Summary
هنا، نقدم بروتوكول حذف exon23 المستندة إلى Cas9 لاستعادة التعبير dystrophin في iPSC من DMDmdx الخلايا الليفية الجلدية المشتقة من الماوس وتميز مباشرة iPSCs في خلايا ذرية myogenic (MPC) باستخدام نظام تنشيط تيت أون MyoD.
Abstract
ضمور العضلات دوشين (DMD) هو مرض العضلات التدريجي الحاد الناجم عن الطفرات في جين dystrophin، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى استنفاد خلايا ذرية العضلات. تجميعها بانتظام بين متباعدة قصيرة تكرار باليندروميك / كريسبر المرتبطة 9 (CRISPR / Cas9) تحرير الجينات لديه القدرة على استعادة التعبير عن جين dystrophin. يمكن للخلايا الجذعية متعددة القوى المستحثة ذاتيًا (iPSCs) التي تستمد خلايا العضلات (MPC) تجديد تجمع الخلايا الجذعية/السلفية وإصلاح الأضرار ومنع حدوث المزيد من المضاعفات في DMD دون التسبب في استجابة مناعية. في هذه الدراسة، نقدم مزيج من كريسبر / كاس9 والتكنولوجيات iPSC غير المتكاملة للحصول على الذرية العضلات مع التعبير البروتين dystrophin تعافى. باختصار، نستخدم متجه Sendai غير متكامل لإنشاء خط iPSC من الخلايا الليفية الجلدية من الفئرانMdx DMD. ثم نستخدم استراتيجية الحذف CRISPR/Cas9 لاستعادة التعبير dystrophin من خلال نهاية غير متجانسة الانضمام إلى الجين dystrophin إعادة صياغة. بعد التحقق من استنفاد exon23 exon23 في ثلاث مستعمرات من 94 المستعمرات التي تم اختيارها iPSC، ونحن نميز iPSC في MPC عن طريق doxycycline (دوكس) التي يسببها التعبير MyoD، وهو عامل النسخ الرئيسي يلعب دورا هاما في تنظيم تمايز العضلات. تظهر نتائجنا جدوى استخدام استراتيجية حذف CRISPR/Cas9 لاستعادة التعبير عن عسر التحجر في MPC المشتقة من iPSC، والتي لديها إمكانات كبيرة لتطوير العلاجات المستقبلية لعلاج DMD.
Introduction
ضمور العضلات دوشين (DMD) هو واحد من الضمور العضلي الأكثر شيوعا ويتميز بعدم وجود dystrophin، مما يؤثر على 1 من حوالي 5000 الأولاد حديثي الولادة في جميع أنحاء العالم1. فقدان وظيفة الجينات dystrophin يؤدي إلى عيوب العضلات الهيكلية مما يؤدي إلى انحطاط myofibers التدريجي1,2. وقد تم اختبار فيروس المؤتلف المرتبطة بأدينو (rAAV) بوساطة نظام العلاج الجيني لاستعادة التعبير dystrophin وتحسين وظيفة العضلات، مثل استبدال الجينات باستخدام خلل التوتر الجزئي (μ-Dys). ومع ذلك، فإن نهج rAAV يتطلب حقن متكررة للحفاظ على التعبير عن البروتين الوظيفي3،4. لذلك، نحن بحاجة إلى استراتيجية التي يمكن أن توفر بشكل فعال ودائم استرداد التعبير الجيني dystrophin في المرضى الذين يعانون من DMD. الماوسDMD MDX، نموذج الماوس لDMD، لديه طفرة نقطة في exon 23 من الجينات dystrophin الذي يقدم codon إنهاء سابق لأوانه والنتائج في البروتين المقتطعة غير وظيفية تفتقر إلى C-محطة dystroglycan نطاق ملزم. أظهرت الدراسات الحديثة استخدام تكنولوجيا CRISPR/Cas9 لاستعادة التعبير الجيني dystrophin عن طريق تصحيح الجينات بدقة أو حذف الطارد اتّصال في الحيوانات الصغيرة والكبيرة5و6و7. أبلغ Long et al.8 عن طريقة تصحيح طفرة الجينات dystrophin في خط الجراثيم الماوس DMDMDX عن طريق إصلاح الموجهة من قبل علم الهولوجي (HDR) القائم على كريسبر / Cas9 تحرير الجينوم. وأفاد الرفاعي وآخرونأن rAAV يمكن أن يقتطع بكفاءة exon 23 متحولة في الفئران عسر التغذية. في هذه الدراسات، تم تصميم gRNAs في الإنترونات 20 و 23 للتسبب في فواصل الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل مرتين، والتي استعادت جزئيا التعبير dystrophin بعد إصلاح الحمض النووي عن طريق نهاية غير متجانسة الانضمام (NHEJ). حتى أكثر إثارة, Amoasii وآخرون10 ذكرت مؤخرا فعالية وجدوى rAAV بوساطة كريسبر تحرير الجينات في استعادة التعبير dystrophin في نماذج الكلاب, خطوة أساسية في التطبيق السريري في المستقبل.
DMD يسبب أيضا اضطرابات الخلايا الجذعية11. لتلف العضلات, الخلايا الجذعية العضلات السكنية تجديد خلايا العضلات الموت بعد تمايز العضلات. ومع ذلك، فإن دورات متتالية من الإصابة والإصلاح يؤدي إلى تقصير التيلوميرات في الخلايا الجذعية العضلات12، واستنفاد سابق لأوانه لتجمعات الخلايا الجذعية13،14. ولذلك، يمكن أن يكون مزيج من العلاج بالخلايا الجذعية الذاتية مع تحرير الجينوم لاستعادة التعبير dystrophin نهجا عمليا لعلاج DMD. توفر تقنية CRISPR/Cas9 إمكانية توليد الخلايا الجذعية متعددة القوى المستحثة (iPSC) التي تم تصحيحها وراثياً من أجل تجديد العضلات الوظيفي ومنع حدوث المزيد من المضاعفات في DMD دون التسبب في رفض المناعة. ومع ذلك، iPSCs لديها خطر تشكيل الورم، والتي يمكن تخفيفها من خلال تمايز iPSC في خلايا ذرية myogenic.
في هذا البروتوكول، ونحن نصف استخدام فيروس Sendai غير دمج لإعادة برمجة الخلايا الليفية الجلدية من الفئرانMdx DMD في iPSCs ومن ثم استعادة التعبير dystrophin عن طريق حذف الجينوم CRISPR /Cas9. بعد التحقق من حذف Exon23 في iPSC عن طريق علم الوراثة، قمنا بتمييز iPSC المصوبة الجينومية في الذرية الميجينية (MPC) عن طريق التمايز الماجينية المستحثة من قبل MyoD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أجريت جميع عمليات التعامل مع الحيوانات والعمليات الجراحية من خلال بروتوكول وافقت عليه اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة أوغوستا. تم تغذية الفئران النظام الغذائي القياسية والمياه الإعلان libitum.
