссавирусами плазмид
    1. Закажите 18 коммерческих плазмид, содержащих полный ген N каждого лиссавируса (16 видов ICTV и два новых вида) для КЦР.
    2. Вычислите номер копии плазмида, используя номер Avogadro (NA) и следующую формулу.
      [(g/мкл плазмид ДНК)/(плазмида длина в BP x 660)] х 6,022 х 1023 = количество молекул/мкл
    3. Подготовьте фондовые решения (2,24 x 109 молекул/мкл) всех 18 плазмид в DDH2O.
    4. Выполните 9 10-кратный серийный разведений всех 18 плазмид в ddH2o. развести 10 мкл каждого плазмиды с 90 мкл DDH2o. вихрь и центрифуга кратко.
    5. Выполните ЦР-усиление, как описано в разделах 3-5.
    6. Проанализируйте специфичность и чувствительность вложенного ЦР, обнаруживая ряд плазмид лизсавирусов.
  2. Определение d Подключение л имит
    1. Отрегулируйте титр вируса бешенства штамм-11 клеточной культуры до 105,5 tcid50/ml (вирус титр определяется в соответствии с руководством МЭБ)5.
    2. Выполните 5 10-кратный серийный разведений CV-11 (фондовый решение 105,5 tcid50/ml) как описано в шаге 6.1.4.
    3. Выполните РНК экстракции и вложенные процедуры амплификации RT-ЦР всех вирусных разведения, как описано в разделах 1-5.
  3. Compar Исон из в этом ВЛОЖЕННЫЙ RT-СР с "золотым стандартом" жира
    1. Проверьте все клинические образцы по вложенным RT-ЦР, а затем, подтвердите результаты с жиром5 и N гена секвенирование9.
    2. Использование нормализованных данных для статистического анализа с помощью SAS 9,1. Используйте тест Каппа и тест хи-квадрат макнемара для статистического сравнения диагностических тестов (команда SAS: прокнутых FREQ; таблица/согласен). Расчет доверительный интервал при аберномиальном распределении.
  4. Оценка эффективности при тестировании ухудшенного образца
    1. Разоблачить два подтвержденных клинических образцов мозговой ткани бешеных собак при температуре 37 ° c.
    2. Анализ двух образцов на каждый день воздействия на 37 ° c на вложенный RT-СР, жир, и MIT5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Результаты вложенного РТ-СР для обнаружения 18 видов лиссавирусов показаны на рисунке 1. Все положительные элементы контроля показали ожидаемый 845 BP в первом-и 371 BP во втором раунде амплификации без группы в отрицательном контроле. Все 18 лизовивирусы производили Ожидаемые диапазоны 845 и/или 371 BP, что указывает на то, что вложенная RT-ЦР обнаружила все 18 лизовивирусов. Шестнадцать лизсавирусов плазмид было эффективное усиление в двух раундах ЦР, но два, а именно АРАВ и Иков, было усиление в любом первом или втором раунде ЦР. Чувствительность метода варьировалась при обнаружении различных плазмид, с лимитами в диапазоне от 2,24 х 100 до 2,24 х 105 молекул/мкл, как показано в таблице 6. Эти различия могут быть отнесены к несоответствие между праймеров и шаблонов из-за разнообразия вирусной последовательности. Кроме того, чувствительность обнаружения вируса бешенства CV-11 в культуре клеток составила 102,5 tcid50/ml.

В общей сложности 9 624 ткани головного мозга из клинических образцов были протестированы вложенными RT-ЦР по сравнению с жиром, и результаты обобщены в таблице 7, которая показывает, что вложенный RT-СР имел чувствительность 100% (CI, 97,75% до 100%) и 99,97% специфичности (CI, 99,91% до 99,99%). В соответствии между двумя методами было 99,07%. Три испытания, которые были положительными по вложенным RT-ЦР, но отрицательные по жир были сильно распались клинического материала. Эти три экземпляра были подтверждены в качестве положительных RABV по секвенированию гена N.

Сравнение тестового представления в обнаружении двух образцов головного мозга, инкубируемых при температуре 37 ° c (шаг 6.4.1 протокола), показало, что вложенная RT-СР может эффективно обнаруживать вирус в разрушенных тканях головного мозга в течение не менее 17 дней после деградации, которая более длительный период времени по сравнению с только 7 дней жир и даже не 1 день в MIT. Этот результат показывает, что вложенный RT-ЦР более чувствителен в обнаружении деградированных образцов, чем жир и MIT.

