Summary
本文为研究右心室故障机制提供了一种有用的方法。利用内部制造的手术器械,建立了一种更方便、更高效的肺动脉收缩方法。此外,还提供了通过超声心动图和导管法来评估该方法质量的方法。
Abstract
右心室衰竭(RVF)的机制需要澄清,因为裂谷热的独特性、高发病率、高死亡率和耐火性。以前的老鼠模型模仿裂谷热进展已经描述。与大鼠相比,老鼠更容易接触、经济、广泛地用于动物实验。我们开发了肺动脉收缩(PAC)方法,该方法包括将小鼠的肺干带以诱导右心室(RV)肥大。设计了一种特殊的手术闩锁针,便于主动脉和肺干分离。在我们的实验中,使用这种制造的闩锁针降低了动脉瘤的风险,并将手术成功率提高到90%。我们使用不同的填充针直径来精确创建定量收缩,从而引起不同程度的RV肥大。我们通过评估PA的血流速度来量化收缩的程度,这是通过非侵入性转胸超声心动图测量的。RV功能在手术后8周内通过右心导管精确评估。室内制造的手术器械由常用材料组成,使用易于掌握的简单工艺。因此,此处描述的 PAC 方法很容易使用实验室中制造的仪器进行模仿,并可广泛应用于其他实验室。本研究提出了一种经过改进的PAC方法,其成功率高于其他型号,8周手术后存活率为97.8%。这种PAC方法为研究裂谷热机制提供了一种有用的技术,有助于增加对裂谷热的理解。
Introduction
RV 功能障碍 (RVD), 定义为异常 RV 结构或功能的证据, 与不良的临床结果相关.裂谷热作为RV功能的终点,是一种临床综合征,其征期RVD1会导致心力衰竭的体征和症状。左心室(LV)衰竭和裂谷热在结构和生理功能上存在差异,病理生理机制不同。已报告裂谷热中的一些独立病理生理学机制,包括过度表达β2-肾上腺素受体信号2、炎症3、横向小管重塑和Ca2+处理功能障碍4.
裂谷热可能由 RV 的体积或压力过载引起。以前的动物模型已经使用SU5416(血管内皮生长因子受体的一种强效和选择性抑制剂)结合缺氧(SuHx)5,6或单克罗塔线7诱导肺高血压,这导致裂谷热继发于肺血管疾病2。进行这些研究的研究人员专注于血管,而不是裂谷热的病理进展。此外,单克罗酮具有心脏外效应,不能精确代表心脏病。其他型号已经使用动脉分流诱导体积过载和裂谷热8。然而,这种手术很难进行,不适合小鼠,他们需要较长的诱导期来生产裂谷热。
使用带状夹的鼠PAC模型也存在9,10。与大鼠相比,小鼠作为心脏病的动物模型具有许多优点,如繁殖方便、使用范围更广、成本降低、基因修饰等优点。然而,带带夹的直径通常从0.5毫米到1.0毫米,这对小鼠9来说太大了。此外,带带夹很难在其他实验室中产生、模仿和普及。
我们提供一个协议,以开发一个基于报告的研究的修改生殖裂谷热小鼠模型,它使用PAC来模仿法洛特和努南综合征或其他肺动脉高血压疾病的四科病12,13, 14,15,16,17,18,19。这种PAC方法是通过使用内部制成的闩锁和填充针对小鼠的肺干进行粘接,以控制收缩程度而创建的。闩锁针由 90° 弯曲的注射注射器制成,其编织的丝线缝合通过注射器。针头由常用材料制成,使用易于掌握的工艺。衬垫针与仪表针弯曲 120°。根据小鼠的重量(20-35 克),使用不同直径(0.6-0.8 mm)的填充针。此外,我们还建立了评估标准,通过超声心动图和右心导管测定来确定裂谷热模型的稳定性和质量。我们使用老鼠作为模型动物,因为它们在其他实验中广泛使用。实验室生产的针头易于复制,可广泛应用于其他实验室。本研究为研究人员研究裂谷热机理提供了一种很好的方法。
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Protocol
所有程序均按照动物研究机构准则进行,该指南符合美国国家卫生研究院出版的《实验室动物护理和使用指南》(NIH出版物第85-23号,1996年修订)。C57BL/6雄性小鼠(8-10周大,重20-25克)由南方医科大学动物中心提供。到达后,老鼠被安置在12/12小时的暗/光周期下,有足够的食物和水。
1. 手术器械的准备和针头的制造
- 准备无菌手术器械(图1A),6-0编织丝缝合线(图1B[a])用于结扎,5-0尼龙缝合用于切口闭合(图1B[b])。
- 通过从 1 mL 注射注射器拆解的 25 G 针头,将 6-0 编织的丝线缝合(图 1B[a])。然后,用止血钳将针90°曲线,使锁针(图1C[a])。将 22 G 针 120° 曲线(图 1C (b)))以制作填充针。
2. 手术准备
