Summary
Aqui, nós apresentamos um protocolo de apagamento exon23 baseado em Cas9 para restaurar a expressão de distrofina em iPSC de fibroblastos de pele derivados do mouseMDX DMD e diferenciar diretamente iPSCs em células progenitoras miogênicas (MPC) usando o sistema de ativação Tet-on MyoD.
Abstract
A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma doença progressiva severa do músculo causada por mutações no gene da distrofina, que conduz finalmente ao esgotamento de pilhas do progenitor do músculo. Agrupadas regularmente interespaçadas repetições palindromic curtas/CRISPR-Associated 9 (CRISPR/Cas9) edição de gene tem o potencial para restaurar a expressão do gene distrofina. As pilhas de haste pluripotentes induzidas autólogas (iPSCs)-células progenitoras derivadas do músculo (MPC) podem reabastecer a associação da pilha da haste/progenitor, reparar dano, e impedir umas complicações mais adicionais no DMD sem causar uma resposta imune. Neste estudo, nós introduzimos uma combinação de CRISPR/Cas9 e de tecnologias não-integradas de iPSC para obter progenitores do músculo com expressão recuperada da proteína do distrophin. Resumidamente, utilizamos um vetor de Sendai não integradora para estabelecer uma linha de iPSC a partir de fibroblastos dérmicos de camundongos DMDMDX . Nós usamos então a estratégia do apagamento de CRISPR/Cas9 para restaurar a expressão do distrophin através de uma junção não-homóloga da extremidade do gene reframed da distrofina. Depois que a validação do PCR da prostração exon23 em três colônias de 94 escolheu colônias de IPSC, nós diferenciamos IPSC em MPC pela expressão doxiciclina (Dox)-induzida de MyoD, um fator chave da transcrição que joga um papel significativo em regular a diferenciação do músculo. Nossos resultados demonstram a viabilidade do uso da estratégia de deleção CRISPR/Cas9 para restaurar a expressão de distrofina no MPC derivado do iPSC, que tem um potencial significativo para o desenvolvimento de terapias futuras para o tratamento da DMD.
Introduction
A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma das distrofias musculares mais comuns e é caracterizada pela ausência de distrofina, afetando 1 de aproximadamente 5.000 meninos recém-nascidos no mundo inteiro1. A perda da função do gene da distrofina resulta em defeitos estruturais do músculo que conduzem à degeneração progressiva do myofibers1,2. O vírus adeno-associado recombinante (rAAV)-o sistema mediado da terapia de gene foi testado para restaurar a expressão do distrophin e para melhorar a função do músculo, tal como a recolocação do gene usando micro-distrophins (μ-DYS). No entanto, a abordagem Raav requer injeções repetidas para sustentar a expressão da proteína funcional3,4. Conseqüentemente, nós precisamos uma estratégia que possa fornecer eficazmente e permanentemente a expressão de gene da distrofina da recuperação nos pacientes com DMD. O DMDMDX mouse, um modelo de mouse para DMD, tem uma mutação de ponto no exon 23 do gene distrofina que introduz um Codon terminação prematura e resulta em uma proteína não-funcional truncado faltando o domínio de ligação C-terminal distroglicanos. Estudos recentes demonstraram o uso da tecnologia crispr/Cas9 para restaurar a expressão gênica de distrofina por correção genética exata ou deleção do exon mutante em animais pequenos e grandes5,6,7. Long et al.8 relataram o método para corrigir a mutação genética da distrofina na germline de DMDMDX mouse por meio da edição do genoma de crispr/Cas9 com base na reparação dirigida por homologia (HDR). El Refaey et al.9 relataram que a Raav poderia, com eficiência, Exir o mutante 23 em camundongos distróficos. Nestes estudos, os grnas foram projetados nos íntrons 20 e 23 para causar rupturas dobro-encalhadas do ADN, que restaurou parcialmente a expressão do distrophin após o reparo do ADN através da junção não-homóloga da extremidade (nhej). Ainda mais excitante, Amoasii et al.10 relataram recentemente a eficácia e a viabilidade da edição do gene crispr mediado pela Raav na restauração da expressão de distrofina em modelos caninos, um passo essencial na futura aplicação clínica.
DMD também provoca distúrbios da célula-tronco11. Para danos musculares, células-tronco musculares residenciais reabastecem células musculares morrendo após a diferenciação muscular. No entanto, os ciclos consecutivos de lesão e reparo levam ao encurtamento dos telômeros nas células-tronco musculares12e depleção prematura de pools de células-tronco13,14. Conseqüentemente, uma combinação de terapia autóloga da pilha de haste com edição do genoma para restaurar a expressão do distrophin pode ser uma aproximação prática para tratar DMD. A tecnologia CRISPR/Cas9 fornece a possibilidade de gerar células-tronco pluripotentes induzidas geneticamente autólogas (iPSC) para a regeneração muscular funcional e evitar complicações adicionais da DMD sem causar rejeição imune. Entretanto, os iPSCs têm um risco da formação do tumor, que poderia ser aliviado pela diferenciação de iPSC em pilhas myogenic do progenitor.
Neste protocolo, nós descrevemos o uso do vírus de Sendai não-integrando a reprogramação fibroblasto dérmicos de ratosMDX de DMD em iPSCs e recuperamos então a expressão do distrophin pelo apagamento do genoma de crispr/Cas9. Após a validação do apagamento Exon23 em iPSC pela genotipagem, nós diferenciamos o iPSC genoma-corrigido em progenitores myogenic (MPC) através da diferenciação myogenic MyoD-induzida.