Для дальнейшей проверки вложенного RT-ЦР было предложено 10 лабораторий по борьбе с бешенством в Китае для проведения тестов по набору образцов. Из них восьми лабораториям был предоставлен набор из 10 ослепленных тканей головного мозга животных из нашей лаборатории, включая положительные и отрицательные образцы RABV. Две другие лаборатории использовали свои собственные экземпляры. Все экземпляры были архивированы и подтверждены FAT ранее. Все 10 лабораторий получены результаты путем вложенного RT-ЦР в 100% согласно FAT, без ложных негативов или ложных срабатываний (Таблица 8), указывая, что ВЛОЖЕННЫЙ RT-СР имел высокую специфичность и воспроизводимость.

Компоненты Объем на одну реакцию (мкл)
НЦТ (2,5 mM) 4
Случайный грунт (50 мкм) 1,5
Олиго (dT) 15 (50 мкм) 0,5
Буфер M-MLV (5x) 4
М-MLV обратная транскриптазы (200 ме/мкл) 1
RNasin (40 МЕ/мкл) 1
Общий объем 12

Таблица 1: Реагентов обратной транскрипции для синтеза кДНК .

Компоненты Объем на одну реакцию (мкл)
НЦТ (10 мм) 1
Ex-Taq (5 U/мкл) 0,3
Taq буфер (10x) 5
N127 (20 мкм) 1
N829 (20 мкм) 1
DD H2O 39,7
Общий объем 48

Таблица 2: Реагентов в отношении в первом РАУНДЕ ЦР.

Температура Время Циклов
94 °C 2 мин. 1
94 °C 30-е годы 35
56 °C 30-е годы 35
72 °C 40 s 35
72 °C 10 мин. 1
4 °C

Таблица 3: С ицепляются параметры первое- и их второй раунд ЦР.

Компоненты Объем на одну реакцию (мкл)
НЦТ (10 мм) 1
Ex-Taq (5 U/мкл) 0,3
Taq буфер (10x) 5
N371F (20 мкм) 1
N371R (20 мкм) 1
DD H2O 39,7
Общий объем 48

Таблица 4: Реагентов в отношении второй раунд ЦР.

Название грунтовки Детали Направление Последовательность (5 '-3 ') Положение нуклеотидов Размер продукта
N127 Первый раунд ЦР Вперед АТГТААКНЦКТАКАГАГГ -19 ~ 0 845bp
N829 Первый раунд ЦР Обратный ГККТГГАТЦГААЦКТ 807 ~ 825 845bp
N371F Второй раунд ЦР- Вперед АКАХАТГГКТКТАГАТАГАТАГ -6 ~ 15 371bp
N371R Второй раунд ЦР- Обратный CCTGYМСМ ГАНЦКАЦККЬТК 345 ~ 367 371bp

Таблица 5: Грунт s уравностей первое- и их второй раунд ЦР . Дегенеративная основа: N (A/T/C/G), к (G/T), R (A/G), Y (C/T), Западная (G/A/C).

Виды лиссавирусов Деформации Плазмид шаблона (молекулы/мкл)
RABV GQ 918139.1 2,24 x 101
Lbv EU 293110.1 2,24 x 102
МОКВ КФ 155005.1 2,24 x 101
ДУВВ EU 293119.1 2,24 x 101
EBLV-1 EF 157976.1 2,24 x 101
EBLV-2 КФ 155004.1 2,24 x 101
Ablv ГУ 992312.1 2,24 x 100
ИРКВ НК_ 020809.1 2,24 x 101
WCBV НК_ 025377.1 2,24 x 101
ХУВ НК_ 025385.1 2,24 x 103
ARAV НК_ 020808.1 2,24 x 102
SHIBV НК_ 025365.1 2,24 x 101
BBLV НК_ 025251.1 2,24 x 101
ИКОВ НК_ 018629.1 2,24 x 105
ЛЛЬБ НК_ 031955.1 2,24 x 103
GBLV НК_ 031988.1 2,24 x 105
KBLV МФ 960865.1 2,24 x 101
TWBLV МФ 472710.1 2,24 x 101

Таблица 6: Предел обнаружения ВЛОЖЕННЫЙ RT-СР о f 18 л иссавирус ES.

Стандартный метод и результат RT-НЦР
Положительные
RT-НЦР
Отрицательные
Корреляция (%)
Жира Положительные
Отрицательные
162
3
0
9459
99,07

Таблица 7: Корреляция между ВЛОЖЕННЫЙ RT-СР и FAT в этом Обнаружение RABVs в клинических образцах.

