Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Genetics

Lyssaviruses tespiti için evrensel Iç Içe Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu değerlendirilmesi

doi: 10.3791/59428 Published: May 2, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Bir Pan-Lyssavirus iç içe Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu özellikle tüm bilinen lyssaviruses algılamak için geliştirilmiştir. Farklı hayvan türlerinin kuduz beyin örneklerini kullanarak doğrulama Bu yöntemin altın standart floresan antikor testi için bir duyarlılık ve özgüllük eşdeğer olduğunu gösterdi ve rutin kuduz tanısı için kullanılabilir.

Abstract

Kuduz virüsü ve aile RhabdoviridaeIçinde cins Lyssavirus diğer üye türlerini algılamak için, Pan-Lyssavirus yuvalanmış Ters transkripsiyon polimeraz zincir REAKSIYONU (Iç Içe RT-PCR) koruma altındaki bölgeyi tespit etmek için geliştirilmiştir lyssaviruses 'in nüklizoprotein (N) geni. Yöntem Ters transkripsiyon uygular (RT) olarak viral RNA kullanarak şablon ve oligo (dT)15 ve rasgele hexamers sentezlemek için astar olarak VIRAL tamamlayıcı DNA (cDNA). Daha sonra, viral cDNA bir 845 BP N gen parçası dış astar kullanarak ilk yuvarlak PCR yükseltmek için bir şablon olarak kullanılan, ikinci tur iç içe PCR tarafından son 371 BP parçası iç astar kullanarak yükseltmek için takip. Bu yöntem, kuduz virüsleri (RABV) farklı genetik klades algılayabilir. Doğrulama, kullanarak 9.624 beyin numuneleri sekiz yerli hayvan türlerinden 10 yıl içinde klinik kuduz teşhis ve gözetim Çin, yöntemi olduğunu gösterdi 100% duyarlılık ve 99,97% özgüllüğü ile karşılaştırıldığında doğrudan floresan antikor testi (FAT), Dünya Sağlık Örgütü (WHO) ve Dünya Hayvan Sağlığı Örgütü (OIS) tarafından önerilen altın standart yöntemdir. Buna ek olarak, yöntem de özellikle% 15 diğer onaylı ve iki roman Lissavirüse türü hedeflenen N gen parçası yükseltmek olabilir 10 rapordaki Uluslararası komitenin taksonomi üzerinde virüslerin (ICTV) sentezlenmiş bir mimik tespiti tarafından değerlendirilir Tüm lyssaviruses, N gen plazmids. Yöntem, kuduz tanısı için FAT 'e uygun bir alternatif sağlar ve Çin 'in Ulusal Standardı (GB/T36789-2018) olarak onaylanmıştır.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kuduz, Lyssavirus1cinsi içinde virüslerin neden olduğu dünya çapında bir zoonotik hastalıktır. Lyssaviruses (aile Rhabdoviridae), beş proteini kodlayan yaklaşık 12 KB genomu olan tek negatıf telli RNA virüsleridir: N, Fosfoprotein (P), matris proteini (M), glikoprotein (G) ve büyük protein veya polimeraz (L). N geni, genetik mesafe ve antijenik desenlerin nükvendotid dizilerine dayanarak, lyssaviruses klasik kuduz virüsü (RABV) ve kuduz ile ilgili virüsler (RRV) içeren 16 türe bölünmüştür: Lagos bat Virus (LBV), Duvenhage virüsü (DUVV ), Mokola virüsü (mokv), Avrupa bat Lissavirüse 1 (eblv-1), Avrupa bat Lissavirüse 2 (eblv-2), Avustralya bat Lissavirüse (ablv), Aravan virüs (arav), Ikoma virüsü (ıkov), bokeloh bat Lissavirüse (bblv), gannoruwa bat Lissavirüse (gblv), Irkut virüsü (ırkv), Khujand virüs (khuv), Batı Kafkas bat virüs (wcbv), Shimoni bat Virus (shibv), ve Lleida bat Lissavirüse (llebv)2. Son zamanlarda, iki ek lyssaviruses tespit edilmiştir: Kotalahti bat Lissavirüse (KBLV) bir Brandt 's yarasa (Myotis brandtii) içinde Finlandiya 'da 20173 ve Tayvan bat Lissavirüse (twblv) bir Japon Pipistrelle izole () izole Pipistrellus abramus) Içinde Tayvan, Çin içinde 2016 – 20174.

