Summary
Пан-лиссавирус вложенной обратной транскрипции полимеразной цепной реакции была разработана для обнаружения конкретно все известные лисовивирусы. Проверка с использованием образцов мозга бешенства различных видов животных показали, что этот метод имеет чувствительность и специфичность эквивалентно золотой стандарт флуоресцентного теста на антитела и может быть использован для рутинной диагностики бешенства.
Abstract
Для обнаружения вируса бешенства и других видов членов рода Лиссавируса в пределах семейства рхабдовиридае, Пан-лиссавирус вложенного обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (ВЛОЖЕННЫЙ RT-СР) был разработан для обнаружения сохранялся регион нуклеопротеин (N) гена лисовивирусов. Метод применяет обратную транскрипцию (RT) с использованием вирусной РНК в качестве шаблона и олиго (dT)15 и случайных гексамеров в качестве праймеров для синтеза вирусной комплементарной ДНК (кДНК). Затем, вирусный cDNA используется в качестве шаблона для усиления 845 BP N фрагмент гена в первом раунде ЦР с использованием внешних праймеров, после второго раунда вложенного КЦР, чтобы усилить окончательный фрагмент 371 BP с использованием внутренней праймеров. Этот метод может обнаруживать различные генетические клады вирусов бешенства (RABV). Проверка, используя 9 624 образцов головного мозга от восьми видов домашних животных за 10 лет клинических диагнозов бешенства и эпиднадзора в Китае, показала, что метод имеет чувствительность 100% и специфичность 99,97% по сравнению с прямым флуоресцентным анализ на антитела (FAT), метод золотого стандарта, рекомендованный Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) и Всемирной организацией по охране здоровья животных (МЭБ). Кроме того, метод мог бы также специально усилить целевой N фрагмент гена 15 других утвержденных и двух новых видов лизсавирусов в 10-м докладе Международного комитета по таксономии вирусов (ICTV), как оценивается имитирующих обнаружение синтезированных N генных плазмид всех лизовивирусов. Метод обеспечивает удобную альтернативу FAT для диагностики бешенства и был одобрен как Национальный стандарт (GB/T36789-2018) Китая.
Introduction
Бешенство-это Всемирная зоонозная болезнь, вызываная вирусами в роду Lyssavirus1. Лисавирусы (Family рхабдовиридае)-ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫЕ РНК-вирусы с приблизительно 12 КБ генома, который кодирует пять белков: N, Фосфоровирус (P), матричный белок (M), гликопротеин (G), и большой белок или полимеразы (L). На основе нуклеотидных последовательностей гена N, генетического расстояния и антигенных паттернов, лиссавирусами были разделены на 16 видов, включая классический вирус бешенства (rabv) и вирусы, связанные с бешенством (RRV): Лагос-летучая мышь (LBV), вирус duvenhage (дувв ), Вирус мокола (МОКВ), Европейская летучая мышь (EBLV-1), Европейская летучая мышь-лиссавирус 2 Австралийский летучая мышь (АБК), вирус Аравана (АРАВ), вирус Икама (иков), Бокело Бат-лиссавирус (BBLV), Ганнорува Бат лиссавирус (ГБЛВ), вирус Иркут (ИРКВ), Худжанский вирус (ХУВ), вирус Западно-кавказской летучей мыши (WCBV), вирус Симони bat (SHIBV) и Ллеида Бат-лиссарус (ллеб)2. Недавно были выявлены два дополнительных лисовируса: Kotalahti летучая мышь (KBLV), изолированная от летучей мыши Брандт (Myotis brandtii) в финляндии в 20173 и Тайваньская летучая мышь ЛИССАВИРУС (twblv), изолированный от японского пистрелле ( Пьпипиреллус абрамы) на Тайване, Китай в 2016 – 20174.
