Summary
Her præsenterer vi en Cas9-baseret exon23 sletnings protokol for at genoprette dystrofin Expression i IPSC fra DMDMDX Mouse-afledte hudfibroblaster og direkte differentiere ipscs i myogenic stamceller (MPC) ved hjælp af tet-on myod aktiveringssystem.
Abstract
Duchenne muskeldystrofi (DMD) er en svær progressiv muskelsygdom forårsaget af mutationer i dystrofin genet, som i sidste ende fører til udmattelse af muskel stamceller. Grupperet jævnligt hinanden korte palindromiske gentagelser/crispr-associeret 9 (crispr/Cas9) genredigering har potentialet til at genskabe ekspression af dystrofin genet. Autologe inducerede pluripotente stamceller (iPSCs)-afledte muskelprogenitorceller (MPC) kan genopbygge stammen/stamcelle puljen, reparere skader og forhindre yderligere komplikationer i DMD uden at forårsage en immunrespons. I denne undersøgelse introducerer vi en kombination af crispr/Cas9 og ikke-integrerede IPSC-teknologier for at opnå muskel progenitorer med genvundet dystrofin-protein udtryk. Kort sagt bruger vi en ikke-integreret Sendai vektor til at etablere en iPSC-linje fra Dermal fibroblaster af DMDMDX -mus. Vi bruger derefter crispr/Cas9-sletnings strategien til at genoprette dystrofin-ekspression gennem en ikke-homologøs ende-forbindelse af det omindrammede dystrofin-gen. Efter PCR validering af exon23 udtømning i tre kolonier fra 94 plukket iPSC kolonier, vi differentiere iPSC til MPC af doxycyclin (DOX)-induceret udtryk for MyoD, en vigtig transkriptionsfaktor spiller en væsentlig rolle i reguleringen af muskel differentiering. Vores resultater viser gennemførligheden af at bruge crispr/Cas9 sletnings strategi til at genoprette dystrofin ekspression i IPSC-afledte MPC, som har betydelige muligheder for at udvikle fremtidige terapier til behandling af DMD.
Introduction
Duchenne muskeldystrofi (DMD) er en af de mest almindeligt muskuløse dystrophier og er karakteriseret ved fravær af dystrofin, påvirker 1 af ca 5.000 nyfødte drenge på verdensplan1. Tab af dystrofin gen funktion resulterer i strukturelle muskel defekter fører til progressive myofibers degeneration1,2. Rekombinant adeno-associeret virus (Raav)-medieret genterapi system er blevet testet for at genoprette dystrofin ekspression og forbedre muskelfunktion, såsom genudskiftning ved hjælp af mikro-dystrophiner (μ-dys). Men Raav-tilgangen kræver gentagne injektioner for at opretholde ekspression af det funktionelle protein3,4. Derfor har vi brug for en strategi, der kan give effektivt og permanent genvinde dystrofin genekspression hos patienter med DMD. DMDMDX Mouse, en musemodel til DMD, har en punkt mutation i exon 23 af dystrofin genet, der introducerer en tidlig opsigelse codon og resulterer i en ikke-funktionel trunkeret protein mangler C-Terminal dystroglycan bindende domæne. Nylige undersøgelser viste brugen af crispr/Cas9-teknologi til at genoprette dystrofin-genekspression ved nøjagtig genkorrektion eller mutant exon-sletning i små og store dyr5,6,7. Long et al.8 rapporterede metoden til korrektion af dystrofin-genmutationen i DMDMDX Mouse kimcelle ved Homology-rettet reparation (HDR) baseret crispr/Cas9 genom-redigering. El Refaey et al.9 rapporterede, at Raav effektivt kunne punktafgiftspligtige den mutante exon 23 i dystrofiske mus. I disse studier blev grnas designet i introns 20 og 23 for at forårsage dobbeltstrenget DNA-pauser, som delvist restaurerede dystrofin-ekspression efter DNA-reparation via ikke-homologe end-sammenslutning (nhej). Endnu mere spændende, amoasii et al.10 rapporterede for nylig effekten og gennemførligheden af Raav-mediated crispr gene redigering i genoprette dystrofin udtryk i canine modeller, et vigtigt skridt i fremtidig klinisk anvendelse.
DMD forårsager også stamcelle lidelser11. For muskelskader, bolig muskel stamceller genopfylde døende muskelceller efter muskel differentiering. Men, de efterfølgende cyklusser af skade og reparation føre til afkortning af telomerer i muskel stamceller12, og for tidlig udtømning af stamcelle puljer13,14. Derfor kan en kombination af autologt stamcelleterapi med genomredigering for at genoprette dystrofin ekspression være en praktisk tilgang til behandling af DMD. CRISPR/Cas9-teknologien giver mulighed for at generere autologe genetisk korrigerede inducerede pluripotente stamceller (iPSC) til funktionel muskel regenerering og forhindre yderligere komplikationer af DMD uden at forårsage immun afvisning. IPSCs har dog en risiko for tumordannelse, som kan afhjælpes ved differentieringen af iPSC til myogene stamceller.
I denne protokol beskriver vi brugen af ikke-integrerende Sendai-virus til omprogrammering af Dermal fibroblaster af DMDMDX -mus til ipscs og derefter inddrive dystrofin udtryk ved crispr/Cas9 genom sletning. Efter validering af Exon23 sletning i IPSC ved genotypebestemmelse differentierede vi Genome-korrigeret IPSC til myogenic forfædre (MPC) via myogen-induceret myogenic differentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyre håndterings-og operationsprocedurer blev udført ved en protokol, der er godkendt af det institutionelle udvalg for dyrepasning og-anvendelse (IACUC) i Augusta. Mus blev fodret standard kost og vand ad libitum.
1. isolering af primære mus fibroblaster fra voksne DMDMDX -mus
- Euthanize Adult DMDMDX -mus (mand, 2 måneder gammel) ved co2 kvælning og THORACOTOMI ifølge iacuc godkendt af Medical College of Georgia, Augusta University. Skær halen med en steril skalpel i en steril tilstand under laminar hætten. Skyl halen med 70% ethanol i 5 min, og vask derefter med steril fosfat-bufferet saltvand (PBS) i en 6 cm skål.
- Skræl halen huden af med et skarpt snit fra bunden til hale spidsen langs halen huden, og derefter forsigtigt skrælle halen huden med pincet. Hakken huden til en størrelse på 1 mm3 ved hjælp af en steril skalpel og flytte det hakkede hudvæv til en 6 cm skål i dulbecco's minimale essentielle medium/Hams F12 (DMEM/F12) indeholdende 0,1% kollagenase IV og 1 U/ml dispase.
- Fordøje hudvævet i en kulturret i 2 timer ved 37 °C i en 5% CO2 -inkubator.
- Coat en 6-brønd plade med fibronektin og 0,2% gelatine (1 ml fibronektin i 199 ml 0,2% gelatine; Tabel over materialer) og Inkuber ved 37 °C i 1 time.
- Afdissociér det Ford øjede hudvæv med et 1 mL pipet spids og Overfør vævet og supernatanten til et sterilt 15 mL konisk centrifugeglas. Centrifugeres ved 217 x g i 3 minutter ved stuetemperatur, kassér supernatanten, og resuspender pellet i 1,5 ml fibroblast medium (tabel over materialer).
- Kultur pellets herunder ufuldstændig fordøjet hudvæv fra trin 1,5 på 6-brønden plade belagt med fibronektin og 0,2% gelatine fra trin 1,4 i en 37 °c, 5% Co2 inkubator. Udskift mediet 24 h efter den indledende plating for at fjerne ikke-tilsluttede celler, og Skift mellem mediet hver 48 h.
2. omprogrammering af muse hudfibroblaster i iPSCs
- To dage før transduktion, fordøje mus Dermal fibroblaster fra trin 1,6 med cellen løsrivelse løsning (tabel over materialer) i en 37 °c inkubator med en befuret atmosfære på 5% Co2 i 5 min.
- Tæl celler ved hjælp af en hemacytometer og centrifuge ved 217 x g i 3 min.
- Frøceller med en densitet på 1 − 2 x 105 celler per brønd på en 6-brønd plade og kultur med fibroblast medium (tabel over materialer) i en 37 °c inkubator med en befuret ATMOSFÆRE på 5% Co2.
- På dagen for transduktion (dag 0), estimerer cellerne og beregner volumenet af hver virus, der er nødvendig for at nå målmultipliciteten af infektion (MOI) på 5, 5 og 3 (dvs., KOS MOI = 5, HC-MYC MOI = 5, hKlf4 MOI = 3) i henhold til den kommercielle manual.
- Tø tre Sendai-rør i et 37 °C-vandbad i 5 − 10 s og tilsæt de beregnede volumener af hvert af de tre Sendai-rør til 1 mL fibroblast medium (tabel over materialer).
- Fjern fibroblast mediet fra trin 2,3, og tilsæt den genprogrammerings virus blanding til brøndene, der indeholder cellerne. Cellerne inkubates natten over i en 37 °C-inkubator med en befugret atmosfære på 5% CO2.
- Udskift mediet med frisk fibroblast medium 24 h efter transduktion. Kultur cellerne i en uge med medium udveksling hver anden dag.
- Høst inficerede mus fibroblaster på dag 7 efter transduktion med 0,05% trypsin/EDTA og sted på retter, der tidligere er belagt med fibronektin og 0,2% gelatine.
- Kultur de inficerede mus fibroblaster fra trin 2,6 med komplet mus embryonale stamceller (ES) vækstmedium (tabel over materialer) i en 37 °c inkubator med en befuret atmosfære på 5% Co2 og skifte medium dagligt.
- Fra 8 dag, observere pladen under et inverteret mikroskop hver anden dag for at identificere udseendet af celle klumper med morfologi af mus ES.
3. brug af basisk fosfataselevende pletter og flowcytometri til kvantificering af omprogrammering effektivitet
- Fjern kulturmediet fra hver brønd, og skyl med DMEM/F-12 i 2 − 3 minutter.
- Påfør 2 mL 1x alkalisk fosfatase (AP) levende bejdseopløsning (1:500 fortynding i DMEM/F-12) til de vedtagede celler, og Inkubér i en 37 °C-inkubator med en befuret atmosfære på 5% CO2 i 30 min.
- Aspirer AP Live pletten og vask to gange med PBS i 5 minutter hver.
- Fordøje cellerne med cellen løsrivelse (tabel over materialer) i en 37 °c inkubator med en befuret atmosfære på 5% Co2 i 5 min. Udfør strømnings cytometri for at bestemme omprogrammerings effektiviteten.
4. udvælgelse og høst af ES-lignende celler
- Undersøg kolonierne fra trin 2,8 under et inverteret mikroskop.
- Marker kolonierne i bunden af skålen med en selv-håndskrift objekt markør.
- Anvend smurt klonings ringe til at dække de markerede celle kolonier. Tilsæt 100 μL 0,05% trypsin/EDTA til hver klonings ring ved 37 °C i 5 min, og overfør derefter de Ford øjede celler med 100 μL pipettespidser til 48-brønd kultur plader, der indeholder mES-vækstmedium.
- Cellerne i 48-brønd kultur pladerne inkubates i en 37 °C-inkubator med en befuret atmosfære på 5% CO2. Passage cellerne til 6 cm parabol, når de når 70% sammenløbet.
- Gentag trin 4,3 og 4,4 for flere gange, indtil der opnås ensartede dorm-formede kloner.
5. frysning iPSCs til Kryopreservation
- De valgte iPSCs dissocierer fra trin 4,5 med trypsin, versene og chick plasma (TVP; Tabel over materialer) opløsning ved 37 °C i en 5% CO2 -inkubator i 30 minutter.
- Cellerne opsamles i et sterilt 15 mL konisk rør og centrifugeres ved 217 x g i 3 minutter ved stuetemperatur.
- Aspirér supernatanten og re-suspendere celle pellet i 2 mL mus ES frosset medium (tabel over materialer) for at opnå 1 ml pr cryovial.
- Tilføj celler til cryovials og fryse ved hjælp af en fryser beholder, der giver den kritiske, gentagen-1 °C/min køling sats kræves for Kryopreservation ved-80 °C natten over.
- Overfør frosne hætteglas til en flydende nitrogen tank.
6. immunofluorescens farvning for stamcelle markører i iPSCs
- Seed iPSCs fra trin 5,1 dyrkes med mES medium til en 8-brøndkammer slide belagt med poly-D-lysin/Laminin (tabel over materialer) ved passende tæthed at opnå mellem 1 − 2 x 104 celler pr brønd og inkubér i en 37 °c inkubator med en luft befuret atmosfære på 5% CO2 for 48 h.
- Nedsænk gliderne i 4% formaldehyd i 15 minutter ved stuetemperatur, og sænk derefter gliderne i PBS to gange i 5 minutter hver gang.
- Inkuber sektioner med en IgG-blokerende reagens (tabel over materialer) og 5% gede serum i 1 time ved stuetemperatur.
- Fortynd de primære antistoffer i protein fortynder (mus-anti-SSEA1, 1:100, kanin-anti-nanog, 1:500; kanin-anti-Pou klasse 5 homeobox 1 [OCT4], 1:500; kanin-anti-Sry-box 2 [SOX2], 1:500; kanin-anti-Lin-28 ligner A [Lin28A], 1:400) (tabel over Materialer). Påfør antistoffer mod cellerne og Inkuber ved 4 °C natten over i et befuret kammer.
- Kassér den primære antistof opløsning og vask gliderne 3x i PBS.
- Påfør andet antistoffer (Alexa488-konjugeret ged-anti-museantistof og Alexa555-konjugeret ged-anti-kanin, 1:400 hver) i M.O.M. protein fortyndingsmiddel på slides og Inkuber i 45 min ved stuetemperatur.
- Vask slides 3x i PBS og montere sektioner med monterings medium, der indeholder 4 ' 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI).
- Tag billeder med et Konfokal mikroskop.
7. undersøgelse af iPSCs-pluristyrken in vivo
- IPSCs adskilles fra trin 5,1 i enkeltceller ved hjælp af TVP-opløsning i en 37 °C-inkubator med en befuret atmosfære på 5% CO2 i 30 min.
- Tæl celler ved hjælp af en hemacytometer og centrifuge ved 217 x g i 3 min.
- Supernatanten indsugning og resuspension af pellet med mES medium i et 1,5 mL sterilt centrifugeglas i en koncentration på 5 x 105 celler/30 μl til celletransplantation.
- Fjern håret fra begge baglemmer af immundefekt mus ved hjælp af hårklippere.
- Anæstetize mus med ketamin (100 mg/kg) og rengør injektionsstedet med 75% alkohol.
- Injicér 30 μL iPSC-suspension fra trin 7,3 intramuskulært i gastrocnemii ved hjælp af en 31 G nål.
- To uger efter injektionen, høst musen gastrocnemii og indlejre i optimal skæring temperatur (Oct) sammensatte, snap fryse og skæres i 5-μm sektioner15,16.
- Fastgør sektioner i 4% formaldehyd i 15 minutter ved stuetemperatur, og vask derefter diasene to gange i PBS i 5 minutter hver gang.
- Bloker cellerne med 5% gede serumprotein fortyndingsmiddel i 1 time ved stuetemperatur.
- Tilsæt fortyndet primært antistof (kanin anti-AFP, 1:50; kanin anti-SMA, 1:50; kanin anti-TH, 1:50) til slidene og Inkuber ved 4 °C natten over i et befuret kammer.
- Kassér den primære antistof opløsning, vask cellerne 3x (5 min/vask) i PBS, tilsæt en 1:400 fortyndet Alexa555-konjugeret ged-anti-kanin antistof til slides, og Inkuber i 45 min ved stuetemperatur.
- Vask slides 3x (5 min/vask) i PBS, og monter sektioner med monterings medium indeholdende DAPI.
8. opførelse af crispr/Cas9 lentiviral vektor målretning introns ledsage dystrofin exon 23
- Design to par grna oligonukleotider rettet mod intron-flankeret dystrofin exon 23 via http://crispor.tefor.net/crispor.py.
Bemærk: de designede par er som følger:
i22sense: 5 '-CACCGTtaagcttaggtaaaatcaa-3 '
i22anti-Sense: 5 '-AAACTtgattttacctaagcttaaC-3 '
i23sense: 5 '-CACCGAgtaatgtgtcataccttct-3 '
i23anti-Sense: 5 '-AAACAgaaggtatgacacattactC-3 '). - Digest og dephosphorylat 5 μg lentiviral CRISPR plasmid (Lenti-CRISPRv2-blast [en gave fra Mohan Babu] og Lenti-guide-Hygro-iRFP670 [en gave fra kristen Brennand]) (tabel over materialer) med BsmB1/Esp3I i 30 min ved 37 °c. For 5 μg Plasmids tilsættes 3 μL BsmB1 enzym, 3 μL hurtig alkalisk fosfatase, 6 μL 10x enzym Digest buffer og 0,6 μL 100 mM DTT i en reaktion på 60 μL).
- Indlæs Reaktionerne på en 0,8% agopstået gel. Kør gelen ved 100 − 150 V i 30 min.
- Purify fordøjet plasmid in-gel ved hjælp af en gel ekstraktions Kit (tabel over materialer) og elueres i 20 μl af H2O.
- Fosforylat og udglødet hvert par af gRNA-oligonukleotider indeholdende 1 μL af hver oligonukleogentid ved 100 μM, 1 μL 10x T4 ligations buffer, 0,5 μL T4 polynucleotidkinase (PNK), 6,5 μL ddH2O ved 37 °c i 30 min, og derefter 95 °c i 5 min og derefter rampe d til 25 °C ved 5 °C/min.
- Ligate en 1:200 fortynding af de udglødede gRNA oligonukleotider i plentiCRISPR v2-blast eller plentiGuide-Hygro-iRFP670. Bland 50 ng af BsmB1/Esp3I fordøjet vektorer med 1 μL fortyndet oligo duplex og 5 μL 2x ligasebuffer plus 1 μL ubiquitinligase i et 11 μL reaktionssystem og Inkuber i 10 min ved stuetemperatur.
- Udfør transformation med 3 μL ligations produkt i 50 μL kompetente celler (tabel over materialer) i henhold til fabrikantens anvisninger.
- De transformerede, kompetente celler i en agar-plade spredes med 100 μg/mL carbenicillin og inkuberes ved 31,5 °C i 18 timer.
- Pick kolonier med 10 μL sterile pipettespidser og kultur i 5 mL fantastisk bouillon (tabel over materialer) indeholdende 100 μg/ml carbenicillin ved 31,5 °c, 185 rpm i en shaker inkubator for 21 h.
- Rense plasmid DNA ved hjælp af mini-prep og MIDI-prep kits (tabel over materialer).
- Bekræft den mini-prep plasmider ved begrænsning fordøjelsen. For 20 μL-reaktionssystemet tilsættes 1 μg plasmid-DNA, 2 μL Digest-reaktionsbuffer (tabel over materialer) og 1 μl restriktionsenzym blanding (0,5 μl kpni-hf og 0,5 ΜL agei-HF for plentiCRISPR v2-blast-i22; 0,5 μl af noti-hf og 0,5 μl af EcoRI-HF til plentiGuide-Hygro-iRFP670-i23). Reaktionssystemet inkubates i 1 time ved 37 °C.
- Indlæs Reaktionerne på en 0,8% agopstået gel. Kør gelen ved 100 − 150 V i 30 min.
Bemærk: de korrekte bånd for plentiCRISPR v2-blast-i22 skal være 622 BP og 12,2 KB, og de korrekte bånd for plentiGuide-Hygro-iRFP670-i23 skal være 2,6 KB og 7,1 kb.
9. lentiviral vektor emballage
- Kultur 7 x 105 293ft celler i 5 ml DMEM-medier indeholdende 10% føtal kvægserum i en 6 cm skål natten over ved 37 °c, 5% Co2.
- Forbered en cocktail (1 μg plenticrispr v2-blast-i22 eller plentiGuide-hygro-iRFP670-i23, 750 ng af psPAX2 emballage plasmid, 250 ng af pMD2. G konvolut plasmid og 5 μl transfektering reagens a [tabel over materialer] i 100 μl af reducerede serum-MEM-medier).
- Der forberedes en blanding af 5 μl transfektering reagens B (tabel over materialer) i 100 μl reducerede serum-MEM-medier.
- Tilsæt 100 μl transfektering reagens B-blanding til plasmid-blanding fra trin 9,2 og Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Tilsæt DNA-lipid-komplekset (fra trin 9,4) dråbevis til de 293ft celler. Inkuber natten over ved 37 °C med 5% CO2.
- Tilføj virus produktion forstærker (500x) (tabel over materialer) til hver skål den næste dag og inkubere for 24 h ved 37 °c, 5% Co2.
- Saml medium fra celler ved hjælp af pipetter på de næste to dage og Filtrer mediet gennem et 0,45 μm filter for at fjerne cellerne.
10. koncentration og rensning af lentiviral vektorer
- Bund fældelse lentiviral vektor i medium af trin 9,7 natten over ved 4 °C med 5x polyethylenglycol 4000 (PEG4000, 8,5% endelig koncentration) og 4 M NaCl (0,4 M slutkoncentration).
- De virale medier, der indeholder PEG4000-opløsningen, centrifugeres ved 2.095 x g og 4 °c i 30 min., Fjern og kassér supernatanten.
- Resuspendere pellets med 500 μL af serum reduceret MEM medier (lentivirus titer: Lenti-CRISPR v2-gRNAi22:1,56 x 108, Lenti-IRFP670-gRNAi23:1,3 x 108, Lenti-crispr v2-Control: 3,13 x 107, lenti-iRFP670-Control: 5,9 x 107 ). Opbevares ved-80 °C indtil brug.
11. sletning af exon 23 i mus iPSCs med to guide RNAs (gRNAs) kombineret med Cas9
- Plade musen ipscs fra trin 4,5 i en 24-brønd plade belagt med fibronektin og gelatine.
- Når cellerne når 50% sammenløbet, skiftes til det friske dyrkningsmedium (komplet mus embryonale stamcelle vækstmedium) indeholdende 8 μg/mL polybrene).
- Tilsæt 100 μL af lentiviral partikel opløsning fra trin 10,3 inklusive Lenti-CRISPR v2-gRNAi22, Lenti-iRFP670-gRNAi23 og Control (Tom vektor: Lenti-CRISPR v2, Lenti-iRFP670) til mus iPSCs. Inkuber cellerne i 3 dage ved 37 °C med 5% CO2.