Tüm memeliler kuduz hassastır; Ancak, hiçbir brüt patognomonik lezyonlar veya spesifik klinik belirtiler kimlik izin verir, ve tanı sadece laboratuvarda yapılabilir5. Kuduz tanısı için en yaygın olarak kullanılan yöntem, hem kim hem de OIE5,6tarafından altın standardı olarak kabul edilen yağ şeklindedir. Yine de, FAT bozulabilir/Autolyzed beyin dokusu örnekleri üzerinde güvenilir olmayan sonuçlar üretebilir. Buna ek olarak, beyin omurilik sıvısı (CSF), tükürük ve idrar gibi biyolojik sıvı örneklerinin tahlil edilmesi için kullanılamaz, böylece büyük ölçüde ölüm öncesi tanı7' de istihdamını engelliyor. Alternatif konvansiyonel tanı testleri, kuduz doku kültürü enfeksiyon testi (rtcıt) ve fare aşı testi (MIT) gibi, birkaç gün gerektirir6, hızlı bir tanı gerekli olduğunda büyük bir dezavantajı.

Çeşitli moleküler tanı testleri (örn., RT-PCR tarafından viral RNA tespiti, PCR – enzim bağlantılı İmmünosorbent tahlil [PCR-ELıSA], situ hybridization, ve gerçek zamanlı PCR) kuduz tanısı için hızlı ve hassas teknikler olarak kullanılır8. RT-PCR artık rutin kuduz tanısı için OIS tarafından tavsiye edilir, ve bir heminested (hn) PCR tüm lyssaviruses5algılamak Için tanısal testler ve karasal hayvanlar Için aşılar RIVE Kılavuzu 'nda açıklanmıştır. Burada bir Pan-Lissavirüse iç içe RT-PCR, hangi tüm 18 Lissavirüse türlerin spesifik ve hassas algılama sağlayan veya FAT tarafından elde aşan karşılaştırılabilir tarif. Yöntemin prensibi, cDNA 'ya hedef RNA 'nın (Lissavirüse N geni tarafından bulunan bölge) bir RT 'dir ve ardından iki tur PCR ile cDNA amplifikasyonu tarafından izlenir. CDNA bir 845 BP parçası yükseltmek için dış astar ile ilk yuvarlak PCR uğrar; daha sonra, ikinci tur PCR ilk yuvarlak PCR ürünü bir 371 BP parçası iç astar ile yükseltmek için bir şablon olarak kullanır. PCR iki tur önemli ölçüde tahlil duyarlılığı artar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu protokolde fareler kullanımı askeri veteriner hekimliği Enstitüsü hayvan refahı Yönetim Komitesi, Askeri Tıp Bilimleri Akademisi, Çin (laboratuar hayvan bakımı ve kullanım Komitesi yetkilendirme, izin tarafından onaylanmıştır numarası JSY-DW-2010-02). Laboratuar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için tüm kurumsal ve ulusal yönergeler takip edildi.

1. RNA ekstraksiyonu

  1. Guanidinyum isothiocyanate-fenol-kloroform bazlı ekstraksiyon yöntemleri veya ticari olarak kullanılabilen viral RNA ekstraksiyon kitleri kullanılarak kuduz şüphelisi beyin dokusu, cilt biyopsisi, tükürük veya CSF veya rabv enfekte hücre kültüründen RNA özü. Hazırlanmış RNA 'ya hemen kullanın veya gerekli olana kadar-80 °C ' de saklayın.

2. viral RNA 'nın ters transkripsiyonu

  1. Tablo 1 ' de listelenen RT reaktifleri dondurucudan çıkarın, buzdan saklayın ve kullanmadan önce onları çözün ve girdap yapın.
  2. Tablo 1' de listelenen reaktifler Ile 0,2 ml PCR tüpünde 12 ΜL RT reaksiyon karışımı hazırlayın. Ana karışımı bir hacmi gerekli olandan daha büyük en az bir reaksiyon boyutu hazırlayarak pipetleme varyasyonları için izin verin.
  3. Bir şablon odasında PCR iş istasyonu içindeki RT reaksiyon karışımında 8 μL örnek, pozitif kontrol RNA veya negatif kontrol ekleyin. RT pozitif kontrolü, sabit RABV gerinim CVS-11 (zorluk virüsü standardı-11) ile enfekte hücre kültüründen çıkarılan ve-80 °C ' de saklanan RNA 'dır. Negatif denetim RNase-Free ddH2O içerir.
  4. RT tüpler içeriğini vortexing ile karıştırın; sonra, kısaca Santrifüjü.
  5. Reaksiyon tüplerini termal bisikletçiye yükleyin. CDNA sentezi programını aşağıdaki koşullara göre ayarlayın: 42 °C için 90 dk, 95 °C 5 dakika ve 4 °C bekletin. Reaksiyon hacmini 20 μL olarak ayarlayın. RT çalışmasını başlatın.

3. ilk yuvarlak PCR

  1. Masa 2 ' de listelenen PCR reaktifleri, kullanım kadar temiz bir odada buz üzerinde tutun; sonra, çözüyor ve onları girdap.
  2. İlk yuvarlak PCR karışımını, Tablo 2' de listelenen reaktifler Ile 0,2 ml PCR tüpüne hazırlayın.
  3. Bir şablon odasında bir PCR iş istasyonu içinde ilk yuvarlak PCR karışımı içine cDNA veya plazmid 2 μL örnek ekleyin. PCR pozitif kontrol CVS-11 cDNA adım 2,3 yukarıda RT yöntemi için belirtildiği gibi hazırlanmıştır. PCR negatif denetim ddH2O.
  4. Mühürlü tüpleri bir PCR termal bisikletçine aktarın ve Tablo 3' te listelenen parametreleri kullanarak döngüye gidin.

4. ikinci tur PCR

  1. İkinci Tur PCR karışımını, Tablo 4' te listelenen reaktifler kullanılarak 0,2 ml PCR tüpünde hazırlayın.
  2. İkinci Tur PCR karışımından 2 μL ilk yuvarlak PCR ürününü ekleyin. Buna ek olarak, ddH2O ikinci yuvarlak PCR negatif bir denetim olarak içerir.
  3. 3,4 adımda verilen aynı parametreleri kullanarak PCR Termal Bisiklet gerçekleştirin.

5. ağak jelleri üzerinde Elektroforez tarafından PCR ürünlerinin Analizi

  1. Bir 1,5% agaroz jel ekleyerek hazırlayın 1,5 g agaroz için 100 ml Tris-asetat-EDTA (Tae) ve bir mikrodalga fırında ısıtarak iyice çözünmesi.
  2. Etidyum bromür (EB) (% 0,01 son konsantrasyonda) ekleyin veya başka bir ticari EB ikame. Jel kalıp içine dökün ve en az 30 dakika için ortam sıcaklığında katılaşma için bırakın.
  3. Her PCR ürününün 5 μL 'i 1 μL 6x yükleme tamponunu karıştırarak yükleme örneklerini hazırlayın.
  4. Numuneleri ve uygun DNA işaretleyicisini kuyulara ayrı olarak yükleyin ve jeli yaklaşık 30-45 dk. 120 V 'ye kadar boya hattı yaklaşık% 75-% 80 ' e kadar jel ile çalıştırın.
  5. Elektriği kapatın, elektrotları güç kaynağından ayırın ve ardından jeli jel kutusundan dikkatle çıkarın.
  6. DNA parçalarını görselleştirmek ve fotoğraf çekmek için cihaz belgeleyen bir UV jeli kullanın.