- 手术前对所有手术器械进行高压灭菌。将加热垫调节到 37°C。用木兰素(5毫克/千克)和氯胺酮(100毫克/千克)的混合物给小鼠麻醉,以缓解疼痛。将小鼠放在单个框中,等待麻醉剂的发病。
注意:也建议使用1.5%的胶质进行吸入麻醉。 - 监测踏板退出反射消失麻醉的充分性。用缝合线固定切口,用胶带固定腿,使小鼠保持在加热垫上的上等位置。再次检查反射,以确保麻醉的深度。
- 在颈部的皮肤上涂抹脱毛膏,至西波德过程。用碘消毒区域,然后用75%的酒精消毒。
- 执行内切管插管。
- 调整动物小通气器(图1D)参数,将呼吸速率设置为150/分钟,将潮汐量设置为300μL。
- 使用尖钳稍微拉出舌头,用实验室制作的铲子图1C[c])抬起下颌骨,以暴露淋巴,并轻轻地插入实验室制作的气管管管(图1C[d]),而冷光源是直接在喉上。
- 连接管子和呼吸机,以验证管状是否已插入气管。如果导管插入正确,请使用胶带固定气管。
3. 外科
- 打开箱子
- 用眼科剪刀在皮肤上切开一个与第二根肋骨平行的切口,长度约10毫米。确保切口从胸腔角度开始,并端在左前线。通过从胸腔角度计算肋骨,确定第二个间间距。
- 分离和切割胸腔主要和胸腔是小肌肉用剪刀和肘钳高于第二个成本空间,以暴露这个空间。
注意:也建议直接分开,动员,并移动胸肌向右和颅骨。 - 用肘钳钝地穿透第二个间空间,打开这个空间。然后,直截了当地分离胸腺和胸腺,直到肺躯干可见。
- 收缩肺动脉。
- 用肘钳将肺躯干和上升主动脉用肘钳钝地分开。用锁针穿过肺干和上升主动脉之间的结缔组织缝合。
- 将衬垫针(参见步骤 1.2)放在肺干主上,然后用 6-0 编织的丝线缝合肺干,并用衬垫针将肺干条拉上。观察肺锥填充后立即取出衬垫针,并切下缝合线两端。
- 观察肺结物的填充,以评估是否存在收缩。再次评估动物的反射,以确保结扎成功。
注:按照上述所有步骤执行假手术,但收缩除外。
- 用5-0尼龙缝合线关闭胸部和皮肤。用75%的酒精再次消毒皮肤。
- 注射0.5 mL的盐水皮下,以取代手术过程中丢失的任何液体。将鼠标与加热垫分开放在笼子里,以促进恢复。当意识返回时,将老鼠送回12/12小时光/暗循环室的笼子里。在接下来的3天里,通过饮用水给小鼠治疗丁丙诺啡。
- 在第一周每天监测小鼠2次,以检测任何愈合不足、行动不便或体重减轻的迹象,特别注意胸腔切除术伤口的愈合。
4. 手术后RV功能的超声心动图评估
注:手术后3天可检测到超声心动图变化。
- 通过吸入用3%的异常鲁兰麻醉小鼠,用1.5%的亚曲尼维持麻醉深度。将鼠标固定在平台上,将其爪子用胶带固定在电极上,并将动物保持在一个苏盘位置。通过将单反酶的浓度调整在1.5%至2.5%之间,使小鼠的心率保持在450-550次/分钟之间。
- 用脱毛霜去除小鼠胸部的头发,并在胸部皮肤上涂上超声波凝胶。
- 使用 30 MHz 探头评估肺干收缩。
- 相对于左护边线,使探头逆时针保持 30° 方向,同时沿波道方向定位切口。在 B 模式下调节y轴和x轴,直到斜面阀、主塔和 LV 室清晰可见。
- 将探头在y轴上旋转 30°-40°,朝胸部旋转。调节y轴和x轴,直到肺锥形清晰可见。
- 将光标放在肺阀传单的尖端,以测量峰值流速。使用"颜色多普勒"模式,按"颜色",后跟PW,然后移动光标,将 PW 虚线与血流方向平行。
- 测量肺动脉峰值速度。使用Cine 存储和帧存储保存数据和图像。
- 使用 30 MHz 探头评估 RV 参数。
- 调整焊盘的左侧,使其低于右侧。保持探头沿右前线向视距方向为 30°,切口指向波道方向。调节y轴和x轴,直到 RV 清晰显示。
- 按M 模式2x 以显示指示灯线。测量 RV 室尺寸、小数缩短和 RV 壁厚。使用Cine 存储和帧存储保存数据和图像。
- 停止黄曲吸入,让小鼠恢复意识,然后将动物送回笼子,在12小时的光/暗循环室。
5. 用于评估 RV 功能的右心导管
注:使用1.0F导管和监测系统,在手术后8周进行右心导管插入,以评估RV功能。
- 高压灭菌所有手术器械。通过腹内注射对动物进行麻醉,混合使用木兰素(5毫克/千克)和氯胺酮(100毫克/千克)。
- 踏板退出反射消失后,将鼠标固定在平台上,将其爪子带到电极上,并保持鼠标处于上等位置。用脱毛霜去除手术区的头发。
- 用75%的酒精对手术区的皮肤进行消毒。使用尖钳,稍微拉出舌头,用室内用铲子抬起下颌,以暴露淋巴,并轻轻地插入内通过淋巴的气管管,而冷光源被定向在喉部。使用呼吸机 (图 1E) 协助通风.
- 通过用眼剪刀和钳子的隔膜,通过西风处理下方的1.5厘米双边切口打开胸腔。用眼科剪刀切开隔膜和肋骨,露出心脏。用23G针穿透RV免费墙,取出针头;用棉签轻轻按压刺穿点,以阻止任何出血。用导管尖刺穿心室,穿过伤口。
注:也建议通过右颈静脉6进行右心导管插入。当导管尖端位于心室时,监视器将显示 RV 压力曲线。 - 当曲线稳定时,记录 RV 收缩压、RV 端舒张压、RV dP/dt、小鼠心率和 RV 指数时间松弛时间常数 (Tau) 10 分钟。使用该软件,单击"选择",然后单击"分析"。
- 调节导管尖端朝向 RV 流出区。录制完成后,将导管拉出。测量完成后,将导管置于盐水中。
- 通过注射五巴比妥钠150毫克/千克,然后宫颈脱位,使小鼠安乐死。然后,收获心脏、肺和头骨,用于进行地貌学和分子生物学分析。
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Representative Results
在这项研究中,小鼠被随机分配到PAC组(n = 9)或假操作组(n = 10)。在手术后1、4和8周进行超声心动图。手术后八周,在最后一次超声心动图和导管化评估后,小鼠被安乐死,他们的心脏被收获进行形态学和组织学评估。
肺躯干收缩引起RV肥大(图2)。与假组相比,从半身长轴视图中,更高的峰值速度(图2A、C)、更大的压力梯度(图2A、D)和更大的RV壁厚(图2B、E)均为在PAC组手术后8周获得。此外,与手术后8周的假组相比,PAC组中RV的收缩功能(RV喷射分数和RV分数缩短)显著减少(图2F,G)。
我们发现RV收缩和舒张功能在PAC后8周受损(图3A-E)。PAC组在systole和二角中具有较高的RV压力,与假组相比,PAC组的收缩率指数降低。在 PAC 组中,RV Tau 比在假组中更大,RV dP/dt 也比在假组中的 RV dP/dt 大。结果表明,在8周肺动脉带带后,小鼠发生RV功能障碍。当我们在RV中进行侵入性血液动力学测试时,心率,这是使用生理记录系统确定,在导管监测前后保持稳定(图3F)。
由PAC诱导的RV改造如图4所示。与假组相比,RV尺寸显著扩大,PAC组中的RV重量更高。表明RV肥大程度的因素,如心脏重量/体重比,RV/(左心室+隔膜)和RV/滴管长度,在PAC8周后比假组大于。此外,组织学检查表明,在PAC组,心脏纤维化和心肌细胞覆盖的区域比假组更大。总之,我们开发了一种生殖性、廉价性和易裂谷热模型,并建立了评价标准,以成功评价裂谷热模型。
图 1:手术器械、内部制造的工具和PAC程序所需的材料。(A) 用于PAC手术的手术器械.(B) (a) 6-0 医用编织丝线和 (b) 5-0 医用尼龙缝合线.(C) 内部制造的工具.(a) 锁紧针.(b) 填充针.(c) 室内制造的铲子.(d) 内切管插管。 (D).动物微型呼吸机。(E) ALC-V8S 呼吸机.请点击此处查看此图的较大版本。
图 2:肺躯干超声成像和假鼠和PAC小鼠的RV功能的代表性结果。(A) 8周后小鼠肺干科的颜色和脉冲波多普勒成像。红色标记表示流向探针的血流;蓝色标记表示探针向后流动。(B) 8周后,假鼠和PAC小鼠RV的B模和M模超声成像。(a) 右心室.(b) 左心室.(C) 房车峰值速度 PLAX(V)、( D ) 压力梯度 (压力梯度 = 4 x V2) 和 (E) 房车壁壁厚度从半截面长轴视图在 8 周后显著增加。(F) RV短轴缩短率 (RVFS) 在 8 周后显著降低。(G) RV喷射分数 (RVEF) 在 8 周后显著减少。对于面板C-G,=P < 0.01 vs. 假操作(pac组中的n = 9,在假组中 n = 10)。PAC = 肺动脉收缩。数据以均值 = SEM 形式呈现。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3:在手术后8周,接受PAC或假手术的小鼠RV热力学的代表性结果。(A) 手术后8周,假和PAC小鼠的RVP和RV dP/dt代表曲线。(B) 右心室收缩压 (RVSBP) 和右心室端舒张压力 (RVEDP)。(C) RV 最大值和最小 dP/dt。(D) RV Tau.(E) 收缩指数.(F) 心率.RVP = 右心室压力;RVSBP = 右心室收缩压;RVEDP = 右心室端裂压;Tau = 指数时间恒定的放松;最大和最小 dp/dt = 右心室压力的最大和最小上升和下降;PAC = 肺动脉收缩。