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Developmental Biology

CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी iPSC में Dystrophin अभिव्यक्ति बहाल करने में व्युत्पन्न मांसपेशी संतति

Published: September 14, 2019 doi: 10.3791/59432
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Medical College of Georgia, Augusta University

Summary

यहाँ, हम Dmdmdx माउस व्युत्पन्न त्वचा फाइब्रोब्लास्ट से iPSC में dystrophin अभिव्यक्ति को बहाल करने के लिए एक Cas9 आधारित exon23 विलोपन प्रोटोकॉल पेश करते हैं और सीधे myogenic जनक कोशिकाओं में iPSCs अंतर (MPC) Tet-on MyoD सक्रियण प्रणाली का उपयोग कर.

Abstract

Duchenne मांसपेशियों dystrophy (DMD) एक गंभीर प्रगतिशील मांसपेशी रोग dystrophin जीन में उत्परिवर्तन के कारण है, जो अंततः मांसपेशियों की संतान कोशिकाओं की थकावट की ओर जाता है. क्लस्टर्ड नियमित रूप से अंतराल वाले लघु पैलिड्रोमिक दोहराता है/CRISPR-संबद्ध 9 (CRISPR/Cas9) जीन संपादन में डाइस्ट्रोपिन जीन की अभिव्यक्ति को बहाल करने की क्षमता है। ऑटोलॉगस प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs)-derived मांसपेशी जनक कोशिकाओं (एमपीसी) स्टेम / जनक सेल पूल की भरपाई कर सकते हैं, क्षति की मरम्मत, और एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के कारण के बिना DMD में आगे जटिलताओं को रोकने. इस अध्ययन में, हम बरामद डिस्ट्रोफिन प्रोटीन अभिव्यक्ति के साथ मांसपेशी जनक प्राप्त करने के लिए CRISPR/Cas9 और गैर एकीकृत iPSC प्रौद्योगिकियों का एक संयोजन पेश करते हैं। संक्षेप में, हम Dmdmdx चूहों के dermal फाइब्रोब्लास्ट्स से एक iPSC लाइन स्थापित करने के लिए एक गैर एकीकृत Sendai वेक्टर का उपयोग करें. फिर हम एक गैर-समजात अंत reframed dystrophin जीन के शामिल होने के माध्यम से dystrophin अभिव्यक्ति को बहाल करने के लिए CRISPR/Cas9 विलोपन रणनीति का उपयोग करें. 94 उठाया iPSC कालोनियों से तीन कालोनियों में exon23 कमी के पीसीआर सत्यापन के बाद, हम myoD के doxycycline (Dox)-प्रेरित अभिव्यक्ति द्वारा एमपीसी में iPSC अंतर, एक प्रमुख प्रतिलेखन कारक मांसपेशियों भेदभाव को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है. हमारे परिणाम iPSC व्युत्पन्न MPC में डिस्ट्रोफिन अभिव्यक्ति को बहाल करने के लिए CRISPR/Cas9 विलोपन रणनीति का उपयोग करने की व्यवहार्यता दिखाते हैं, जिसमें डीएमडी के उपचार के लिए भविष्य के उपचारों के विकास की महत्वपूर्ण क्षमता है।

Introduction

Duchenne मांसपेशियों dystrophy (DMD) सबसे आम मांसपेशियों dystrophies में से एक है और dystrophin की अनुपस्थिति की विशेषता है, दुनिया भर में लगभग 5,000 नवजात लड़कों में से 1 को प्रभावित1. डाइस्ट्रोपिन जीन समारोह की कमी के परिणामस्वरूप संरचनात्मक मांसपेशी दोष होते हैं जिससे प्रगतिशील मायोफाइबर अध: पतन1,2. रिकॉमबिनेंट एडेनो-संबद्ध वायरस (आरएएवी)-मध्यस्थ जीन थेरेपी सिस्टम का परीक्षण डाइस्ट्रोपिन अभिव्यक्ति को बहाल करने और मांसपेशियों के समारोह में सुधार करने के लिए किया गया है, जैसे कि माइक्रो-डाइस्ट्रोफिन का उपयोग करके जीन प्रतिस्थापन (जेड-Dys)। तथापि, आरएवी दृष्टिकोण को कार्यात्मक प्रोटीन 3,4 की अभिव्यक्ति को बनाए रखने के लिए बार-बार इंजेक्शन की आवश्यकता होतीहै। इसलिए, हम एक रणनीति है कि प्रभावी ढंग से प्रदान कर सकते हैं और स्थायी रूप से DMD के साथ रोगियों में dystrophin जीन अभिव्यक्ति ठीक की जरूरत है. Dmdmdx माउस, DMD के लिए एक माउस मॉडल, dystrophin जीन के exon 23 में एक बिंदु उत्परिवर्तन है कि एक समय से पहले समाप्ति codon परिचय और एक गैर कार्यात्मक छोटा प्रोटीन सी-टर्मिनल dystroglycan बाध्यकारी डोमेन की कमी में परिणाम है. हाल के अध्ययनों से पता चला है कि छोटे औरबड़ेजानवरोंमें सटीक जीन सुधार या उत्परिवर्ती एक्सोन विलोपन द्वारा डिस्ट्रोपिन जीन अभिव्यक्ति को बहाल करने के लिए CRISPR/Cas9 तकनीक का उपयोग किया गया है. लांग एट अल8 ने होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) आधारित CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन द्वारा Dmdmdx माउस germline में डिस्ट्रोफिन जीन उत्परिवर्तन को सही करने की विधि की सूचना दी। एल Refaey एट अल9 की सूचना दी है कि rAAV कुशलतापूर्वक उत्परिवर्ती exon 23 dystrophic चूहों में उत्पाद निकाल सकता है. इन अध्ययनों में, gRNAs introns में डिजाइन किए गए थे 20 और 23 डबल-स्ट्रेस्ड डीएनए टूट जाता है, जो आंशिक रूप से गैर-homologous अंत में शामिल होने के माध्यम से डीएनए की मरम्मत के बाद dystrophin अभिव्यक्ति बहाल (NHEJ). इससे भी अधिक रोमांचक, Amoasii एटअल. 10 हाल ही में प्रभावकारिता और canine मॉडल, भविष्य नैदानिक आवेदन में एक आवश्यक कदम में dystrophin अभिव्यक्ति बहाल करने में rAAV-मध्यस्थ CRISPR जीन संपादन की व्यवहार्यता की सूचना दी.

DMD भी स्टेम सेल विकारों का कारण बनताहै 11. मांसपेशियों की क्षति के लिए, आवासीय मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं मांसपेशियों भेदभाव के बाद मर मांसपेशी कोशिकाओं की भरपाई. तथापि, चोट और मरम्मत के लगातार चक्र से मांसपेशियों की स्टेम कोशिकाओं में टेलोमर्स का आकारकमहो जाता है , और स्टेम सेल पूल13,14की समय पूर्व कमी होती है . इसलिए, dystrophin अभिव्यक्ति को बहाल करने के लिए जीनोम संपादन के साथ autologous स्टेम सेल थेरेपी का एक संयोजन DMD के इलाज के लिए एक व्यावहारिक दृष्टिकोण हो सकता है. CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी कार्यात्मक मांसपेशी पुनर्जनन के लिए autologous आनुवंशिक रूप से सही प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSC) पैदा करने की संभावना प्रदान करता है और प्रतिरक्षा अस्वीकृति के कारण के बिना DMD के आगे जटिलताओं को रोकने. हालांकि, iPSCs ट्यूमर गठन का खतरा है, जो myogenic जनक कोशिकाओं में iPSC के भेदभाव से कम किया जा सकता है.