- Vælg stabilt inficerede celler med medier, der indeholder 2,5 μg/ml blasticidin og 100 μg/ml hygromycin b ved at bestemme den mindste koncentration af blasticidin og hygromycin b kræves for at dræbe den FN-inficerede celle.
Bemærk: un-inficerede celler ville blive dræbt af blasticidin og hygromycin B. - Fordøje den valgte mus iPSCs med 0,5 mL TVP opløsning hver brønd (24-brønd plade) og inkubere celler i 30 min ved 37 °C med 5% CO2.
- Dissociere iPSCs i enkeltceller ved pipettering, tælle celler med et celle tælle kammer og derefter fortynde omkring 150 fordøjet enkeltceller med mES medium til 10 cm skål for kultur ved 37 °C med 5% CO2.
- Efter ca. 10 dage kan du plukke enkelt kolonier under et inverteret mikroskop med 10 μL sterile pipettespidser (96 kolonier skal plukkes).
- Overfør de plukkede kolonier til 50 μL TVP-opløsning hver brønd (96-brønd plade, en koloni hver brønd), fordøje ved 37 °C i 30 min, og frø derefter de Ford øjede celler til 2 96-brønd kultur plader for at holde kulturen (en til genotypebestemmelse).
- Der Inkubér i en CO2 -inkubator ved 37 °c, indtil 70% er konflydende.
12. identifikation af iPSC-kolonier med exon23 sletning
- Fjern mediet i 96-brønd pladen, når celle kolonierne når 70% sammenløbet.
- Der tilsættes 25 μL lysis-reagens (tabel over materialer) indeholdende proteinase k-opløsning (1 ml proteinase k i 100 ml lysis-reagens) til hver brønd, og lysatet overføres til en 96-BRØND-PCR-plade.
- PCR-pladen forseges, og pladerne inkubates ved 55 °C i 30 minutter og derefter ved 95 °C i 45 min for at lyse cellerne og denatur proteinase K.
- Udfør PCR-reaktion med 2 μL lysat fra trin 12,3. For 20 μL PCR-reaktionen tilsættes 2 μL lysat, 10 μL 2x DNA-Polymerase-premix (tabel over materialer), 7 μl DNase-frit vand og 1 μl DMD exon 23 primere (tabel 1).
- Brug følgende parametre for PCR-reaktion: 98 °C i 1 min, 35 cyklusser af 98 °C i 10 s, 60 °C for 15 s, 72 °C i 30 s og en endelig udvidelse ved 72 °C i 1 min.
- Indlæs PCR-reaktionen på en 2% agopstået gel. Kør gelen ved 100 − 150 V i 30 min.
- Undersøg gelen under UV-lys (udskærings effektiviteten er 3/94).
13. brug af tet-on MyoD-aktiverings systemet til direkte at differentiere iPSC til myogene progenitorceller (MPC)
- Pak LV-TRE-VP64-Mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 og LV-TRE-VP16 mus MyoD-T2A-dsRedExpress2 (en gave fra Charles Gersbach) (tabel over materialer) som tidligere beskrevet for Lenti-CRISPRv2-blast og Lenti-grna-iRFP670 vektorer i sektioner 9 og 10.
- Inficere mus iPSC med lentivirus-TRE-VP64-MyoD-T2A-dsRed-Express2 eller lentivirus-TRE-VP16-MyoD-T2A-dsRedExpress2 som tidligere beskrevet for Lenti-CRISPRv2-blast og Lenti-gRNA-iRFP670 vektorer i trin 11.1 − 11.3.
- Vælg celler med 1 μg/mL puromycin efter tre dages infektion for at opnå en ren transduceret cellepopulation.
- Tilsæt 3 μg/mL doxycyclin til kultur medier (10% FBS DMEM) til MPC-differentiering. Udskift frisk medium suppleret med doxycyclin hver anden dag.
14. kvantitativ reverse transkriptionspcr til evaluering af dynamisk muskel differentiering og DMD exon 22-24-udtryk
- Udtræk cellulært RNA efter 0, 3, 6 og 10 dage efter behandling med doxycyclin ved hjælp af RNA-isolations reagens, omskriver RNA med det samme til cDNA ved hjælp af første streng cDNA-syntese Kit (tabel over materialer).
- For 20 μL qPCR-reaktionssystemet tilsættes 1 μL cDNA, 10 μL PCR-reaktionsbuffer (tabel over materialer), 8 μl DNA H2O og 1 μl blanding af fremad-og bakprimere (glyceraldehyd-3-phosphat-DEHYDROGENASE [gapdh], skeletmuskulatur [ACTA1], OCT4 og DMD exon22, DMD exon23 og DMD exon24, se tabel 1).
- Brug følgende parametre for PCR-reaktion: 50 °C i 2 min, 95 °C i 2 min., 40 cyklusser af 95 °C i 15 s, 60 °C i 1 min, smelte kurve 65,0 °C til 95,0 °C, tilvækst 0,5 °C.
15. immunofluorescens farvning af myosin tung kæde 2 (MYH2) og dystrofin protein udtryk
- Plade doxycyclin-induceret, Lenti-TRE-MyoD modificerede celler fra trin 13,4 til 8-Well Culture slides.
- Fastgør cellerne i 4% formaldehyd i 15 minutter ved stuetemperatur, og vask derefter diasene to gange i PBS i 5 minutter hver gang.
- Bloker cellerne med 5% gede serumprotein fortyndingsmiddel i 1 time ved stuetemperatur.
- Tilsæt kanin-anti-dystrophin antistof (1:300) og mus-anti-MYH2 antistof (1:100) til slidene, Inkuber ved 4 °C natten over i et befuret kammer.
- Kassér den primære antistof opløsning, vask cellerne 3x (5 min/vask) i PBS, tilsæt 1:400 fortyndet Alexa488-konjugeret ged-anti-kanin antistof og Alexa555-konjugeret ged-anti-mus antistof til slides, og Inkuber i 45 min ved stuetemperatur.
- Vask slidene 3x (5 min/vask) i PBS, og monter sektioner med monterings medium, der indeholder DAPI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etablering af DMDMDX Skin fibroblaster afledt IPSC. Vi demonstrerede effektiviteten af at generere mus iPSCs fra DMDMDX mus afledt hud fibroblast ved hjælp af integration-fri omprogrammering vektorer. Figur 1a viste, at forekomsten af embryonale stamceller (ESC)-lignende kolonier på tre uger efter infektion. Vi evaluerer effektiviteten af iPSC induktion ved levende alkalisk fosfatase (AP) bejdsen; Figur 1b viser, at procentdelen af AP-positive celler var ca. 1,8% ved FACS-analyse. SSEA1, Lin28, nanog, OCT4 og SOX2, pluripotens markører for mus embryonale stamceller, var positive for IPSC kolonier ved immunfluorescent farvning, (figur 1c). For at undersøge de tre kimcelle differentiering af ipscs in vivo, vi intramuskulært injiceres ipscs i mus gastrocnemii. Vi bemærkede, at de injicerede iPSCs differentieret i leveren celler (endoderm), glatte muskelceller (mesoderm), og adrenerge neuron celler (ectoderm) (figur 1d), tilsigtning pluripotens af ipscs.
Crispr/Cas9-mediated exon23 sletning. Vi designede to guide RNAs, der flankerer mutant exon 23. Efter Cas9-medierede, dobbeltstrengede pauser (DSB) og ikke-homologe end-sammenslutning (NHEJ) blev mutant exon 23 slettet, hvilket gav mulighed for afkortet, men funktionel dystrofin produktion (figur 2a). For at identificere exon 23 slettede mus iPSC, celler var sparsomt seedet, og individuelle kolonier blev plukket og formeret. Genomic DNAs ekstraheret fra disse kolonier blev udsat for PCR-genotypebestemmelse. Figur 2b viste, at koloni #1 og #2 har exon 23 sletninger tyder på en vellykket sletning af exon 23.
Differentierer mus ipscs i en myogen afstamning og genoprette dystrofin udtryk. Vi bruger et tetracyclin-inducerbart MyoD ekspressionssystem til at inducere myogen differentiering af iPSCs. Doxycyclin blev anvendt til at inducere MyoD-ekspression i iPSCs. Figur 3a viser tidsforløbet for muskel differentiering i DOX-behandlede ipscs. qRT-PCR viste, at mRNA-niveauet for OCT4, en pluripotente markør, gradvist faldt, mens ekspression af ACTA1, en skeletmuskulatur markør, steg efter DOX-induktion. Også, vi observerede myotubes dannelse på to uger efter DOX behandling (figur 3b). Det er vigtigt, at qRT-PCR-Analysen viste genfinding af DMD exon 24 mRNA-ekspression i DOX-induceret, Cas9-medieret Exon23 slettet linje i forhold til Cas9-kontrol linje (figur 3c). Inkonsistent med QRT-PCR, immunfluorescent farvning viser dystrofin protein expressionin Cas9-mediated exon 23 slettede celler, mens dystrofin udtryk var fraværende i kontrol celler (figur 3D).
Figur 1: omprogrammering af hudfibroblaster fra DMDMDX -mus til ipscs.
A) repræsentativt billede af es-lignende kolonier (skala stang = 200 μm). (B) FACS analyse af omprogrammering effektivitet af mus hud fibroblaster i ipscs efter 8 dage af Sendai virus transduktion ved levende AP farvning. C) Immunofluorescent farvning af SSEA1, Lin28, Nanog, OCT4 og SOX2 i ipscs (Scale bar = 50 μm). D) Immunofluorescent farvning af AFP (endoderm), sma (mesoderm) og tyrosinhydrolase (th) (ectoderm) af teratom 2 uger efter IPSC-injektion i gastrocnemii (skala stang = 20 μm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: CRISPR/Cas9-mediated exon23 sletning.
(A) skematisk diagram over Crispr/Cas9-mediated exon 23 sletninger. Cas9 nuclease mål intron 22 og intron 23 af to gRNAs. Dobbelt-strandede pauser (DSBs) af Cas9 resulterer i excision af mutant exon 23. De distale ender repareres af ikke-homologe ende slutter (nhej), hvilket resulterer i restaurering af læse rammen af dystrofin genet. B) PCR-genotype analyse af exon 23. Pilen angiver PCR-produktet af exon 23. GAPDH fungerer som reference. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: differentiering af muse ipscs i den myogene slægt og gendannelse af dystrofin-ekspression.
A) QRT-PCR viste tidsforløbet for mRNA-niveauet for OCT4 og ACTA1 i DOX-behandlet exon 23-slettet DMDMDX IPSC (* P < 0,05 vs d0, D6, D10, #P < 0,05 vs d0, D3, D10, $P < 0,05 vs d0, D3, D6, n = 4 for Oct4) (* P < 0,05 vs D6 og D10 , #P < 0,05 vs. d0, D3 og D10, $P < 0,05 vs. d0, D3 og D6, n = 3 for ACTA1). (B) venstre: repræsentativt billede af myotube dannelse fra DOX-induceret mus ipscs (Scale bar = 200 μm). Til højre: Immunofluorescent analyse af MYH2 i myotube dannelse fra DOX-induceret mus iPSCs (Scale bar = 20 μm). C) øvre: PCR-primer-POSITIONERNE for DMD Exon22, Exon23 og Exon24 Bund: qRT-PCR-analyse af mRNA-niveauet for DMD Exon22, Exon23 og Exon24 udtryk i MPC (* * * * P < 0,0001, n = 3). D) Immunofluorescent analyse af dystrofin ekspression i DOX-induceret MPC fra IPSCCas9-CTRL og IPSCCas9-grna (Scale bar = 50 μm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Guide primere | |
| i22 Sense | 5 '-CACCGTTAAGCTTAGGTAAAATCAA-3 ' |
| i22 antisense | 5 '-AAACTTGATTTTACCTAAGCTTAAC-3 ' |
| i23 Sense | 5 '-CACCGAGTAATGTGTCATACCTTCT-3 ' |
| I23 antisense | 5 '-AAACAGAAGGTATGACACATTACTC-3 ' |
| PCR primere | |
| OCT4-fremad | 5 '-AGCTGCTGAAGCAGAAGAGGATCA-3 ' |
| OCT4-omvendt | 5 '-TCTCATTGTTGTCGGCTTCCTCCA-3 ' |
| ACTA1-fremad | 5 '-GATCCATGAGACCACCTACAAC-3 ' |
| ACTA1-omvendt | 5 '-TCAGCGATACCAGGGTACAT-3 ' |
| Exon22-fremad | 5 '-TTACCACCAATGCGCTATCA-3 ' |
| Exon22-omvendt | 5 '-CCGAGTCTCTCCTCCATTATTTC-3 ' |
| Exon23-fremad | 5 '-CCAAGAAAGCACCTTCAGAAATATG-3 ' |
| Exon23-omvendt | 5 '-TTTGGCAGCTTTCCACCA-3 ' |
| Exon24-fremad | 5 '-AAC CTT ACA GAA ATG GAT GGC-3 ' |
| Exon24-omvendt | 5 '-TTTCAGGATTTCAGCATCCC-3 ' |
| GAPDH-fremad | 5 '-TGACAAGCTTCCCATTCTCG-3 ' |
| GAPDH-baglæns | 5 '-CCCTTCATTGACCTCAACTACAT-3 ' |
Tabel 1: primer-sekvens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Duchenne muskeldystrofi (DMD) er en destruktiv og i sidste ende dødelig arvelig sygdom karakteriseret ved en mangel på dystrofin, fører til progressiv muskelatrofi1,2. Vores resultater viser det restaurerede dystrofin-genekspression i DMDMDX IPSC-afledte myogene stamceller ved tilgangen af crispr/Cas9-medieret exon23 sletning. Denne fremgangsmåde har tre fordele.
Først genererede vi iPSCs fra DMDMDX Mouse-afledte Dermal fibroblaster ved hjælp af en ikke-integreret RNA-vektor. En række forskellige metoder er blevet udviklet til at generere iPSCs, såsom lentiviral og retrovirale vektorer, som vil integrere i Host kromosomer at udtrykke omprogrammering gener, og dermed bærer sikkerhedsmæssige betænkeligheder. DNA-baserede vektorer såsom plasmid vektorer, adeno-associerede vira og adenoviruser findes på en ikke-integreret måde; de kan dog stadig integreres i værts kromosom ved en lav frekvens. I denne undersøgelse brugte vi en modificeret, ikke-overførbar Sendai-virus, en ikke-integreret RNA-vektor, til sikkert og effektivt at levere stamcelle transkriptionsfaktorer til fibroblaster til omprogrammering.
Dernæst bruger vi crispr-mediated genom sletning, snarere end crispr/Cas9-mediated Precision gen korrektion, at genoprette dystrofin udtryk i ipscs. Denne metode er gennemførlig og effektiv; Det er nemt at designe flere gRNAs at slette flere mutant exons, som forekommer i mange humane DMD patienter17. Exon deletion udnytter en relativt effektiv ikke-homologe end-sti, og metoden undgår også behovet for at levere en DNA-reparations skabelon. Derfor, i sammenligning med Cas9-medieret præcision korrektion, Cas9-medieret exon sletning er egnet til DMD patienter med flere genmutationer.
Endelig inducerede vi udifferentierede ipscs i myogene stamceller, hvilket kan nedsætte risikoen for tumor forårsaget af ipscs. I denne protokol inducerede vi myod-ekspression via et inducerbart tetracyclin-reguleret (tet-on) vektorsystem til at differentiere ipscs i skeletmuskulatur progenitorer18,19.
Afslutningsvis, kombinationen af crispr/Cas9 genom redigering med tet-on myod aktiveringssystem kan give en sikker, gennemførlig og effektiv strategi for mutant DMD-Exon23 sletning i stamceller til celletransplantation hos DMD patienter.
Hvis du vil udvælge og høste es-lignende celler effektivt, bør vi identificere de udifferentierede IPSC-celler via deres Dome-lignende morfologi, og en håndskrift Object-markør kan hjælpe os med at mærke individuelle kloner fra bunden af kultur skålen med en 1,8 mm cirkel omkring IPSC Kloner. For at undgå lækage af trypsin-opløsning skal vi anvende fedt jævnt på bunden af ringene. Efter at have placeret de fedt belagte ringe på toppen af de mærkede celle kolonier bør man også være forsigtig med ikke at røre ved ringene. Ellers vil iPSC klonerne blive løsrevet.
Protokollen har sine begrænsninger; for eksempel valgte vi et ikke-integreret RNA-vektorsystem til at generere iPSCs. Men, vi brugte en lentiviral CRISPR/Cas9 system til at slette DMD exon 23 og en lentiviral-baserede MyoD aktivering system til at inducere iPSC myogenic differentiering; disse Integrative lentiviral vektorer har sikkerhedsmæssige betænkeligheder. Men, disse spørgsmål kan løses ved anvendelse af en ribonucleoprotein (RNP) kompleks bestående af en rekombinant, høj renhed S. pyogenes Cas9 nuclease med en crRNA: tracrRNA duplex; Vi kan vælge kemisk modificeret myod mRNA transfektering til direkte at differentiere ipscs til myogenic stamfader, selv om effektiviteten kan være udfordrende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Tang og Weintraub blev delvist støttet af NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Instruments | |||
| 31-gauge needle | Various | ||
| Sharp Incision | Various | ||
| Sterile Scalpels | Various | ||
| Tweezers | Various | ||
| Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.1 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 1 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 87 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 10 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 1 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 1 mL |
| TVP solution (for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Chicken Serum | Gibco | 16110-082 | 5 mL |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | 186 mg |
| Phosphat-buffered saline | to 500 mL | ||
| Trypsin (2.5%) | Thermo | 15090046 | 5 mL |
| mES growth medium(for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.5 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 408.5 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 75 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 5 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 500 μL |
| MEK/GS3 Inhibitor Supplement | EMD Millipore Corp | CS210510-500UL | 500 μL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 5 mL |
| The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks. | |||
| mES frozen medium(for 50 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | SIGMA | D2650 | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 24.9 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 25 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 50 μL |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | RRID |
| 0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA | CORNING | 25-052-CI | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo scientific | J19943-k2 | |
| Accutase solution | SIGMA | A6964 | Cell detachment solution |
| AgeI-HF | NEB | R3552L | |
| Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody | Invitrogen | A32723 | AB_2633275 |
| Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32731 | AB_2633280 |
| Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32732 | AB_2633281 |
| anti-AFP | Thermo scientific | RB-365-A1 | AB_59574 |
| anti-α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP | CST | 19245S | AB_2734735 |
| anti-Dystrophin | Thermo | PA5-32388 | AB_2549858 |
| anti-LIN28A (D1A1A) XP | CST | 8641S | AB_10997528 |
| anti-MYH2 | DSHB | mAb2F7 | AB_1157865 |
| anti-Nanog-XP | CST | 8822S | AB_11217637 |
| anti-Oct-4A (D6C8T) | CST | 83932S | AB_2721046 |
| anti-Sox2 | abcam | ab97959 | AB_2341193 |
| anti-SSEA1(MC480) | CST | 4744s | AB_1264258 |
| anti-TH (H-196) | SANTA CRUZ | sc-14007 | AB_671397 |
| Alkaline Phosphatase Live Stain (500x) | Thermo | A14353 | |
| Blasticidin S | Sigma-Aldrich | 203350 | |
| BsmBI/Esp3I | NEB | R0580L/R0734L | |
| Carbenicillin | Millipore | 205805-250MG | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Competent Cells | TakaRa | 636763 | |
| CutSmart | NEB | B7204S | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo | A16517 | |
| DirectPCR Lysis Reagent (cell) | VIAGEN BIOTECH | 302-C | |
| Dispase (1 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP26535 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101L | |
| Fibronectin bovine plasma | SIGMA | F1141 | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit (500) |
QIAGEN | 20051 | |
| Gelatin from porcine skin, type A | SIGMA | G1890 | |
| HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1500 | |
| Hygromycin B (50 mg/mL) | Invitrogen | 10687010 | |
| Ketamine HCL Injection | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | 45822 | |
| KpnI-HF | NEB | R3142L | |
| lenti-CRISPRv2-blast | Addgene | 83480 | |
| lenti-Guide-Hygro-iRFP670 | Addgene | 99377 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000015 | |
| LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60625 | |
| LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60626 | |
| Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit | Vector | BMK-2202 | |
| NotI-HF | NEB | R3189L | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | ThermoFisher | 31985070 | |
| Polyethylene glycol 4,000 | Alfa Aesar | AAA161510B | |
| Polybrene | SIGMA | TR1003 | |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide | CORNING | CB354688 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | A25742 | |
| PrimeSTAR Max Premix | TakaRa | R045 | |
| Proteinase K | VIAGEN BIOTECH | 507-PKP | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals | ICN19453980 | |
| qPCR Lentivirus Titration Kit | abm | LV900 | |
| Quick ligation kit | NEB | M2200S | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100) | QIAGEN | 12945 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo scientific | K1691 | |
| RNAzol RT | Molecular Research Center, INC | RN 190 | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Terrific Broth Modified | Fisher BioReagents | BP9729-600 | |
| ViralBoost Reagent (500x) | ALSTEM | VB100 |
References
- Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).
- Batchelor, C. L., Winder, S. J. Sparks, signals and shock absorbers: how dystrophin loss causes muscular dystrophy. Trends Cell Biology. 16 (4), 198-205 (2006).
- Gregorevic, P., et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).
- Bengtsson, N. E., Seto, J. T., Hall, J. K., Chamberlain, J. S., Odom, G. L. Progress and prospects of gene therapy clinical trials for the muscular dystrophies. Human Molecular Genetics. 25 (R1), R9-R17 (2016).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351 (6271), 407-411 (2016).
- Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 400-403 (2016).
- Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 403-407 (2016).
- Long, C., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345 (6201), 1184-1188 (2014).
- El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circulation Research. 121 (8), 923-929 (2017).
- Amoasii, L., et al. Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 362 (6410), 86-91 (2018).
- Eisen, B., et al. Electrophysiological abnormalities in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes generated from Duchenne muscular dystrophy patients. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 2125-2135 (2019).
- Marion, R. M., et al. Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- Sacco, A., et al. Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice. Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).
- Su, X., et al. Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
- Su, X., et al. Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 412-419 (2018).
- Ousterout, D. G., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nature Communications. 6, 6244 (2015).
- Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
- Glass, K. A., et al. Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties. Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).