6. Iç Içe RT-PCR karakterizasyonu

  1. 6,1. 18 lyssaviruses plazmids tespiti için özgüllük ve hassasiyet
    1. PCR için her Lissavirüse (16 ICTV türü ve iki roman türü) tam N geni içeren 18 ticari plazmids sipariş.
    2. Avogadro 'nun numarasını (NA) ve aşağıdaki formülü kullanarak Plasmid 'nin kopya numarasını hesaplayın.
      [(g/μL plazmid DNA)/(plazmid uzunluğu BP x 660)] x 6,022 x 1023 = moleküllerin sayısı/μL
    3. DdH2O 'da tüm 18 plazmids stok çözümlerini (2,24 x 109 molekülleri/μL) hazırlayın.
    4. DdH2o, tüm 18 plazmids 9 10 kat seri dilüsyonları gerçekleştirin. 90 μL DDH2o ile her bir Plasmid stokunda 10 μL seyreltme. Vortex ve santrifüjler kısaca.
    5. 3-5 bölümlerde açıklandığı gibi PCR amplifikasyonu gerçekleştirin.
    6. Bir dizi Lissavirüse plazmid algılayarak iç içe PCR 'nin özgüllüğü ve hassasiyetini analiz edin.
  2. Belirlenmesi d yapılmasına l yok
    1. Kuduz virüs gerinim CVS-11 hücre kültürünün titresini 105,5 tcid50/ml 'ye ayarlayın (virüs titresini OIS kılavuzuna göre belirlenir)5.
    2. CVS-11 ' i n 5 10 kat seri seyreltme işlemini gerçekleştirin (hisse senedi çözümü 105,5 tcid50/ml) adımda açıklandığı gibi 6.1.4.
    3. 1-5 bölümlerde açıklandığı gibi tüm viral dillerin RNA ekstraksiyonu ve iç içe RT-PCR amplifikasyon prosedürlerini gerçekleştirin.
  3. Compar iSon en iç Içe RT-PCR "altın standardı" yağ ile
    1. Tüm klinik numuneleri iç içe RT-PCR ile sınayın ve sonra sonuçları FAT5 ve N gen sıralaması9ile onaylayın.
    2. SAS 9,1 ile istatistiksel analiz için normalleştirilmiş verileri kullanın. Tanı testlerinin istatistiksel karşılaştırması için Kappa testi ve McNemar 'ın Chi-squared testini kullanın (SAS komutu: proc FREQ; tablo/katılıyorum). Abinomial dağılım varsayarak güven aralıklarını hesaplayın.
  4. Bozulmuş numunelerin testinde etkinliğinin değerlendirilmesi
    1. 37 °C ' de kuduz köpeklerin iki teyit edilmiş klinik beyin dokusu örneğini açığa çıkarın.
    2. 37 °C ' de, iç içe RT-PCR, FAT ve MıT5' de her bir pozlama gününde iki numuneyi tahlil etme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

18 Lissavirüse türünün tespit edilmesi için yuvalanmış RT-PCR sonuçları Şekil 1' de gösterilir. Tüm PCR pozitif kontroller negatif kontrol hiçbir bant ile ikinci tur amplifikasyonlar ilk-ve 371 BP beklenen 845 BP gösterdi. Tüm 18 lyssaviruses beklenen 845 ve/veya 371 BP bantları, iç içe RT-PCR tüm 18 lyssaviruses algıladı gösteren üretilen. On altı lyssaviruses plazmids PCR iki turda verimli amplifikasyon vardı, ama iki, yani ARAV ve ıKOV, ya ilk veya ikinci tur PCR amplifikasyon vardı. Yöntemin hassasiyeti, Tablo 6' da gösterildiği gibi, 2,24 x 100 ile 2,24 x 105 molekül/μL arasında değişen sınırlar ile farklı Lissavirüse plazmidlerin algılanması ile değişmektedir. Bu farklılıklar, viral dizi çeşitliliği nedeniyle astar ve şablonlar arasındaki uyuşmazlıklarla ilişkilendirilebilir. Ayrıca, hücre kültüründe kuduz virüsü CVS-11 tespit duyarlılığı 102,5 tcid50/ml. oldu.

Klinik örneklerden toplam 9.624 beyin dokuları, FAT ile karşılaştırıldığında yuvalanmış RT-PCR tarafından test edildi ve sonuçlar Tablo 7' de özetlenmiştir, bu da Iç içe RT-PCR ' i k% 100 HASSASIYET (CI,% 97,75-% 100) olduğunu gösterir ve bir% 99,97 özgüllüğü (CI, 99,91% için 99,99%). İki yöntem arasındaki uygun% 99,07 oldu. İç içe RT-PCR tarafından pozitif ancak FAT tarafından negatif olan üç test yüksek derecede çürüme klinik malzemedir. Bu üç numune, N gen sıralaması ile RABV pozitif olarak doğrulandı.

37 °C ' de (protokolün adım 6.4.1) iki beyin numunelerinin algılanması içinde test performansının karşılaştırılması iç içe RT-PCR ' i k i, en az 17 gün süreyle bozulabilen beyin dokularında virüsü etkili bir şekilde algılayabileceğini belirtti. FAT tarafından sadece 7 gün ile karşılaştırıldığında zaman uzun süre ve MıT tarafından bile 1 gün. Bu sonuç, yuvalanmış RT-PCR ' i k ve MıT 'den daha fazla azaltılmış numunelerin algılanması konusunda daha duyarlıdır.

İç içe RT-PCR ' i daha fazla doğrulamak için Çin 'de 10 kuduz Laboratuvarı bir dizi numune üzerinde testler yapmaya davet edildi. Bunlardan sekiz laboratuar, RABV pozitif ve negatif numuneler de dahil olmak üzere laboratuvarımızın 10 kör hayvan beyin dokularından oluşan bir dizi sağladı. Diğer iki laboratuar kendi örneklerini kullandı. Tüm numuneler daha önce FAT tarafından arşivlendi ve doğrulandı. Tüm 10 laboratuvarlar, iç içe RT-PCR tarafından% 100 oranında FAT 'e uygun olarak, yanlış negatifleri veya yanlış pozitifler (Tablo 8) ile elde edilen sonuçları, YUVALANMıŞ RT-PCR ' i yüksek bir özgüllük ve yeniden Üretilebilirlik olduğunu gösteren.

Bileşen Reaksiyon başına hacim (μL)
dNTPs (2,5 mM) 4
Rasgele astar (50 μM) 1,5
Oligo (dT) 15 (50 μM) 0,5
M-MLV tampon (5x) 4
M-MLV ters transkriptaz (200 IU/μL) 1
RNasin (40 ıU/μL) 1
Toplam hacim 12

Tablo 1: Reaktifler cDNA Synthesis için Ters transkripsiyon .

Bileşen Reaksiyon başına hacim (μL)
dNTPs (10 mM) 1
Eski Taq (5 U/μL) 0,3
Taq tampon (10X) 5
N127 (20 μM) 1
N829 (20 μM) 1
dd H2O 39,7
Toplam hacim 48

Tablo 2: Reaktifler olan ilk yuvarlak PCR.

Sıcaklık Zaman Döngü
94 °C derece 2 dk. 1
94 °C ' ye kadar 30 sn 35
56 °C ' ye kadar 30 sn 35
72 °C ' ye kadar 40 s 35
72 °C ' ye kadar 10 dak. 1
4 °C ' ye kadar

Tablo 3: C ikilik parametreleri ilk ve ikinci tur PCR.

Bileşen Reaksiyon başına hacim (μL)
dNTPs (10 mM) 1
Eski Taq (5 U/μL) 0,3
Taq tampon (10X) 5
N371F (20 μM) 1
N371R (20 μM) 1
dd H2O 39,7
Toplam hacim 48

Tablo 4: Reaktifler olan ikinci tur PCR.

Primer adı Şey Yön Sıra (5 '-3 ') Nüktiotid pozisyonu Ürün boyutu
N127 İlk turda PCR Ileri (ATGTAACN) -19 ~ 0 845bp basınç
N829 İlk turda PCR Ters (GCCCTGGTTCGAACATTCT) 807 ~ 825 845bp basınç
N371F İkinci yuvarlak PCR Ileri (Akdal) -6 ~ 15 371bp basınç
N371R İkinci yuvarlak PCR Ters Bu da ne? 345 ~ 367 371bp basınç

Tablo 5: Astar s equences ilk ve ikinci tur PCR . Dejenere üsleri: N (A/T/C/G), K (G/t), R (A/G), Y (C/T), WV (G/A/C).

Lyssavirus türleri Zorlanma Şablon Plasmid (moleküller/μL)
RABV GQ 918139.1 2,24 x 101
LBV EU 293110.1 2,24 x 102
MOKV makineleri KF 155005.1 2,24 x 101
DUVV EU 293119.1 2,24 x 101
EBLV-1 EF 157976.1 2,24 x 101
EBLV-2 KF 155004.1 2,24 x 101
ABLV GU 992312.1 2,24 x 100
(IRKV) NC_020809.1 2,24 x 101
WCBV NC_025377.1 2,24 x 101
ERMRE NC_025385.1 2,24 x 103
ARAV NC_020808.1 2,24 x 102
ŞıBV NC_025365.1 2,24 x 101
(BBLV) NC_025251.1 2,24 x 101
(IKOV) NC_018629.1 2,24 x 105
BIR NC_031955.1 2,24 x 103
(GBLV) NC_031988.1 2,24 x 105
KBLV MF 960865.1 2,24 x 101
(TWBLV) MF 472710.1 2,24 x 101

Tablo 6: Algılama sınırı iç Içe RT-PCR o f 18 l yssavirus es.

Standart Yöntem ve sonuç RT-nPCR
Pozitif
RT-nPCR
Negatif
Korelasyon (%)
Yağ Pozitif
Negatif
162
3
0
9459
99,07

Tablo 7: Arasındaki korelasyon iç Içe RT-PCR ve FAT içinde belgili tanımlık klinik örneklerde RABVs tespiti.

Table 8
Tablo 8: İç Içe RT-PCR tarafından doğrulama sonuçları 10 laboratuvar.