इस प्रोटोकॉल में, हम DMdmdx चूहों के dermal फाइब्रोब्लास्ट्स iPSCs में reprogramming और फिर CRISPR/Cas9 जीनोम विलोपन द्वारा dystrophin अभिव्यक्ति ठीक करने के लिए गैर एकीकृत Sendai वायरस के उपयोग का वर्णन. जीनोटाइपिंग द्वारा iPSC में Exon23 विलोपन के सत्यापन के बाद, हम MyoD प्रेरित myogenic भेदभाव के माध्यम से myogenic संतति (एमपीसी) में जीनोम-सुधारित iPSC विभेदित.

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Protocol

सभी पशु हैंडलिंग और शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं अगस्ता विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित एक प्रोटोकॉल द्वारा प्रदर्शन किया गया. चूहे मानक आहार और पानी विज्ञापन libitum खिलाया गया.

1. वयस्क Dmdmdx चूहों से प्राथमिक माउस फाइब्रोब्लास्ट ्स्सका अलगाव

  1. EUthanize वयस्क Dmdmdx चूहों (पुरुष, 2 महीने पुराने) सीओद्वारा 2 asphyxiation और thoracotomy के अनुसार IACUC जॉर्जिया के मेडिकल कॉलेज द्वारा अनुमोदित, अगस्ता विश्वविद्यालय. लेमिनर हुड के नीचे एक बाँझ हालत में एक बाँझ स्केलपेल के साथ पूंछ काट. 5 मिनट के लिए 70% इथेनॉल के साथ पूंछ कुल्ला, और फिर एक 6 सेमी डिश में बाँझ फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) के साथ धो लो।
  2. पूंछ त्वचा के साथ पूंछ टिप करने के लिए आधार से एक तेज चीरा द्वारा पूंछ त्वचा छील, और फिर धीरे से tweezers के साथ पूंछ त्वचा छील. 1 मिमी3 के एक आकार के लिए त्वचा को कम एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग कर और Dulbecco के न्यूनतम आवश्यक मध्यम में एक 6 सेमी पकवान के लिए कीमा बनाया त्वचा ऊतक ले जाएँ /
  3. एक 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए एक संस्कृति पकवान में त्वचा के ऊतकों को डाइजेस्ट।
  4. फाइब्रोनेक्टिन और 0.2% जिलेटिन के साथ एक 6-वेल प्लेट कोट (1 एमएल फाइब्रोनेक्टिन में 0.2% जिलेटिन का 199 एमएल; सामग्री की तालिका) और 1 h के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  5. एक 1 एमएल पाइप टिप के साथ पचा त्वचा के ऊतकों को अलग करें और ऊतक और supernatant एक बाँझ 15 एमएल शंकु अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए स्थानांतरण। कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 217 x g पर सेंट्रीफ्यूज, सुपरनेंट को त्यागें और फाइब्रोब्लास्ट माध्यम(सामग्री की तालिका)के 1.5 एमएल में गोली को पुन: स्फूंश करें।
  6. एक 37 डिग्री सेल्सियस में कदम 1.4 से और 0.2% जिलेटिन के साथ लेपित 6 अच्छी तरह से प्लेट पर कदम 1.5 से अधूरा पचा त्वचा ऊतक सहित छर्रों संस्कृति, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर. असंबद्ध कोशिकाओं को हटाने के लिए प्रारंभिक चढ़ाना के बाद मध्यम 24 एच बदलें, और मध्यम हर 48 एच बदल जाते हैं।

2. iPSCs में माउस त्वचा फाइब्रोब्लास्ट्स reprogramming

  1. transduction से दो दिन पहले, डाइजेस्ट माउस dermal फाइब्रोब्लास्ट्स कदम से 1.6 सेल टुकड़ी समाधान के साथ (सामग्री की तालिका) एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 5 मिनट के लिए 5% सीओ2 के एक आर्द्र वातावरण के साथ.
  2. 3 मिनट के लिए 217 x ग्राम पर एक हेमाकिटोमीटर और अपकेंद्रित्र का उपयोग करकोशिकाओं की गणना करें।
  3. बीज कोशिकाओं के घनत्व पर 1 डिग्री 2 x 105 कोशिकाओं पर अच्छी तरह से एक 6 अच्छी तरह से प्लेट और fibroblast माध्यम के साथ संस्कृति पर (सामग्री की तालिका) एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 5% ब्रू2के एक आर्द्र वातावरण के साथ .
  4. transduction के दिन (दिन 0), कोशिकाओं का अनुमान है और संक्रमण के लक्ष्य गुणक तक पहुँचने के लिए आवश्यक प्रत्येक वायरस की मात्रा की गणना (MOI) 5, 5, और 3 (यानी, KOS MOI ] 5, एचसी-माइक MOI ] 5, hKlf4 MOI ] 3) वाणिज्यिक मैनुअल के अनुसार.

Equation 1

  1. 5 डिग्री 10 एस के लिए 37 डिग्री सेल्सियस जल स्नान में तीन सेंडाइ ट्यूबों को थपथपाएं और फाइब्रोब्लास्ट माध्यम(सामग्रीसारणी) के 1 एमएल में प्रत्येक की परिकलित मात्राएं जोड़ें।
  2. चरण 2.3 से फाइब्रोब्लास्ट माध्यम निकालें और कोशिकाओं वाले कुओं में reprogramming वायरस मिश्रण जोड़ें. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रात भर 5% ब्व्2के आर्द्र वातावरण के साथ इनक्यूबेट करें .
  3. संक्रमण के बाद ताजा फाइब्रोब्लास्ट माध्यम 24 ज के साथ मध्यम को बदलें। हर दूसरे दिन मध्यम विनिमय के साथ एक सप्ताह के लिए कोशिकाओं संस्कृति.
  4. फसल संक्रमित माउस फाइब्रोब्लास्ट्स 7 दिन 0.05% trypsin/EDTA और व्यंजन है कि पहले फाइब्रोनेक्टिन और 0.2% जिलेटिन के साथ लेपित हैं पर जगह के साथ transduction के बाद.
  5. एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में पूर्ण माउस भ्रूणीय स्टेम सेल (ES) वृद्धि माध्यम(सामग्री की तालिका)के साथ चरण 2.6 से संक्रमित माउस फाइब्रोब्लास्ट्स को 5% ब्व्2 के आर्द्र वातावरण के साथ संस्कृति और मध्यम दैनिक बदलते हैं।
  6. 8 वें दिन से, माउस ES की आकृति विज्ञान के साथ सेल clumps की उपस्थिति की पहचान करने के लिए हर दूसरे दिन एक उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत प्लेट का निरीक्षण करें।

3. क्षारीय फॉस्फेटाज लाइव दाग और प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करने के लिए reprogramming दक्षता मात्रा

  1. प्रत्येक अच्छी तरह से संस्कृति मीडिया निकालें और 2 $3 मिनट के लिए DMEM/F-12 के साथ कुल्ला.
  2. 2 एमएल 1x क्षारीय फॉस्फेट (एपी) लाइव दाग कार्य समाधान (1:500 DMEM/F-12 में कमजोर पड़ने) को अनुलग्न कोशिकाओं के लिए लागू करें, और 30 मिनट के लिए 5% सीओ2 के आर्द्र वातावरण के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
  3. एपी रहते दाग aspirate और 5 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस के साथ दो बार धो लें.
  4. कोशिका टुकड़ी समाधान के साथ कोशिकाओं को डाइजेस्ट करें (सामग्री की तालिका) एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 5 मिनट के लिए 5% सीओ2 के आर्द्र वातावरण के साथ। पुनः प्रोग्रामिंग दक्षता निर्धारित करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री निष्पादित करें।

4. का चयन और ईएस की तरह कोशिकाओं की कटाई

  1. एक उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत कदम 2.8 से कालोनियों की जांच.
  2. एक आत्म इंकिंग वस्तु मार्कर के साथ पकवान के तल पर कालोनियों को चिह्नित करें।
  3. चिह्नित सेल कालोनियों को कवर करने के लिए ग्रीज़्ड क्लोनिंग रिंगों को लागू करें। 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक क्लोनिंग अंगूठी के लिए 0.05% trypsin/EDTA के 100 $L जोड़ें, और फिर 100 $L पिपेट युक्तियों के साथ पचा कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए 48 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में एमईएस विकास माध्यम युक्त.
  4. 5% सीओ2के आर्द्र वातावरण के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 48 कूप संस्कृति प्लेटों में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। 6 सेमी पकवान करने के लिए कोशिकाओं को पारित जब वे 70% संगम तक पहुँचने.
  5. एक समान छात्रावास के आकार के क्लोन प्राप्त कर रहे हैं जब तक कई बार के लिए कदम 4.3 और 4.4 दोहराएँ.

5. क्रायोप्रेक्षण के लिए आई पी एस सी को फ्रीज करना

  1. ट्रिप्सिन, छंद, और चिक प्लाज्मा (TVP) के साथ चरण 4.5 से चयनित iPSCs को अलग करें; सामग्री की तालिका) 30 मिनट के लिए एक 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर समाधान।
  2. कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 217 x ग्राम पर एक बाँझ 15 एमएल शंकु ट्यूब और अपकेंद्रित्र में कोशिकाओं को ले लीजिए।
  3. सुपरनेंट को प्रेरित करें और सेल गोली को 2 एमएल माउस ते जमे हुए माध्यम (सामग्री की तालिका) में पुन: निलंबित करें ताकि 1 एमएल प्रति क्रायोविएल प्राप्त किया जा सके।
  4. क्रायोविएल्स में कोशिकाओं को जोड़ें और एक फ्रीजर कंटेनर का उपयोग करके फ्रीज करें जो रात भर -80 डिग्री सेल्सियस पर क्रायोप्रेक्षण के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण, दोहराया -1 डिग्री सेल्सियस/मिनट ठंडा दर प्रदान करता है।
  5. जमे हुए शीशियों को तरल नाइट्रोजन टैंक में स्थानांतरित करें।

6. iPSCs में स्टेम सेल मार्करों के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला

  1. चरण 5.1 से बीज iPSCs एमईएस माध्यम के साथ एक 8-वेल चैम्बर स्लाइड में पाली-डी-lysine/laminin (सामग्री की तालिका) के साथ लेपित उचित घनत्व पर 1 डिग्री 2 x 104 कोशिकाओं के बीच अच्छी तरह से प्राप्त करने के लिए और एक के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट 48 ज के लिए 5% सीओ2 का आर्द्र वातावरण।
  2. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 4% formaldehyde में स्लाइड विसर्जित, और फिर पीबीएस में दो बार 5 मिनट के लिए हर बार स्लाइड विसर्जित.
  3. एक माउस आईजीजी अवरुद्ध अभिएजेंट के साथ इनक्यूबेट वर्गों(सामग्री की तालिका),और कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए 5% बकरी सीरम।
  4. प्रोटीन diluent में प्राथमिक एंटीबॉडी को कम करें (माउस-एंटी-SSEA1, 1:100, खरगोश-विरोधी-नाओग, 1:500; खरगोश-विरोधी-POU वर्ग 5 homeobox 1 [OCT4], 1:500; खरगोश-विरोधी-SRY-बॉक्स 2 [SOX2], 1:500; खरगोश-एंटी-लिन-28) सामग्री)। कोशिकाओं के लिए एंटीबॉडी लागू करें और एक आर्द्र कक्ष में रात 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  5. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान छोड़ें और PBS में स्लाइड 3x धो लें।
  6. दूसरी एंटीबॉडी लागू करें (Alexa488-कंजुटेड बकरी-एंटी-माउस एंटीबॉडी और Alexa555-कंजुटेड बकरी-एंटी-रैबिट, 1:400 प्रत्येक) में M.O.M. प्रोटीन diluent स्लाइड पर और कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  7. पीबीएस में स्लाइड 3x धो एंट्स और माउंटिंग मीडियम जिसमें 4'6-डायमिडिनो-2-फेनिलिनोल (डीएपीआई) शामिल हैं।
  8. एक confocal माइक्रोस्कोप के साथ तस्वीरें ले लो.

7. विवो में आई पी एस सी की उदारता की जांच

  1. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में TVP समाधान का उपयोग करते हुए चरण 5.1 से एकल कोशिकाओं में आई पी एस सी को 30 मिनट के लिए 5% सीओ2 के आर्द्र वातावरण के साथ अलग करें।
  2. 3 मिनट के लिए 217 x ग्राम पर एक हेमाकिटोमीटर और अपकेंद्रित्र का उपयोग करकोशिकाओं की गणना करें।
  3. सुपरनेटेंट को प्रेरित करें और सेल प्रत्यारोपण के लिए 5 x 105 कोशिकाओं/30 जेडएल की एकाग्रता पर 1.5 एमएल बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब में एमईएस माध्यम के साथ गोली को फिर से शुरू करें।
  4. बाल क्लिपर का उपयोग कर प्रतिरक्षा कमी चूहों के दोनों पिछले अंगों से बाल निकालें.
  5. केटामाइन (100 मिलीग्राम/किग्रा) के साथ चूहों को एनेस्थेटाइज करें और 75% अल्कोहल के साथ इंजेक्शन साइट को साफ करें।
  6. एक 31 जी सुई का उपयोग कर, गैस्ट्रोकेनेमी में चरण 7.3 इंट्रामस्क्युलर से iPSC निलंबन के 30 डिग्री सेल्सियस इंजेक्शन।
  7. इंजेक्शन के दो सप्ताह बाद, माउस गैस्ट्रोकेनेमी को काट दें और इष्टतम काटने वाले तापमान (ओसीटी) यौगिक में एम्बेड करें, स्नैप फ्रीज करें और 5-जेडएम वर्गों15,16में कटौती करें।
  8. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 4% formaldehyde में वर्गों को ठीक करें, और फिर हर बार 5 मिनट के लिए पीबीएस में दो बार स्लाइड धोएं।
  9. कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए 5% बकरी सीरम प्रोटीन diluent के साथ कोशिकाओं को ब्लॉक।
  10. पतला प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें (रैबिट विरोधी एएफपी, 1:50; खरगोश विरोधी SMA, 1:50; खरगोश विरोधी TH, 1:50) स्लाइड करने के लिए और एक humidified कक्ष में रात 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट.
  11. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को छोड़ दें, पीबीएस में कोशिकाओं 3x (5 मिनट/धोने) को धोलें, स्लाइड में 1:400 पतला एलेक्सा5555-संयोजित बकरी-एंटी-रैबिट एंटीबॉडी जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  12. PBS में 3x (5 मिनट/वॉश) स्लाइड को धोएं, और डीएपीआई युक्त बढ़ते मध्यम के साथ वर्गों को माउंट करें।

8. CRISPR/Cas9 lentiviral वेक्टर लक्ष्यीकरण introns के निर्माण के बगल में डिस्ट्रोफिन एक्सन 23

  1. http://crispor.tefor.net/crispor.py के माध्यम से gRNA oligos के दो जोड़े डिजाइन intron-flanked dystrophin exon 23 को लक्षित.
    नोट: डिज़ाइन किए गए जोड़े निम्नानुसार हैं:
    i22sense: 5'-CACCGTTATAGGTAAATCAA- 3'
    i22anti-sense: 5'-AAACTTGATTTAGCTTAAC-3'
    i23sense: 5'-CACCGAGTAGTGTCATCTCT- 3'
    i23anti-sense: 5'-AAACAGAAGGATGAACTCCC-3').
  2. डाइजेस्ट और डेफॉस्फोरीलेट 5 डिग्री ग्रेन्टीवायरल क्रिसआर प्लाज्मिड (लंटी-क्रिसआरवी2-ब्लास्ट से मोहन बाबू का एक उपहार] और मसूरी-गाइड-हाइग्रो-आईआरएफपी670 [क्रिस्टन ब्रेननेड से एक उपहार]) (सामग्री की तालिका) के साथ 30 मिनट के लिए 37 मिनट के लिए BsmB1/ 5 डिग्री प्लाज्मिड के लिए, बी एस एम बी 1 प्रतिबंधित एंजाइम के 3 डिग्री एल, 3 डिग्री एल फास्ट क्षारीय फॉस्फेटेज, 10x एंजाइम डाइजेस्ट बफर के 6 डिग्री एल और 60 डिग्री प्रतिक्रिया में 100 एमएम डीटीटी के 0.6 डिग्री एल जोड़ें।
  3. एक 0.8% agarose जेल पर प्रतिक्रियाओं लोड. 30 मिनट के लिए 100 डिग्री 150 वी पर जेल चलाएँ.
  4. शुद्ध पाचन प्लाज़्मिड इन-जेल में जेल निष्कर्षण किट(सामग्री की तालिका) का उपयोग करके और एच2ओ के 20 डिग्री एल में एल्यूट करें।
  5. Phosphorylate और anneal gRNA oligonucleotides के प्रत्येक ओलिगोन्यूक्लिओटाइड के प्रत्येक $L 100 $M, 10x T4 लिगिंग बफर के 1 $L, टी 4 पॉलीन्यूक्लिओटाइड kinase (PNK) के 0.5 डिग्री एल, डीडीएच2ओ के 6.5 डिग्री एल 30 मिनट के लिए और फिर 5 मिनट के लिए 30 मिनट के लिए और फिर 5 मिनट के लिए 5 मिनट और फिर रैंप के लिए 95 मिनट के लिए 5 डिग्री सेल्सियस/मिनट पर 25 डिग्री सेल्सियस के लिए खुद।
  6. एक 1:200 analed gRNA oligonucleotides के एक 1:200 कमजोर पड़ने plentiCRISPR V2-Blast या plentiGuide-Hygro-iRFP670 में. BsmB1/Esp3I पचा वैक्टर के 50 एनजी को पतला ओलिगो डुप्लेक्स का 1 डिग्री सेल्सियस और 2x लिगे बफर प्लस 1 डिग्री एल लिगे के 1 डिग्री एल के साथ 11 डिग्री एल प्रतिक्रिया प्रणाली में और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट के साथ मिलाएं।
  7. निर्माता के निर्देशों के अनुसार 50 डिग्री सेल्सियस सक्षम कोशिकाओं (सामग्री की तालिका)में लिगिंग उत्पाद के 3 डिग्री एल के साथ रूपांतरण करें।
  8. एक आगर प्लेट में रूपांतरित सक्षम कोशिकाओं को 18 ज के लिए 31.5 डिग्री सेल्सियस पर 100 ग्राम/एमएल कार्बेनिकसिलिन और इनक्यूबेट के साथ फैलाएं।
  9. भयानक शोरबा (सामग्री की तालिका) में 10 डिग्री एल बाँझ पिपेट टिप्स और संस्कृति के साथ कालोनियों उठाओ , जिसमें 31.5 डिग्री सेल्सियस पर 100 ग्राम/एमएल कार्बेनिसिलिन, 21 एच के लिए एक शेकर इनक्यूबेटर में 185 आरपीएम शामिल हैं।
  10. मिनी-प्रीप और मिडी-प्रीप किट(सामग्री की तालिका)का उपयोग करके प्लाज्मिड डीएनए को शुद्ध करें।
  11. प्रतिबंध पाचन द्वारा मिनी-प्री प्लैस्मिड की पुष्टि करें। 20 डिग्री सेल्सियस प्रतिक्रिया प्रणाली के लिए, प्लास्टी डीएनए के 1 डिग्री, डाइजेस्ट रिएक्शन बफर (सामग्री की तालिका)और 1 डिग्री एल प्रतिबंध एंजाइम मिश्रण (KpnI-HF के 0.5 डिग्री सेल्सियस और एजीआई-एचएफ के 0.5 डिग्री एल के लिए plentiCRISPR V2-i22; 0.5 एचएफएल-एचएफएल-एचएफएल- एफएफआई-ए-एफएफएल और 0.5-ई-एफएल के ब्लास्ट के लिए जोड़ें। plentiGuide-Hygro- iRFP670- i23). 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए अभिक्रिया प्रणाली को इनक्यूबेट करें।
  12. एक 0.8% agarose जेल पर प्रतिक्रियाओं लोड. 30 मिनट के लिए 100 डिग्री 150 वी पर जेल चलाएँ.
    नोट: plentiCRISPR V2-Blast-i22 के लिए सही बैंड 622 bp और 12.2 kb होना चाहिए, और plentiGuide-Hygro- iRFP670- i23 के लिए सही बैंड होना चाहिए 2.6 kb और 7.1 kb.

9. Lentiviral वेक्टर पैकेजिंग

  1. संस्कृति 7 x 105 DMEM मीडिया के 5 एमएल में 293FT कोशिकाओं 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर रात भर एक 6 सेमी पकवान में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त .
  2. एक कॉकटेल तैयार करें (1 $g plentiCRISPR V2-Blast-i22 या plentiGuide-Hygro-iRFP670-i23, PSPAX2 पैकेजिंग प्लाज्मिड के 750 एनजी, pMD2.G लिफाफा प्लाज्मिड के 250 एनजी, और ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक के 5 डिग्री एल कम मीडिया के 100 में सामग्री कीतालिका).
  3. कम सीरम एमईएम मीडिया के 100 डिग्री एल में 5 डिग्री सेल्सियस ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक बी (सामग्री की सारणी) का मिश्रण तैयार कीजिए।
  4. चरण 9.2 से प्लाज्मिड मिश्रण में ट्रांसफेक्शन रिएजेंट बी मिश्रण के 100 डिग्री एल जोड़ें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. 293FT कोशिकाओं के लिए डीएनए-लिपिड जटिल (चरण 9.4 से) dropwise जोड़ें. 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात में इनक्यूबेट करें।
  6. अगले दिन प्रत्येक डिश में वायरस उत्पादन बढ़ाने (500x) (सामग्री की तालिका)जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 एच के लिए इनक्यूबेट करें, 5% ब्व्2.
  7. अगले दो दिनों में पिपेट का उपयोग करने वाली कोशिकाओं से माध्यम लीजिए और कोशिकाओं को निकालने के लिए 0.45 डिग्री मीटर फ़िल्टर के माध्यम से माध्यम को फ़िल्टर करें।

10. lentiviral सदिशों की एकाग्रता और शुद्धि

  1. चरण 9.7 के माध्यम में प्रीसिपिट लेन्टीवायरल वेक्टर 5x पॉलीथीन ग्लाइकोल 4000 (PEG4000, 8.5% अंतिम एकाग्रता) और 4 एम NaCl (0.4 एम अंतिम एकाग्रता) के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर।
  2. 30 मिनट के लिए 2,095 x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर PEG4000 समाधान युक्त वायरल मीडिया को केंद्र में रखते हुए, सुपरनेंट को हटा दें और छोड़ दें।
  3. सीरम कम एमईएम मीडिया के 500 डिग्री एल के साथ छर्रों को फिर से निलंबित करें (lentivirus titer: lenti-CRISPR V2-gRNAi222: 1.56 x 108, lenti-iRFP670-gRNAi23: 1.3 x 108, lenti-CRISPR V2-नियंत्रण: 3.13 x 107, lenti-iRFP670-नियंत्रण: 5.9 x 107 ). -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर जब तक उपयोग करें।

11. दो गाइड RNAs (gRNAs) Cas9 के साथ युग्मित के साथ माउस iPSCs में exon 23 का विलोपन

  1. फाइब्रोनेक्टिन और जिलेटिन के साथ लेपित 24-वेल प्लेट में चरण 4.5 से माउस iPSCs को प्लेट करें।
  2. कोशिकाओं 50% संगम तक पहुँचने के बाद, ताजा संस्कृति माध्यम (पूर्ण माउस भ्रूण स्टेम सेल विकास माध्यम) युक्त करने के लिए स्विच 8 g/
  3. lenti-CRISPR V2-gRNAi22, lenti-iRFP670-gRNAi23 और नियंत्रण (खाली वेक्टर: lenti-CRISPR V2, lenti-iRFP670) माउस iPSCs सहित चरण 10.3 से lentiviral कण समाधान के 100 $L जोड़ें। 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए इनक्यूबेट कोशिकाओं ।
  4. गैर-संक्रमित कोशिका को मारने के लिए आवश्यक ब्लास्टीसिडिन और आर्द्रतामाइसिन बी की न्यूनतम सांद्रता का निर्धारण करके 2.5 ग्राम/एमएल ब्लास्टीसिन और 100 ग्राम/एमएल हाइग्रोमाइसिन बी युक्त मीडिया के साथ स्टिबली संक्रमित कोशिकाओं का चयन करें।
    नोट: संक्रमित कोशिकाओं blasticidin और hygromycin बी द्वारा मार डाला जाएगा.
  5. TVP समाधान के 0.5 एमएल के साथ चयनित माउस iPSCs डाइजेस्ट प्रत्येक अच्छी तरह से (24 अच्छी तरह से थाली) और 5% सीओ2के साथ 37 मिनट पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट कोशिकाओं.
  6. पाइपिंग द्वारा आई पी एस सी को एकल कोशिकाओं में विभाजित करें, कोशिकाओं को एक सेल काउंटिंग चैम्बर के साथ गिनें और फिर लगभग 150 पचे हुए एकल कोशिकाओं को एमईएस माध्यम के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति के लिए 10 सेमी डिश में पतला करें जिसमें 5% सीओ2है।
  7. के बारे में 10 दिनों के बाद, एक उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत एकल कालोनियों लेने के 10 L बाँझ pipette सुझावों का उपयोग (96 कालोनियों उठाया जाना चाहिए).
  8. उठाया कालोनियों TVP समाधान के 50 $L में प्रत्येक अच्छी तरह से हस्तांतरण (96 अच्छी तरह से थाली, एक कॉलोनी प्रत्येक अच्छी तरह से), 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पचा, और फिर दो 96 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में पचा कोशिकाओं बीज संस्कृति रखने के लिए (एक जीनोटाइपिंग के लिए).
  9. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सीओ2 इनक्यूबेटर में 70% confluent तक इनक्यूबेट।

12. exon23 विलोपन के साथ iPSC कालोनियों की पहचान

  1. जब सेल कालोनियों 70% संगम तक पहुँचने 96 अच्छी तरह से थाली में मध्यम निकालें.
  2. प्रत्येक कुएं में 100 एमएल लाइसिस अभिकर्मक में प्रोटीने के घोल (1 एमएल प्रोटीनाज के) युक्त 25 डिग्री सेल्सियस लाइसिस अभिकर्मक (सामग्री की तालिका) जोड़ें, और lysate को 96-वेल PCR प्लेट में स्थानांतरित करें.
  3. पीसीआर प्लेट को सील करें और प्लेटों को 30 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, और फिर कोशिकाओं को lyse करने के लिए 45 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर और प्रोटीनाज के को विकृत करें।
  4. चरण 12-3 से 2 डिग्री सेल्सियस लाइसेट के साथ पीसीआर प्रतिक्रिया को पूरा करें। 20 डिग्री सेल्सियस की प्रतिक्रिया के लिए, 2 डिग्री सेल्सियस, 2x डीएनए पॉलिमरेज प्रीमिक्स (सामग्री की तालिका),DNase-मुक्त पानी के 7 $L, और DMD एक्सऑन 23 प्राइमर के 1 $L (तालिका 1) के 2डिग्री एल जोड़ें।
  5. पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए निम्नलिखित पैरामीटर ों का उपयोग करें: 1 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, 10 s के लिए 98 डिग्री सेल्सियस के 35 चक्र, 15 s के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, 30 s के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, और 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम विस्तार।
  6. एक 2% agarose जेल पर पीसीआर प्रतिक्रिया लोड. 30 मिनट के लिए 100 डिग्री 150 वी पर जेल चलाएँ.
  7. यूवी प्रकाश के तहत जेल का निरीक्षण करें (नॉकआउट दक्षता 3/

13. सीधे myogenic जनक कोशिकाओं (एमपीसी) में iPSC अंतर करने के लिए Tet-on MyoD सक्रियण प्रणाली का उपयोग

  1. पैकेज LV-TRE-VP64-माउस MyoD-T2A-dsRedExpress2 और LV-TRE-VP16 माउस MyoD-T2A-dsRedExpress2 (चार्ल्स Gersbach से एक उपहार) (सामग्री की तालिका)के रूप में पहले lenti-CRISPRv2-ब्लास्ट और lenti-gRNA-iRF670 वैक्टर के लिए वर्णित वर्गों में 9 और 10.
  2. lentivirus-TRE-VP64-MyoD-T2A-dsRed-Express2 या lentivirus-TRE-VP16-MyoD-T2A-dsRedExpress2 के साथ संक्रमित माउस iPSC पहले lenti-CRISPRv2-blast और lenti-gRNA-iRFP670 वेटर्स के लिए पहले वर्णित कदम में 11.1$11.3.
  3. एक शुद्ध ट्रांसड्यूस्ड सेल आबादी प्राप्त करने के लिए संक्रमण के तीन दिनों के बाद 1 g/mL puromycin के साथ कोशिकाओं का चयन करें।
  4. एमपीसी भेदभाव करने के लिए संस्कृति मीडिया (10% FBS DMEM) में 3 g/mL doxycycline जोड़ें। हर दो दिन doxycycline के साथ पूरक ताजा मध्यम बदलें.

14. गतिशील मांसपेशी भेदभाव और DMD एक्सऑन 22-24 अभिव्यक्ति के मूल्यांकन के लिए मात्रात्मक रिवर्स प्रतिलेखन पीसीआर

  1. आरएनए आइसोलेशन रिएजेंट का उपयोग करके doxycycline उपचार के बाद सेलुलर आरएनए निकालें, पहले किनारा cDNA संश्लेषण किट(सामग्री की तालिका) का उपयोग करके डीडीएनए में रिवर्सल टाइप करें आरएनए का उपयोग करें।
  2. 20 [L क्षपीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली के लिए, cDNA के 1 डिग्री एल, पीसीआर प्रतिक्रिया बफरके10 डिग्री एल , डीएनए एच2ओ के 8 डिग्री एल, और आगे और रिवर्स प्राइमर के मिश्रण का 1 [L (ग्लिसेरेल्डिहाइड-3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज [GAPDH], कंकाल की मांसपेशी [ACTA1], OCT4 और DMD exon22, DMD exon23, और DMD exon24, तालिका 1देखें .
  3. पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए निम्नलिखित पैरामीटरों का उपयोग करें: 2 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस, 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 15 s के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्र, 1 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, पिघल वक्र 65.0 डिग्री सेल्सियस से 95.0 डिग्री सेल्सियस, वृद्धि 0.5 डिग्री सेल्सियस।

15. मायोसिन भारी श्रृंखला 2 (MYH2) और डिस्ट्रोपिन प्रोटीन अभिव्यक्ति के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला

  1. प्लेट doxycycline प्रेरित, lenti-TRE-MyoD संशोधित कोशिकाओं कदम से 13.4 8 अच्छी तरह से संस्कृति स्लाइड पर.
  2. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 4% formaldehyde में कोशिकाओं को ठीक करें, और फिर हर बार 5 मिनट के लिए पीबीएस में दो बार स्लाइड धोएं।
  3. कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए 5% बकरी सीरम प्रोटीन diluent के साथ कोशिकाओं को ब्लॉक।
  4. स्लाइड में खरगोश-विरोधी-डाइस्ट्रोफिन एंटीबॉडी (1:300) और माउस-एंटी-एमएच2 एंटीबॉडी (1:100) जोड़ें, एक आर्द्र कक्ष में रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  5. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को छोड़ दें, पीबीएस में कोशिकाओं 3x (5 मिनट/धोने) को धोएं, 1:400 पतला एलेक्सा488-कंजुगेट्ड बकरी-एंटी-रैबिट एंटीबॉडी और एलेक्सा555-कंजुटेड बकरी-एंटी-माउस एंटीबॉडी को स्लाइड करने के लिए जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए इन्क्यूबेट करें।
  6. पीबीएस में स्लाइड 3x (5 मिनट/

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Representative Results

Dmdmdx त्वचा फाइब्रोब्लास्ट्स की स्थापना iPSC व्युत्पन्न. हम Dmdmdx चूहों से माउस iPSCs उत्पन्न करने की दक्षता का प्रदर्शन किया एकीकरण मुक्त reprogramming वैक्टर का उपयोग कर त्वचा फाइब्रोब्लास्ट व्युत्पन्न. चित्र 1क ने यह प्रदर्शित किया कि संक्रमण के तीन सप्ताह बाद भ्रूणीय स्टेम सेल (ईएससी) जैसी कालोनियों की उपस्थिति। हम लाइव क्षारीय फॉस्फेट (एपी) दाग द्वारा iPSC प्रेरण की दक्षता का मूल्यांकन; चित्र 1ख से पता चलता है कि एपी सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत एफएसीएस विश्लेषण द्वारा लगभग 1.8% था। SSEA1, Lin28, Nanog, OCT4 और SOX2, माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के लिए pluripotency मार्करों, इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला द्वारा iPSC कालोनियों के लिए सकारात्मक थे, (चित्र 1C). विवो में आई पी एस सी के तीन जर्मलाइन भेदभाव की जांच करने के लिए, हमने इंट्रामस्क्युलर रूप से माउस गैस्ट्रोकनमी में आई पी एस सी को इंजेक्ट किया। हमने देखा कि इंजेक्शन iPSCs जिगर की कोशिकाओं में विभेदित (एंडोडर्म), चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (mesoderm), और adrenergic न्यूरॉन कोशिकाओं (ectoderm) (चित्र 1D),iPSCs की pluripotency अभियोग.

CRISPR/Cas9-मध्यस्थ exon23 विलोपन| हम दो गाइड RNAs कि उत्परिवर्ती exon 23 पार्श्व डिजाइन. Cas9-मध्यस्थ डबल-स्ट्रेस्ड ब्रेक (DSB) और गैर-समजात अंत में शामिल होने (NHEJ) के बाद, उत्परिवर्ती एक्सन 23 हटा दिया गया था, छोटा लेकिन कार्यात्मक dystrophin उत्पादन के लिए अनुमति देता है (चित्र 2A). एक्सन 23 हटाए गए माउस आईपीएससी की पहचान करने के लिए, कोशिकाओं को विरल रूप से वरीयता दी गई थी, और अलग-अलग कालोनियों को उठाया गया था और प्रचारित किया गया था। इन कालोनियों से निकाले गए जीनोमिक डीएनए को पीसीआर जीनोटाइपिंग के अधीन किया गया था। चित्र 2ख ने दिखा दिया कि कॉलोनी #1 और #2 ने 23 विलोपन का प्रदर्शन किया है जो 23 को एक सफल विलोपन का संकेत देता है।

एक myogenic वंश में माउस iPSCs भेदभाव और dystrophin अभिव्यक्ति बहाल. हम एक टेट्रासाइक्लिन-इंड्यूसिबल मायोड अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करने के लिए iPSCs के myogenic भेदभाव प्रेरित करते हैं. doxycycline iPSCs में MyoD अभिव्यक्ति प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. चित्र 3क Dox-उपचारित iPSCs में मांसपेशी विभेद के समय पाठ्यक्रम को दर्शाता है। क्यूआरटी-पीसीआर से पता चला है कि OCT4 के MRNA स्तर, एक pluripotent मार्कर, धीरे-धीरे कमी आई, जबकि ACTA1 की अभिव्यक्ति, एक कंकाल की मांसपेशी मार्कर, Dox प्रेरण के बाद वृद्धि हुई. इसके अलावा, हमने डॉक्स उपचार के दो सप्ताह बाद मायोट्यूब के गठन को देखा (चित्र 3ख)। महत्वपूर्ण बात, QRT-पीसीआर परख Dox प्रेरित में DMD exon 24 MRNA अभिव्यक्ति की वसूली से पता चला, Cas9-मध्यस्थ Exon23 Cas9 नियंत्रण लाइन की तुलना में नष्ट कर दिया लाइन (चित्र 3C)। क्यूआरटी-पीसीआर के साथ असंगत, इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला डिस्ट्रोफिन प्रोटीन एक्सप्रेशनिन Cas9-मध्यस्थ एक्सोन 23 हटाए गए कोशिकाओं को दिखाता है, जबकि डाइस्ट्रोफिन अभिव्यक्ति नियंत्रण कोशिकाओं में अनुपस्थित थी (चित्र 3 डी)।

Figure 1
चित्रा 1: IPSCs में Dmdmdx चूहों से त्वचा फाइब्रोब्लास्ट्स reprogramming.
(ए) ते जैसी कालोनियों की प्रतिनिधि छवि (स्केल बार र् 200 उ)। (बी) लाइव एपी धुंधला द्वारा Sendai वायरस transduction के 8 दिनों के बाद iPSCs में माउस त्वचा फाइब्रोब्लास्ट्स के reprogramming दक्षता का FACS विश्लेषण. (ग) आई पी एस सी में SSEA1, Lin28, Nanog, Oct4, और SOX2 के इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला (स्केल बार $ 50 m)। (डी) एएफपी (एंडोडर्म), एसएमए (मेसोडरम), और टायरोसिन हाइड्रोलेस (थ) (एटोडर्म) के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला, पीपीएससी इंजेक्शन के 2 सप्ताह बाद गैस्ट्रोकेनमीई (स्केल बार ] 20 डिग्री मी)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: CRISPR/Cas9-मध्यस्थ exon23 विलोपन.
(क)CRISPR/Cas9-मध्यस्थ एक्सोन 23 विलोपन का योजनाबद्ध आरेख. Cas9 न्यूक्लेस लक्ष्य intron 22 और intron 23 द्वारा दो gRNAs. डबल-stranded टूट जाता है (DSBs) Cas9 द्वारा उत्परिवर्ती exon 23 के चीरा में परिणाम. जिला समाप्त होता है गैर-homologous अंत में शामिल होने (NHEJ) द्वारा मरम्मत कर रहे हैं, dystrophin जीन के पढ़ने के फ्रेम की बहाली में जिसके परिणामस्वरूप. (ख) एक्सऑन 23 का पीसीआर जीनोटाइपिंग विश्लेषण। तीर exon 23 के PCR उत्पाद को इंगित करता है। GAPDH एक संदर्भ के रूप में कार्य करता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: myogenic वंश में माउस iPSCs भेद और dystrophin अभिव्यक्ति बहाल.
(ए) क्यूआरटी-पीसीआर ने डॉक्स-उपचारित एक्सऑन 23-हटाए गए डीएमडीएमडीएक्स आईपीएससी (* पी एंड एलटीटी में अक्टूबर 4 और ACTA1 के एमआरएनए स्तर का समय पाठ्यक्रम दिखाया; 0.05 बनाम डी0, डी 0, डी 10, #P और lt; 0.05 बनाम D0, D3, D10, $P और lt; 0.05 बनाम D0, D3, D6, n $ 4 अक्टूबर के लिए) (* पी एंड एलटी; 0.05 बनाम D6 और D10 , #P 0.05 बनाम D0, D3, और D10, $P और lt; 0.05 बनाम D0, D3, और D6, n ] 3 ACTA1 के लिए). (बी) बाएँ: Dox प्रेरित माउस iPSCs से मायोट्यूब गठन के प्रतिनिधि छवि (स्केल बार $ 200 डिग्री मी). दाएँ: Dox प्रेरित माउस iPSCs से myotube गठन में MYH2 के इम्यूनोफ्लोरेसेंट विश्लेषण (स्केल बार $ 20 डिग्री मी). (सी)ऊपरी: DMD Exon22, Exon23 और Exon24 के लिए पीसीआर प्राइमर पदों; नीचे: DMD Exon22, Exon23, और Exon24 अभिव्यक्ति एमपीसी में MRNA स्तर के क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण (* * * पी एंड एलटी; 0.0001, n ] 3)। (डी) iPSCCas9-Ctrl और iPSCCas9-gRNA (स्केल बार ] 50 डिग्री से Dox प्रेरित MPC में डिस्ट्रोफिन अभिव्यक्ति का इम्यूनोफ्लोरेसेंट विश्लेषण। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

गाइड प्राइमर
i22 भावना 5'-कागगटागटगगटाआ- 3'
i22 प्रतिसेंस 5'-AAACTTGATTAGCTAAC-3'
i23 भावना 5'-CACCGAGTAATGTCATCATCT- 3'
I23 प्रतिसेंस 5'-AAACAGAATGAATACTC-3'
पीसीआर प्राइमर
OCT4-फॉरवर्ड 5'-एजीसीटीजीसीटीएजीएजीएजीएजीसीए-3'
OCT4-रिवर्स 5'-टीसीसीटीईटीजीटीजीसीसीटीसीसी-3'
ACTA1-फॉरवर्ड 5'-GATCCATGAGATACTACAAC-3'
ACTA1-रिवर्स 5'-टीसीजीजीएजीएजीजीटी-3'
Exon22-आगे 5'-टाकाकाकाएटीजीजीसीटीसीए-3'
Exon22-रिवर्स 5'-सीसीजीटीसीटीसीटीसीटीसीटीटीसी-3'
Exon23-आगे 5'-CCAAGAAGCACCTCAGAATG-3'
Exon23-रिवर्स 5'-टीटीटीजीजीसीटीसीसीए-3'
Exon24-आगे 5'-एएसी सीटीटी एसीए जीए एटीजी जीसी-3'
Exon24-रिवर्स 5'-TTTCAGGATTCAGCCC-3'
GAPDH-आगे 5'-TGACAAGCTTCCCTCCG-3'
GAPDH-रिवर्स 5'-सीसीसीटीसीटीजीएसीटीसीकैट-3'

तालिका 1: प्राइमर अनुक्रम।

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Discussion

Duchenne पेशी Dystrophy (DMD) एक विनाशकारी और अंततः घातक वंशानुगत रोग डिस्ट्रोपिन की कमी की विशेषता है, प्रगतिशील मांसपेशी शोष के लिए अग्रणी1,2. हमारे परिणाम CRISPR/Cas9-मध्यस्थ exon23 विलोपन के दृष्टिकोण से Dmdmdx iPSC व्युत्पन्न myogenic जनक कोशिकाओं में बहाल dystrophin जीन अभिव्यक्ति प्रदर्शित करता है. इस दृष्टिकोण के तीन फायदे हैं।

सबसे पहले, हम एक गैर एकीकृत आरएनए वेक्टर का उपयोग कर Dmdmdx माउस व्युत्पन्न dermal फाइब्रोब्लास्ट्स से iPSCs उत्पन्न. आई पी एस सी उत्पन्न करने के लिए विभिन्न प्रकार के तरीके विकसित किए गए हैं, जैसे लेन्टिवायरल और रेट्रोवायरल वेक्टर्स, जो रीप्रोग्रामिंग जीनों को व्यक्त करने के लिए मेजबान गुणसूत्रों में एकीकृत होंगे, इस प्रकार सुरक्षा चिंताओं को ध्यान में रखते हुए। डीएनए-आधारित सदिश जैसे प्लाज्मिड वेक्टर, एडेनो-संबद्ध वायरस और एडेनोवायरस एक गैर-एकीकृत तरीके से मौजूद हैं; हालांकि, वे अभी भी एक कम आवृत्ति पर मेजबान गुणसूत्र में एकीकृत कर सकते हैं. इस अध्ययन में, हम एक संशोधित, गैर-ट्रांसमिबल Sendai वायरस, एक गैर एकीकृत आरएनए वेक्टर, सुरक्षित रूप से और प्रभावी ढंग से reprogramming के लिए फाइब्रोब्लास्ट्स के लिए स्टेम सेल प्रतिलेखन कारकों देने के लिए इस्तेमाल किया।

इसके बाद, हम आई पी एस सी में डाइस्ट्रोफिन अभिव्यक्ति को बहाल करने के लिए CRISPR/Cas9-मध्यस्थ परिशुद्धता सुधार के बजाय CRISPR-मध्यस्थ जीनोम विलोपन का उपयोग करते हैं। यह विधि व्यवहार्य और कुशल है; यह कई उत्परिवर्ती exons, जो कई मानव DMD रोगियों17में पाए जाते हैं को नष्ट करने के लिए कई gRNAs डिजाइन करने के लिए आसान है। Exon विलोपन एक अपेक्षाकृत कुशल गैर समजात अंत मार्ग में शामिल होने का इस्तेमाल करता है, और विधि भी एक डीएनए की मरम्मत टेम्पलेट देने की जरूरत से बचा जाता है. इसलिए, Cas9 मध्यस्थता सटीक सुधार की तुलना में, Cas9 मध्यस्थता exon विलोपन कई जीन उत्परिवर्तनों के साथ DMD रोगियों के लिए उपयुक्त है.

अंत में, हमने माइजेनिक जनक कोशिकाओं में अलग-अलग आईपीएससी को प्रेरित किया, जो आई पी एस सी के कारण ट्यूमरजनन के जोखिम को कम कर सकता है। इस प्रोटोकॉल में, हमने आई पी एस सी को कंकालीय मांसपेशी जनक18,19में अंतर करने के लिए एक प्रेरक टेट्रासाइक्लिन-नियंत्रित (टेट-ऑन) वेक्टर सिस्टम के माध्यम से मायोड अभिव्यक्ति को प्रेरित किया।

अंत में, Tet-on MyoD सक्रियण प्रणाली के साथ CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन के संयोजन DMD रोगियों में सेल प्रत्यारोपण के लिए स्टेम सेल में उत्परिवर्ती DMD-Exon23 विलोपन के लिए एक सुरक्षित, व्यवहार्य, और कुशल रणनीति प्रदान कर सकते हैं.

का चयन करें और ES की तरह कोशिकाओं कुशलता से फसल, हम उनके गुंबद की तरह आकृति विज्ञान के माध्यम से undifferentiated iPSC कोशिकाओं की पहचान करनी चाहिए, और एक इंकिंग वस्तु मार्कर हमें iPSC के आसपास एक 1.8 मिमी चक्र के साथ संस्कृति पकवान के नीचे से व्यक्तिगत क्लोन लेबल मदद कर सकते हैं क्लोन. trypsin समाधान के रिसाव से बचने के लिए, हम छल्ले के नीचे करने के लिए समान रूप से तेल लागू करने की जरूरत है. इसके अलावा, लेबल सेल कालोनियों के शीर्ष पर तेल लेपित छल्ले रखने के बाद, ध्यान के छल्ले को छूने के लिए नहीं लिया जाना चाहिए। अन्यथा, आईपीएससी क्लोन अलग हो जाएगा।

प्रोटोकॉल की अपनी सीमाएं हैं; उदाहरण के लिए, हमने आई पी एस सी उत्पन्न करने के लिए एक गैर-एकीकृत आरएनए वेक्टर प्रणाली को चुना। हालांकि, हमने बीपीएससी मायोजेनिक भेदभाव को प्रेरित करने के लिए डीएमडी एक्सऑन 23 और एक मसूरीवायरल-आधारित मायोड सक्रियण प्रणाली को हटाने के लिए एक मसूरीवायरल CRISPR/Cas9 सिस्टम का उपयोग किया; इन एकीकृत lentiviral वेक्टर सुरक्षा चिंताओं है. हालांकि, इन मुद्दों को एक रिबोन्यूक्लिओप्रोटीन (आरएनपी) परिसर के आवेदन द्वारा हल किया जा सकता है जिसमें एक रिकॉमबिनेंट, उच्च-शुद्धता एस pyogenes Cas9 एक crRNA के साथ न्यूक्लीज:tracrRNA plex; दक्षता चुनौतीपूर्ण हो सकता है, हालांकि हम सीधे myogenic संतति में iPSCs अंतर करने के लिए रासायनिक संशोधित MyoD MRNA transfection चुन सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

तांग और Weintraub आंशिक रूप से NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354 द्वारा समर्थित थे.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical Instruments
31-gauge needle Various 
Sharp Incision Various 
Sterile Scalpels Various 
Tweezers Various 
Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium) Company Catalog Number Volume
2-Mercaptoethanol (55 mM) Gibco 21-985-023 0.1 mL
Antibiotic Antimycotic Slution 100x CORNING MT30004CI 1 mL
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose SIGMA D6429 87 mL
Fetal Bovine Serum Characterized HyClone SH30396.03 10 mL
L-Glutamine solution SIGMA G7513 1 mL
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)  Gibco 11140076 1 mL
TVP solution (for 500 mL of complete solution) Company Catalog Number Volume
Chicken Serum Gibco 16110-082 5 mL
EDTA Sigma-Aldrich E6758 186 mg
Phosphat-buffered saline to 500 mL
Trypsin (2.5%) Thermo 15090046 5 mL
mES growth medium(for 500 mL of complete solution) Company Catalog Number Volume
2-Mercaptoethanol (55 mM) Gibco 21-985-023 0.5 mL
Antibiotic Antimycotic Slution 100x CORNING MT30004CI 5 mL
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose SIGMA D6429 408.5 mL
Fetal Bovine Serum Characterized HyClone SH30396.03 75 mL
L-Glutamine solution SIGMA G7513 5 mL
Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL EMD Millipore Corp CS210511 500 μL
MEK/GS3 Inhibitor Supplement EMD Millipore Corp CS210510-500UL 500 μL
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)  Gibco 11140076 5 mL
The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks.
mES frozen medium(for 50 mL of complete solution) Company Catalog Number Volume
Dimethyl sulfoxide (DMSO) SIGMA D2650 5 mL
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose SIGMA D6429 24.9 mL
Fetal Bovine Serum Characterized HyClone SH30396.03 25 mL
Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL EMD Millipore Corp CS210511 50 μL
Name of Material/ Equipment Company Catalog Number RRID
0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA CORNING 25-052-CI
4% Paraformaldehyde Thermo scientific J19943-k2
Accutase solution SIGMA A6964 Cell detachment solution
AgeI-HF NEB R3552L
Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody Invitrogen A32723 AB_2633275
Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody Invitrogen A32731 AB_2633280
Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody Invitrogen A32732 AB_2633281
anti-AFP Thermo scientific RB-365-A1 AB_59574
anti-α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP CST 19245S AB_2734735
anti-Dystrophin Thermo PA5-32388 AB_2549858
anti-LIN28A (D1A1A) XP    CST 8641S AB_10997528
anti-MYH2 DSHB mAb2F7 AB_1157865
anti-Nanog-XP CST 8822S AB_11217637
anti-Oct-4A (D6C8T) CST 83932S AB_2721046
anti-Sox2 abcam ab97959 AB_2341193
anti-SSEA1(MC480)  CST 4744s AB_1264258
anti-TH (H-196) SANTA CRUZ  sc-14007 AB_671397
Alkaline Phosphatase Live Stain (500x) Thermo A14353
Blasticidin S Sigma-Aldrich 203350
BsmBI/Esp3I NEB R0580L/R0734L
Carbenicillin Millipore 205805-250MG
Collagenase IV  Worthington Biochemical Corporation LS004189
Competent Cells TakaRa 636763
CutSmart  NEB B7204S
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit Thermo A16517
DirectPCR Lysis Reagent (cell) VIAGEN BIOTECH 302-C
Dispase (1 U/mL) STEMCELL Technologies 7923
Doxycycline Hydrochloride Fisher BioReagents BP26535
EcoRI-HF NEB R3101L
Fibronectin bovine plasma SIGMA F1141
 
QIAEX II Gel Extraction Kit (500)		 QIAGEN 20051
Gelatin from porcine skin, type A SIGMA G1890
HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI Vector H-1500
Hygromycin B (50 mg/mL) Invitrogen 10687010
Ketamine HCL Injection HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH 45822
KpnI-HF NEB R3142L
lenti-CRISPRv2-blast Addgene 83480
lenti-Guide-Hygro-iRFP670 Addgene 99377
Lipofectamin 3000 Transfection Kit Invitrogen L3000015
LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2   Addgene 60625
LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 Addgene 60626
Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit Vector BMK-2202
NotI-HF NEB R3189L
Opti-MEM I Reduced Serum Media ThermoFisher 31985070
Polyethylene glycol 4,000 Alfa Aesar AAA161510B
Polybrene SIGMA TR1003
Corning BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide CORNING CB354688
PowerUp SYBR Green Master Mix ThermoFisher A25742
PrimeSTAR Max Premix TakaRa R045
Proteinase K VIAGEN BIOTECH 507-PKP
Puromycin Dihydrochloride MP Biomedicals ICN19453980
qPCR Lentivirus Titration Kit abm LV900
Quick ligation kit NEB M2200S
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) QIAGEN 27106
QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100) QIAGEN 12945
RevertAid RT Reverse Transcription Kit Thermo scientific K1691
RNAzol RT Molecular Research Center, INC RN 190
T4 DNA Ligase Reaction Buffer NEB B0202S
T4 Polynucleotide Kinase NEB M0201S
Terrific Broth Modified Fisher BioReagents BP9729-600
ViralBoost Reagent (500x) ALSTEM VB100

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References

  1. Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).
  2. Batchelor, C. L., Winder, S. J. Sparks, signals and shock absorbers: how dystrophin loss causes muscular dystrophy. Trends Cell Biology. 16 (4), 198-205 (2006).
  3. Gregorevic, P., et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).
  4. Bengtsson, N. E., Seto, J. T., Hall, J. K., Chamberlain, J. S., Odom, G. L. Progress and prospects of gene therapy clinical trials for the muscular dystrophies. Human Molecular Genetics. 25 (R1), R9-R17 (2016).
  5. Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351 (6271), 407-411 (2016).
  6. Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 400-403 (2016).
  7. Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 403-407 (2016).
  8. Long, C., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345 (6201), 1184-1188 (2014).
  9. El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circulation Research. 121 (8), 923-929 (2017).
  10. Amoasii, L., et al. Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 362 (6410), 86-91 (2018).
  11. Eisen, B., et al. Electrophysiological abnormalities in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes generated from Duchenne muscular dystrophy patients. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 2125-2135 (2019).
  12. Marion, R. M., et al. Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).
  13. Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
  14. Sacco, A., et al. Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice. Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).
  15. Su, X., et al. Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
  16. Su, X., et al. Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 412-419 (2018).
  17. Ousterout, D. G., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nature Communications. 6, 6244 (2015).
  18. Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
  19. Glass, K. A., et al. Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties. Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 151 प्रेरित pluripotent स्टेम सेल iPSC CRISPR/Cas9 DMD डिस्ट्रोफिन myogenic जनक भेदभाव
CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी iPSC में Dystrophin अभिव्यक्ति बहाल करने में व्युत्पन्न मांसपेशी संतति
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Jin, Y., Shen, Y., Su, X.,… More

Jin, Y., Shen, Y., Su, X., Weintraub, N., Tang, Y. CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors. J. Vis. Exp. (151), e59432, doi:10.3791/59432 (2019).

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CRISPR/Cas9_A tribute to the Nobel Prize in Chemistry 2020

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