1. عزل الخلايا الليفية الماوس الأولية من الفئرانMdx DMD الكبار
- القتل الرحيم الكبار DMDMDX الفئران (ذكر, 2 أشهر من العمر) من قبل CO2 الاختناق واستئصال الصدر وفقا لIACUC المعتمدة من قبل كلية الطب في جورجيا, جامعة أوغوستا. قطع الذيل مع مشرط معقمة في حالة معقمة تحت غطاء محرك السيارة laminar. شطف الذيل مع الإيثانول 70٪ لمدة 5 دقائق، ومن ثم يغسل مع محلول ة الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) في طبق 6 سم.
- قشر الجلد الذيل قبالة عن طريق شق حاد من القاعدة إلى طرف الذيل على طول الجلد الذيل، ومن ثم قشر بلطف قبالة الجلد الذيل مع ملاقط. قم بتحريك الجلد إلى حجم 1 مم3 باستخدام مشرط معقم ونقل أنسجة الجلد المفرومة إلى طبق 6 سم في الحد الأدنى من المتوسط الأساسي دولبكو / F12 لحم الخنزير (DMEM /F12) التي تحتوي على 0.1٪ كولاجيناز الرابع و 1 U / مل من ديسباس.
- هضم أنسجة الجلد في طبق الثقافة لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 5٪.
- معطف لوحة 6 جيدا مع فيبرونيكتين و الجيلاتين 0.2٪ (1 مل من فيبرونيكتين في 199 مل من الجيلاتين 0.2٪. جدول المواد) وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- فصل أنسجة الجلد المهضومة مع طرف الأنابيب 1 مل ونقل الأنسجة وsupernatant إلى أنبوب الطرد المركزي مخروطي 15 مل معقمة. الطرد المركزي في 217 × ز لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وتجاهل supernatant وإعادة تعليق بيليه في 1.5 مل من المتوسطة الليفية(جدول المواد).
- ثقافة الكريات بما في ذلك أنسجة الجلد هضمها غير مكتملة من الخطوة 1.5 على لوحة 6 جيدا المغلفة مع فيبرونيكتين و 0.2٪ الجيلاتين من الخطوة 1.4 في حاضنة 37 درجة مئوية، 5٪ CO2. استبدال المتوسطة 24 ساعة بعد الطلاء الأولي لإزالة الخلايا غير المرفقة، وتغيير المتوسطة كل 48 ساعة.
2. إعادة برمجة الخلايا الليفية الجلد الماوس في iPSCs
- قبل يومين من التحويل، هضم الخلايا الليفية الجلدية من الخطوة 1.6 مع حل مفرزة الخلية(جدول المواد)في حاضنة 37 درجة مئوية مع جو رطب من 5٪ CO2 لمدة 5 دقائق.
- عد الخلايا باستخدام مقياس الهيماسيومتر والطرد المركزي في 217 × ز لمدة 3 دقائق.
- خلايا البذور بكثافة 1−2 × 105 خلايا لكل بئر على لوحة 6 آبار وثقافة مع وسط ليفي(جدول المواد)في حاضنة 37 درجة مئوية مع جو رطب من 5٪ CO2.
- في يوم التحويل (اليوم 0)، تقدير الخلايا وحساب حجم كل فيروس المطلوبة للوصول إلى التعدد المستهدف للعدوى (وزارة الداخلية) من 5 و 5 و 3 (أي، KOS MOI = 5، HC-Myc MOI = 5، hKlf4 MOI = 3) وفقا للدليل التجاري.
- إذابة ثلاثة أنابيب سينداي في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 5−10 ثوان وأضف الأحجام المحسوبة لكل من أنابيب سينداي الثلاثة إلى 1 مل من وسط الليفي(جدول المواد).
- إزالة وسيطة الأورام الليفية من الخطوة 2.3 وإضافة خليط فيروس إعادة برمجة إلى الآبار التي تحتوي على الخلايا. حضانة الخلايا بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية مع جو رطب من 5٪ CO2.
- استبدال المتوسطة مع المتوسطة الليفية الطازجة 24 ساعة بعد transduction. ثقافة الخلايا لمدة أسبوع واحد مع تبادل المتوسطة كل يوم.
- حصاد الخلايا الليفية الماوس المصابة في اليوم 7 بعد transduction مع 0.05٪ تريبسين / EDTA ووضع هاعلى الأطباق التي كانت مغلفة سابقا مع فيبرونيكتين و 0.2٪ الجيلاتين.
- ثقافة الخلايا الليفية الماوس المصابة من الخطوة 2.6 مع كامل الماوس الخلايا الجذعية الجنينية (ES) متوسط النمو(جدول المواد)في حاضنة 37 درجة مئوية مع جو رطب من 5٪ CO2 وتغيير المتوسطة يوميا.
- من اليوم الثامن، لاحظ لوحة تحت المجهر المقلوب كل يوم لتحديد مظهر كتل الخلية مع مورفولوجيا الماوس ES.
3. باستخدام الفوسفاتيز القلوية بقعة حية وتدفق قياس السيتومترية لتحديد كفاءة إعادة البرمجة
- قم بإزالة الوسائط الثقافية من كل بئر واشطفها بـ DMEM/F-12 لمدة 2-3 دقائق.
- تطبيق 2 مل من 1X الفوسفاتيز القلوية (AP) يعيش وصمة عار حل العمل (1:500 تخفيف في DMEM / F-12) على الخلايا الملتصقة، واحتضان في حاضنة 37 درجة مئوية مع جو رطب من 5٪ CO2 لمدة 30 دقيقة.
- يستنشق وصمة عار AP الحية وغسل مرتين مع PBS لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- هضم الخلايا مع حل مفرزة الخلية(جدول المواد)في حاضنة 37 درجة مئوية مع جو رطب من 5٪ CO2 لمدة 5 دقائق.
4. اختيار وحصاد الخلايا الشبيهة ES
- فحص المستعمرات من الخطوة 2.8 تحت المجهر المقلوب.
- وضع علامة على المستعمرات في الجزء السفلي من الطبق مع علامة كائن التحبير الذاتي.
- تطبيق حلقات الاستنساخ مدهون لتغطية مستعمرات الخلايا ملحوظ. إضافة 100 ميكرولتر من 0.05٪ تريبسين / EDTA إلى كل حلقة استنساخ في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ومن ثم نقل الخلايا المهضومة مع 100 * نصائح ماصة إلى لوحات ثقافة 48 جيدا التي تحتوي على mES متوسط النمو.