Figure 1
Şekil 1 : 18 algılama Lissavirüse ları tarafından iç Içe RT-PCR. (A) ilk yuvarlak PCR sonucu. (B) ikinci tur PCR sonucu. M = DL 2000 DNA işaretçisi. Şeritleri 1 – 18 = RABV, LBV, MOKV, DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, ARAV, ıKOV, BBLV, GBLV, ıRKV, KHUV, LLEBV, SHIBV, WCBV, KBLV, ve TWBLV, sırasıyla. Şerit 19 = PCR pozitif kontrol; şerit 20 = ilk yuvarlak PCR için negatif kontrol; Şerit 21 = ikinci yuvarlak PCR için negatif kontrol. Pozitif bir PCR sonucu ikinci yuvarlak PCR içinde ilk turda 845 BP ve 371 BP bir bant gösterir. Arav 'ın amplikon ilk turda görünmez, ama ikinci yuvarlak PCR görünür (şerit 8), ıkov amplikon ilk turda görünür iken, ama ikinci yuvarlak PCR görünmez (şerit 9). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2 : Primer dizileriyle karşılaştırma 18 Lissavirüse türünün primer bölgelerinde diferansiyel nükleotidler gösterir. N127 ve N829 dış astar, N371F ve N371R iç astar vardı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Şu anda, rabv Çin 'de neredeyse tüm insan ve hayvan kuduz sorumlu büyük bir Lissavirüse, yanı sıra diğer ülkelerde. Buna ek olarak, bir ıRKV varyantı ilk olarak 201210' da Northeast China 'Daki Jilin eyaletinde Murina leucogaster bat 'tan tespit edildi ve 201711' de Liaoning eyaletinde bir köpeğin ölümüne neden olduğu bildirilmiştir. En son, bir roman Lyssavirus, TWBLV, Ayrıca Tayvan, Çin 'de bir Japon Pipistrelle yarasa tespit edildi 2017. Bu sonuçlar diğer lyssaviruses etkili tespiti de dökülen-Over bat-kaynaklı lyssaviruses önlemek için önemli olduğunu düşündürmektedir. Bu bağlamda, Pan-Lissavirüse iç içe RT-PCR en çok kullanılan N gen bölge hedefleme çok yararlı bir araçtır, ve sonuçları etkili tüm 16 ictv onaylı ve şimdiye kadar tanımlanan iki roman Lissavirüse türlerinin algılayabilir göstermiştir, dahil genetik farklı rabvs ve Çin 'de ırkv (veri ırkv gerinim gösterilmez). Ancak, ARAV 'ın sadece ikinci tur PCR astar tarafından tespit edildiğini, ıKOV 'un sadece ilk yuvarlak PCR astarları tarafından tespit edildiğini de dikkate almak ilginçtir (Şekil 1). Bu tutarsızlık nedenini incelemek için, dört primer bölgedeki tüm 18 lyssavirüslerin sıralı karşılaştırması, ilk yuvarlak PCR 'de dış primer N829 3 ' End nükrenotid T ve 3 ' de ikinci nüklerotid T 'in olduğu gösterilen sonuçlar ile gerçekleştirildi. İkinci yuvarlak PCR 'de iç primer N371F sonu, ARAV (G) ve ıKOV (A) (Şekil 2) ' nin ilgili pozisyonlarına aynı değildi. Bir kez T primer N829 ARAV G ve T astar N371F A IKOV değiştirildi, her iki virüs başarıyla PCR (gösterilmez veri) tespit edildi değiştirildi. Bu sonuç, hedef bölgenin başarılı amplifikasyonunda 3 ' End veya yakın uç nükleotidler önemli rolünü gösterir.

Klinik tanı ve gözetim için kuduz virüsü tespiti yönteminin hassasiyet ve özgüllüğü değerlendirmek için, 9.624 hayvan beyin dokusu örnekleri son 10 yıl içinde FAT ve yuvalanmış RT-PCR tarafından paralel olarak test edildi. 165 numunelerin iç içe RT-PCR tarafından pozitif kuduz test, 162 FAT tarafından pozitif olarak tespit edildi; Bu nedenle, iki yöntem% 99,07 uygun gösterir. Bu 165 örneklerde algılanan rabvs Asya, kutup ile ilgili farklı sırlarda sınıflandırılmış olabilir ve Cosmopolitan12,13, iç içe RT-PCR rabvs çeşitli genetik clades kapsayabilir gösteren yutarlar. Üç yüksek çürüme klinik numuneler iç içe RT-PCR tarafından pozitif test edildi ama FAT tarafından negatif. Bu sonuç, temsili sonuçlar bölümünde gösterildiği gibi iki bozulmuş numuneyi test etme etkinliğinin değerlendirilmesi ile tutarlı olup, iç içe RT-PCR ' i yüksek derecede çürümüş örneklerde virüslerin algılanması sırasında FAT 'den daha hassas olduğunu gösterir.