Table 8
Таблица 8: Результаты валидации ВЛОЖЕННЫХ РТ-СР 10 лабораторий.

Figure 1
Рисунок 1 : Обнаружение 18 лиссавирус ЕС путем ВЛОЖЕННЫЙ RT-СР. А) результат первого раунда ЦР. B) в результате второго раунда ЦР. M = DL 2000 ДНК маркер. Полосы 1-18 = RABV, LBV, МОКВ, ДУВВ, EBLV-1, EBLV-2, АБК, АРАВ, Иков, BBLV, ГБЛВ, ИРКВ, ХУВ, ллеб, SHIBV, WCBV, KBLV, и TWBLV, соответственно. Lane 19 = положительный контроль над ЦР; полоса 20 = отрицательный контроль для первого раунда ЦР; полоса 21 = отрицательный элемент управления для второго раунда ЦР. Положительный результат ЦР показывает полосу на 845 BP в первом раунде и 371 BP во втором раунде ЦР. Ампликон Arav не видна в первом раунде, но видны во втором раунде КЦР (полоса 8), в то время как ампликон икова видна в первом раунде, но не видны во втором раунде КЦР (полоса 9). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Сравнение со последовательностей грунтовки показывает дифференциальные нуклеотиды в праймериз 18 видов лиссавирусов. N127 и N829 были внешними праймерами, N371F и N371R были внутренними праймерами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В настоящее время, RABV является одним из основных лизсавирусов, ответственных за почти всех людей и животных, бешенства в Китае, а также в других странах. Кроме того, вариант ИРКВ был впервые идентифицирован с м.урина лойкогстер бат в провинции Цзилинь в северо-восточном Китае в 201210, и, как сообщается, причиной смерти собаки в провинции Ляонин в 201711. Совсем недавно, Роман lyssavirus, TWBLV, также был идентифицирован из японских летучих мышей в Тайване, Китай в 2017. Эти результаты свидетельствуют о том, что эффективное обнаружение других лизовирусов также имеет важное значение для предотвращения утечки лисовирусов в летучем состоянии. В связи с этим, Пан-лиссавирус вложенных RT-СР ориентации наиболее сохраненной ген N региона является очень полезным инструментом, и результаты показали, что он может эффективно обнаруживать все 16 ICTV утвержденных и двух новых видов лизсавирусов, выявленных до сих пор, в том числе генетически различаящиеся RABVs и ИРКВ в Китае (данные по деформации IRKV не показаны). Тем не менее, также интересно отметить, что ARAV был обнаружен только второй раунд праймеров ЦР, в то время как иков был обнаружен только в первом раунде праймеров ЦР (рис. 1). Чтобы исследовать причину этого несоответствия, было проведено сравнение последовательности всех 18 лизовирусов в четырех регионах праймера, результаты которого показали, что 3 ' конец нуклеотидов T внешнего праймера N829 в первом раунде ЦР и второй нуклеотид T на 3 ' конец внутренней грунтовки N371F во втором раунде ЦР не была идентична соответствующим позициям АРАВ (G) и иков (A) (рис. 2). После того, как T грунтовки N829 был изменен на G из ARAV и т грунтовки N371F изменено на а Иков, оба вируса были успешно обнаружены в ЦР (данные не показаны). Этот результат демонстрирует важнейшую роль 3 ' конец или почти конец нуклеотидов праймеров в успешное усиление целевого региона.

Для оценки чувствительности и специфичности метода в обнаружении вируса бешенства для клинической диагностики и эпиднадзора, 9 624 образцов тканей головного мозга животных были протестированы в течение последних 10 лет жиром и вложенными RT-СР параллельно. Из 165 образцов, которые испытали положительный результат бешенства на вложенный RT-СР, 162 были обнаружены в качестве положительных по FAT; Таким образом, два метода показывают 99,07% соответствии. Rabvs обнаружены в этих 165 образцов могут быть классифицированы в различных линий в азиатских, арктических связанных, и космополитные клады12,13, указав, что вложенный RT-ЦР может охватывать различные генетические клады rabvs. Три сильно разложившихся клинических образца были протестированы положительно на вложенный RT-ЦР, но отрицательный жиром. Этот результат согласуется с оценкой эффективности в тестировании двух деградировавших образцов, как показано в разделе репрезентативных результатов, что указывает на то, что вложенный RT-ЦР более чувствителен, чем жир, при обнаружении вирусов в сильно разрушенных образцах.