- حضانة الخلايا في لوحات الثقافة 48 جيدا في حاضنة 37 درجة مئوية مع جو رطب من 5٪ CO2. تمر الخلايا إلى طبق 6 سم عندما تصل إلى التقاء 70٪.
- كرر الخطوتين 4.3 و4.4 لعدة مرات حتى يتم الحصول على نسخ موحدة على شكل سكن.
5- تجميد المعدات الأساسية للحماية من أجل الحفظ بالتبريد
- فصل iPSCs المحدد من الخطوة 4.5 مع التربسين، versene، والبلازما الفرخ (TVP; جدول المواد) حل في 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 5٪ لمدة 30 دقيقة.
- جمع الخلايا في أنبوب مخروطي معقمة 15 مل والطرد المركزي في 217 × ز لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- يستنشق supernatant وإعادة تعليق بيليه الخلية في 2 مل من الماوس ES المجمدة المتوسطة(جدول المواد)للحصول على 1 مل لكل cryovial.
- إضافة خلايا إلى الفيوارير وتجميد باستخدام حاوية الفريزر التي توفر الحرجة، المتكررة -1 درجة مئوية / دقيقة معدل التبريد اللازمة للحفظ بالتبريد في -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- نقل قارورة المجمدة في خزان النيتروجين السائل.
6. تلطيخ الفلورة المناعية لعلامات الخلايا الجذعية في iPSCs
- iPSCs البذور من الخطوة 5.1 المستزرعة مع mES المتوسطة في شريحة غرفة 8-جيدا المغلفة مع بولي د-يسين / لامينين(جدول المواد)في الكثافة المناسبة لتحقيق ما بين 1−2 × 104 خلايا لكل بئر وحضانة في حاضنة 37 درجة مئوية مع حاضنة 37 درجة مئوية مع حاضنة 37 درجة مئوية مع جو رطب من 5٪ CO2 لمدة 48 ساعة.
- تزج الشرائح في 4٪ الفورمالديهايد لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ومن ثم تزج الشرائح في PBS مرتين لمدة 5 دقائق في كل مرة.
- أقسام الحضانة مع الكاشف الماوس IgG حجب(جدول المواد)،و مصل الماعز 5٪ لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- تخفيف الأجسام المضادة الأولية في مخفف البروتين (الماوس المضادة لSSEA1، 1:100، أرنب المضادة نانوغ، 1:500؛ أرنب المضادة للPOU فئة 5 homeobox 1 [OCT4]، 1:500؛ أرنب المضادة للسري مربع 2 [SOX2]، 1:500؛ أرنب المضادة لين-28 التجانس A [Lin28A]، 1:400) (جدول من [Lin28A]، 1:400)(جدول المواد). تطبيق الأجسام المضادة على الخلايا وحضانة في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها في غرفة رطبة.
- تجاهل الحل الأساسي للجسم المضاد واغسل الشرائح 3x في PBS.
- تطبيق الأجسام المضادة الثانية (Alexa488-المترافق الماعز المضادة للماوس الأجسام المضادة للفئران وAlexa555-المترافق الماعز المضادة للأرنب، 1:400 لكل منهما) في M.O.M. بروتين مخفف على الشرائح وحضانة لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل الشرائح 3X في PBS وجبل المقاطع مع تصاعد المتوسطة التي تحتوي على 4'6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI).
- التقاط الصور مع المجهر البؤري.
7- التحقيق في تعدد القوى في الكائنات الحية
- فصل iPSCs من الخطوة 5.1 إلى خلايا واحدة باستخدام حل TVP في حاضنة 37 درجة مئوية مع جو رطب من 5٪ CO2 لمدة 30 دقيقة.
- عد الخلايا باستخدام مقياس الهيماسيومتر والطرد المركزي في 217 × ز لمدة 3 دقائق.
- يستنشق supernatant وإعادة تعليق بيليه مع mES المتوسطة في أنبوب الطرد المركزي المعقم 1.5 مل بتركيز 5 × 105 خلايا / 30 ميكرولتر لزراعة الخلايا.
- إزالة الشعر من كلا الأطراف الخلفية من الفئران نقص المناعة باستخدام مقص الشعر.
- التخدير الفئران مع الكيتامين (100 ملغ / كغ) وتنظيف موقع الحقن مع الكحول 75٪.
- حقن 30 ميكرولتر من تعليق iPSC من الخطوة 7.3 العضل في الجهاز الهضمي، وذلك باستخدام إبرة 31 G.
- بعد أسبوعين من الحقن، حصاد الجهاز الهضمي الماوس وتضمين في درجة الحرارة المثلى (OCT) مركب، تجميد المفاجئة وقطع إلى أقسام 5-ميكرومتر15،16.
- إصلاح أقسام في الفورمالديهايد 4٪ لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم غسل الشرائح مرتين في PBS لمدة 5 دقائق في كل مرة.
- سد الخلايا مع 5٪ مصل الماعز بروتين مخفف لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة الجسم المضاد الأساسي المخفف (أرنب المضادة لوكالة فرانس برس، 1:50؛ أرنب المضادة SMA، 1:50؛ أرنب المضادة TH، 1:50) إلى الشرائح وحضانة في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها في غرفة رطبة.
- تجاهل محلول الأجسام المضادة الأساسي، وغسل الخلايا 3X (5 دقائق / غسل) في PBS، إضافة 1:400 المخفف Alexa555-المترافق الماعز المضادة للأرنب الأجسام المضادة للانزلاقات، وحضانة لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- اغسل الشرائح 3x (5 دقائق /غسل) في PBS، وجبل أقسام مع تصاعد المتوسطة التي تحتوي على DAPI.
8. بناء كريسبر / Cas9 ناقلات لينتيفيروسي استهداف الإينترونات المحيطة dystrophin exon 23
- تصميم اثنين من أزواج من القلة gRNA استهداف الإنترون يحيط dystrophin exon 23 عبر http://crispor.tefor.net/crispor.py.
ملاحظة: أزواج مصممة كما يلي:
i22sense: 5'-CACCGTTAAGCTTAGGTAAAAA- 3'
i22anti-sense: 5'-AAACTTGATTTTACCAAAGCTTAAC-3'
i23sense: 5'-CACCGAGTAATGTGTCATATTTCT- 3'
i23anti-sense: 5'-AAACAGAAGGTATGACACATTACTC-3'). - هضم وdephosphorylate 5 ميكروغرام من بلازميد كريسبر لينتيفيروسي (lenti-CRISPRv2-blast [هدية من موهان بابو] ولينتي-دليل-هيغرو-iRFP670 [هدية من كريستين بريناند])(جدول المواد)مع BsmB1/Esp3I لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية. بالنسبة لـ 5 ميكروغرام من البلازميدات، أضف 3 ميكرولتر من BsmB1 تقييد الإنزيم، و3 ميكرولتر من الفوسفاتيز القلوي السريع، و6 ميكرولتر من 10x من أنزيم الملخص الاحتياطي و0.6 ميكرولتر من 100 مليون متر DTT في رد فعل 60 ميكرولتر).
- تحميل ردود الفعل على هلام أروز 0.8٪. تشغيل هلام في 100-150 V لمدة 30 دقيقة.
- تنقية البلازميد المهضوم في هلام باستخدام مجموعة استخراج هلام(جدول المواد)وelute في 20 ميكرولتر من H2O.
- الفوسفوريات والصلب كل زوج من oligonucleotides gRNA تحتوي على 1 ميكرولتر من كل oligonucleotide في 100 ميكرومتر، 1 ميكرولتر من 10X T4 الربط العازلة، 0.5 ميكرولتر من T4 polynucleotide كيناز (PNK)، 6.5 ميكرولتر من ddH2O في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم منحدر د الخاصة إلى 25 درجة مئوية عند 5 درجة مئوية / دقيقة.
- [ليغت] 1:200 تخفيف من ال [أنّليد] [غرنا] [أوليغونوكلوتيدس] داخل ال [لنتيكريسبر] [ف2-فّل] [بلنتيغيد-هيغرو-رفب670]. مزيج 50 نانوغرام من BsmB1 /Esp3I هضم ناقلات مع 1 ميكرولتر من دوبلكس oligo المخفف و 5 ميكرولتر من 2X الرباط العازلة بالإضافة إلى 1 ميكرولتر من ligase في نظام رد فعل 11 درجة مئوية وحضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إجراء التحول مع 3 ميكرولتر من المنتج الربط إلى 50 ميكرولتر الخلايا المختصة(جدول المواد)وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- نشر الخلايا المختصة المحولة في لوحة أجار مع 100 ميكروغرام / مل كاربينسيلين وحضانة في 31.5 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.
- اختيار المستعمرات مع 10 ميكروغرام نصائح ماصة معقمة والثقافة في 5 مل من مرق رائع(جدول المواد)التي تحتوي على 100 ميكروغرام / مل كاربينسيلين في 31.5 درجة مئوية، 185 دورة في الدقيقة في حاضنة شاكر لمدة 21 ساعة.
- تنقية الحمض النووي بلازميد باستخدام مصغرة الإعدادية وميدي الإعدادية مجموعات(جدول المواد).
- تحقق من بلازميدات الإعدادية المصغرة عن طريق تقييد الهضم. بالنسبة لنظام التفاعل بسعة 20 ميكرولتر، أضف 1 ميكروغرام من الحمض النووي بلازميد، و2 ميكرولتر من المخزن الاحتياطي لتفاعل الهضم(جدول المواد)و1 ميكرو لتر من خليط إنزيم تقييد (0.5 ميكرولتر من KpnI-HF و0.5 ميكرولتر من AgeI-HF for plentiCRISPR V2-Blast-i22؛ 0.5 ميكرولتر من NotI-HF و0.5 ميكرولتر من EcoRI-HF لـ EcoRI-HF plentiGuide-Hygro- iRFP670- i23). احتضان نظام رد الفعل لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- تحميل ردود الفعل على هلام أروز 0.8٪. تشغيل هلام في 100-150 V لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: يجب أن تكون النطاقات الصحيحة لplentiCRISPR V2-Blast-i22 622 bp و 12.2 كيلو بايت، ويجب أن تكون النطاقات الصحيحة لplentiGuide-Hygro-iRFP670- i23 2.6 كيلو بايت و 7.1 كيلو بايت.
9. تغليف ناقلات Lentiviral
- ثقافة 7 × 105 293FT الخلايا في 5 مل من وسائل الإعلام DMEM تحتوي على 10٪ مصل البقر الجنين في طبق 6 سم بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
- إعداد كوكتيل (1 ميكروغرام من plentiCRISPR V2-Blast-i22 أو plentiGuide-Hygro-iRFP670-i23، 750 نانوغرام من بلازميد التعبئة والتغليف psPAX2، 250 نانوغرام من بلازميد مغلف pMD2.G، و 5 ميكرولتر من الكاشف المتحول A [جدول المواد]في 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام MEM المصل المنخفض).
- إعداد خليط من 5 ميكرولتر من الكاشف الانسياق B(جدول المواد)في 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام MEM المصل مخفضة.
- يُضاف 100 لتر من خليط الكاشف البيرفيل B إلى خليط البلازميد من الخطوة 9.2 والحضانة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة مجمع الدهون الحمض النووي (من الخطوة 9.4) قطرة إلى خلايا 293FT. حضانة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
- إضافة محسن إنتاج الفيروس (500x)(جدول المواد)إلى كل طبق في اليوم التالي وحضانة لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
- جمع المتوسطة من الخلايا باستخدام الماصات في اليومين المقبلين وتصفية المتوسطة من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر لإزالة الخلايا.
10- تركيز وتنقية ناقلات الفيروسات اللينة
- ناقلات النضدية المعجّلة في وسط الخطوة 9.7 بين عشية وضحاها عند 4 درجة مئوية مع 5x البولي إثيلين غليكول 4000 (PEG4000, 8.5% التركيز النهائي) و 4 M كلوريد التركيز (0.4 M التركيز النهائي).
- طرد مركزي وسائل الإعلام الفيروسية التي تحتوي على حل PEG4000 في 2095 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، وإزالة وتجاهل supernatant.
- إعادة تعليق الكريات مع 500 درجة مئوية من المصل خفض MEM وسائل الإعلام (لينتيفيروس titer: lenti-CRISPR V2-gRNAi22: 1.56 × 108،lenti-iRFP6 70-gRNAi23: 1.3 × 108، لينتي كريسبر V2-- السيطرة: 3.13 × 107، lenti-iRFP670-التحكم: 5.9 × 107 ). يُحفظ عند -80 درجة مئوية حتى يُستعمل.
11- حذف الإكسون 23 في أجهزة iPSCs الماوس مع دليلين RNAs (rnAs) إلى جانب Cas9
- لوحة iPSCs الماوس من الخطوة 4.5 في لوحة 24 جيدا المغلفة مع فيبرونيكتين والجيلاتين.
- بعد أن تصل الخلايا إلى التقاء 50٪، انتقل إلى وسط الثقافة الطازجة (كامل الماوس نمو الخلايا الجذعية الجنينية المتوسطة) التي تحتوي على 8 ميكروغرام / مل بوليبرين).
- إضافة 100 ميكرولتر من محلول الجسيمات اللينفيروسي من الخطوة 10.3 بما في ذلك lenti-CRISPR V2-gRNAi22، lenti-iRFP670-gRNAi23 والتحكم (ناقلات فارغة: lenti-CRISPR V2، lenti-iRFP670) إلى iPSCs الماوس. حضانة الخلايا لمدة 3 أيام في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
- حدد الخلايا المصابة بشكل كبير مع وسائل الإعلام التي تحتوي على 2.5 ميكروغرام / مل blasticidin و 100 ميكروغرام / مل هيغروميسين B عن طريق تحديد الحد الأدنى من تركيز blasticidin والهيغروميسين B اللازمة لقتل الخلية غير المصابة.
ملاحظة: سيتم قتل الخلايا غير المصابة بواسطة blasticidin والهيغروميسين B. - هضم iPSCs الماوس المحدد مع 0.5 مل من حل TVP كل بئر (لوحة 24 جيدا) والخلايا الحاضنة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
- فصل iPSCs في خلايا واحدة عن طريق الأنابيب، عد الخلايا مع غرفة عد الخلايا ومن ثم تخفيف حوالي 150 خلايا واحدة هضمها مع mES المتوسطة في طبق 10 سم للثقافة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
- بعد حوالي 10 أيام، واختيار مستعمرات واحدة تحت المجهر المقلوب باستخدام 10 * لتر نصائح ماصة معقمة (96 المستعمرات تحتاج إلى أن يتم انتقاؤها).
- نقل المستعمرات المختارة إلى 50 درجة مئوية من محلول TVP كل بئر (لوحة 96-well، مستعمرة واحدة كل بئر)، هضم في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ومن ثم زرع الخلايا المهضومة في اثنين من لوحات الثقافة 96 جيدا للحفاظ على الثقافة (واحد للكتابة الجينية).
- حضانة في حاضنة CO2 في 37 درجة مئوية حتى 70٪ confluent.
12. تحديد مستعمرات iPSC مع حذف exon23
- إزالة المتوسطة في لوحة 96 جيدا عندما تصل مستعمرات الخلية 70٪ التقاء.
- إضافة 25 ميكرولتر من كاشف الليسات(جدول المواد)التي تحتوي على محلول بروتيناز K (1 مل من بروتيناس K في 100 مل من كاشف الليسات) إلى كل بئر، ونقل lysate إلى لوحة PCR 96 جيدا.
- ختم لوحة PCR واحتضان لوحات في 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم في 95 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة لتحلل الخلايا وتشوه بروتيناس K.
- تنفيذ تفاعل PCR مع 2 ميكرولتر من lysate من الخطوة 12.3. بالنسبة لتفاعل PCR 20 ميكرولتر، أضف 2 ميكرولتر من الليسات، و10 ميكرولتر من 2x DNA polymerase premix(جدول المواد)،و7 ميكرولتر من المياه الخالية من DNase، و1 ميكرولتر من DMD exon 23 التمهيديات(الجدول 1).
- استخدم المعلمات التالية لرد فعل PCR: 98 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، و35 دورة من 98 درجة مئوية لمدة 10 درجات، و60 درجة مئوية لمدة 15 ق، و72 درجة مئوية لمدة 30 ق، وملحق نهائي عند 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة.
- تحميل رد فعل PCR على هلام أجاروز 2٪. تشغيل هلام في 100-150 V لمدة 30 دقيقة.
- فحص هلام تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية (كفاءة خروج المغلوب هو 3/94).
13. استخدام نظام تنشيط تيت أون ميوغة للتمييز مباشرة بين iPSC وخلايا الذرية المسببة للسرطان (MPC)
- حزمة LV-TRE-VP64-الماوس MyoD-T2A-dsRedExpress2 و LV-TRE-VP16 الماوس MyoD-T2A-dsRedExpress2 (هدية من تشارلز Gersbach)(جدول المواد)كما هو موضح سابقا لlenti-CRISPRv2-الانفجار وlenti-gRNA-iRFP670 ناقلات في أقسام 9 و10
- إصابة iPSC الماوس مع lentivirus-TRE-VP64-MyoD-T2A-dsRed-Express2 أو lentivirus-TRE-VP16-MyoD-T2A-dsRedExpress2 كما هو موضح سابقا ً لناقلات lenti-CRISPRv2-blast وlenti-gRNA-iRFP670 في الخطوات 11.1−11.3.
- حدد الخلايا مع 1 ميكروغرام / مل بوروميسيسين بعد ثلاثة أيام من العدوى للحصول على السكان الخلايا المستحثة نقية.
- إضافة 3 ميكروغرام / مل دوكسيسيكلين في وسائل الإعلام الثقافة (10٪ FBS DMEM) إلى تمايز MPC. استبدال المتوسطة الطازجة تستكمل مع الدوكسيسيكلين كل يومين.
14. النسخ العكسي الكمي PCR لتقييم التمايز الديناميكي للعضلات وDMD exon التعبير 22-24
- استخراج الحمض النووي الريبي الخلوي بعد 0، 3، 6، و 10 أيام بعد العلاج الدوكسيسيكلين باستخدام الكاشف العزل RNA، نسخ عكس الحمض النووي الريبي في cDNA باستخدام أول حبلا cDNA توليف عدة(جدول المواد).
- بالنسبة لنظام التفاعل بين الـ 20 ميكرولتر، أضف 1 ميكرولتر من cDNA، و10 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتفاعل PCR(جدول المواد)،و8 ميكرولتر من الحمض النووي H2O، و1 ميكرولتر من خليط من المواد التمهيدية الأمامية والعكسية (غليسيرالدهايد-3-فوسفات ديهيدروجينز [GAPDH]، العضلات الهيكلية [ACTA1]، OCT4 و DMD exon22, DMD exon23, و DMD exon24, انظر الجدول 1).
- استخدام المعلمات التالية لرد فعل PCR: 50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 15 ق، 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، منحنى ذوبان 65.0 درجة مئوية إلى 95.0 درجة مئوية، زيادة 0.5 درجة مئوية.
15. تلطيخ الفلورة المناعية من سلسلة الموسين الثقيلة 2 (MYH2) والتعبير عن بروتين dystrophin
- لوحة الدوكسيسيكلين الناجمة، لينتي-TRE-MyoD الخلايا المعدلة من الخطوة 13.4 على 8-جيدا الشرائح الثقافة.
- إصلاح الخلايا في الفورمالديهايد 4٪ لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم غسل الشرائح مرتين في PBS لمدة 5 دقائق في كل مرة.
- سد الخلايا مع 5٪ مصل الماعز بروتين مخفف لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة الأرنب المضادة لdystrophin الأجسام المضادة (1:300) والماوس المضادة للMYH2 الأجسام المضادة (1:100) إلى الشرائح، وحضانة في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها في غرفة رطبة.
- تجاهل محلول الأجسام المضادة الأولية، وغسل الخلايا 3X (5 دقائق / غسل) في PBS، إضافة 1:400 المخفف Alexa488-المترافق الماعز المضادة للأرنب الأجسام المضادة وAlexa555-المترافقة الماعز المضادة للماوس الأجسام المضادة للماوس إلى الشرائح، وحضانة لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- اغسل الشرائح 3x (5 دقائق /غسل) في PBS، وجبل أقسام مع تصاعد المتوسطة التي تحتوي على DAPI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إنشاء DMDMDX الجلد الليفية المستمدة iPSC. أظهرنا كفاءة توليد iPSCs الماوس من الفئرانDMD MDX المستمدة من الخلايا الليفية الجلد باستخدام ناقلات إعادة برمجة خالية من التكامل. ويبين الشكل 1ألف أن ظهور مستعمرات تشبه الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) في ثلاثة أسابيع بعد العدوى. نحن نقيم كفاءة الحث iPSC من قبل الفوسفاتيز القلوية الحية (AP) وصمة عار. ويبين الشكل 1 باء أن النسبة المئوية للخلايا الإيجابية AP كانت حوالي 1.8 في المائة حسب تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية. SSEA1، Lin28، Nanog، OCT4 وSOX2، علامات تعدد القوى للخلايا الجذعية الجنينية الماوس، كانت إيجابية لiPSC المستعمرات عن طريق تلطيخ الفلورسنت المناعي،(الشكل 1C). للتحقيق في التمايز الجرثومي الثلاثة من iPSCs في الجسم الحي، ونحن حقن العضل iPSCs في الجهاز الهضمي الماوس. لاحظنا أن iPSCs حقن تختلف في خلايا الكبد (endoderm)، خلايا العضلات الملساء (mesoderm)، والخلايا العصبية الأدرينالية (ectoderm)(الشكل 1D)،توجيه الاتهام إلى تعدد قوة iPSCs.
[كريسبر/كش9-بوساطة] [إإكسون23] حذف. لقد صممنا دليلين لـ RNAs يحيطان بـ 23 من الـ 23 بعد فواصل Cas9 بوساطة مزدوجة الذين تقطعت بهم السبل (DSB) ونهاية غير متجانسة الانضمام (NHEJ)، تم حذف exon 23 متحولة، مما يسمح لإنتاج dystrophin اقتطاع ولكن وظيفية(الشكل 2A). لتحديد exon 23 حذف الماوس iPSC، كانت الخلايا البذور متفرقة، وتم اختيار المستعمرات الفردية ونشرها. وقد تعرضت السلطات الوطنية المعينة الجينية المستخرجة من هذه المستعمرات للكتابة الجينية لـ PCR. ويبين الشكل 2 باء أن #1 المستعمرة #2 قد أفيت 23 عملية حذف تشير إلى نجاح حذف النسخة الطاردة 23.
التمييز بين iPSCs الماوس في سلالة myogenic واستعادة التعبير dystrophin. نحن نستخدم نظام تعبير MyoD التتراسيكلين inducible للحث على التمايز myogenic من iPSCs. تم استخدام الدوكسيسيكلين للحث على التعبير MyoD في iPSCs. ويبين الشكل 3A مسار الوقت من تمايز العضلات في iPSCs المعالجة بدوكس. وأظهرت qRT-PCR أن مستوى mRNA من OCT4، علامة متعددة القوى، انخفض تدريجيا، في حين أن التعبير عن ACTA1، علامة العضلات الهيكلية، زادت بعد تحريض دوكس. أيضا، لاحظنا تشكيل الأنابيب الأنبوبية في أسبوعين بعد العلاج دوكس(الشكل 3B). الأهم من ذلك، أظهر فحص qRT-PCR الانتعاش من DMD exon 24 mRNA التعبير في Dox-المستحثة، Cas9 بوساطة Exon23 الخط المحذوف ة بالمقارنة مع خط التحكم Cas9(الشكل 3C). لا يتفق مع qRT-PCR، تلطيخ الفلورسنت المناعي يظهر عنصر البروتين dystrophin التعبير في Cas9-بوساطة exon 23 الخلايا المحذوفة، في حين أن التعبير dystrophin كان غائبا في خلايا التحكم (الشكل 3D).
الشكل 1: إعادة برمجة الخلايا الليفية الجلدية من الفئرانDMD MDX في iPSCs.
(أ)صورة تمثيلية للمستعمرات الشبيهة بـ ES (شريط المقياس = 200 درجة مئوية). (B)تحليل FACS من كفاءة إعادة برمجة الخلايا الليفية الجلد الماوس في iPSCs بعد 8 أيام من تحويل الفيروس سينداي عن طريق تلطيخ AP الحية. (C)تلطيخ الفلورسنت المناعي من SSEA1، Lin28، Nanog، Oct4، وSOX2 في iPSCs (شريط مقياس = 50 ميكرومتر). (د)تلطيخ الفلورسنت المناعي لوكالة الصحافة الفرنسية (endoderm)، SMA (mesoderm)، وهيدرولاز التيروزين (TH) (ectoderm) من الورم المسخي بعد أسبوعين من حقن iPSC في gastrocnemii (شريط مقياس = 20 ميكرومتر). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: حذف exon23 بوساطة من CRISPR/Cas9.
(أ)رسم تخطيطي من كريسبر / Cas9 بوساطة exon 23 الحذف. ويستهدف الـ Cas9 nuclease إينترون 22 وإينترون 23 بواسطة اثنين من الـ GRNAs. فواصل مزدوجة الذين تقطعت بهم السبل (DSBs) من قبل Cas9 النتائج في استئصال exon متحولة 23. يتم إصلاح نهايات القاصي من قبل نهاية غير متجانسة الانضمام (NHEJ)، مما أدى إلى استعادة إطار القراءة من الجين dystrophin. (ب)PCR تحليل النمط الجيني من exon 23. يشير السهم إلى منتج PCR من exon 23. وتعمل الرابطة كمرجع. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التمييز بين iPSCs الماوس في سلالة myogenic واستعادة التعبير dystrophin.
(A)أظهر qRT-PCR المسار الزمني لمستوى mRNA من Oct4 وACTA1 في الطارد ة 23-م.م.م م(DMDmdx iPSC (*P < 0.05 مقابل D0، D6، D10، #P <؛ 0.05 مقابل D0، D3، D10، $P <؛ 0.05 مقابل D0، D3، D6، n = 4 لـ Oct4) (*P < 0.05 مقابل D6 و D10 ، #P < 0.05 مقابل D0 و D3 و D10 $P < 0.05 مقابل D0 و D3 و D6 = n = 3 لـ ACTA1). (B)اليسار: صورة تمثيلية لتكوين myotube من iPSCs الماوس التي يسببها دوكس (شريط مقياس = 200 م). الحق: تحليل الفلورسنت المناعي لـ MYH2 في تشكيل myotube من iPSCs الماوس المستحث بـ Dox (شريط المقياس = 20 ميكرومتر). (C)العلوي: مواقف التمهيدي PCR لExon22 DMD، Exon23 وExon24؛ أسفل: تحليل qRT-PCR لمستوى mRNA من DMD Exon22 و Exon23 و Exon24 التعبير في MPC (****P < 0.0001, n = 3). (د)تحليل الفلورسنت المناعي للتعبير dystrophin في MPC التي يسببها دوكس من iPSCCas9-Ctrl و iPSCCas9-gRNA (شريط مقياس = 50 ميكرومتر). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| دليل التمهيديات | |
| i22 بمعنى | 5'-كاكغتاغتتاغتاغااتكا- 3' |
| i22 مضاد للحس | 5'-AAACTTGATTTTACCAAGCTTAAC-3' |
| i23 بمعنى | 5'-CACCGAGTAGTGTCATATTTCT- 3' |
| I23 مضاد للتحسس | 5'-AAACAGAAGGTATGACACATTACTC-3' |
| التمهيديات PCR | |
| OCT4-إلى الأمام | 5'-AGCTGCGAAGCGAAGAGGATCA-3' |
| OCT4-عكس | 5'-TCTCATTGTGTGCGCTTCCA-3' |
| ACTA1-إلى الأمام | 5'-جاتكاتغاجاكتاك-3' |
| ACTA1-عكس | 5'-TCAGCGATACCAGGGTACAT-3' |
| Exon22-Forward | 5'-TTACCACCAATGCGCTATCA-3' |
| Exon22-Reverse | 5'-CCGAGTCTCTCCATATTC-3' |
| Exon23-Forward | 5'-CCAAGAAAGCACCTTAATAtG-3' |
| Exon23-عكس | 5'-TTTGGCAGCTTTCCACCA-3' |
| Exon24-Forward | 5'-AAC CTT ACA GAA ATG GAT GGC-3' |
| Exon24-عكس | 5'-TTTCAGGATTTCAGCATCCC-3' |
| GAPDH-إلى الأمام | 5'-TGACAAGCTTCCCATCTCG-3' |
| GAPDH-عكس | 5'-CCCTTCATTGACCTCAACTACAT-3' |
الجدول 1: التسلسل التمهيدي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ضمور العضلات دوشين (DMD) هو مرض وراثي مدمر وقاتل في نهاية المطاف يتميز بعدم وجود dystrophin، مما يؤدي إلى ضمور العضلات التدريجي1،2. تظهر نتائجنا التعبير الجيني المزيل المنتم في خلايا السلالة الماجينية المستمدة من DMDmdx iPSC من خلال نهج حذف exon23 من CRISPR/Cas9-بوساطة. ولهذا النهج ثلاث مزايا.
أولاً، قمنا بتوليد iPSCs من الخلايا الليفية الجلدية المستمدة من Dmdmdx باستخدام متجه RNA غير مدمج. وقد تم تطوير مجموعة متنوعة من الأساليب لتوليد iPSCs، مثل ناقلات الفيروسات اللينة والفيروسات الرجعية، والتي سوف تدمج في الكروموسومات المضيفة للتعبير عن الجينات إعادة برمجة، وبالتالي تحمل مخاوف السلامة. وتوجد ناقلات تستند إلى الحمض النووي مثل ناقلات البلازميد والفيروسات المرتبطة بأدينو والفيروسات الغدية بطريقة غير متكاملة؛ ومع ذلك، فإنها قد لا تزال تتكامل في الكروموسوم المضيف على تردد منخفض. في هذه الدراسة، استخدمنا فيروس سينداي المعدل وغير القابل للنقل، وهو ناقل RNA غير مدمج، لتقديم عوامل النسخ من الخلايا الجذعية بأمان وفعالية إلى الخلايا الليفية لإعادة برمجتها.
بعد ذلك، نستخدم حذف الجينوم بوساطة كريسبر، بدلاً من تصحيح الجينات الدقيقة بوساطة كريسبر/كاس9، لاستعادة التعبير عن الديستروفين في iPSCs. وهذه الطريقة ممكنة وفعالة؛ فمن السهل لتصميم gRNAs متعددة لحذف exons متحولة متعددة، والتي تحدث في العديد من المرضى DMD الإنسان17. يستخدم حذف Exon مسار انضمام غير متجانس وفعّال نسبيًا، كما تتجنب الطريقة الحاجة إلى تقديم قالب إصلاح الحمض النووي. لذلك، بالمقارنة مع تصحيح الدقة بوساطة Cas9، Cas9-بوساطة الحذف الطارد هو مناسبة لمرضى DMD مع طفرات جينية متعددة.
وأخيراً، قمنا بتحفيز iPSCs غير المتمايزة في خلايا ذرية الميجينية، مما قد يقلل من خطر تكوين الورم الناجم عن iPSCs. في هذا البروتوكول، قمنا بتحفيز تعبير MyoD عن طريق نظام ناقلات التتراسيكلين اللاتتراسي (Tet-On) الذي ينظم التتراسيلاين (Tet-On) للتمييز بين iPSCs في ذرية العضلات والهيكل العظمي18،19.
في الختام، فإن الجمع بين تحرير الجينوم CRISPR/Cas9 مع نظام تنشيط Tet-on MyoD قد يوفر استراتيجية آمنة ومجدية وفعالة لحذف DMD-Exon23 المتحولة في الخلايا الجذعية لزراعة الخلايا في مرضى DMD.
لتحديد الخلايا الشبيهة بـ ES وحصادها بكفاءة، يجب أن نحدد خلايا iPSC غير المتمايزة عبر مورفولوجيا تشبه القبة، ويمكن أن تساعدنا علامة كائن التحبير على تسمية الحيوانات المستنسخة الفردية من أسفل طبق الثقافة بدائرة 1.8 مم حول iPSC استنساخ. لتجنب تسرب محلول التربسين، نحن بحاجة إلى تطبيق الشحوم بالتساوي على الجزء السفلي من الحلقات. أيضا، بعد وضع الحلقات المغلفة بالشحوم على الجزء العلوي من مستعمرات الخلايا المسماة، وينبغي الحرص على عدم لمس الحلقات. وإلا، سيتم فصل استنساخ iPSC.
وللبروتوكول حدودها؛ على سبيل المثال، اخترنا نظام ناقلات RNA غير مدمج لتوليد iPSCs. ومع ذلك، استخدمنا نظام كريسبر/كاس9 الفيروسي لحذف DMD exon 23 ونظام تنشيط MyoD القائم على اللينفيروسي للحث على تمايز iPSC myogenic; هذه النواقل اللاتيفية التكاملية لديها مخاوف تتعلق بالسلامة. ومع ذلك، يمكن حل هذه القضايا عن طريق تطبيق مجمع ريبونوكليوبروتين (RNP) الذي يتألف من المؤتلف، عالية النقاء S. pyogenes Cas9 nuclease مع crRNA: تراكررنا دوبلكس. يمكننا اختيار تعديل كيميائيا MyoD mRNA transfection للتمييز مباشرة iPSCs في الذرية myogenic، على الرغم من أن الكفاءة قد تكون صعبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم تانغ ووينتروب جزئيا من قبل NIH-AR070029، NIH-HL086555، NIH-HL134354.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Instruments | |||
| 31-gauge needle | Various | ||
| Sharp Incision | Various | ||
| Sterile Scalpels | Various | ||
| Tweezers | Various | ||
| Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.1 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 1 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 87 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 10 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 1 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 1 mL |
| TVP solution (for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Chicken Serum | Gibco | 16110-082 | 5 mL |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | 186 mg |
| Phosphat-buffered saline | to 500 mL | ||
| Trypsin (2.5%) | Thermo | 15090046 | 5 mL |
| mES growth medium(for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.5 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 408.5 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 75 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 5 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 500 μL |
| MEK/GS3 Inhibitor Supplement | EMD Millipore Corp | CS210510-500UL | 500 μL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 5 mL |
| The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks. | |||
| mES frozen medium(for 50 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | SIGMA | D2650 | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 24.9 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 25 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 50 μL |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | RRID |
| 0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA | CORNING | 25-052-CI | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo scientific | J19943-k2 | |
| Accutase solution | SIGMA | A6964 | Cell detachment solution |
| AgeI-HF | NEB | R3552L | |
| Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody | Invitrogen | A32723 | AB_2633275 |
| Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32731 | AB_2633280 |
| Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32732 | AB_2633281 |
| anti-AFP | Thermo scientific | RB-365-A1 | AB_59574 |
| anti-α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP | CST | 19245S | AB_2734735 |
| anti-Dystrophin | Thermo | PA5-32388 | AB_2549858 |
| anti-LIN28A (D1A1A) XP | CST | 8641S | AB_10997528 |
| anti-MYH2 | DSHB | mAb2F7 | AB_1157865 |
| anti-Nanog-XP | CST | 8822S | AB_11217637 |
| anti-Oct-4A (D6C8T) | CST | 83932S | AB_2721046 |
| anti-Sox2 | abcam | ab97959 | AB_2341193 |
| anti-SSEA1(MC480) | CST | 4744s | AB_1264258 |
| anti-TH (H-196) | SANTA CRUZ | sc-14007 | AB_671397 |
| Alkaline Phosphatase Live Stain (500x) | Thermo | A14353 | |
| Blasticidin S | Sigma-Aldrich | 203350 | |
| BsmBI/Esp3I | NEB | R0580L/R0734L | |
| Carbenicillin | Millipore | 205805-250MG | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Competent Cells | TakaRa | 636763 | |
| CutSmart | NEB | B7204S | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo | A16517 | |
| DirectPCR Lysis Reagent (cell) | VIAGEN BIOTECH | 302-C | |
| Dispase (1 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP26535 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101L | |
| Fibronectin bovine plasma | SIGMA | F1141 | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit (500) |
QIAGEN | 20051 | |
| Gelatin from porcine skin, type A | SIGMA | G1890 | |
| HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1500 | |
| Hygromycin B (50 mg/mL) | Invitrogen | 10687010 | |
| Ketamine HCL Injection | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | 45822 | |
| KpnI-HF | NEB | R3142L | |
| lenti-CRISPRv2-blast | Addgene | 83480 | |
| lenti-Guide-Hygro-iRFP670 | Addgene | 99377 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000015 | |
| LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60625 | |
| LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60626 | |
| Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit | Vector | BMK-2202 | |
| NotI-HF | NEB | R3189L | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | ThermoFisher | 31985070 | |
| Polyethylene glycol 4,000 | Alfa Aesar | AAA161510B | |
| Polybrene | SIGMA | TR1003 | |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide | CORNING | CB354688 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | A25742 | |
| PrimeSTAR Max Premix | TakaRa | R045 | |
| Proteinase K | VIAGEN BIOTECH | 507-PKP | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals | ICN19453980 | |
| qPCR Lentivirus Titration Kit | abm | LV900 | |
| Quick ligation kit | NEB | M2200S | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100) | QIAGEN | 12945 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo scientific | K1691 | |
| RNAzol RT | Molecular Research Center, INC | RN 190 | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Terrific Broth Modified | Fisher BioReagents | BP9729-600 | |
| ViralBoost Reagent (500x) | ALSTEM | VB100 |
References
- Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).
- Batchelor, C. L., Winder, S. J. Sparks, signals and shock absorbers: how dystrophin loss causes muscular dystrophy. Trends Cell Biology. 16 (4), 198-205 (2006).
- Gregorevic, P., et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).
- Bengtsson, N. E., Seto, J. T., Hall, J. K., Chamberlain, J. S., Odom, G. L. Progress and prospects of gene therapy clinical trials for the muscular dystrophies. Human Molecular Genetics. 25 (R1), R9-R17 (2016).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351 (6271), 407-411 (2016).
- Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 400-403 (2016).
- Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 403-407 (2016).
- Long, C., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345 (6201), 1184-1188 (2014).
- El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circulation Research. 121 (8), 923-929 (2017).
- Amoasii, L., et al. Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 362 (6410), 86-91 (2018).
- Eisen, B., et al. Electrophysiological abnormalities in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes generated from Duchenne muscular dystrophy patients. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 2125-2135 (2019).
- Marion, R. M., et al. Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- Sacco, A., et al. Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice. Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).
- Su, X., et al. Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
- Su, X., et al. Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 412-419 (2018).
- Ousterout, D. G., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nature Communications. 6, 6244 (2015).
- Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
- Glass, K. A., et al. Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties. Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).