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Protocol
Todos os procedimentos cirúrgicos e de manuseio de animais foram realizados por um protocolo aprovado pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais da Universidade Augusta (IACUC). Camundongos foram alimentados com dieta padrão e água ad libitum.
1. isolamento de fibroblastos primários do mouse de camundongos DMDMDX adultos
- Eutanize adultos DMDMDX camundongos (masculino, 2 meses de idade) por co2 asfixia e toracotomia de acordo com iacuc aprovado pela faculdade de medicina da Geórgia, Universidade de Augusta. Corte a cauda com um bisturi estéril em uma condição estéril a capa laminar. Enxágüe a cauda com etanol a 70% por 5 min e depois lave com soro fisiológico tamponado (PBS) estéril em um prato de 6 cm.
- Descasque a pele da cauda fora por uma incisão afiada da base à ponta da cauda ao longo da pele da cauda, e então descasque delicadamente fora a pele da cauda com tweezers. Mince a pele a um tamanho de 1 milímetro3 usando um bisturi estéril e mova o tecido triturado da pele a um prato de 6 cm no meio essencial mínimo de Dulbecco/presunto F12 (DMEM/F12) que contem 0,1% colagenase IV e 1 U/ml do Dispase.
- Digerir o tecido da pele em um prato de cultura para 2 h a 37 ° c em uma incubadora de 5% CO2 .
- Cubra uma placa de 6 poços com fibronectina e 0,2% de gelatina (1 mL de fibronectina em 199 mL de 0,2% de gelatina; Tabela de materiais) e incubar a 37 ° c por 1 h.
- Dissociar o tecido da pele digerida com uma ponta de 1 mL de Pipet e transferir o tecido e o sobrenadante para um tubo de centrifugação cônico estéril de 15 mL. Centrifugar a 217 x g durante 3 min à temperatura ambiente, descartar o sobrenadante e ressuscitará a pelota em 1,5 ml de meio fibroblasto (tabela de materiais).
- Cultive as pelotas que incluem o tecido digerido incompleto da pele da etapa 1,5 na placa 6-well revestida com o fibronectina e a gelatina 0,2% da etapa 1,4 em um ° c 37, incubadora de 5% CO2 . Substitua o meio 24 h após o chapeamento inicial para remover as pilhas não anexadas, e mude o meio cada 48 h.
2. reprogramming fibroblastos da pele do rato em iPSCs
- Dois dias antes da transdução, digerir os fibroblastos dérmicos do camundongo da etapa 1,6 com a solução de descolamento celular (tabela de materiais) em uma incubadora de 37 ° c com uma atmosfera umidificada de 5% co2 por 5 min.
- Contagem de células usando um hemacitômetro e centrífuga em 217 x g por 3 min.
- Células de semente em uma densidade de 1 − 2 x 105 células por poço em uma placa de 6 poços e cultura com meio de fibroblastos (tabela de materiais) em uma incubadora de 37 ° c com uma atmosfera umidificada de 5% co2.
- No dia da transdução (dia 0), estimar as células e calcular o volume de cada vírus necessário para atingir a multiplicidade alvo de infecção (MOI) de 5, 5 e 3 (ou seja, KOS MOI = 5, HC-Myc MOI = 5, hKlf4 MOI = 3) de acordo com o manual comercial.
- Thaw três tubos de Sendai em um banho de água de 37 ° c para 5 − 10 s e adicione os volumes calculados de cada um dos três tubos de Sendai a 1 mL do meio do fibroblasto (tabela dos materiais).
- Retire o meio fibroblasto da etapa 2,3 e adicione a mistura de reprogramação do vírus aos poços que contêm as células. Incubar as células durante a noite em uma incubadora de 37 ° c com uma atmosfera umidificada de 5% CO2.
- Substitua o meio com o meio fresco do fibroblasto 24 h após a transdução. Cultura as células para uma semana com troca média todos os dias.
- Colha fibroblastos infectados do rato no dia 7 após a transdução com 0, 5% de Trypsin/EDTA e coloque em pratos que são previamente revestidos com fibronectina e 0,2% de gelatina.
- Cultura os fibroblastos infectados do rato da etapa 2,6 com o meio de crescimento embrionário completo da pilha de haste do rato (ES) (tabela dos materiais) em uma incubadora de 37 ° c com uma atmosfera humidificada de 5% co2 e meio diário da mudança.
- A partir do 8º dia, observar a placa um microscópio invertido todos os dias para identificar o aparecimento de aglomerados de células com a morfologia do rato ES.
3. usando a fosfatase alcalina viva a mancha e o fluxo citometria para quantificar a eficiência reprogramação
- Remova a mídia de cultura de cada poço e enxague com DMEM/F-12 por 2 − 3 min.
- Aplique 2 mL de 1x fosfatase alcalina (AP) mancha viva solução de trabalho (1:500 diluição em DMEM/F-12) para as células aderentes, e incubar em uma incubadora de 37 ° c com uma atmosfera humidificada de 5% CO2 por 30 min.
- Aspirar a mancha viva AP e lave duas vezes com PBS por 5 min cada.
- Digerir as células com a solução de descolamento de células (tabela de materiais) em uma incubadora de 37 ° c com uma atmosfera humidificada de 5% co2 por 5 min. realizar citometria de fluxo para determinar a eficiência de reprogramação.
4. selecionando e colhendo células ES-like
- Examine as colônias da etapa 2,8 um microscópio invertido.
- Marque as colônias na parte inferior do prato com um marcador de objeto Self-Inking.
- Aplique anéis de clonagem lubrificados para cobrir as colônias de células marcadas. Adicionar 100 μL de 0, 5% de tripsina/EDTA a cada anel de clonagem a 37 ° c durante 5 min e, em seguida, transferir as células digeridas com pontas de pipeta 100 μL para placas de cultura de 48 poços contendo meio de crescimento mES.
- Incubar as células em placas de cultura 48-well em uma incubadora de 37 ° c com uma atmosfera humidificada de 5% CO2. Passagem das células para 6 cm prato quando chegar a 70% confluência.
- Repita as etapas 4,3 e 4,4 por várias vezes até que os clones uniformes em forma de dormitório sejam obtidos.
5. congelamento de iPSCs para a criopreservação
- Dissociar os iPSCs selecionados da etapa 4,5 com tripsina, versene e plasma de pintinho (TVP; Tabela de materiais) solução a 37 ° c em uma incubadora de 5% CO2 por 30 min.
- Colete as células em um tubo cônico estéril de 15 mL e Centrifugue a 217 x g por 3 min à temperatura ambiente.
- Aspirar o sobrenadante e re-suspender a pelota da pilha em 2 mL do meio congelado do rato ES (tabela de materiais) para obter 1 ml por o CryoVial.
- Adicione pilhas aos cryovials e congele-se usando um recipiente do congelador que forneça a taxa de resfriamento crítica, repetida-1 ° c/min exigida para a criopreservação em-80 ° c durante a noite.
- Transfira frascos congelados para um reservatório de azoto líquido.
6. coloração de imunofluorescência para marcadores de células-tronco em iPSCs
- Semente iPSCs da etapa 5,1 cultivada com meio do mES em uma corrediça da câmara de 8 poços revestida com poli-D-lysine/laminin (tabela de materiais) na densidade apropriada para conseguir entre 1 − 2 x 104 pilhas por o poço e incubar em uma incubadora de 37 ° c com um atmosfera umidificada de 5% CO2 para 48 h.
- Mergulhe as lâminas em formaldeído a 4% por 15 min à temperatura ambiente e, em seguida, mergulhe as lâminas em PBS duas vezes por 5 min de cada vez.
- Incubar as secções com um reagente de bloqueio de IgG do rato (tabela de materiais) e 5% de soro de cabra durante 1 h à temperatura ambiente.
- Diluir os anticorpos primários no diluente de proteínas (rato-anti-SSEA1, 1:100, coelho-anti-NANOG, 1:500; coelho-anti-Pou classe 5 Homeobox 1 [OCT4], 1:500; coelho-anti-sry-Box 2 [SOX2], 1:500; coelho-anti-Lin-28 homólogo A [Lin28A], 1:400) (tabela de Materiais). Aplique anticorpos para as células e incubar a 4 ° c durante a noite em uma câmara humidificada.
- Descarte a solução de anticorpos primários e lave as lâminas 3x em PBS.
- Aplique anticorpos segundo (Alexa488-conjugated goat-anti-mouse anticorpo e Alexa555-conjugated cabra-anti-coelho, 1:400 cada) em M.O.M. diluente de proteínas em lâminas e incubar para 45 min à temperatura ambiente.
- Lave as lâminas 3x em PBS e monte secções com meio de montagem contendo 4 ' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
- Tire fotos com um microscópio confocal.
7. investigando a pluripotência dos iPSCs in vivo
- Dissociar as iPSCs da etapa 5,1 em células únicas usando a solução de TVP em uma incubadora de 37 ° c com uma atmosfera humidificada de 5% CO2 por 30 min.
- Contagem de células usando um hemacitômetro e centrífuga em 217 x g por 3 min.
- Aspirar o sobrenadante e suspender a pelota com meio mES em um tubo de centrífuga estéril de 1,5 mL em uma concentração de 5 x 105 células/30 μl para transplante de células.
- Retire o cabelo de ambos os membros traseiros de camundongos imunodeficientes usando cortadores de cabelo.
- Anestesiar camundongos com cetamina (100 mg/kg) e limpar o local da injeção com 75% de álcool.
- Injete 30 μL de suspensão de iPSC da etapa 7,3 intramuscularmente no gastrocnemii, usando uma agulha de 31 G.
- Duas semanas após a injeção, colher o rato desenvolvidos e incorporar em temperatura de corte ideal (OCT) composto, snap Freeze e cortado em 5-μm seções15,16.
- Fixe secções em formaldeído a 4% durante 15 min à temperatura ambiente e, em seguida, lave as lâminas duas vezes em PBS durante 5 min de cada vez.
- Bloqueie as células com diluente de proteína sérica de cabra a 5% durante 1 h à temperatura ambiente.
- Adicionar anticorpo primário diluído (coelho anti-AFP, 1:50; coelho anti-SMA, 1:50; coelho anti-TH, 1:50) para as lâminas e incubar a 4 ° c durante a noite em uma câmara humidificada.
- Descartar a solução de anticorpo primário, lave as células 3x (5 min/Wash) em PBS, adicione um 1:400 diluído Alexa555-conjugado de cabra-anti-coelho para slides, e incubar para 45 min à temperatura ambiente.
- Lave as corrediças 3x (5 min/Wash) em PBS, e monte seções com o meio de montagem que contem DAPI.
8. construção de vetor lentivirais crispr/Cas9 visando íntrons flanqueando distrofina exon 23
- Projete dois pares de oligos do gRNA que alvejam o exon intron-flanqueado do distrophin 23 através de http://crispor.tefor.net/crispor.py.
Nota: os pares projetados são como segue:
i22sense: 5 '-CACCGTtaagcttaggtaaaatcaa-3 '
i22anti-Sense: 5 '-AAACTtgattttacctaagcttaaC-3 '
i23sense: 5 '-CACCGAgtaatgtgtcataccttct-3 '
i23anti-Sense: 5 '-AAACAgaaggtatgacacattactC-3 '). - Digerir e dephosphorylate 5 μg de plasmídeo crispr lentivirais (Lenti-CRISPRv2-Blast [um presente de Mohan Babu] e Lenti-Guide-Hygro-iRFP670 [um presente de Kristen Brennand]) (tabela de materiais) com BsmB1/Esp3I por 30 min a 37 ° c. Para 5 μg de plasmís, adicione 3 μL de enzima BsmB1 restrict, 3 μL de fosfatase alcalina rápida, 6 μL de tampão de síntese enzimática 10x e 0,6 μL de 100 mM DTT em 60 μL de reacção).
- Carregue as reações em um gel de agarose de 0,8%. Execute o gel a 100 − 150 V durante 30 min.
- Purify o plasmídeo digerido em-gel usando um kit de extração de gel (tabela de materiais) e eluir em 20 μL de H2O.
- Phosphorylate e recoze cada par dos oligonucleotídeos do grna que contêm 1 μL de cada Oligonucleotide em 100 μm, 1 μl do amortecedor da ligadura 10x T4, 0,5 μL da quinase do polinucleotídeo T4 (PNK), 6,5 μL de DDH2O em 37 ° c por 30 minutos, e então ° c 95 por 5 próprio a 25 ° c a 5 ° c/min.
- Ligate uma diluição 1:200 do oligonucleotídeos recozido do grna no plenticrispr v2-explosão ou abundante-Hygro-iRFP670. Misturar 50 ng de vectores BsmB1/Esp3I digeridos com 1 μL de oligo duplex diluído e 5 μL de tampão de ligase 2x mais 1 μL de ligase num sistema de reacção de 11 μL e incubar durante 10 min à temperatura ambiente.
- Realize a transformação com 3 μL de produto de ligadura em 50 μL de células competentes (tabela de materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
- Espalhe as células competentes transformadas numa placa de agar com 100 μg/mL de carbenicilina e incubar a 31,5 ° c durante 18 h.
- Escolha colônias com 10 μL de pontas de pipeta estéreis e cultura em 5 mL de caldo fantástico (tabela de materiais) contendo 100 μg/ml de carbenicilina a 31,5 ° c, 185 RPM em uma incubadora de Shaker por 21 h.
- Purificar o DNA plasmídeo usando os kits de mini-Prep e MIDI-Prep (tabela de materiais).
- Verifique os plasmíos de minipreparação por digestão de restrição. Para o sistema de reação de 20 μL, adicione 1 μg de DNA plasmídeo, 2 μL de tampão de reação Digest (tabela de materiais) e 1 μL de mistura enzimática de restrição (0,5 μL de kpni-hf e 0,5 μL de agei-HF para plentiCRISPR v2-Blast-i22; 0,5 μL de noti-hf e 0,5 μL de EcoRI Abundantes-Hygro-iRFP670-i23). Incubar o sistema de reacção durante 1 h a 37 ° c.
- Carregue as reações em um gel de agarose de 0,8%. Execute o gel a 100 − 150 V durante 30 min.
Nota: as bandas correctas para plentiCRISPR v2-Blast-i22 devem ser 622 BP e 12,2 KB, e as bandas correctas para abundantes Guide-Hygro-iRFP670-i23 devem ser 2,6 KB e 7,1 KB.
9. empacotamento do vetor de lentiviral
- Cultura 7 x 105 293ft células em 5 ml de DMEM mídia contendo 10% soro fetal bovino em um prato de 6 cm durante a noite a 37 ° c, 5% co2.
- Prepare um cocktail (1 μg de plentiCRISPR v2-Blast-i22 ou abundante-Hygro-iRFP670-i23, 750 ng de plasmídeo de embalagem psPAX2, 250 ng de plasmídeo de envelope de pMD2. G e 5 μL de reagente de transfecção A [tabela de materiais] em 100 μl de média de Mem de soro reduzida).
- Prepare uma mistura de 5 μL de reagente de transfecção B (tabela de materiais) em 100 μl de suportes de mem séricos reduzidos.
- Adicionar 100 μL de mistura de Reagente B de transfecção à mistura de plasmídeo do passo 9,2 e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
- Adicione o complexo DNA-lipídico (da etapa 9,4) gota gota às células de 293ft. Incubar durante a noite a 37 ° c com 5% CO2.
- Adicionar potenciador de produção de vírus (500x) (tabela de materiais) para cada prato no dia seguinte e incubar para 24 h a 37 ° c, 5% co2.
- Colete meio de células usando pipetas nos próximos dois dias e filtre o meio através de um filtro de 0,45 μm para remover as células.
10. concentração e purificação de vetores lentivirais
- Precipitar o vetor lentivirais no meio da etapa 9,7 durante a noite em 4 ° c com 5x polietileno glicol 4000 (PEG4000, 8,5% concentração final) e 4 m NaCl (0,4 m de concentração final).
- Centrifugue a mídia viral contendo a solução PEG4000 em 2.095 x g e 4 ° c por 30 min, retire e descarte o sobrenadante.
- Ressuscite os pellets com 500 μL de soro reduzido MEM Media (titer de Lentivirus: Lenti-CRISPR v2-gRNAi22:1,56 x 108, Lenti-IRFP670-gRNAi23:1,3 x 108, Lenti-crispr v2-controle: 3,13 x 107, lenti-iRFP670-controle: 5,9 x 107 ). Armazene em-80 ° c até o uso.
11. supressão do exon 23 no rato iPSCs com duas guias RNAs (gRNAs) acopladas a Cas9
- Placa do mouse iPSCs da etapa 4,5 em uma placa de 24 poços revestido com fibronectina e gelatina.
- Após as células atingirem 50% de confluência, mude para o meio de cultura fresco (meio de crescimento de células estaminais embrionárias do rato completo) contendo 8 μg/mL de polibreno).
- Adicionar 100 μl da solução de partícula lentivirais da etapa 10,3 incluindo Lenti-crispr v2-gRNAi22, Lenti-iRFP670-gRNAi23 e controle (vetor vazio: Lenti-crispr v2, Lenti-iRFP670) para mouse iPSCs. Incubar células durante 3 dias a 37 ° c com 5% CO2.
- Selecione células estavelmente infectadas com meios contendo 2,5 μg/mL de blasticidina e 100 μg/mL de higromicina B, determinando a concentração mínima de blasticidina e hygromicina B necessárias para matar a célula não infectada.
Nota: as células não infectadas seriam mortas por blasticidina e hygromicina B. - Digerir o rato selecionado iPSCs com 0,5 mL de solução de TVP cada poço (placa de 24 poços) e incubar células por 30 min a 37 ° c com 5% CO2.
- Dissociar os iPSCs em células únicas por pipetagem, contagem de células com uma célula contando câmara e, em seguida, diluir cerca de 150 digerido células individuais com mES médio em 10 cm prato para a cultura em 37 ° c com 5% CO2.
- Após cerca de 10 dias, escolha colônias únicas um microscópio invertido usando 10 μL de pontas de pipeta estéreis (96 colônias precisam ser colhidas).
- Transfira as colônias escolhidas em 50 μL da solução de TVP cada poço (placa de 96 poços, uma colônia cada poço), digerir em 37 ° c por 30 minutos, e então semente as pilhas digeridas em placas da cultura 2 96-well para manter a cultura (uma para Genotyping).
- Incubar em uma incubadora do CO2 em 37 ° c até 70% confluente.
12. identificação de colônias de iPSC com deleção de exon23
- Remova o meio na placa 96-well quando as colônias da pilha alcangam 70% confluência.
- Adicionar 25 μL de reagente de lise (tabela de materiais) contendo solução de proteinase k (1 ml de proteinase k em 100 ml de reagente de Lise) a cada poço, e transferir o lisado para uma placa de PCR de 96 poços.
- Sele a placa do PCR e incubar as placas no ° c 55 por 30 minutos, e então em 95 ° c para 45 minutos para lyse as pilhas e para desnaturar o proteinase K.
- Realize a reacção de PCR com 2 μL de lisado a partir do passo 12,3. Para a reação de PCR de 20 μL, acrescente 2 μL de lisado, 10 μL de 2x pré-mistura de DNA polimerase (tabela de materiais), 7 μL de água livre de DNase e 1 μL de primers de DMD exon 23 (tabela 1).
- Use os seguintes parâmetros para a reação do PCR: 98 ° c por 1 minuto, 35 ciclos de 98 ° c para 10 s, 60 ° c para 15 s, 72 ° c para 30 s, e uma extensão final em 72 ° c por 1 minuto.
- Carregue a reação do PCR em um gel do agarose de 2%. Execute o gel a 100 − 150 V durante 30 min.
- Inspecione o gel a luz UV (a eficiência do nocaute é 3/94).
13. usando o sistema de ativação Tet-on MyoD para diferenciar diretamente o iPSC em células progenitoras miogênicas (MPC)
- Pacote o LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 e LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 (um presente de Charles Gersbach) (tabela de materiais) como descrito anteriormente para Lenti-CRISPRv2-Blast e Lenti-grna-iRFP670 vetores em seções 9 e 10.
- Infete o mouse iPSC com Lentivirus-TRE-VP64-MyoD-T2A-dsRed-Express2 ou Lentivirus-TRE-VP16-MyoD-T2A-dsRedExpress2 conforme descrito anteriormente para vetores Lenti-CRISPRv2-Blast e Lenti-gRNA-iRFP670 nas etapas 11.1 − 11.3.
- Selecione células com 1 μg/mL de puromicina após três dias de infecção para obter uma população pura de células transadas.
- Adicionar 3 μg/mL de doxiciclina em meios de cultura (10% FBS DMEM) à diferenciação de MPC. Substitua o meio fresco suplementado com o doxiciclina cada dois dias.
14. PCR quantitativa da transcrição reversa para avaliar a diferenciação dinâmica do músculo e a expressão do exon 22-24 de DMD
- Extraia o RNA celular após 0, 3, 6, e 10 dias após o tratamento do doxiciclina usando o reagente da isolação do RNA, reversamente transcrever o RNA no cDNA usando o primeiro jogo da síntese do cDNA da Costa (tabela dos materiais).
- Para o sistema de reação de 20 μL de qPCR, adicione 1 μL de cDNA, 10 μL de tampão de reação de PCR (tabela de materiais), 8 ΜL de DNA H2O e 1 μL de mistura de primers para diante e reverso (gliceraldeído-3-fosfato DESIDROGENASE [GAPDH], músculo esquelético [ACTA1], OCT4 e DMD exon22, DMD exon23 e DMD exon24, consulte a tabela 1).
- Utilize os seguintes parâmetros para reação de PCR: 50 ° c por 2 min, 95 ° c por 2 min, 40 ciclos de 95 ° c para 15 s, 60 ° c por 1 min, curva de fusão 65,0 ° c a 95,0 ° c, incremento de 0,5 ° c.