İç içe RT-PCR ' i k i performans, Fransız gıda, çevre ve Iş Sağlığı & Güvenliği Ajansı 'nda kuduz AB referans laboratuvarı tarafından düzenlenen Uluslararası Laboratuar karşılaştırma testi 'ne (ıLCT) katılım ile daha da doğrulandı ( ANSES) 2010, 12 numune kümesi kullanarak (her biri RABV, EBLV-1, EBLV-2 ve ABLV pozitif kontroller, bir negatif kontrol ve yedi kör numune). Test, iç içe RT-PCR başarıyla tüm lyssaviruses ile bir 100% tutarlılık belirledi. 2018 yılında, yöntem Çin hayvan sağlığı Ulusal Teknik Standardizasyon Komitesi tarafından Rabies teşhis (GB/T36789-2018) Ulusal standardı olarak onaylandı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Çalışma ulusal anahtar araştırma ve geliştirme planı (Grant No. 2016YFD0500401) ve Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (Grant No. 31302043) tarafından destekleniyordu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 × TAE Various Various
6 × loading buffer TakaRa 9156
Agarose US Everbright® Inc A-2015-100g
ddH2O Various Various
DL 2,000 Marker Takara 3427A
dNTPs (10 mM) TakaRa 4019
dNTPs (2.5 mM) TakaRa 4030
Electrophoresis System Tanon EPS300
Ex-Taq (5 U/μL) TakaRa RR001
Gel Imaging System UVITEC Fire Reader
Microcentifuge tubes Various Various
M-MLV reverse transcriptase (200 IU/µL) TakaRa 2641A 
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermoscientific ND1000
Oligo (dT)15 TakaRa 3805
PCR Machine BIO-RAD T100
PCR Tubes Various Various
Phusion High-Fidelity DNA Polymearase NEW ENGLAND BioLabs M0530S
Pipettors Various Various
Random Primer TakaRa 3801
RNase Inhibitor (40 IU/µL) TakaRa 2313A
RNase-free ddH2O TakaRa 9102
Taq Buffer (10×) TakaRa 9152A
Tips Various Various
Vortex mixer Various Various

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hemachudha, T., Laothamatas, J., Rupprecht, C. E. Human rabies: a disease of complex neuropathogenetic mechanisms and diagnostic challenges. Lancet Neurology. 1, (2), 101-109 (2002).
  2. Amarasinghe, G. K., Arechiga Ceballos, N. G. Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2018. Archives of Virology. 163, (8), 2283-2294 (2018).
  3. Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland. Transboundary and Emerging Diseases. 65, (3), 593-596 (2018).
  4. Hu, S. C., et al. Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 24, (4), 782-785 (2018).
  5. World Organization for Animal Health (OIE). Chapter 2.1.17 - Rabies (infection with rabies virus and other lyssaviruses). Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2018. Available from: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_RABIES.pdf 2-14 (2018).
  6. Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. Laboratory techniques in rabies. World Health Organization. 74-195 (2018).
  7. Mani, R. S., et al. Utility of real-time Taqman PCR for antemortem and postmortem diagnosis of human rabies. Journal of Medical Virology. 86, (10), 1804-1812 (2014).
  8. Fooks, A. R., et al. Emerging technologies for the detection of rabies virus: challenges and hopes in the 21st century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 3, (9), 530 (2009).
  9. Jiang, Y., et al. An outbreak of pig rabies in Hunan province, China. Epidemiology and Infection. 136, (4), 504-508 (2008).
  10. Liu, Y., et al. Analysis of the complete genome of the first Irkut virus isolate from China: comparison across the Lyssavirus genus. Molecular Phylogenetics and Evolution. 69, (3), 687-693 (2013).
  11. Chen, T., et al. Possible Transmission of Irkut Virus from Dogs to Humans. Biomedical and Environmental Sciences. 31, (2), 146-148 (2018).
  12. Feng, Y., et al. Disease outbreaks caused by steppe-type rabies viruses in China. Epidemiology and Infection. 143, (6), 1287-1291 (2015).
  13. Feng, Y., et al. Livestock rabies outbreaks in Shanxi province, China. Archives of Virology. 161, (10), 2851-2854 (2016).
Lyssaviruses tespiti için evrensel Iç Içe Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu değerlendirilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Y., Xu, W., Guo, H., Gong, W., He, B., Tu, Z., Tu, C., Feng, Y. Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses. J. Vis. Exp. (147), e59428, doi:10.3791/59428 (2019).More

Wang, Y., Xu, W., Guo, H., Gong, W., He, B., Tu, Z., Tu, C., Feng, Y. Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses. J. Vis. Exp. (147), e59428, doi:10.3791/59428 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter