Summary
Hier stellen wir ein Cas9-basiertes Exon23-Löschprotokoll vor, um die Dystrophinexpression in iPSC von Dmdmdx Maus-abgeleiteten Hautfibroblasten wiederherzustellen und iPSCs direkt in myogene Vorläuferzellen (MPC) mit dem Tet-on MyoD Aktivierungssystem zu differenzieren.
Abstract
Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) ist eine schwere progressive Muskelerkrankung, die durch Mutationen im Dystrophin-Gen verursacht wird, was letztlich zur Erschöpfung der Muskelvorläuferzellen führt. Die regelmäßig interspaceed short palindromic repeats/CRISPR-associated 9 (CRISPR/Cas9) Genbearbeitung hat das Potenzial, die Expression des Dystrophin-Gens wiederherzustellen. Autologinduzierte induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) abgeleitete Muskelvorläuferzellen (MPC) können den Stamm-/Vorläuferzellpool auffüllen, Schäden reparieren und weitere Komplikationen in DMD verhindern, ohne eine Immunantwort zu verursachen. In dieser Studie führen wir eine Kombination aus CRISPR/Cas9 und nicht integrierten iPSC-Technologien ein, um Muskelvorläufer mit wiedergewonnener Dystrophin-Proteinexpression zu erhalten. Kurz gesagt, verwenden wir einen nicht integrierenden Sendai-Vektor, um eine iPSC-Linie aus dermalen Fibroblasten von Dmdmdx-Mäusen zu erstellen. Wir verwenden dann die CRISPR/Cas9-Löschstrategie, um die Dystrophinexpression durch eine nicht-homologe Endverbindung des regerahmten Dystrophin-Gens wiederherzustellen. Nach der PCR-Validierung der Exon23-Erschöpfung in drei Kolonien aus 94 ausgewählten iPSC-Kolonien differenzieren wir iPSC in MPC durch Doxycyclin (Dox)-induzierte Expression von MyoD, einem wichtigen Transkriptionsfaktor, der eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Muskeldifferenzierung spielt. Unsere Ergebnisse zeigen die Durchführbarkeit der Verwendung der CRISPR/Cas9-Löschstrategie zur Wiederherstellung der Dystrophinexpression in iPSC-abgeleitetem MPC, die ein erhebliches Potenzial für die Entwicklung zukünftiger Therapien zur Behandlung von DMD hat.
Introduction
Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) ist eine der häufigsten Muskeldystrophien und zeichnet sich durch das Fehlen von Dystrophin aus, von dem 1 von etwa 5.000 neugeborenen Jungen weltweit betroffen ist1. Der Verlust der Dystrophin-Genfunktion führt zu strukturellen Muskeldefekten, die zu einer progressiven Myofiberdegeneration1,2führen. Das rekombinante adenoassoziierte Virus (rAAV)-vermittelte Gentherapiesystem wurde getestet, um die Dystrophinexpression wiederherzustellen und die Muskelfunktion zu verbessern, wie z. B. Genersatz mittels Mikrodystrophine (-Dys). Der rAAV-Ansatz erfordert jedoch wiederholte Injektionen, um die Expression des funktionellen Proteins3,4aufrechtzuerhalten. Daher brauchen wir eine Strategie, die eine effektive und dauerhafte Wiederherstellung der Dystrophin-Genexpression bei Patienten mit DMD bietet. Die Dmdmdx Maus, ein Mausmodell für DMD, hat eine Punktmutation in exon 23 des Dystrophin-Gens, die ein vorzeitiges Beendigungscodon einführt und zu einem nicht-funktionellen abgeschnittenen Protein führt, das nicht die C-terminale dystroglygische Bindungsdomäne enthält. Jüngste Studien haben den Einsatz der CRISPR/Cas9-Technologie zur Wiederherstellung der Dystrophin-Genexpression durch genaue Genkorrektur oder mutierte Exon-Deletion bei kleinen und großen Tieren5,6,7gezeigt. Long et al.8 berichtete über die Methode zur Korrektur der Dystrophin-Genmutation in Dmdmdx Mauskeimbahn durch homology-directed repair (HDR) basierte CRISPR/Cas9 Genombearbeitung. El Refaey et al.9 berichteten, dass rAAV das mutierte Exon 23 bei dystrophischen Mäusen effizient verbrauchen konnte. In diesen Studien wurden gRNAs in den Introns 20 und 23 entwickelt, um doppelsträngige DNA-Brüche zu verursachen, die die Dystrophinexpression nach DNA-Reparatur über nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) teilweise wiederhergestellt haben. Noch spannender ist, dass Amoasii et al.10 kürzlich über die Wirksamkeit und Machbarkeit der rAAV-vermittelten CRISPR-Genbearbeitung bei der Wiederherstellung der Dystrophinexpression in Canine-Modellen berichtet haben, ein wesentlicher Schritt in der zukünftigen klinischen Anwendung.
DMD verursacht auch Stammzellstörungen11. Bei Muskelschäden füllen die muskuchen Muskelstammzellen nach der Muskeldifferenzierung sterbende Muskelzellen auf. Jedoch, die aufeinanderfolgenden Zyklen der Verletzung und Reparatur führen zu Verkürzung der Telomere in Muskelstammzellen12, und vorzeitige Erschöpfung der Stammzellbecken13,14. Daher kann eine Kombination aus autologer Stammzelltherapie mit Genombearbeitung zur Wiederherstellung der Dystrophinexpression ein praktischer Ansatz zur Behandlung von DMD sein. Die CRISPR/Cas9-Technologie bietet die Möglichkeit, autologe genetisch korrigierte induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) zur funktionellen Muskelregeneration zu erzeugen und weitere Komplikationen von DMD zu verhindern, ohne eine Immunabstoßung zu verursachen. IPSCs haben jedoch ein Risiko für eine Tumorbildung, die durch die Differenzierung von iPSC in myogene Vorläuferzellen gemildert werden könnte.
In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung des nicht integrierenden Sendai-Virus zur Umprogrammierung dermaler Fibroblasten von Dmdmdx-Mäusen in iPSCs und dann die Dystrophinexpression durch CRISPR/Cas9-Genomlöschung. Nach der Validierung der Exon23-Deletion bei iPSC durch Genotypisierung differenzierten wir genomkorrigiertes iPSC in myogene Vorläufer (MPC) über MyoD-induzierte myogene Differenzierung.
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Protocol
Alle Tierbehandlungen und chirurgischen Eingriffe wurden durch ein Protokoll durchgeführt, das vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Universität Augusta genehmigt wurde. Mäuse wurden mit Standarddiät und Wasser ad libitum gefüttert.
1. Isolierung von primären Maus-Fibroblasten von erwachsenen Dmdmdx Mäusen
- Euthanisieren Erwachsene Dmdmdx Mäuse (männlich, 2 Monate alt) durch CO2 Erstickung und Thorakotomie nach IACUC genehmigt von Medical College of Georgia, Augusta University. Schneiden Sie den Schwanz mit einem sterilen Skalpell in einem sterilen Zustand unter der laminaren Haube. Den Schwanz mit 70% Ethanol für 5 min abspülen und dann mit steriler Phosphat-gepufferter Saline (PBS) in einer 6 cm Schale waschen.
- Schälen Sie die Schwanzhaut durch einen scharfen Schnitt von der Basis bis zur Schwanzspitze entlang der Schwanzhaut, und schälen Sie dann sanft die Schwanzhaut mit einer Pinzette ab. Die Haut mit einem sterilen Skalpell auf eine Größe von 1 mm3 zerkleinern und das gehackte Hautgewebe in Dulbeccos minimalem essentiellen Medium/Schinken F12 (DMEM/F12) mit 0,1% Kollagennase IV und 1 U/ml Dispase auf eine 6 cm große Schale bewegen.
- Das Hautgewebe in einer Kulturschale für 2 h bei 37 °C in einem 5%CO2-Inkubator verdauen.
- Mantel einer 6-Well-Platte mit Fibronectin und 0,2% Gelatine (1 ml Fibronectin in 199 ml von 0,2% Gelatine; Materialtabelle) und bei 37 °C für 1 h inkubieren.
- Dissoziieren Sie das verdaute Hautgewebe mit einer 1 ml Pipettenspitze und übertragen Sie das Gewebe und den Überstand in ein steriles 15 ml konisches Zentrifugenrohr. Zentrifuge bei 217 x g für 3 min bei Raumtemperatur, den Überstand entsorgen und das Pellet in 1,5 ml Fibroblastenmedium(Materialtabelle)wieder aufsetzen.
- Kultur die Pellets einschließlich unvollständig verdautem Hautgewebe ab Schritt 1.5 auf der mit Fibronectin beschichteten 6-Well-Platte und 0,2% Gelatine ab Schritt 1,4 in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator. Ersetzen Sie das Medium 24 h nach der ersten Beschichtung, um nicht angefügte Zellen zu entfernen, und ändern Sie das Medium alle 48 h.
2. Umprogrammierung von Maushaut-Fibroblasten in iPSCs
- Zwei Tage vor der Transduktion verdauen Maus dermale Fibroblasten aus Schritt 1.6 mit der Zellablösung (Materialtabelle) in einem 37 °C Inkubator mit einer befeuchteten Atmosphäre von 5%CO2 für 5 min.
- Zählen Sie Zellen mit einem Hemacytometer und Zentrifuge bei 217 x g für 3 min.
- Samenzellen mit einer Dichte von 1x2 x 105 Zellen pro Brunnen auf eine 6-Well-Platte und Kultur mit Fibroblastenmedium (Materialtabelle) in einem 37 °C Inkubator mit einer befeuchteten Atmosphäre von 5%CO2.
- Schätzen Sie am Tag der Transduktion (Tag 0) die Zellen und berechnen Sie das Volumen jedes Virus, das erforderlich ist, um die Zielvielzahl der Infektion (MOI) von 5, 5 und 3 (d.h. KOS MOI = 5, hc-Myc MOI = 5, hKlf4 MOI = 3) gemäß dem handelsüblichen Handbuch zu erreichen.
- Drei Sendai-Rohre in einem 37 °C-Wasserbad für 5 bis 10 s auftauen und die berechneten Volumina der drei Sendai-Röhren zu 1 ml Fibroblastenmedium(Materialtabelle)hinzufügen.
- Entfernen Sie das Fibroblastenmedium aus Schritt 2.3 und fügen Sie die Neuprogrammierungsvirusmischung in die Brunnen ein, die die Zellen enthalten. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht in einem 37 °C Inkubator mit einer befeuchteten Atmosphäre von 5%CO2.
- Ersetzen Sie das Medium nach der Transduktion durch frisches Fibroblastenmedium 24 h. Kultur die Zellen für eine Woche mit mittlerem Austausch jeden zweiten Tag.
- Ernten Sie infizierte Maus-Fibroblasten am Tag 7 nach der Transduktion mit 0,05% Trypsin/EDTA und legen Sie sie auf Gerichte, die zuvor mit Fibronectin und 0,2% Gelatine beschichtet waren.
- Kultur die infizierten Maus-Fibroblasten aus Schritt 2.6 mit komplettem mausembryonalen Stammzell (ES) Wachstumsmedium (Materialtabelle) in einem 37 °C-Inkubator mit einer befeuchteten Atmosphäre von 5%CO2 und täglich mittleres Wechselmedium.
- Beobachten Sie ab dem 8. Tag die Platte unter einem invertierten Mikroskop jeden zweiten Tag, um das Auftreten von Zellklumpen mit der Morphologie der Maus ES zu identifizieren.
3. Verwendung von alkalischer Phosphatase Lebendfleck und Durchflusszytometrie zur Quantifizierung der Reprogrammierungseffizienz
- Entfernen Sie die Kulturmedien aus jedem Brunnen und spülen Sie mit DMEM/F-12 für 2 x 3 min.
- Tragen Sie 2 ml 1x 1x alkalische Phosphatase (AP) lebende Fleckenarbeitslösung (1:500 Verdünnung in DMEM/F-12) auf die anhaftenden Zellen auf und in einem 37 °C-Inkubator mit einer befeuchteten Atmosphäre von 5%CO2 für 30 min inkubieren.
- Aspirieren Sie den AP-Live-Färbung und waschen Sie zweimal mit PBS für jeweils 5 min.
- Verdauen Sie die Zellen mit der Zellablösung (Materialtabelle) in einem 37 °C-Inkubator mit einer befeuchteten Atmosphäre von 5%CO2 für 5 min. Führen Sie die Durchflusszytometrie durch, um die Reprogrammierungseffizienz zu bestimmen.
4. Auswahl und Ernte von ES-ähnlichen Zellen
- Untersuchen Sie die Kolonien ab Schritt 2.8 unter einem invertierten Mikroskop.
- Markieren Sie die Kolonien am boden der Schale mit einem selbstfänzigen Objektmarker.
- Tragen Sie gefettete Klonringe auf, um die markierten Zellkolonien abzudecken. Fügen Sie jedem Klonring bei 37 °C für 5 min 100 l 0,05 % Trypsin/EDTA hinzu und übertragen Sie dann die verdauten Zellen mit 100 L Pipettenspitzen auf 48-Well-Kulturplatten, die mES-Wachstumsmedium enthalten.
- Inkubieren Sie die Zellen in 48-Well-Kulturplatten in einem 37 °C-Inkubator mit einer befeuchteten Atmosphäre von 5%CO2. Durchkommen Sie die Zellen auf 6 cm Schale, wenn sie 70% Zusammenfluss erreichen.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.3 und 4.4 mehrmals, bis einheitliche Wohnheim-förmige Klone erhalten sind.
5. Einfrieren von iPSCs zur Kryokonservierung
- Trennen Sie die ausgewählten iPSCs von Schritt 4.5 mit Trypsin, Versene und Kükenplasma (TVP; Materialtabelle) Lösung bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator für 30 min.
- Sammeln Sie die Zellen in einem sterilen 15 ml konischen Rohr und Zentrifuge bei 217 x g für 3 min bei Raumtemperatur.
- Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 2 ml Maus ES gefrorenes Medium (Tabelle der Materialien) wieder auf, um 1 ml pro Kryovial zu erhalten.
- Fügen Sie den Kryovials Zellen hinzu und frieren Sie mit einem Gefrierbehälter ein, der die kritische, wiederholte -1 °C/min Kühlrate liefert, die für die Kryokonservierung bei -80 °C über Nacht erforderlich ist.
- Gefrorene Fläschchen in einen flüssigen Stickstofftank übertragen.
6. Immunfluoreszenzfärbung für Stammzellmarker in iPSCs
- Saat-iPSCs von Schritt 5.1 mit mES-Medium zu einem 8-Well-Kammerschlitten, der mit Poly-D-Lysin/Laminin(Materialtabelle)mit entsprechender Dichte beschichtet ist, um zwischen 1 x 2 x 104 Zellen pro Bohrkörper zu erreichen und in einem 37 °C-Inkubator mit einem befeuchtete Atmosphäre von 5%CO2 für 48 h.
- Tauchen Sie die Dias in 4% Formaldehyd für 15 min bei Raumtemperatur ein, und tauchen Sie die Dias dann zweimal für 5 min ein.
- Inkubieren Sie Abschnitte mit einem Maus-IgG-blockierenden Reagenz (Materialtabelle) und 5% Ziegenserum für 1 h bei Raumtemperatur.
- Verdünnen Sie die primären Antikörper in Proteinverdünnungsmittel (Maus-Anti-SSEA1, 1:100, Kaninchen-Anti-Nanog, 1:500; Kaninchen-Anti-POU-Klasse 5 Homöobox 1 [OCT4], 1:500; Kaninchen-Anti-SRY-Box 2 [SOX2], 1:500; Kaninchen-Anti-Lin-28 Homolog A [Lin28A], 1:400) (Tabelle Materialien). Antikörper auf die Zellen auftragen und bei 4 °C über Nacht in einer befeuchteten Kammer brüten.
- Entsorgen Sie die primäre Antikörperlösung und waschen Sie die Dias 3x in PBS.
- Zweite Antikörper (Alexa488-konjugierte Ziegen-Anti-Maus-Antikörper und Alexa555-konjugierte Ziege-Anti-Kaninchen, jeweils 1:400) in M.O.M.-Proteinverdünnung auf Dias auftragen und 45 min bei Raumtemperatur brüten.
- Waschen Sie die Dias 3x in PBS und montieren Sie Abschnitte mit Montagemedium mit 4'6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI).
- Nehmen Sie Bilder mit einem konfokalen Mikroskop auf.
7. Untersuchung der Pluripotenz von iPSCs in vivo
- Dissoziieren Sie die iPSCs von Schritt 5.1 in Einzelzellen mit TVP-Lösung in einem 37 °C-Inkubator mit einer befeuchteten Atmosphäre von 5%CO2 für 30 min.
- Zählen Sie Zellen mit einem Hemacytometer und Zentrifuge bei 217 x g für 3 min.
- Den Überstand ansaugen und das Pellet mit mES-Medium in einem 1,5 ml sterilen Zentrifugenrohr in einer Konzentration von 5 x 105 Zellen/30 l für die Zelltransplantation wieder aufsetzen.
- Entfernen Sie Das Haar von beiden Hinterbeinen von immundefizienten Mäusen mit Haarclippern.
- Mäuse mit Ketamin (100 mg/kg) ansietheisieren und die Injektionsstelle mit 75% Alkohol reinigen.
- Intramuskulär in die Gastrocnemii mit einer 31 G-Nadel injizieren.
- Zwei Wochen nach der Injektion die Maus gastrocnemii ernten und in eine optimale Schnitttemperatur (OCT) einbetten, einfrieren und in 5-m Abschnitte15,16schneiden.
- Befestigen Sie Abschnitte in 4% Formaldehyd für 15 min bei Raumtemperatur, und waschen Sie dann die Dias zweimal in PBS für 5 min jedes Mal.
- Blockieren Sie die Zellen mit 5% Ziegenserumprotein verdünnbar für 1 h bei Raumtemperatur.
- Verdünnter Primärantikörper (Kaninchen anti-AFP, 1:50; Kaninchen anti-SMA, 1:50; Kaninchen-Anti-TH, 1:50) zu den Dias geben und bei 4 °C über Nacht in einer befeuchteten Kammer brüten.
- Entsorgen Sie die primäre Antikörperlösung, waschen Sie die Zellen 3x (5 min/wash) in PBS, fügen Sie einen 1:400 verdünnten Alexa555-konjugierten Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper zu Dias hinzu und brüten 45 min bei Raumtemperatur.
- Schlitten 3x (5 min/Wash) in PBS waschen und Abschnitte mit Montagemedium mit DAPI montieren.
8. Bau von CRISPR/Cas9 lentiviralen Vektor, der auf Introns abzielt, die Dystrophin exon 23 flankieren
- Entwerfen Sie zwei Paare von gRNA-Oligos, die auf intron-flankiertes Dystrophin exon 23 über http://crispor.tefor.net/crispor.py abzielen.
HINWEIS: Die entworfenen Paare sind wie folgt:
i22Sense: 5'-CACCGTTAAGCTTAGGTAAAAATCAA- 3'
i22Anti-Sinn: 5'-AAACTTGATTTTACCTAAGCTTAAC-3'
i23Sense: 5'-CACCGAGTAATGTGTCATACCTTCT- 3'
i23Anti-Sinn: 5'-AAACAGAAGGTATGACACATTACTC-3'). - Verdauen und dephosphorylieren 5 g lentivirales CRISPR-Plasmid (lenti-CRISPRv2-blast [ein Geschenk von Mohan Babu] und lenti-Guide-Hygro-iRFP670 [ein Geschenk von Kristen Brennand]) (Materialtabelle) mit BsmB1/Esp3I für 30 min bei 37 °C. Für 5 g Plasmide, fügen Sie 3 l BsmB1-Restrict-Enzym, 3 l schnelle alkalische Phosphatase, 6 l 10x Enzym-Digest-Puffer und 0,6 l von 100 mM DTT in 60-L-Reaktion hinzu.
- Laden Sie die Reaktionen auf ein 0,8% Agarose-Gel. Führen Sie das Gel bei 100 bis 150 V für 30 min.
- Reinigen Sie verdautes Plasmid in-Gel mit einem Gel-Extraktions-Kit (Tabelle der Materialien) und elute in 20 l von H2O.
- Phosphorylat und Anneal jedes Paar der gRNA-Oligonukleotide, die 1 l jedes Oligonukleotids bei 100 m, 1 l 10x T4-Ligationspuffer, 0,5 l T4-Polynukleotidkinase (PNK), 6,5 l ddH2O bei 37 °C für 30 min und dann 95 °C für 5 min und bis 25 °C bei 5 °C/min.
- Ligate eine 1:200 Verdünnung der geglühten gRNA-Oligonukleotide in die plentiCRISPR V2-Blast oder plentiGuide-Hygro-iRFP670. Mischen Sie 50 ng BsmB1/Esp3I verdautVektoren mit 1 l verdünntem Oligo-Duplex und 5 l 2x Ligase-Puffer plus 1 l Ligase in einem 11-L-Reaktionssystem und inkubieren Sie 10 min bei Raumtemperatur.
- Führen Sie die Umwandlung mit 3 l Ligationsprodukt in 50 l kompetente Zellen(Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
- Die transformierten, kompetenten Zellen in einer Agarplatte mit 100 g/ml Carbenicillin verteilen und bei 31,5 °C für 18 h inkubieren.
- Pflücken Sie Kolonien mit 10 l sterilen Pipettenspitzen und Kultur in 5 ml toller Brühe (Materialtabelle) mit 100 g/ml Carbenicillin bei 31,5 °C, 185 Umdrehungen pro Minute in einem Shaker-Inkubator für 21 h.
- Reinigen Sie die Plasmid-DNA mit den Mini-Prep- und Midi-Prep-Kits (Table of Materials).
- Überprüfen Sie die Mini-Prep-Plasmide durch Einschränkung der Verdauung. Für das 20-L-Reaktionssystem fügen Sie 1 g Plasmid-DNA, 2 l Verdauungsreaktionspuffer(Materialtabelle) und 1 l Restriktionsenzymgemisch (0,5 l KpnI-HF und 0,5 l AgeI-HF für plentiCRISPR V2-Blast-i22; 0,5 l NotI-HF und 0,5 l EcoRI-HF für EcoRI-HF für plentiGuide-Hygro- iRFP670- i23). Inkubieren Sie das Reaktionssystem für 1 h bei 37 °C.
- Laden Sie die Reaktionen auf ein 0,8% Agarose-Gel. Führen Sie das Gel bei 100 bis 150 V für 30 min.
HINWEIS: Die richtigen Bänder für plentiCRISPR V2-Blast-i22 sollten 622 bp und 12.2 kb sein, und die richtigen Bänder für plentiGuide-Hygro- iRFP670- i23 sollten 2,6 kb und 7,1 kb sein.
9. Lentivirale Vektorverpackung
- Kultur 7 x 105 293FT Zellen in 5 ml DMEM-Medien, die 10% fetales Rinderserum in einer 6 cm Schale über Nacht bei 37 °C, 5%CO2enthalten.
- Bereiten Sie einen Cocktail zu (1 g plentiCRISPR V2-Blast-i22 oder plentiGuide-Hygro-iRFP670-i23, 750 ng psPAX2-Verpackungsplasmid, 250 ng pMD2.G Hüllhüllenplasmid und 5 l Transfektionsreagenz A [Materialtabelle] in 100 l reduziertem MeM-Medium).
- Bereiten Sie eine Mischung aus 5 l Transfektionsreagenz B (Materialtabelle) in 100 l reduziertem Serum MEM-Medien vor.
- Fügen Sie 100 l Transfektionsreagenz B-Gemisch zu Plasmid-Mischung aus Schritt 9.2 und inkubieren für 5 min bei Raumtemperatur.
- Fügen Sie den DNA-Lipid-Komplex (ab Schritt 9.4) tropfenweise zu den 293FT-Zellen hinzu. Über Nacht bei 37 °C mit 5%CO2inkubieren.
- Fügen Sie jedem Gericht am nächsten Tag virusproduction enhancer (500x)(Materialtabelle)hinzu und brüten 24 h bei 37 °C, 5% CO2.
- Sammeln Sie an den nächsten zwei Tagen Mittel aus Zellen, die Pipetten verwenden, und filtern Sie das Medium durch einen 0,45 m Filter, um die Zellen zu entfernen.
10. Konzentration und Reinigung von lentiviralen Vektoren
- Exzipitate lentiviralvektor im Medium Schritt 9.7 über Nacht bei 4 °C mit 5x Polyethylenglykol 4000 (PEG4000, 8,5% Endkonzentration) und 4 M NaCl (0,4 M Endkonzentration).
- Zentrifugieren Sie die viralen Medien, die die PEG4000-Lösung bei 2.095 x g und 4 °C enthalten, für 30 min, entfernen und entsorgen Sie den Überstand.
- Die Pellets mit 500 l Serum reduzierten MEM-Medien (Lentivirus-Titer: lenti-CRISPR V2-gRNAi22: 1,56 x 108, lenti-iRFP6 70-gRNAi23: 1,3 x 108, lenti-CRISPR V2-Steuerung: 3,13 x 107, lenti-iRFP670-Steuerung: 5,9 x 107 ). Bei -80 °C bis zur Verwendung lagern.
11. Löschen von exon 23 in Maus iPSCs mit zwei Führungs-RNAs (gRNAs) gekoppelt mit Cas9
- Die Maus-iPSCs ab Schritt 4.5 in einer 24-Well-Platte mit Fibronectin und Gelatine beschichtet.
- Nachdem die Zellen 50% Zusammenfluss erreicht haben, wechseln Sie zum frischen Kulturmedium (vollständiges embryonales Stammzellwachstumsmedium der Maus), das 8 g/ml Polybren enthält).
- Fügen Sie 100 l der lentiviralen Partikellösung aus Schritt 10.3 einschließlich lenti-CRISPR V2-gRNAi22, lenti-iRFP670-gRNAi23 und Steuerung (leerer Vektor: lenti-CRISPR V2, lenti-iRFP670) zu Maus-iPSCs hinzu. Inkubieren Sie Zellen für 3 Tage bei 37 °C mit 5%CO2.
- Wählen Sie stabil infizierte Zellen mit Medien aus, die 2,5 g/ml Blasticidin und 100 g/ml Hygromycin B enthalten, indem Sie die Minimale Konzentration von Blasticidin und Hygromycin B bestimmen, die erforderlich ist, um die nicht infizierte Zelle abzutöten.
HINWEIS: Nicht infizierte Zellen würden durch Blasticidin und Hygromycin B getötet. - Verdauen Sie die ausgewählten Maus-iPSCs mit 0,5 ml TVP-Lösung jeweils gut (24-Well-Platte) und brüten Zellen für 30 min bei 37 °C mit 5%CO2.
- Dissoziieren Sie die iPSCs in Einzelzellen durch Pipettieren, zählen Sie Zellen mit einer Zellzählkammer und verdünnen Sie dann etwa 150 verdaute Einzelzellen mit mES-Medium in 10 cm Schale für Kultur bei 37 °C mit 5%CO2.
- Nach etwa 10 Tagen wählen Sie einzelne Kolonien unter einem invertierten Mikroskop mit 10 l sterilen Pipettenspitzen (96 Kolonien müssen gepflückt werden).
- Übertragen Sie die gepflückten Kolonien in 50 l TVP-Lösung jeden Brunnen (96-Well-Platte, eine Kolonie jeder Brunnen), verdauen bei 37 °C für 30 min, und säen Sie dann die verdauten Zellen in zwei 96-Well-Kulturplatten, um Kultur zu halten (eine für Genotypisierung).
- Inkubieren Sie in einem CO2-Inkubator bei 37 °C bis 70% konfluent.
12. Identifizierung von iPSC-Kolonien mit exon23-Löschung
- Entfernen Sie das Medium in 96-Well-Platte, wenn die Zellkolonien 70% Zusammenfluss erreichen.
- Fügen Sie jedem Brunnen 25 L Lysereagenz(Materialtabelle) mit Proteinase-K-Lösung (1 ml Proteinase K in 100 ml Lysereagenz) hinzu und übertragen Sie das Lysat auf eine 96-Well-PCR-Platte.
- Versiegeln Sie die PCR-Platte und inkubieren Sie die Platten bei 55 °C für 30 min, und dann bei 95 °C für 45 min, um die Zellen zu lysieren und die Proteinase K zu denaturieren.
- PCR-Reaktion mit 2 l Lysat ab Schritt 12.3 durchführen. Für die 20-L-PCR-Reaktion 2 l Lysat, 10 l 2x DNA-Polymerase-Vormischung(Materialtabelle),7 l DNase-freies Wasser und 1 l DMD-Exon 23-Primer (Tabelle 1) hinzufügen.
- Verwenden Sie die folgenden Parameter für die PCR-Reaktion: 98 °C für 1 min, 35 Zyklen von 98 °C für 10 s, 60 °C für 15 s, 72 °C für 30 s und eine Endverlängerung bei 72 °C für 1 min.
- Laden Sie die PCR-Reaktion auf ein 2% Agarose-Gel. Führen Sie das Gel bei 100 bis 150 V für 30 min.
- Prüfen Sie das Gel unter UV-Licht (die Knockout-Effizienz ist 3/94).
13. Verwendung des Tet-on MyoD-Aktivierungssystems zur direkten Unterscheidung von iPSC in myogene Vorläuferzellen (MPC)
- Verpacken Sie die LV-TRE-VP64-Maus MyoD-T2A-dsRedExpress2 und LV-TRE-VP16 Maus MyoD-T2A-dsRedExpress2 (ein Geschenk von Charles Gersbach) (Materialtabelle) wie zuvor für lenti-CRISPRv2-blast und lenti-gRNA-iRFP670 Vektoren in Abschnitten beschrieben 9 und 10.
- Infizieren Sie Maus iPSC mit lentivirus-TRE-VP64-MyoD-T2A-dsRed-Express2 oder lentivirus-TRE-VP16-MyoD-T2A-dsRedExpress2, wie zuvor für lenti-CRISPRv2-blast und lenti-gRNA-iRFP670 Vektoren in den Schritten 11.1-11.3 beschrieben.
- Wählen Sie nach drei Tagen der Infektion Zellen mit 1 g/ml Puromycin aus, um eine reine transduzierte Zellpopulation zu erhalten.
- Fügen Sie der MPC-Differenzierung 3 g/ml Doxycyclin in Kulturmedien (10% FBS DMEM) hinzu. Ersetzen Sie frisches Medium, das alle zwei Tage durch Doxycyclin ergänzt wird.
14. Quantitative Reverse-Transkription PCR zur Bewertung der dynamischen Muskeldifferenzierung und DMD-Exon-22-24-Expression
- Extrahieren Sie zelluläre RNA nach 0, 3, 6 und 10 Tage nach der Doxycyclin-Behandlung mit RNA-Isolationsreagenz, transkribieren Sie RNA in cDNA mit Hilfe des ersten StrangcDNA-Synthesekits (Table of Materials).
- Für das 20-L-qPCR-Reaktionssystem 1 l cDNA, 10 l PCR-Reaktionspuffer(Materialtabelle),8 l DNA H2O und 1 l Mischung aus Vorwärts- und Rückwärtsprimern (Glyzeraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase [GAPDH], Skelettmuskel [ACTA1], OCT4 und DMD exon22, DMD exon23 und DMD exon24, siehe Tabelle 1).
- Verwenden Sie die folgenden Parameter für die PCR-Reaktion: 50 °C für 2 min, 95 °C für 2 min, 40 Zyklen von 95 °C für 15 s, 60 °C für 1 min, Schmelzkurve 65,0 °C bis 95,0 °C, Inkrement 0,5 °C.
15. Immunfluoreszenzfärbung von Myosin-Schwerketten 2 (MYH2) und Dystrophin-Proteinexpression
- Platte Doxycyclin-induzierte, lenti-TRE-MyoD modifizierte Zellen von Schritt 13.4 auf 8-Well-Kultur-Dias.
- Fix Zellen in 4% Formaldehyd für 15 min bei Raumtemperatur, und dann waschen Sie die Dias zweimal in PBS für 5 min jedes Mal.
- Blockieren Sie die Zellen mit 5% Ziegenserumprotein verdünnbar für 1 h bei Raumtemperatur.
- Kaninchen-Antidystrophin-Antikörper (1:300) und Maus-Anti-MYH2-Antikörper (1:100) zu den Dias geben, bei 4 °C über Nacht in einer befeuchteten Kammer inkubieren.
- Entsorgen Sie die primäre Antikörperlösung, waschen Sie die Zellen 3x (5 min/wash) in PBS, fügen Sie 1:400 verdünnte Alexa488-konjugierte Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper und Alexa555-konjugierte Ziege-Anti-Maus-Antikörper zu Dias hinzu und brüten für 45 min bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Dias 3x (5 min/wash) in PBS, und montieren Sie Abschnitte mit Montagemedium, das DAPI enthält.
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Representative Results
Etablierung von Dmdmdx Haut-Fibroblasten abgeleitet iPSC. Wir demonstrierten die Effizienz der Erzeugung von Maus-iPSCs von Dmdmdx-Mäusen abgeleiteten Haut-Fibroblasten mit den integrationsfreien Reprogrammierungsvektoren. Abbildung 1A zeigte, dass das Auftreten embryonaler Stammzellen (ESC)-ähnliche Kolonien drei Wochen nach der Infektion. Wir bewerten die Effizienz der iPSC-Induktion durch lebende alkalische Phosphatase (AP) Fleck; Abbildung 1B zeigt, dass der Anteil der AP-positiven Zellen durch FACS-Analyse bei etwa 1,8 % lag. SSEA1, Lin28, Nanog, OCT4 und SOX2, Pluripotenzmarker für embryonale Stammzellen der Maus, waren positiv für iPSC-Kolonien durch immunfluoreszierende Färbung , (Abbildung 1C). Um die drei Keimbahndifferenzierung entzaller iPSCs in vivo zu untersuchen, injizierten wir iPSCs intramuskulär in die Maus gastrocnemii. Wir beobachteten, dass die injizierten iPSCs in Leberzellen (Endoderm), glatte Muskelzellen (Mesoderm) und adrenerge Neuronenzellen (Ektoderm)(Abbildung 1D)differenziert wurden, was die Pluripotenz von iPSCs anklagt.
CRISPR/Cas9-vermittelte exon23-Löschung. Wir haben zwei Führungs-RNAs entworfen, die den mutierten Exon 23 flankieren. Nach Cas9-vermittelten Doppelsträngigenbrüchen (DSB) und nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) wurde mutiertes Exon 23 gelöscht, was eine abgeschnittene, aber funktionelle Dystrophinproduktion ermöglichte (Abbildung 2A). Um exon 23 gelöschte Maus iPSC zu identifizieren, wurden Zellen spärlich gesät, und einzelne Kolonien wurden gepflückt und vermehrt. Aus diesen Kolonien extrahierte genomische DNAs wurden PCR-Genotypisierung unterzogen. Abbildung 2B zeigte, dass Kolonie #1 und #2 Exon 23 Löschungen haben, die auf eine erfolgreiche Löschung des Exon 23 hindeuten.
Unterscheidung von Maus-iPSCs in eine myogene Abstammung und Wiederherstellung der Dystrophin-Expression. Wir verwenden ein tetracyclinininininduzierbares MyoD-Expressionssystem, um eine myogene Differenzierung von iPSCs zu induzieren. Doxycyclin wurde verwendet, um MyoD-Expression in iPSCs zu induzieren. Abbildung 3A zeigt den zeitlichen Verlauf der Muskeldifferenzierung in Dox-behandelten iPSCs. qRT-PCR zeigte, dass der mRNA-Spiegel von OCT4, einem pluripotenten Marker, allmählich abnahm, während die Expression von ACTA1, einem Skelettmuskelmarker, nach der Dox-Induktion zunahm. Außerdem beobachteten wir die Myotubebildung zwei Wochen nach der Dox-Behandlung (Abbildung 3B). Wichtig ist, dass der qRT-PCR-Assay die Wiederherstellung der DMD-Exon-24-mRNA-Expression in Dox-induzierter, Cas9-vermittelter Exon23-gelöschter Zeile im Vergleich zur Cas9-Steuerlinie zeigte (Abbildung 3C). Inkonsistent mit qRT-PCR zeigt die immunfluoreszierende Färbung die Dystrophin-Proteinexpression in Cas9-vermittelten Exon 23 gelöschten Zellen, während die Dystrophin-Expression in Kontrollzellen fehlte (Abbildung 3D).
Abbildung 1: Neuprogrammierung von Hautfibroblasten von Dmdmdx-Mäusen in iPSCs.
(A) Repräsentatives Bild von ES-ähnlichen Kolonien (Skala bar = 200 m). (B) FACS-Analyse der Reprogrammierungseffizienz von Maushaut-Fibroblasten in iPSCs nach 8 Tagen Sendai-Virustransduktion durch Live-AP-Färbung. (C) Immunfluoreszenzfärbung von SSEA1, Lin28, Nanog, Oct4 und SOX2 in iPSCs (Skala bar = 50 m). (D) Immunfluoreszenzfärbung für AFP (Endoderm), SMA (Mesoderm) und Tyrosinhydrolase (TH) (Ektoderm) von Teratomen 2 Wochen nach der iPSC-Injektion in gastrocnemii (Skala bar = 20 m). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: CRISPR/Cas9-vermittelte exon23-Löschung.
(A) Schematisches Diagramm von CRISPR/Cas9-vermittelten Exon 23-Löschungen. Die Cas9-Nuklease zielt auf intron 22 und intron 23 durch zwei gRNAs. Doppelsträngige Breaks (DSBs) von Cas9 führen zur Exzision des mutierten Exons 23. Die distalen Enden werden durch nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) repariert, was zur Wiederherstellung des Leserahmens des Dystrophin-Gens führt. (B) PCR-Genotypisierungsanalyse von Exon 23. Der Pfeil zeigt das PCR-Produkt von exon 23 an. GAPDH dient als Referenz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Differenzierung von Maus-iPSCs in die myogene Abstammung und Wiederherstellung der Dystrophin-Expression.
(A) qRT-PCR zeigte den Zeitverlauf des mRNA-Niveaus von Oct4 und ACTA1 in Dox-behandeltem Exon 23-gelöschtem Dmdmdx iPSC (*P < 0,05 vs D0, D6, D10, #P < 0,05 vs D0, D3, D10, $P < 0,05 vs D0, D3, D6, n = 4 für Okt4) (*P < 0,05 vs D6 und D10 , #P < 0,05 vs. D0, D3 und D10, $P < 0,05 vs D0, D3 und D6, n = 3 für ACTA1). (B) Links: Repräsentatives Bild der Myotube-Formation von Dox-induzierten Maus-iPSCs (Skalenbalken = 200 m). Rechts: Immunfluoreszenzanalyse von MYH2 in Myotubebildung aus Dox-induzierten Maus-iPSCs (Skalenbalken = 20 m). (C) Ober: die PCR-Primerpositionen für DMD Exon22, Exon23 und Exon24; Unten: qRT-PCR-Analyse des mRNA-Niveaus von DMD Exon22, Exon23 und Exon24 Expression in MPC (****P < 0.0001, n = 3). (D) Immunfluoreszenzanalyse der Dystrophinexpression in Dox-induziertem MPC aus iPSCCas9-Ctrl und iPSCCas9-gRNA (Skalenbalken = 50 m). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Guide Primer | |
| i22 Sinn | 5'-CACCGTTAAGTAGGTAAAATCAA- 3' |
| i22 Antisense | 5'-AAACTTGATTTTACCTACTTAAC-3' |
| i23 Sinn | 5'-CACCGAGTAATGTGTCATACCTTCT- 3' |
| I23 Antisense | 5'-AAACAGAAGGTATGACACATTACTC-3' |
| PCR-Grundierungen | |
| OCT4-Forward | 5'-AGCTGCTGAGAGAGAAGAGGATCA-3' |
| OCT4-Reverse | 5'-TCTCATTGTTGTCGGCCTCCA-3' |
| ACTA1-Forward | 5'-GATCCATGAGACCACCTACAAC-3' |
| ACTA1-Reverse | 5'-TCAGCGATACCAGGGTACAT-3' |
| Exon22-Forward | 5'-TTACCACCAATGCGCTATCA-3' |
| Exon22-Reverse | 5'-CCGAGTCTCTCTCTCTTATTTC-3' |
| Exon23-Forward | 5'-CCAAGAAAGCACCTTCAGAAATATG-3' |
| Exon23-Reverse | 5'-TTTGGCAGCTTTCCACCA-3' |
| Exon24-Forward | 5'-AAC CTT ACA GAA ATG GAT GGC-3' |
| Exon24-Reverse | 5'-TTTCAGGATTTCAGCATCCC-3' |
| GAPDH-Forward | 5'-TGACAAGCTTCCCATTCTCG-3' |
| GAPDH-Reverse | 5'-CCCTTCATTGACCTCAACTACAT-3' |
Tabelle 1: Primersequenz.
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Discussion
Duchenne Muskeldystrophie (DMD) ist eine destruktive und letztlich tödliche Erbkrankheit durch einen Mangel an Dystrophin gekennzeichnet, was zu progressiver Muskelatrophie1,2. Unsere Ergebnisse zeigen die wiederhergestellte Dystrophin-Genexpression in Dmdmdx iPSC-abgeleiteten myogenen Vorläuferzellen durch den Ansatz der CRISPR/Cas9-vermittelten Exon23-Deletion. Dieser Ansatz hat drei Vorteile.
Zunächst haben wir iPSCs aus Dmdmdx mausabgeleiteten dermalen Fibroblasten mit einem nicht integrierten RNA-Vektor generiert. Es wurden eine Vielzahl von Methoden entwickelt, um iPSCs zu erzeugen, wie z. B. lentivirale und retrovirale Vektoren, die sich in Wirtschromosomen integrieren, um Reprogrammierungsgene auszudrücken, wodurch Sicherheitsbedenken bestehen. DNA-basierte Vektoren wie Plasmidvektoren, Adeno-assoziierte Viren und Adenoviren existieren in nicht integrierter Weise; Sie können sich jedoch immer noch mit geringer Frequenz in das Wirtschromosom integrieren. In dieser Studie verwendeten wir ein modifiziertes, nicht übertragbares Sendai-Virus, einen nicht integrierten RNA-Vektor, um Stammzellentranskriptionsfaktoren für die Neuprogrammierung sicher und effektiv an Fibroblasten zu liefern.
Als nächstes verwenden wir CRISPR-vermittelte Genomlöschung anstelle von CRISPR/Cas9-vermittelter Präzisionsgenkorrektur, um die Dystrophinexpression in iPSCs wiederherzustellen. Diese Methode ist machbar und effizient; es ist einfach, mehrere gRNAs zu entwerfen, um mehrere mutierte Exons zu löschen, die bei vielen menschlichen DMD-Patienten vorkommen17. Exon-Deletion nutzt einen relativ effizienten nicht-homologen Endverbindungsweg, und die Methode vermeidet auch die Notwendigkeit, eine DNA-Reparatur-Vorlage zu liefern. Daher ist die Cas9-vermittelte Exon-Deletion im Vergleich zur Cas9-vermittelten Präzisionskorrektur für DMD-Patienten mit mehreren Genmutationen geeignet.
Schließlich induzierten wir undifferenzierte iPSCs in myogene Vorläuferzellen, die das Risiko einer Tumorgenese durch iPSCs reduzieren können. In diesem Protokoll induzierten wir myoD-Expression über ein induzierbares Tetracyclin-reguliertes (Tet-On) Vektorsystem, um iPSCs in Skelettmuskelvorläufer18,19zu differenzieren.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kombination der CRISPR/Cas9-Genombearbeitung mit dem Tet-on MyoD-Aktivierungssystem eine sichere, praktikable und effiziente Strategie für die mutierte DMD-Exon23-Deletion in Stammzellen zur Zelltransplantation bei DMD-Patienten bieten kann.
Um ES-ähnliche Zellen effizient auszuwählen und zu ernten, sollten wir die undifferenzierten iPSC-Zellen über ihre kuppelartige Morphologie identifizieren, und ein Farbobjektmarker kann uns helfen, einzelne Klone von der Unterseite der Kulturschale mit einem 1,8 mm Kreis um das iPSC zu kennzeichnen. Klone. Um ein Auslaufen der Trypsinlösung zu vermeiden, müssen wir Fett gleichmäßig auf den Boden der Ringe auftragen. Auch nach dem Platzieren der fettbeschichteten Ringe auf der Oberseite der beschrifteten Zellkolonien sollte darauf geachtet werden, die Ringe nicht zu berühren. Andernfalls werden die iPSC-Klone getrennt.
Das Protokoll hat seine Grenzen; Zum Beispiel haben wir uns für ein nicht-integriertes RNA-Vektorsystem entschieden, um iPSCs zu generieren. Wir verwendeten jedoch ein lentivirales CRISPR/Cas9-System, um DMD-Exon 23 und ein lentiviralbasiertes MyoD-Aktivierungssystem zu löschen, um eine myogene iPSC-Differenzierung zu induzieren; diese integrativen lentiviralen Vektoren haben Sicherheitsbedenken. Diese Probleme können jedoch durch die Anwendung eines Ribonukleoprotein(RNP)-Komplexes gelöst werden, der eine rekombinante, hochreine S. pyogenes Cas9-Nuklease mit einem crRNA:tracrRNA-Duplex umfasst; wir können chemisch modifizierte MyoD mRNA-Transfektion wählen, um iPSCs direkt in myogene Vorläufer zu differenzieren, obwohl die Effizienz eine Herausforderung sein kann.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Tang und Weintraub wurden teilweise von NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Instruments | |||
| 31-gauge needle | Various | ||
| Sharp Incision | Various | ||
| Sterile Scalpels | Various | ||
| Tweezers | Various | ||
| Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.1 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 1 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 87 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 10 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 1 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 1 mL |
| TVP solution (for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Chicken Serum | Gibco | 16110-082 | 5 mL |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | 186 mg |
| Phosphat-buffered saline | to 500 mL | ||
| Trypsin (2.5%) | Thermo | 15090046 | 5 mL |
| mES growth medium(for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.5 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 408.5 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 75 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 5 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 500 μL |
| MEK/GS3 Inhibitor Supplement | EMD Millipore Corp | CS210510-500UL | 500 μL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 5 mL |
| The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks. | |||
| mES frozen medium(for 50 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | SIGMA | D2650 | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 24.9 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 25 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 50 μL |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | RRID |
| 0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA | CORNING | 25-052-CI | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo scientific | J19943-k2 | |
| Accutase solution | SIGMA | A6964 | Cell detachment solution |
| AgeI-HF | NEB | R3552L | |
| Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody | Invitrogen | A32723 | AB_2633275 |
| Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32731 | AB_2633280 |
| Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32732 | AB_2633281 |
| anti-AFP | Thermo scientific | RB-365-A1 | AB_59574 |
| anti-α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP | CST | 19245S | AB_2734735 |
| anti-Dystrophin | Thermo | PA5-32388 | AB_2549858 |
| anti-LIN28A (D1A1A) XP | CST | 8641S | AB_10997528 |
| anti-MYH2 | DSHB | mAb2F7 | AB_1157865 |
| anti-Nanog-XP | CST | 8822S | AB_11217637 |
| anti-Oct-4A (D6C8T) | CST | 83932S | AB_2721046 |
| anti-Sox2 | abcam | ab97959 | AB_2341193 |
| anti-SSEA1(MC480) | CST | 4744s | AB_1264258 |
| anti-TH (H-196) | SANTA CRUZ | sc-14007 | AB_671397 |
| Alkaline Phosphatase Live Stain (500x) | Thermo | A14353 | |
| Blasticidin S | Sigma-Aldrich | 203350 | |
| BsmBI/Esp3I | NEB | R0580L/R0734L | |
| Carbenicillin | Millipore | 205805-250MG | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Competent Cells | TakaRa | 636763 | |
| CutSmart | NEB | B7204S | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo | A16517 | |
| DirectPCR Lysis Reagent (cell) | VIAGEN BIOTECH | 302-C | |
| Dispase (1 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP26535 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101L | |
| Fibronectin bovine plasma | SIGMA | F1141 | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit (500) |
QIAGEN | 20051 | |
| Gelatin from porcine skin, type A | SIGMA | G1890 | |
| HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1500 | |
| Hygromycin B (50 mg/mL) | Invitrogen | 10687010 | |
| Ketamine HCL Injection | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | 45822 | |
| KpnI-HF | NEB | R3142L | |
| lenti-CRISPRv2-blast | Addgene | 83480 | |
| lenti-Guide-Hygro-iRFP670 | Addgene | 99377 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000015 | |
| LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60625 | |
| LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60626 | |
| Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit | Vector | BMK-2202 | |
| NotI-HF | NEB | R3189L | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | ThermoFisher | 31985070 | |
| Polyethylene glycol 4,000 | Alfa Aesar | AAA161510B | |
| Polybrene | SIGMA | TR1003 | |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide | CORNING | CB354688 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | A25742 | |
| PrimeSTAR Max Premix | TakaRa | R045 | |
| Proteinase K | VIAGEN BIOTECH | 507-PKP | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals | ICN19453980 | |
| qPCR Lentivirus Titration Kit | abm | LV900 | |
| Quick ligation kit | NEB | M2200S | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100) | QIAGEN | 12945 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo scientific | K1691 | |
| RNAzol RT | Molecular Research Center, INC | RN 190 | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Terrific Broth Modified | Fisher BioReagents | BP9729-600 | |
| ViralBoost Reagent (500x) | ALSTEM | VB100 |
References
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