15. coloração de imunofluorescência da cadeia pesada de miosina 2 (MYH2) e expressão da proteína distrofina
- A placa Doxycycline-induzida, Lenti-TRE-MyoD modificou pilhas da etapa 13,4 em 8 corrediças da cultura do poço.
- Fixe as células em formaldeído a 4% durante 15 min à temperatura ambiente e, em seguida, lave as lâminas duas vezes em PBS durante 5 min de cada vez.
- Bloqueie as células com diluente de proteína sérica de cabra a 5% durante 1 h à temperatura ambiente.
- Adicionar anticorpo coelho-anti-distrofina (1:300) e anticorpo rato-MYH2 (1:100) para as lâminas, incubar a 4 ° c durante a noite em uma câmara humidificada.
- Descartar a solução de anticorpo primário, lave as células 3x (5 min/Wash) em PBS, adicione 1:400 diluído Alexa488-conjugado de cabra-anti-coelho anticorpo e Alexa555-conjugado de cabra-anti-mouse anticorpo para slides, e incubar para 45 min à temperatura ambiente.
- Lave as lâminas 3x (5 min/Wash) em PBS e monte seções com meio de montagem contendo DAPI.
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Representative Results
Estabelecimento de fibroblastos de pele DMDMDX derivados de IPSC. Demonstramos a eficiência da geração de iPSCs de mouse a partir de fibroblastos de pele derivados DMDMDX usando os vetores de reprogramação sem integração. A Figura 1a demonstrou que a aparência de células-tronco embrionárias (ESC)-como colônias em três semanas após a infecção. Nós avaliamos a eficiência da indução de iPSC pela mancha alcalina viva da fosfatase (AP); A Figura 1b mostra que a percentagem de células AP positivas foi de cerca de 1,8% por análise de FACS. SSEA1, Lin28, NANOG, OCT4 e SOX2, marcadores de pluripotência para células-tronco embrionárias do camundongo, foram positivos para colônias de iPSC por coloração imunofluorescente, (Figura 1C). Para investigar a diferenciação de três germline de iPSCs in vivo, nós injetamos intramuscularmente iPSCs no gastrocnemii do rato. Observamos que os iPSCs injetados diferenciaram-se em células hepáticas (endoderma), células musculares lisas (mesoderma) e células neurais adrenérgicas (ectoderma) (Figura 1D), indacando a pluripotência das iPSCs.
Supressão de exon23 mediada por Crispr/Cas9. Nós projetamos duas RNAs guia que flanqueiam o exon mutante 23. Após quebras de dupla-ociosas mediadas por Cas9 (DSB) e junção de extremidade não homóloga (NHEJ), o exon 23 mutante foi excluído, permitindo a produção de distrofina truncada mas funcional (Figura 2a). Para identificar o exon 23 excluído iPSC mouse, as células foram escassamente semeadas, e colônias individuais foram colhidas e propagados. Os DNAs de Genomic extraídos destas colônias foram sujeitados ao PCR que genotyping. A Figura 2b demonstrou que a colônia #1 e #2 têm deleções do exon 23 indicando uma deleção bem-sucedida do exon 23.
Diferenciando iPSCs do mouse em uma linhagem miogênica e restaurando a expressão de distrofina. Nós usamos um sistema Tetracycline-inducible da expressão do MyoD para induzir a diferenciação myogenic de iPSCs. A doxiciclina foi utilizada para induzir a expressão de MyoD em iPSCs. A Figura 3a mostra o curso de tempo de diferenciação muscular em iPSCs tratados com Dox. o qRT-PCR mostrou que o nível de mRNA de OCT4, um marcador pluripotente, diminuiu gradualmente, quando a expressão de ACTA1, um marcador do músculo esqueletal, aumentou após a indução de Dox. Observou-se também a formação de miotubos em duas semanas após o tratamento com Dox (Figura 3B). É importante ressaltar que o teste de qRT-PCR mostrou a recuperação da expressão de DMD exon 24 mRNA em linha deletada induzida por Dox, Exon23, em comparação com a linha de controle Cas9 (Figura 3C). Inconsistente com a qRT-PCR, a coloração imunofluorescente mostra a expressão da proteína distrofina em células exon 23 excluídas, enquanto que as expressões de distrofina estavam ausentes nas células de controle (Figura 3D).
Figura 1: reprogramando fibroblastos da pele de camundongosMDX DMD em iPSCs.
(A) imagem representativa de colônias semelhantes a es (barra de escala = 200 μm). (B) análise do FACS da eficiência reprogramação de fibroblasto da pele do rato em iPSCs após 8 dias da transdução do vírus de Sendai pela mancha viva do AP. (C) coloração imunofluorescente de SSEA1, Lin28, NANOG, OCT4 e SOX2 em iPSCs (barra de escala = 50 μm). (D) coloração imunofluorescente para AFP (endoderma), sma (mesoderma) e tirosina hidrolase (TH) (ectoderma) de teratoma 2 semanas após injeção de IPSC em desenvolvidos (barra de escala = 20 μm). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: supressão exon23 mediada por CRISPR/Cas9.
(A) diagrama esquemático de deleções de exon 23 mediadas por crispr/Cas9. A nuclease Cas9 atinge intron 22 e intron 23 por dois gRNAs. As rupturas dobro-encalhadas (DSBs) por Cas9 resultam na excisão do exon 23 do mutante. As extremidades longe do ponto de origem são reparadas pela junção não-homóloga da extremidade (NHEJ), tendo por resultado a restauração do frame da leitura do gene do distrophin. (B) análise de genotipagem de PCR do exon 23. A seta indica o produto do PCR do exon 23. GAPDH serve como referência. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: diferenciando iPSCs do mouse na linhagem miogênica e restaurando a expressão de distrofina.
(A) o qRT-PCR mostrou o curso do tempo do nível do mRNA de Oct4 e de ACTA1 no exon Dox-Tratado 23-suprimido DMDMDX IPSC (* P < 0, 5 contra D0, d6, d10, #P < 0, 5 vs D0, d3, d10, $P < 0, 5 vs D0, D3, D6, n = 4 para Oct4) (* P < 0, 5 vs D6 e D10 , #P < 0, 5 vs D0, D3 e D10, $P < 0, 5 vs D0, D3 e D6, n = 3 para ACTA1). (B) esquerda: imagem representativa da formação de Miotubos de iPSCs de camundongo induzido por Dox (barra de escala = 200 μm). Direita: análise imunofluorescente de MYH2 na formação de miotubos de iPSCs de camundongo induzido por Dox (barra de escala = 20 μm). (C) superior: as posições do primer do PCR para DMD Exon22, Exon23 e Exon24; Fundo: análise de qRT-PCR do nível de mRNA de DMD Exon22, Exon23, e expressão Exon24 em MPC (* * * * P < 0, 1, n = 3). (D) análise imunofluorescente da expressão de DISTROFINA em MPC induzida por Dox de IPSCCAS9-CTRL e IPSCCAS9-grna (barra de escala = 50 μm). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Cartilhas de guia | |
| i22 sentido | 5 '-CACCGTTAAGCTTAGGTAAAATCAA-3 ' |
| i22 antisense | 5 '-AAACTTGATTTTACCTAAGCTTAAC-3 ' |
| i23 sentido | 5 '-CACCGAGTAATGTGTCATACCTTCT-3 ' |
| I23 antisense | 5 '-AAACAGAAGGTATGACACATTACTC-3 ' |
| Primers de PCR | |
| OCT4-Forward | 5 '-AGCTGCTGAAGCAGAAGAGGATCA-3 ' |
| OCT4-reverso | 5 '-TCTCATTGTTGTCGGCTTCCTCCA-3 ' |
| ACTA1-Forward | 5 '-GATCCATGAGACCACCTACAAC-3 ' |
| ACTA1-reverso | 5 '-TCAGCGATACCAGGGTACAT-3 ' |
| Exon22-Forward | 5 '-TTACCACCAATGCGCTATCA-3 ' |
| Exon22-reverso | 5 '-CCGAGTCTCTCCTCCATTATTTC-3 ' |
| Exon23-Forward | 5 '-CCAAGAAAGCACCTTCAGAAATATG-3 ' |
| Exon23-reverso | 5 '-TTTGGCAGCTTTCCACCA-3 ' |
| Exon24-Forward | 5 '-AAC CTT ACA GAA ATG GAT GGC-3 ' |
| Exon24-reverso | 5 '-TTTCAGGATTTCAGCATCCC-3 ' |
| GAPDH-Forward | 5 '-TGACAAGCTTCCCATTCTCG-3 ' |
| GAPDH reverso | 5 '-CCCTTCATTGACCTCAACTACAT-3 ' |
Tabela 1: sequência da cartilha.
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Discussion
A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma doença hereditária destrutiva e finalmente fatal caracterizada pela falta de distrofina, levando à atrofia progressiva do músculo1,2. Nossos resultados demonstram a expressão restaurada do gene do distrophin em pilhas de progenitor myogenic de DMDMDX IPSC-derivadas pela aproximação do apagamento EXON23 de crispr/Cas9-negociado. Esta abordagem tem três vantagens.
Primeiramente, nós geramos iPSCs dos fibroblasto dérmicos derivados do rato de DMDMDX usando um vetor não-integrado do RNA. Uma variedade de métodos foi desenvolvida para gerar iPSCs, tais como vetores lentivirais e retrovirais, que se integrarão em cromossomas hospedeiros para expressar os genes de reprogramação, tendo assim preocupações de segurança. Vetores baseados em DNA, como vetores plasmídeo, vírus adeno-associados e adenovírus, existem de forma não integrada; Entretanto, podem ainda integrar no cromossoma do anfitrião em uma baixa freqüência. Neste estudo, utilizou-se um vírus de Sendai modificado, não transmissível, um vetor de RNA não integrado, para fornecer de forma segura e efetiva fatores de transcrição de células-tronco a fibroblastos para reprogramação.
Em seguida, utilizamos a deleção do genoma mediada por CRISPR, em vez da correção do gene de precisão mediada por CRISPR/Cas9, para restaurar a expressão de distrofina em iPSCs. Este método é viável e eficiente; é fácil projetar gRNAs múltiplos suprimir exons múltiplos do mutante, que ocorrem em muitos pacientes humanos de DMD17. O apagamento do exon utiliza um caminho de junção da extremidade não-homologous relativamente eficiente, e o método igualmente evita a necessidade de entregar um molde do reparo do ADN. Portanto, em comparação com a correção de precisão mediada por Cas9, a deleção de exon Cas9-mediada é adequada para pacientes com DMD com mutações genéticas múltiplas.
Finalmente, nós induziu iPSCs indiferenciados em pilhas myogenic do progenitor, que podem reduzir o risco do tumorigênese causado por iPSCs. Neste protocolo, nós induzimos a expressão do MyoD através de um sistema Tetracycline-regulado induzível do vetor (Tet-em) para diferenciar iPSCs em progenitores do músculo esqueletal18,19.
Concluindo, a combinação da edição do genoma CRISPR/Cas9 com o sistema de ativação Tet-on MyoD pode fornecer uma estratégia segura, viável e eficiente para deleção de DMD-Exon23 mutante em células-tronco para transplante de células em pacientes com DMD.