对于面板B-F ,n = PAC 组中的 9,以及沙姆组中的n = 10。•P < 0.01 与虚假操作。数据以均值 = SEM 形式呈现。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4:小鼠肺动脉收缩导致8周后RV重塑。(A) 整个心脏的代表图像(刻度杆 = 3 mm)。(a) 右中庭,红色箭头:肺动脉躯干连接。(B) 心脏重量/体重比 (HW/BW)。(C) 右心室质量与左心室质量加隔膜质量(RV/[LV[S])的比率。(D) 右心室质量与胆囊长度(RV/TL)的比率。对于面板B-D, n = 9 在 PAC 组中, n = 10 在假组.•P < 0.01 与虚假操作。(E) 心脏横截面沾染血氧林-欧素的代表性图像(第一行:刻度杆 = 2 mm;第二行:刻度杆 = 50 μm)。(F) 代表马森染色的图像,每组心肌纤维化。刻度条 = 100 μm。对于面板E和F,n = 每个组中的 4。 •P < 0.01 与假组。RV = 右心室;PAC = 肺动脉收缩。RV/[LV[S] = 右心室质量与左心室质量加隔膜质量的比率。数据以均值 = SEM 形式呈现。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
RV填充压力的病理增加导致隔膜向左移动,从而改变LV几何形状21。这些变化导致心脏输出和LV弹出分数(LVEF)的减少,这可能导致循环系统22的血液动力学紊乱。因此,为研究裂谷热机制提供一个高效、稳定、经济的模型是有价值的。
我们使用内部制造的闩锁和衬垫针,开发出一种更有效、更可重复的 PAC 方法。内部制造的闩锁可以更容易地分离主动脉和肺干,从而降低动脉出血的风险,提高手术成功率。通过选择不同直径的衬垫针,我们诱导了不同程度的RV肥大。
尽管此处描述的肺干带的一般程序与前几份报告4、9、10、14、15中所述类似,但我们对手术器械。因此,我们降低了手术难度,缩短了手术时间,提高了手术成功率。我们使用的填充针的直径从0.6毫米到0.8毫米不等,这些直径只适合小鼠体重在20克至35克之间。在大鼠中,使用填充针(0.6-0.8毫米)可能导致急性裂谷热和死亡。此外,如果小鼠重量小于 20 g,填充针(0.6-0.8 mm)可能不容易导致 RVD。因此,应根据动物的重量选择正确的衬套针直径。
肺动脉高血压(PAH)通常是通过心底注射血管内皮生长因子受体抑制剂SU5416在缺氧环境中喂养超过3周23,24,25,26,27,28.这些条件模拟慢性缺血和肺动脉缺氧的病理生理学过程,诱发PAH和肺动脉纤维化。然而,RV改造,肥大,或裂谷热需要超过12周诱导慢性缺氧在这些模型。此外,SU5416和缺氧治疗可能会影响其他器官。此外,需要昂贵的机器来创造低氧环境。因此,需要更快、更高效的裂谷热模型。Reddy等人报告了一种RV改造方法,将前两个肺瓣膜传单13套。而不是使用显微镜和昂贵的手术血管夹29,我们使用锁针和不同类型的填充针内部,以精确创建一个定量收缩,以及评估血流速度超声 心动 图。
此外,内部制成的闩锁和衬垫针也用于诱导小鼠的横向主动脉收缩(TAC)。内部制造的闩锁也可用于诱导大鼠的PAC或TAC。在大血管的转位过程中,LV没有遇到足够的阻力,因此需要通过应用肺动脉收缩来为矫正手术做准备30,31加强。我们提供的PAC方法可以导致肺动脉阻力升高,这将有助于研究潜在的机制。在心脏移植设置中,供体RV可能严重暴露于接受者肺动脉阻力升高,导致RV失败。这里介绍的PAC方法有助于研究心脏后移植并发症32、33和先天性心脏病34。
PAC 方法有一些限制。首先,肺干周围结扎引起的RVD不能模仿PAH5、7中的RVD。第二,PAC导致RV后载荷的突然增加,这不同于PAH9、19肺血管阻力的逐渐增加。
与这里介绍的结果一致,以前的报告表明,肺瓣峰值速度、RV壁厚和RV舒张内径在超声心动图测试下显著增加,表明成功收缩和肥大的RV13,35。增加的RV压力、RV dP/dt和收缩指数表明RVF的发展和RV函数36的补偿期。最后,演示了两种新型实验室制造仪器的应用,以廉价、方便的方式建立RVD。我们使用非侵入性超声心动图技术和侵入性右心导管来评估裂谷热方法的质量。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家自然科学基金(81570464,81770271;廖博士)和广州市科技规划项目(201804020083)(向廖博士)的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ALC-V8S ventilator | SHANGHAI ALCOTT BIOTECH CO | ALC-V8S | Assist ventilation |
| Animal Mini Ventilator | Haverd | Type 845 | Assist ventilation |
| Animal ultrasound system VEVO2100 | Visual Sonic | VEVO2100 | Echocardiography |
| Cold light illuminator | Olympus | ILD-2 | Light |
| Heat pad- thermostatic surgical system (ALC-HTP-S1) | SHANGHAI ALCOTT BIOTECH CO | ALC-HTP-S1 | Heating |
| Isoflurane | RWD life science | R510-22 | Inhalant anaesthesia |
| Matrx VIP 3000 Isofurane Vaporizer | Midmark Corporation | VIP 3000 | Anesthetization |
| Medical braided silk suture (6-0) | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co. | 6-0 | Ligation |
| Medical nylon suture (5-0) | Ningbo Medical Needle Co. | 5-0 | Suture |
| Millar Catheter (1.0 F) | AD instruments | 1.0F | For right heart catheterization |
| Pentobarbital sodium salt | Merck | 25MG | Anesthetization |
| PowerLab multi-Directional physiological Recording System | AD instruments | 4/35 | Record the result of right heart catheterization |
| Precision electronic balance | Denver Instrument | TB-114 | Weighing sensor |
| Self-made latch needle | Separate the aorta and pulmonary trunk | ||
| Self-made padding needle | Constriction | ||
| Self-made tracheal intubation | Tracheal intubation | ||
| Small animal microsurgery equipment | Napox | MA-65 | Surgical instruments |
| Transmission Gel | Guang Gong pai | 250ML | Echocardiography |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benchiser | RQ/B 33 Type 2 | Remove hair of mice |
| Vertical automatic electrothermal pressure steam sterilizer | Hefei Huatai Medical Equipment Co. | LX-B50L | Auto clean the surgical instruments |
| Vertical small animal surgery microscope | Yihua Optical Instrument | Y-HX-4A | For right heart catheterization |
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