Все млекопитающие подвержены бешенству; Однако, никакие грубые патогномонические поражения или специфические клинические знаки не разрешают свою идентификацию, и диагноз можно только сделать в лаборатории5. Наиболее широко используемым методом диагностики бешенства является жир, который считается золотым стандартом как для ВОЗ, так и для МЭБ5,6. Тем не менее, жир может производить ненадежные результаты на деградированных/аутолzed образцов мозговой ткани. Кроме того, он не может быть использован для анализа биологических образцов жидкости, таких как спинномозговой жидкости (ЛИКВОРА), слюны и мочи, тем самым в значительной степени исключая его занятости в антеморной диагностики7. Альтернативные обычных диагностических тестов, таких, как бешенство ткани культуры инфекции тест (РЦКМЭ) и тест инокуляции мыши (MIT), требуют несколько дней6, основным недостатком, когда быстрый диагноз имеет важное значение.
Различные молекулярные диагностические тесты (например, обнаружение вирусной РНК с помощью RT-ЦР, терапия с иммуноферментной инфекцией (ЦР-ИФА), гибридизация на месте и в режиме реального времени (СР), используются в качестве быстрых и чувствительных методов диагностики бешенства8. В настоящее время "RT-ЦР" рекомендуется МЭБ для рутинного диагностирования бешенства, а в руководстве по диагностическим испытаниям и вакцинам для наземных животных МЭБ описано описание всех лисивирусов5. Здесь мы описываем "Пан-лиссавирус", вложенный в-ЦР, что позволяет специфическое и чувствительное обнаружение всех 18 видов лиссавирусов, сопоставимых или превышающих полученные жиром. Принцип метода является RT целевой РНК (сохраняется область лизисавируса N гена) в кДНК, а затем усиление кДНК двумя раундами ЦР. CDNA подвергается в первом раунде КЦР с внешними праймеров, чтобы усилить фрагмент 845 BP; Затем, второй раунд ЦР использует в первом раунде продукта ЦР в качестве шаблона для усиления 371 BP фрагмент с внутренним праймеров. Два раунда ЦР значительно увеличивают чувствительность анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Использование мышей в этом протоколе был одобрен Административным комитетом по охране животных института военной ветеринарной медицины, Академия военно-медицинских наук, Китай (Лаборатория по уходу за животными и Комитета использования разрешения, разрешение номер JSY-DW-2010-02). Были соблюдены все институциональные и национальные руководящие принципы по уходу за лабораторными животными и их использованию.
1. РНК экстракция
- Экстракт РНК от бешенства подозреваемой ткани головного мозга, биопсия кожи, слюна, или ЛИКВОРА или от RABV-инфицированных клеток культуры, с использованием guanidиния изоцианата-фенола-хлороформ основе методов извлечения или коммерчески доступных наборов вирусной РНК экстракции. Используйте подготовленную РНК немедленно или храните ее при температуре-80 ° c, пока не требуется.
2. Обратная транскрипция вирусной РНК
- Удалите реагенты RT, перечисленные в таблице 1 , из морозильной камеры, держите их на льду и оттепели и вихря перед использованием.
- Подготовьте 12 мкКл в реакционной смеси RT в 0,2 мл трубки с реагентами, перечисленными в таблице 1. Разрешить для пипетин вариации путем подготовки объема мастер смеси по крайней мере один размер реакции больше, чем требуется.
- Добавьте 8 мкл образца, положительную управляю РНК или отрицательный контроль на реакцию RT в рамках рабочей станции ЦР в комнате шаблона. Положительный контроль RT — РНК, извлеченная из клеточной культуры, инфицированной фиксированным штаммом RABV CV-11 (стандарт вируса-11) и хранится при температуре-80 ° c. Отрицательный элемент управления содержит Нrase-Free ddH2O.
- Смешайте содержимое труб RT с помощью vortexing; то, центрифуга кратко.
- Загрузите реакционную трубу в Термоциклер. Настройка программы синтеза cDNA со следующими условиями: 42 ° c для 90 мин, 95 ° c в течение 5 минут и 4 °C на удержание. Установите громкость реакции до 20 мкл. Запустите RT Run.
3. Первый раунд ЦР
- Храните реагенты ЦР, перечисленные в таблице 2 , на льду в чистом помещении до использования; Затем, оттепель и вихрь их.
- Подготовьте в первом раунде ЦР-смесь в 0,2 мл трубки с реагентами, перечисленными в таблице 2.
- Добавьте 2 мкл образца кДНК или плазмида в первую круглую смесь ЦР в пределах рабочей станции ЦР в шаблоне комнаты. Положительный контроль КЦР-это CV-11 cDNA, подготовленный как упомянуто в шаге 2,3 для вышеуказанного метода RT. Отрицательный контроль ЦР ddH2O.
- Перенесите запечатанные трубы на тепловизионный Циклер и цикл, используя параметры, перечисленные в таблице 3.
4. Второй раунд ЦР
- Подготовьте второй раунд-смесь ЦР в 0,2 mL-трубке с использованием реагентов, перечисленных в таблице 4.
- Добавьте 2 мкл первого раунда продукта для ЦР в второй раунд. Кроме того, включите ddH2O как отрицательный контроль второго раунда ЦР.
- Выполните ЦР-тепловой Велоспорт, используя те же параметры, которые приведены в шаге 3,4.
5. анализ продукции ЦР электрофорез на гелях агарозы
- Подготовить 1,5% агарозы гель, добавив 1,5 g агарозы до 100 mL из трис-ацетат-ЭДТА (ТЭ) и растворять его тщательно, нагрев его в микроволновой печи.
- Добавить этидий бромид (EB) (при конечной концентрации 0,01%) или другого коммерческого EB замещения. Налейте гель в форму и оставить его закрепить при температуре окружающей среды, по крайней мере 30 мин.
- Подготовьте образцы погрузки, смешивая 5 мкл каждого продукта ЦР с 1 мкл 6X загрузочного буфера.
- Загрузите образцы и подходящий маркер ДНК отдельно в скважины и запустить гель для примерно 30-45 мин на 120 V, пока линия красителя составляет около 75%-80% вниз гель.
- Выключите питание, отключите электроды от источника питания, а затем осторожно удалите гель из коробки геля.
- Используйте УФ гель документирования устройство для визуализации и фотографии фрагментов ДНК.
6. характеристика вложенного РТ-СР
-
6,1. специфичность и чувствительность к обнаружению 18 лиссавирусами плазмид
- Закажите 18 коммерческих плазмид, содержащих полный ген N каждого лиссавируса (16 видов ICTV и два новых вида) для КЦР.
- Вычислите номер копии плазмида, используя номер Avogadro (NA) и следующую формулу.
[(g/мкл плазмид ДНК)/(плазмида длина в BP x 660)] х 6,022 х 1023 = количество молекул/мкл - Подготовьте фондовые решения (2,24 x 109 молекул/мкл) всех 18 плазмид в DDH2O.
- Выполните 9 10-кратный серийный разведений всех 18 плазмид в ddH2o. развести 10 мкл каждого плазмиды с 90 мкл DDH2o. вихрь и центрифуга кратко.
- Выполните ЦР-усиление, как описано в разделах 3-5.
- Проанализируйте специфичность и чувствительность вложенного ЦР, обнаруживая ряд плазмид лизсавирусов.
-
Определение d Подключение л имит
- Отрегулируйте титр вируса бешенства штамм-11 клеточной культуры до 105,5 tcid50/ml (вирус титр определяется в соответствии с руководством МЭБ)5.
- Выполните 5 10-кратный серийный разведений CV-11 (фондовый решение 105,5 tcid50/ml) как описано в шаге 6.1.4.
- Выполните РНК экстракции и вложенные процедуры амплификации RT-ЦР всех вирусных разведения, как описано в разделах 1-5.
-
Compar Исон из в этом ВЛОЖЕННЫЙ RT-СР с "золотым стандартом" жира
- Проверьте все клинические образцы по вложенным RT-ЦР, а затем, подтвердите результаты с жиром5 и N гена секвенирование9.
- Использование нормализованных данных для статистического анализа с помощью SAS 9,1. Используйте тест Каппа и тест хи-квадрат макнемара для статистического сравнения диагностических тестов (команда SAS: прокнутых FREQ; таблица/согласен). Расчет доверительный интервал при аберномиальном распределении.
-
Оценка эффективности при тестировании ухудшенного образца
- Разоблачить два подтвержденных клинических образцов мозговой ткани бешеных собак при температуре 37 ° c.
- Анализ двух образцов на каждый день воздействия на 37 ° c на вложенный RT-СР, жир, и MIT5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Результаты вложенного РТ-СР для обнаружения 18 видов лиссавирусов показаны на рисунке 1. Все положительные элементы контроля показали ожидаемый 845 BP в первом-и 371 BP во втором раунде амплификации без группы в отрицательном контроле. Все 18 лизовивирусы производили Ожидаемые диапазоны 845 и/или 371 BP, что указывает на то, что вложенная RT-ЦР обнаружила все 18 лизовивирусов. Шестнадцать лизсавирусов плазмид было эффективное усиление в двух раундах ЦР, но два, а именно АРАВ и Иков, было усиление в любом первом или втором раунде ЦР. Чувствительность метода варьировалась при обнаружении различных плазмид, с лимитами в диапазоне от 2,24 х 100 до 2,24 х 105 молекул/мкл, как показано в таблице 6. Эти различия могут быть отнесены к несоответствие между праймеров и шаблонов из-за разнообразия вирусной последовательности. Кроме того, чувствительность обнаружения вируса бешенства CV-11 в культуре клеток составила 102,5 tcid50/ml.
В общей сложности 9 624 ткани головного мозга из клинических образцов были протестированы вложенными RT-ЦР по сравнению с жиром, и результаты обобщены в таблице 7, которая показывает, что вложенный RT-СР имел чувствительность 100% (CI, 97,75% до 100%) и 99,97% специфичности (CI, 99,91% до 99,99%). В соответствии между двумя методами было 99,07%. Три испытания, которые были положительными по вложенным RT-ЦР, но отрицательные по жир были сильно распались клинического материала. Эти три экземпляра были подтверждены в качестве положительных RABV по секвенированию гена N.
Сравнение тестового представления в обнаружении двух образцов головного мозга, инкубируемых при температуре 37 ° c (шаг 6.4.1 протокола), показало, что вложенная RT-СР может эффективно обнаруживать вирус в разрушенных тканях головного мозга в течение не менее 17 дней после деградации, которая более длительный период времени по сравнению с только 7 дней жир и даже не 1 день в MIT. Этот результат показывает, что вложенный RT-ЦР более чувствителен в обнаружении деградированных образцов, чем жир и MIT.
Для дальнейшей проверки вложенного RT-ЦР было предложено 10 лабораторий по борьбе с бешенством в Китае для проведения тестов по набору образцов. Из них восьми лабораториям был предоставлен набор из 10 ослепленных тканей головного мозга животных из нашей лаборатории, включая положительные и отрицательные образцы RABV. Две другие лаборатории использовали свои собственные экземпляры. Все экземпляры были архивированы и подтверждены FAT ранее. Все 10 лабораторий получены результаты путем вложенного RT-ЦР в 100% согласно FAT, без ложных негативов или ложных срабатываний (Таблица 8), указывая, что ВЛОЖЕННЫЙ RT-СР имел высокую специфичность и воспроизводимость.
| Компоненты | Объем на одну реакцию (мкл) |
| НЦТ (2,5 mM) | 4 |
| Случайный грунт (50 мкм) | 1,5 |
| Олиго (dT) 15 (50 мкм) | 0,5 |
| Буфер M-MLV (5x) | 4 |
| М-MLV обратная транскриптазы (200 ме/мкл) | 1 |
| RNasin (40 МЕ/мкл) | 1 |
| Общий объем | 12 |
Таблица 1: Реагентов обратной транскрипции для синтеза кДНК .
| Компоненты | Объем на одну реакцию (мкл) |
| НЦТ (10 мм) | 1 |
| Ex-Taq (5 U/мкл) | 0,3 |
| Taq буфер (10x) | 5 |
| N127 (20 мкм) | 1 |
| N829 (20 мкм) | 1 |
| DD H2O | 39,7 |
| Общий объем | 48 |
Таблица 2: Реагентов в отношении в первом РАУНДЕ ЦР.
| Температура | Время | Циклов |
| 94 °C | 2 мин. | 1 |
| 94 °C | 30-е годы | 35 |
| 56 °C | 30-е годы | 35 |
| 72 °C | 40 s | 35 |
| 72 °C | 10 мин. | 1 |
| 4 °C | ∞ |
Таблица 3: С ицепляются параметры первое- и их второй раунд ЦР.
| Компоненты | Объем на одну реакцию (мкл) |
| НЦТ (10 мм) | 1 |
| Ex-Taq (5 U/мкл) | 0,3 |
| Taq буфер (10x) | 5 |
| N371F (20 мкм) | 1 |
| N371R (20 мкм) | 1 |
| DD H2O | 39,7 |
| Общий объем | 48 |
Таблица 4: Реагентов в отношении второй раунд ЦР.
| Название грунтовки | Детали | Направление | Последовательность (5 '-3 ') | Положение нуклеотидов | Размер продукта | |
| N127 | Первый раунд ЦР | Вперед | АТГТААКНЦКТАКАГАГГ | -19 ~ 0 | 845bp | |
| N829 | Первый раунд ЦР | Обратный | ГККТГГАТЦГААЦКТ | 807 ~ 825 | 845bp | |
| N371F | Второй раунд ЦР- | Вперед | АКАХАТГГКТКТАГАТАГАТАГ | -6 ~ 15 | 371bp | |
| N371R | Второй раунд ЦР- | Обратный | CCTGYМСМ ГАНЦКАЦККЬТК | 345 ~ 367 | 371bp | |
Таблица 5: Грунт s уравностей первое- и их второй раунд ЦР . Дегенеративная основа: N (A/T/C/G), к (G/T), R (A/G), Y (C/T), Западная (G/A/C).
| Виды лиссавирусов | Деформации | Плазмид шаблона (молекулы/мкл) |
| RABV | GQ 918139.1 | 2,24 x 101 |
| Lbv | EU 293110.1 | 2,24 x 102 |
| МОКВ | КФ 155005.1 | 2,24 x 101 |
| ДУВВ | EU 293119.1 | 2,24 x 101 |
| EBLV-1 | EF 157976.1 | 2,24 x 101 |
| EBLV-2 | КФ 155004.1 | 2,24 x 101 |
| Ablv | ГУ 992312.1 | 2,24 x 100 |
| ИРКВ | НК_ 020809.1 | 2,24 x 101 |
| WCBV | НК_ 025377.1 | 2,24 x 101 |
| ХУВ | НК_ 025385.1 | 2,24 x 103 |
| ARAV | НК_ 020808.1 | 2,24 x 102 |
| SHIBV | НК_ 025365.1 | 2,24 x 101 |
| BBLV | НК_ 025251.1 | 2,24 x 101 |
| ИКОВ | НК_ 018629.1 | 2,24 x 105 |
| ЛЛЬБ | НК_ 031955.1 | 2,24 x 103 |
| GBLV | НК_ 031988.1 | 2,24 x 105 |
| KBLV | МФ 960865.1 | 2,24 x 101 |
| TWBLV | МФ 472710.1 | 2,24 x 101 |
Таблица 6: Предел обнаружения ВЛОЖЕННЫЙ RT-СР о f 18 л иссавирус ES.
| Стандартный метод и результат | RT-НЦР Положительные |
RT-НЦР Отрицательные |
Корреляция (%) | |
| Жира | Положительные Отрицательные |
162 3 |
0 9459 |
99,07 |
Таблица 7: Корреляция между ВЛОЖЕННЫЙ RT-СР и FAT в этом Обнаружение RABVs в клинических образцах.
Таблица 8: Результаты валидации ВЛОЖЕННЫХ РТ-СР 10 лабораторий.
Рисунок 1 : Обнаружение 18 лиссавирус ЕС путем ВЛОЖЕННЫЙ RT-СР. А) результат первого раунда ЦР. B) в результате второго раунда ЦР. M = DL 2000 ДНК маркер. Полосы 1-18 = RABV, LBV, МОКВ, ДУВВ, EBLV-1, EBLV-2, АБК, АРАВ, Иков, BBLV, ГБЛВ, ИРКВ, ХУВ, ллеб, SHIBV, WCBV, KBLV, и TWBLV, соответственно. Lane 19 = положительный контроль над ЦР; полоса 20 = отрицательный контроль для первого раунда ЦР; полоса 21 = отрицательный элемент управления для второго раунда ЦР. Положительный результат ЦР показывает полосу на 845 BP в первом раунде и 371 BP во втором раунде ЦР. Ампликон Arav не видна в первом раунде, но видны во втором раунде КЦР (полоса 8), в то время как ампликон икова видна в первом раунде, но не видны во втором раунде КЦР (полоса 9). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 2 : Сравнение со последовательностей грунтовки показывает дифференциальные нуклеотиды в праймериз 18 видов лиссавирусов. N127 и N829 были внешними праймерами, N371F и N371R были внутренними праймерами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В настоящее время, RABV является одним из основных лизсавирусов, ответственных за почти всех людей и животных, бешенства в Китае, а также в других странах. Кроме того, вариант ИРКВ был впервые идентифицирован с м.урина лойкогстер бат в провинции Цзилинь в северо-восточном Китае в 201210, и, как сообщается, причиной смерти собаки в провинции Ляонин в 201711. Совсем недавно, Роман lyssavirus, TWBLV, также был идентифицирован из японских летучих мышей в Тайване, Китай в 2017. Эти результаты свидетельствуют о том, что эффективное обнаружение других лизовирусов также имеет важное значение для предотвращения утечки лисовирусов в летучем состоянии. В связи с этим, Пан-лиссавирус вложенных RT-СР ориентации наиболее сохраненной ген N региона является очень полезным инструментом, и результаты показали, что он может эффективно обнаруживать все 16 ICTV утвержденных и двух новых видов лизсавирусов, выявленных до сих пор, в том числе генетически различаящиеся RABVs и ИРКВ в Китае (данные по деформации IRKV не показаны). Тем не менее, также интересно отметить, что ARAV был обнаружен только второй раунд праймеров ЦР, в то время как иков был обнаружен только в первом раунде праймеров ЦР (рис. 1). Чтобы исследовать причину этого несоответствия, было проведено сравнение последовательности всех 18 лизовирусов в четырех регионах праймера, результаты которого показали, что 3 ' конец нуклеотидов T внешнего праймера N829 в первом раунде ЦР и второй нуклеотид T на 3 ' конец внутренней грунтовки N371F во втором раунде ЦР не была идентична соответствующим позициям АРАВ (G) и иков (A) (рис. 2). После того, как T грунтовки N829 был изменен на G из ARAV и т грунтовки N371F изменено на а Иков, оба вируса были успешно обнаружены в ЦР (данные не показаны). Этот результат демонстрирует важнейшую роль 3 ' конец или почти конец нуклеотидов праймеров в успешное усиление целевого региона.
Для оценки чувствительности и специфичности метода в обнаружении вируса бешенства для клинической диагностики и эпиднадзора, 9 624 образцов тканей головного мозга животных были протестированы в течение последних 10 лет жиром и вложенными RT-СР параллельно. Из 165 образцов, которые испытали положительный результат бешенства на вложенный RT-СР, 162 были обнаружены в качестве положительных по FAT; Таким образом, два метода показывают 99,07% соответствии. Rabvs обнаружены в этих 165 образцов могут быть классифицированы в различных линий в азиатских, арктических связанных, и космополитные клады12,13, указав, что вложенный RT-ЦР может охватывать различные генетические клады rabvs. Три сильно разложившихся клинических образца были протестированы положительно на вложенный RT-ЦР, но отрицательный жиром. Этот результат согласуется с оценкой эффективности в тестировании двух деградировавших образцов, как показано в разделе репрезентативных результатов, что указывает на то, что вложенный RT-ЦР более чувствителен, чем жир, при обнаружении вирусов в сильно разрушенных образцах.
Эффективность вложенного RT-ЦР была также подтверждена участием в международном лабораторном сравнении испытаний (ILCT), организованном референс-лабораторией ЕС по борьбе с бешенством во французском агентстве по продовольствию, окружающей среде и гигиене труда & безопасности ( ANSES) в 2010 году, используя набор из 12 образцов (по одному в каждом из RABV, EBLV-1, EBLV-2, и АББ в качестве положительных элементов управления, один отрицательный контроль, и семь ослепленных образцов). В тесте, вложенные RT-ЦР успешно определили все лизовивирусы с консистенцией 100%. В 2018, метод был одобрен как Национальный стандарт диагнозов бешенства (GB/T36789-2018) национальным комитетом технической стандартизации животного здоровья Китая.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Исследование было поддержано национальным ключевым научно-исследовательским планом развития (Грант No. 2016ИД0500401) и национальным фондом естественных наук Китая (Грант No 31302043).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 × TAE | Various | Various | |
| 6 × loading buffer | TakaRa | 9156 | |
| Agarose | US Everbright® Inc | A-2015-100g | |
| ddH2O | Various | Various | |
| DL 2,000 Marker | Takara | 3427A | |
| dNTPs (10 mM) | TakaRa | 4019 | |
| dNTPs (2.5 mM) | TakaRa | 4030 | |
| Electrophoresis System | Tanon | EPS300 | |
| Ex-Taq (5 U/μL) | TakaRa | RR001 | |
| Gel Imaging System | UVITEC | Fire Reader | |
| Microcentifuge tubes | Various | Various | |
| M-MLV reverse transcriptase (200 IU/µL) | TakaRa | 2641A | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermoscientific | ND1000 | |
| Oligo (dT)15 | TakaRa | 3805 | |
| PCR Machine | BIO-RAD | T100 | |
| PCR Tubes | Various | Various | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymearase | NEW ENGLAND BioLabs | M0530S | |
| Pipettors | Various | Various | |
| Random Primer | TakaRa | 3801 | |
| RNase Inhibitor (40 IU/µL) | TakaRa | 2313A | |
| RNase-free ddH2O | TakaRa | 9102 | |
| Taq Buffer (10×) | TakaRa | 9152A | |
| Tips | Various | Various | |
| Vortex mixer | Various | Various |
References
- Hemachudha, T., Laothamatas, J., Rupprecht, C. E. Human rabies: a disease of complex neuropathogenetic mechanisms and diagnostic challenges. Lancet Neurology. 1 (2), 101-109 (2002).
- Amarasinghe, G. K., Arechiga Ceballos, N. G. Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2018. Archives of Virology. 163 (8), 2283-2294 (2018).
- Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland. Transboundary and Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).
- Hu, S. C., et al. Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 24 (4), 782-785 (2018).
- World Organization for Animal Health (OIE). Chapter 2.1.17 - Rabies (infection with rabies virus and other lyssaviruses). Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2018. , Available from: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_RABIES.pdf 2-14 (2018).
- Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. Laboratory techniques in rabies. World Health Organization. , 74-195 (2018).
- Mani, R. S., et al. Utility of real-time Taqman PCR for antemortem and postmortem diagnosis of human rabies. Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).
- Fooks, A. R., et al. Emerging technologies for the detection of rabies virus: challenges and hopes in the 21st century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (9), 530 (2009).
- Jiang, Y., et al. An outbreak of pig rabies in Hunan province, China. Epidemiology and Infection. 136 (4), 504-508 (2008).
- Liu, Y., et al. Analysis of the complete genome of the first Irkut virus isolate from China: comparison across the Lyssavirus genus. Molecular Phylogenetics and Evolution. 69 (3), 687-693 (2013).
- Chen, T., et al. Possible Transmission of Irkut Virus from Dogs to Humans. Biomedical and Environmental Sciences. 31 (2), 146-148 (2018).
- Feng, Y., et al. Disease outbreaks caused by steppe-type rabies viruses in China. Epidemiology and Infection. 143 (6), 1287-1291 (2015).
- Feng, Y., et al. Livestock rabies outbreaks in Shanxi province, China. Archives of Virology. 161 (10), 2851-2854 (2016).