Para selecionar e colher as células ES-like eficientemente, devemos identificar as células iPSC indiferenciadas através de sua morfologia de cúpula, e um marcador de objeto de tinta pode nos ajudar a rotular clones individuais da parte inferior do prato de cultura com um círculo de 1,8 mm em torno do iPSC Clones. Para evitar vazamento de solução de tripsina, precisamos aplicar graxa uniformemente para a parte inferior dos anéis. Também, após ter coloc os anéis graxa-revestidos na parte superior das colônias etiquetadas da pilha, o cuidado deve ser tomado para não tocar nos anéis. Caso contrário, os clones de iPSC serão destacados.
O protocolo tem suas limitações; por exemplo, escolhemos um sistema vetorial de RNA não integrado para gerar iPSCs. No entanto, utilizamos um sistema crispr/Cas9 lentivirais para excluir o exon 23 de DMD e um sistema de ativação MyoD baseado em lentivirus para induzir a diferenciação miogênica do IPSC; Estes vectores lentivirais integrativos têm preocupações de segurança. No entanto, essas questões podem ser resolvidas pela aplicação de um complexo de ribonucleoproteína (RNP) que compreende uma nuclease de S. pyogenes Cas9 recombinante, de alta pureza, com uma crRNA: tracrRNA duplex; Nós podemos escolher o transfection quimicamente modificado do mRNA de MyoD para diferenciar diretamente iPSCs em progenitors myogenic, embora a eficiência possa ser desafiante.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Tang e Weintraub foram parcialmente apoiados por NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Instruments | |||
| 31-gauge needle | Various | ||
| Sharp Incision | Various | ||
| Sterile Scalpels | Various | ||
| Tweezers | Various | ||
| Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.1 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 1 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 87 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 10 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 1 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 1 mL |
| TVP solution (for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Chicken Serum | Gibco | 16110-082 | 5 mL |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | 186 mg |
| Phosphat-buffered saline | to 500 mL | ||
| Trypsin (2.5%) | Thermo | 15090046 | 5 mL |
| mES growth medium(for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.5 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 408.5 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 75 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 5 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 500 μL |
| MEK/GS3 Inhibitor Supplement | EMD Millipore Corp | CS210510-500UL | 500 μL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 5 mL |
| The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks. | |||
| mES frozen medium(for 50 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | SIGMA | D2650 | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 24.9 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 25 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 50 μL |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | RRID |
| 0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA | CORNING | 25-052-CI | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo scientific | J19943-k2 | |
| Accutase solution | SIGMA | A6964 | Cell detachment solution |
| AgeI-HF | NEB | R3552L | |
| Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody | Invitrogen | A32723 | AB_2633275 |
| Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32731 | AB_2633280 |
| Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32732 | AB_2633281 |
| anti-AFP | Thermo scientific | RB-365-A1 | AB_59574 |
| anti-α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP | CST | 19245S | AB_2734735 |
| anti-Dystrophin | Thermo | PA5-32388 | AB_2549858 |
| anti-LIN28A (D1A1A) XP | CST | 8641S | AB_10997528 |
| anti-MYH2 | DSHB | mAb2F7 | AB_1157865 |
| anti-Nanog-XP | CST | 8822S | AB_11217637 |
| anti-Oct-4A (D6C8T) | CST | 83932S | AB_2721046 |
| anti-Sox2 | abcam | ab97959 | AB_2341193 |
| anti-SSEA1(MC480) | CST | 4744s | AB_1264258 |
| anti-TH (H-196) | SANTA CRUZ | sc-14007 | AB_671397 |
| Alkaline Phosphatase Live Stain (500x) | Thermo | A14353 | |
| Blasticidin S | Sigma-Aldrich | 203350 | |
| BsmBI/Esp3I | NEB | R0580L/R0734L | |
| Carbenicillin | Millipore | 205805-250MG | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Competent Cells | TakaRa | 636763 | |
| CutSmart | NEB | B7204S | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo | A16517 | |
| DirectPCR Lysis Reagent (cell) | VIAGEN BIOTECH | 302-C | |
| Dispase (1 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP26535 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101L | |
| Fibronectin bovine plasma | SIGMA | F1141 | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit (500) |
QIAGEN | 20051 | |
| Gelatin from porcine skin, type A | SIGMA | G1890 | |
| HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1500 | |
| Hygromycin B (50 mg/mL) | Invitrogen | 10687010 | |
| Ketamine HCL Injection | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | 45822 | |
| KpnI-HF | NEB | R3142L | |
| lenti-CRISPRv2-blast | Addgene | 83480 | |
| lenti-Guide-Hygro-iRFP670 | Addgene | 99377 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000015 | |
| LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60625 | |
| LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60626 | |
| Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit | Vector | BMK-2202 | |
| NotI-HF | NEB | R3189L | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | ThermoFisher | 31985070 | |
| Polyethylene glycol 4,000 | Alfa Aesar | AAA161510B | |
| Polybrene | SIGMA | TR1003 | |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide | CORNING | CB354688 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | A25742 | |
| PrimeSTAR Max Premix | TakaRa | R045 | |
| Proteinase K | VIAGEN BIOTECH | 507-PKP | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals | ICN19453980 | |
| qPCR Lentivirus Titration Kit | abm | LV900 | |
| Quick ligation kit | NEB | M2200S | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100) | QIAGEN | 12945 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo scientific | K1691 | |
| RNAzol RT | Molecular Research Center, INC | RN 190 | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Terrific Broth Modified | Fisher BioReagents | BP9729-600 | |
| ViralBoost Reagent (500x) | ALSTEM | VB100 |
References
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