Эффективность вложенного RT-ЦР была также подтверждена участием в международном лабораторном сравнении испытаний (ILCT), организованном референс-лабораторией ЕС по борьбе с бешенством во французском агентстве по продовольствию, окружающей среде и гигиене труда & безопасности ( ANSES) в 2010 году, используя набор из 12 образцов (по одному в каждом из RABV, EBLV-1, EBLV-2, и АББ в качестве положительных элементов управления, один отрицательный контроль, и семь ослепленных образцов). В тесте, вложенные RT-ЦР успешно определили все лизовивирусы с консистенцией 100%. В 2018, метод был одобрен как Национальный стандарт диагнозов бешенства (GB/T36789-2018) национальным комитетом технической стандартизации животного здоровья Китая.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Исследование было поддержано национальным ключевым научно-исследовательским планом развития (Грант No. 2016ИД0500401) и национальным фондом естественных наук Китая (Грант No 31302043).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 × TAE Various Various
6 × loading buffer TakaRa 9156
Agarose US Everbright® Inc A-2015-100g
ddH2O Various Various
DL 2,000 Marker Takara 3427A
dNTPs (10 mM) TakaRa 4019
dNTPs (2.5 mM) TakaRa 4030
Electrophoresis System Tanon EPS300
Ex-Taq (5 U/μL) TakaRa RR001
Gel Imaging System UVITEC Fire Reader
Microcentifuge tubes Various Various
M-MLV reverse transcriptase (200 IU/µL) TakaRa 2641A 
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermoscientific ND1000
Oligo (dT)15 TakaRa 3805
PCR Machine BIO-RAD T100
PCR Tubes Various Various
Phusion High-Fidelity DNA Polymearase NEW ENGLAND BioLabs M0530S
Pipettors Various Various
Random Primer TakaRa 3801
RNase Inhibitor (40 IU/µL) TakaRa 2313A
RNase-free ddH2O TakaRa 9102
Taq Buffer (10×) TakaRa 9152A
Tips Various Various
Vortex mixer Various Various

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hemachudha, T., Laothamatas, J., Rupprecht, C. E. Human rabies: a disease of complex neuropathogenetic mechanisms and diagnostic challenges. Lancet Neurology. 1, (2), 101-109 (2002).
  2. Amarasinghe, G. K., Arechiga Ceballos, N. G. Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2018. Archives of Virology. 163, (8), 2283-2294 (2018).
  3. Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland. Transboundary and Emerging Diseases. 65, (3), 593-596 (2018).
  4. Hu, S. C., et al. Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 24, (4), 782-785 (2018).
  5. World Organization for Animal Health (OIE). Chapter 2.1.17 - Rabies (infection with rabies virus and other lyssaviruses). Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2018. Available from: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_RABIES.pdf 2-14 (2018).
  6. Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. Laboratory techniques in rabies. World Health Organization. 74-195 (2018).
  7. Mani, R. S., et al. Utility of real-time Taqman PCR for antemortem and postmortem diagnosis of human rabies. Journal of Medical Virology. 86, (10), 1804-1812 (2014).
  8. Fooks, A. R., et al. Emerging technologies for the detection of rabies virus: challenges and hopes in the 21st century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 3, (9), 530 (2009).
  9. Jiang, Y., et al. An outbreak of pig rabies in Hunan province, China. Epidemiology and Infection. 136, (4), 504-508 (2008).
  10. Liu, Y., et al. Analysis of the complete genome of the first Irkut virus isolate from China: comparison across the Lyssavirus genus. Molecular Phylogenetics and Evolution. 69, (3), 687-693 (2013).
  11. Chen, T., et al. Possible Transmission of Irkut Virus from Dogs to Humans. Biomedical and Environmental Sciences. 31, (2), 146-148 (2018).
  12. Feng, Y., et al. Disease outbreaks caused by steppe-type rabies viruses in China. Epidemiology and Infection. 143, (6), 1287-1291 (2015).
  13. Feng, Y., et al. Livestock rabies outbreaks in Shanxi province, China. Archives of Virology. 161, (10), 2851-2854 (2016).
Оценка универсального вложенного обратного транскрипционного цепной реакции для обнаружения Лисовивирусов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Y., Xu, W., Guo, H., Gong, W., He, B., Tu, Z., Tu, C., Feng, Y. Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses. J. Vis. Exp. (147), e59428, doi:10.3791/59428 (2019).More

Wang, Y., Xu, W., Guo, H., Gong, W., He, B., Tu, Z., Tu, C., Feng, Y. Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses. J. Vis. Exp. (147), e59428, doi:10.3791/59428 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter