Summary
Aquí, presentamos un protocolo de eliminación exon23 basado en Cas9 para restaurar la expresión de distrofina en iPSC a partir de fibroblastos cutáneos derivados del ratón Dmdmdx y diferenciar directamente los iPSC en células progenitoras miogénicas (MPC) utilizando el sistema de activación Tet-on MyoD.
Abstract
La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad muscular progresiva grave causada por mutaciones en el gen de la distrofina, que en última instancia conduce al agotamiento de las células progenitoras musculares. La edición de genes 9 (CRISPR/Cas9) agrupada regularmente interespaciada tiene el potencial de restaurar la expresión del gen de la distrofina. Las células progenitoras musculares derivadas de células madre (iPSC) derivadas de células anticuarias derivadas de la ínloga (IPSC) pueden reponer la agrupación de células madre/progenitoras, reparar el daño y prevenir más complicaciones en dMD sin causar una respuesta inmunitaria. En este estudio, introducimos una combinación de tecnologías CRISPR/Cas9 y iPSC no integradas para obtener progenitores musculares con expresión de proteína de distrofina recuperada. Brevemente, utilizamos un vector Sendai no integrador para establecer una línea iPSC a partir de fibroblastos dérmicos de ratones Dmdmdx. A continuación, utilizamos la estrategia de eliminación de CRISPR/Cas9 para restaurar la expresión de la distrofina a través de una unión final no homóloga del gen de la distrofina reenmarcada. Después de la validación de PCR de agotamiento de exon23 en tres colonias de 94 colonias iPSC escogidas, diferenciamos iPSC en MPC por expresión de MyoD inducida por doxiciclina (Dox), un factor de transcripción clave que desempeña un papel significativo en la regulación de la diferenciación muscular. Nuestros resultados muestran la viabilidad de utilizar la estrategia de eliminación de CRISPR/Cas9 para restaurar la expresión de distrofina en MPC derivado de iPSC, que tiene un potencial significativo para desarrollar terapias futuras para el tratamiento de la DMD.
Introduction
La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una de las distrofias musculares más comunes y se caracteriza por la ausencia de distrofina, afectando a 1 de aproximadamente 5.000 niños recién nacidos en todo el mundo1. La pérdida de la función del gen de la distrofina da lugar a defectos musculares estructurales que conducen a la degeneración progresiva de las miofibras1,2. Se ha probado el sistema de terapia génica mediado por el virus adeno asociado recombinante (rAAV) para restaurar la expresión de la distrofina y mejorar la función muscular, como el reemplazo de genes mediante microdistrophins(-Dys). Sin embargo, el enfoque de rAAV requiere inyecciones repetidas para sostener la expresión de la proteína funcional3,4. Por lo tanto, necesitamos una estrategia que pueda proporcionar de manera efectiva y permanente la expresión génica de la distrofina en pacientes con DMD. El ratón Dmdmdx, un modelo de ratón para DMD, tiene una mutación puntual en el exón 23 del gen de la distrofina que introduce un codón de terminación prematura y da como resultado una proteína truncada no funcional que carece del dominio de unión de distroglicano C-terminal. Estudios recientes demostraron el uso de la tecnología CRISPR/Cas9 para restaurar la expresión del gen de la distrofina mediante una corrección génica precisa o la eliminación de exón mutante en animales pequeños y grandes5,6,7. 8 informaron del método para corregir la mutación del gen de la distrofina en la línea germinal del ratón Dmdmdx por reparación dirigida por homología (HDR) basada en la edición del genoma CRISPR/Cas9. 9informaron que el rAAV podría extirpar eficientemente el exón 23 mutante en ratones distróficos. En estos estudios, los gRNA fueron diseñados en los intrones 20 y 23 para causar roturas de ADN de doble cadena, que restauraron parcialmente la expresión de distrofina después de la reparación del ADN a través de la unión final no homóloga (NHEJ). 10 recientemente informaron de la eficacia y viabilidad de la edición de genes CRISPR mediada por rAAV en la restauración de la expresión de distrofina en modelos caninos, un paso esencial en la aplicación clínica futura.
DMD también causa trastornos de las células madre11. Para el daño muscular, las células madre musculares residenciales reponen las células musculares moribundas después de la diferenciación muscular. Sin embargo, los ciclos consecutivos de lesión y reparación conducen a la acortación de telómeros en las células madre musculares12,y el agotamiento prematuro de las agrupaciones de células madre13,14. Por lo tanto, una combinación de terapia de células madre autóloga con edición del genoma para restaurar la expresión de la distrofina puede ser un enfoque práctico para el tratamiento de la DMD. La tecnología CRISPR/Cas9 ofrece la posibilidad de generar células madre pluripotentes inducidas genéticamente autodescriptivas (iPSC) para la regeneración muscular funcional y prevenir más complicaciones de DMD sin causar rechazo inmune. Sin embargo, los ISPC tienen un riesgo de formación de tumores, que podría aliviarse mediante la diferenciación de iPSC en células progenitoras miogénicas.
En este protocolo, describimos el uso del virus Sendai no integrador para reprogramar fibroblastos dérmicos de ratones Dmdmdx en isPC y luego recuperar la expresión de distrofina mediante la eliminación del genoma CRISPR/Cas9. Después de la validación de la eliminación de Exon23 en iPSC por genotipado, diferencimos el iPSC corregido por genoma en progenitores miogénicos (MPC) a través de la diferenciación miogénica inducida por MyoD.
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Protocol
Todos los procedimientos quirúrgicos y de manejo de animales fueron realizados por un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Augusta (IACUC). Los ratones fueron alimentados con dieta estándar y agua ad libitum.
1. Aislamiento de fibroblastos primarios de ratón de ratones Dmdmdx adultos
- Euthanizar adultodmdx ratones (masculino, 2 meses de edad) por asfixia deCO2 y toracotomía según IACUC aprobado por el Colegio Médico de Georgia, Universidad Augusta. Cortar la cola con un bisturí estéril en una condición estéril bajo la campana laminar. Enjuague la cola con 70% de etanol durante 5 min y luego lave con solución salina estéril con fosfato (PBS) en un plato de 6 cm.
- Pelar la piel de la cola por una incisión aguda desde la base hasta la punta de la cola a lo largo de la piel de la cola, y luego pelar suavemente la piel de la cola con pinzas. Mince la piel a un tamaño de 1 mm3 usando un bisturí estéril y mueva el tejido de la piel picada a un plato de 6 cm en el medio esencial mínimo de Dulbecco/F12 de Ham (DMEM/F12) que contiene 0.1% colagenasa IV y 1 U/ml de dispase.
- Digerir el tejido cutáneo en un plato de cultivo durante 2 h a 37 oC en una incubadora de CO2 al 5%.
- Recubrir una placa de 6 pocillos con fibronectina y 0,2% de gelatina (1 ml de fibronectina en 199 ml de 0,2% de gelatina; Tabla de Materiales) e incubar a 37oC durante 1 h.
- Disociar el tejido cutáneo digerido con una punta de pipeta de 1 ml y transferir el tejido y el sobrenadante a un tubo de centrífuga cónica estéril de 15 ml. Centrifugar a 217 x g durante 3 min a temperatura ambiente, desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1,5 ml de medio defibroblastos (Tabla de materiales).
- Cultivo de los pellets incluyendo tejido cutáneo digerido incompleto del paso 1.5 en la placa de 6 pocillos recubierto con fibronectina y 0.2% gelatina del paso 1.4 en una incubadora de 37oC, 5% CO2. Reemplace el medio 24 h después del revestimiento inicial para eliminar las celdas no conectadas y cambie el medio cada 48 h.
2. Reprogramar fibroblastos de la piel del ratón en iPSCs
- Dos días antes de la transducción, digerir los fibroblastos dérmicos del ratón del paso 1.6 con la solución de desprendimiento celular(Tabla de Materiales)en una incubadora de 37oC con una atmósfera humidificada de 5%CO2 durante 5 min.
- Cuente las células usando un hemacitómetro y centrífuga a 217 x g durante 3 min.
- Células de semillas a una densidad de 1 x 2 x 105 células por pocido sobre una placa de 6 pocillos y cultivo con medio defibroblastos (Tabla de materiales)en una incubadora de 37oC con una atmósfera humidificada del 5% de CO2.
- El día de la transducción (día 0), estime las células y calcule el volumen de cada virus necesario para alcanzar la multiplicidad objetivo de infección (MOI) de 5, 5 y 3 (es decir, KOS MOI 5, hc-Myc MOI a 5, hKlf4 MOI a 3) de acuerdo con el manual comercial.
- Descongelar tres tubos Sendai en un baño de agua de 37oC durante 5 o 10 s y añadir los volúmenes calculados de cada uno de los tres tubos Sendai a 1 ml de medio defibroblastos (Tabla de materiales).
- Retire el medio fibroblasto del paso 2.3 y agregue la mezcla de virus de reprogramación a los pozos que contienen las células. Incubar las células durante la noche en una incubadora de 37oC con una atmósfera humidificada del 5% deCO2.
- Sustituya el medio por un fibroblasto fresco medio de 24 horas después de la transducción. Cultivo de las células durante una semana con intercambio medio cada dos días.
- Cosecha fibroblastos de ratón infectados el día 7 después de la transducción con 0.05% trypsin/EDTA y colocar en platos previamente recubiertos con fibronectina y 0.2% gelatina.
- Cultivo de los fibroblastos de ratón infectados del paso 2.6 con medio de crecimiento completo de células madre embrionarias de ratón (ES)(Tabla de materiales)en una incubadora de 37 oC con una atmósfera humidificada de 5% CO2 y cambio de medio diario.
- A partir del octavo día, observe la placa bajo un microscopio invertido cada dos días para identificar la apariencia de los grumos celulares con la morfología de la ES del ratón.
3. Uso de la mancha viva de fosfatasa alcalina y citometría de flujo para cuantificar la eficiencia de reprogramación
- Retire los medios de cultivo de cada poca y enjuague con DMEM/F-12 durante 2 x 3 min.
- Aplicar 2 ml de 1 x solución de trabajo de manchas de fosfatasa alcalina (AP) vivo (1:500 dilución en DMEM/F-12) a las células adherentes, e incubar en una incubadora de 37 oC con una atmósfera humidificada de 5% CO2 durante 30 min.
- Aspirar la mancha viva AP y lavar dos veces con PBS para 5 min cada uno.
- Digerir las células con la solución de desprendimiento celular(Tabla de Materiales)en una incubadora de 37 oC con una atmósfera humidificada de 5%CO2 durante 5 min. Realizar citometría de flujo para determinar la eficiencia de reprogramación.
4. Selección y cosecha de células similares a ES
- Examine las colonias del paso 2.8 bajo un microscopio invertido.
- Marque las colonias en la parte inferior del plato con un marcador de objeto autoentintado.
- Aplique anillos de clonación engrasados para cubrir las colonias celulares marcadas. Añadir 100 sl de tripina/EDTA al 0,05% de trippsina/EDTA a cada anillo de clonación a 37 oC durante 5 min, y luego transferir las células digeridas con puntas de pipeta de 100 l a placas de cultivo de 48 pocillos que contienen medio de crecimiento mES.
- Incubar las células en placas de cultivo de 48 pocillos en una incubadora de 37oC con una atmósfera humidificada del 5% deCO2. Pasar las células a 6 cm de plato cuando alcancen 70% de confluencia.
- Repita los pasos 4.3 y 4.4 varias veces hasta obtener clones uniformes en forma de dormitorio.
5. Congelación de iPSCs para criopreservación
- Disociar los iPSC seleccionados del paso 4.5 con trippsina, versene y plasma de polluelo (TVP; Tabla de Materiales) solución a 37 oC en una incubadora de CO2 al 5% durante 30 min.
- Recoger las células en un tubo cónico estéril de 15 ml y centrifugar a 217 x g durante 3 minutos a temperatura ambiente.
- Aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet celular en 2 ml de medio congelado ES de ratón(Tabla de Materiales)para obtener 1 ml por criovial.
- Agregue las células a los crioviales y congele con un recipiente congelador que proporcione la velocidad de enfriamiento crítica y repetida de -1 oC/min necesaria para la criopreservación a -80 oC durante la noche.
- Transfiera los viales congelados a un tanque de nitrógeno líquido.
6. Tinción de inmunofluorescencia para marcadores de células madre en isPC
- IPSCs de semillas del paso 5.1 cultivadas con medio mES en un portaobjetos de cámara de 8 polos recubierto con poli-D-lisina/laminina(Tabla de Materiales)a la densidad adecuada para lograr entre 1 x 2 x 104 células por pocto e incubar en una incubadora de 37 oC con una ambiente humidificado del 5% deCO2 durante 48 h.
- Sumerja las diapositivas en un 4% de formaldehído durante 15 minutos a temperatura ambiente, y luego sumerja las diapositivas en PBS dos veces durante 5 minutos cada vez.
- Incubar secciones con un reactivo de bloqueo de IgG de ratón(Tabla de Materiales)y un 5% de suero de cabra durante 1 h a temperatura ambiente.
- Diluir los anticuerpos primarios en diluyente proteico (ratón-anti-SSEA1, 1:100, conejo-anti-Nanog, 1:500; conejo-anti-POU clase 5 homeobox 1 [OCT4], 1:500; conejo-anti-SRY-box 2 [SOX2], 1:500; conejo-anti-Lin-28 homolog A [Lin28A], 1:400 Materiales). Aplicar anticuerpos sobre las células e incubar a 4oC durante la noche en una cámara humidificada.
- Deseche la solución primaria de anticuerpos y lave los portaobjetos 3x en PBS.
- Aplique segundos anticuerpos (anticuerpo de cabra antiratón conjugado conAlexa488 y Alexa555 conjugado de cabra-anticonejo, 1:400 cada uno) en diluyente proteico M.O.M. en portaobjetos e incubar durante 45 minutos a temperatura ambiente.
- Lave las diapositivas 3x en PBS y monte secciones con medio de montaje que contenga 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
- Tome fotografías con un microscopio confocal.
7. Investigar la pluripotencia de los iPSC in vivo
- Disociar los iPSC del paso 5.1 en células individuales utilizando la solución TVP en una incubadora de 37oC con una atmósfera humidificada del 5% de CO2 durante 30 min.
- Cuente las células usando un hemacitómetro y centrífuga a 217 x g durante 3 min.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet con medio mES en un tubo de centrífuga estéril de 1,5 ml a una concentración de 5 x 105 células/30 l para el trasplante de células.
- Retire el vello de ambas extremidades posteriores de ratones inmunodeficientes usando cortapelos.
- Anestetiza ratones con ketamina (100 mg/kg) y limpia el lugar de inyección con 75% de alcohol.
- Inyectar 30 s de suspensión de iPSC desde el paso 7.3 por vía intramuscular en el gastrocnemii, utilizando una aguja de 31 G.
- Dos semanas después de la inyección, cosechar el ratón gastrocnemii e incrustar en el compuesto de temperatura de corte óptima (OCT), congelar y cortar en secciones de 5-m15,16.
- Arreglar secciones en 4% formaldehído durante 15 minutos a temperatura ambiente, y luego lavar los portaobjetos dos veces en PBS durante 5 min cada vez.
- Bloquear las células con un diluyente de proteína sérica de cabra al 5% durante 1 h a temperatura ambiente.
- Añadir anticuerpo primario diluido (conejo anti-AFP, 1:50; conejo anti-SMA, 1:50; conejo anti-TH, 1:50) a los toboganes e incubar a 4oC durante la noche en una cámara humidificada.
- Deseche la solución primaria de anticuerpos, lave las células 3x (5 min/lavado) en PBS, agregue un anticuerpo de cabra anticonejo conjugado con 1:400 diluido Alexa555 a diapositivas e incubar durante 45 min a temperatura ambiente.
- Lave los portaobjetos 3x (5 min/lavado) en PBS, y monte las secciones con medio de montaje que contenga DAPI.
8. Construcción de vectores lentivirales CRISPR/Cas9 dirigidos a intrones que flanquean el exón de distrofina 23
- Diseñar dos pares de oligos gRNA dirigidos a exón 23 de distrofina flanqueado por intron a través de http://crispor.tefor.net/crispor.py.
NOTA: Los pares diseñados son los siguientes:
i22sense: 5'-CACCGTTAAGCTTAGGTAAAATCAA- 3'
i22anti-sense: 5'-AAACTTGATTTTACCTAAGCTTAAC-3'
i23sense: 5'-CACCGAGTAATGTGTCATACCTTCT- 3'
i23anti-sense: 5'-AAACAGAAGGTATGACACATTACTC-3'). - Digestylate 5 g de plásmido CRISPR lentiviral (lenti-CRISPRv2-blast [un regalo de Mohan Babu] y lenti-Guide-Hygro-iRFP670 [un regalo de Kristen Brennand])(Tabla de Materiales)con BsmB1/Esp3I durante 30 min a 37oC. Para 5 g de plásmidos, añadir 3 l de enzima de restricción BsmB1, 3 l de fosfatasa alcalina rápida, 6 ml de tampón de digestión enzimática 10x y 0,6 ml de TDT de 100 mM en reacción de 60 ml).
- Cargue las reacciones en un gel de agarosa del 0,8%. Ejecuta el gel a 100 x 150 V durante 30 min.
- Purificar el plásmido digerido en gel utilizando un kit de extracción de gel(Tabla de Materiales)y eluir en 20 oL de H2O.
- Fosforilato y recocido cada par de oligonucleótidos gRNA que contienen 1 l de cada oligonucleótido a 100 m, 1 l de tampón de ligadura 10x T4, 0,5 ml de polinucleótido quinasa T4 (PNK), 6,5 ml de ddH 2 O a 37 oC durante 30 minutos, y luego 95 oC de polinucleótidos quinasa (PNK), 6,5 oC de ddH 2 O a 37 oC durante 30 minutos, y luego 95 oC de polinucleótido quinasa (PNK), 6,5 oL de ddH 2 OC a 37 oC durante 30 minutos, y luego 95 oC de polinucleótido quinasa (PNK), 6,5 oL de ddH 2 O C a 37 oC durante 30 min, y luego 95 oC de polinucleótido quinasa (PNK), 6,5 oL de ddH 2 O C a 37 oC durante 30 minutos, y luego 95 oC de polinucleótidos quinasa (PNK), 6,5 oL de ddH2O C a 37 oC durante 30 minutos, y luego 9 propiedad a 25 oC a 5 oC/min.
- Ligar una dilución 1:200 de los oligonucleótidos gRNA recocidos en el plentiCRISPR V2-Blast o plentiGuide-Hygro-iRFP670. Mezclar 50 ng de vectores digeridos BsmB1/Esp3I con 1 l de dúplex oligo diluido y 5 l de tampón de ligasa de 2x más 1 l de ligasa en un sistema de reacción de 11 l e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Realizar la transformación con 3 l de producto de ligadura en celdas competentes de 50 l(Tabla de materiales)de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Esparcir las células competentes transformadas en una placa de agar con 100 g/ml de carbenicilina e incubar a 31,5 oC durante 18 h.
- Escoja colonias con puntas de pipeta estériles de 10 ol y cultivo en 5 ml de caldo estupendo(Tabla de Materiales)que contenga 100 g/ml de carbenicilina a 31,5 oC, 185 rpm en una incubadora de coctelera durante 21 h.
- Purifica el ADN plásmido usando los kits de mini-preparación y midi-prep(Tabla de Materiales).
- Verifique los plásmidos de mini-preparación mediante la digestión de restricción. Para el sistema de reacción de 20 l, añadir 1 g de ADN plásmido, 2 l de tampón de reacción de digerida(Tabla de materiales)y 1 l de mezcla de enzimas de restricción (0,5 l de KpnI-HF y 0,5 l de AgeI-HF para abundanteCRISPR V2-Blast-i22; 0,5 l de NotI-HF y 0,5 l de EcoRI-HF para plentiCRISPR V2-Blast-i22; 0,5 ?L de NotI-HF y 0,5 l de EcoRI-HF para plentiGuide-Hygro- iRFP670- i23). Incubar el sistema de reacción durante 1 h a 37oC.
- Cargue las reacciones en un gel de agarosa del 0,8%. Ejecuta el gel a 100 x 150 V durante 30 min.
NOTA: Las bandas correctas para plentiCRISPR V2-Blast-i22 deben ser de 622 bp y 12,2 kb, y las bandas correctas para plentiGuide-Hygro- iRFP670- i23 deben ser de 2,6 kb y 7,1 kb.
9. Embalaje vectorial lentiviral
- Cultivo 7 x 105 293FT células en 5 mL de medios DMEM que contienen 10% de suero bovino fetal en un plato de 6 cm durante la noche a 37 oC, 5% CO2.
- Preparar un cóctel (1 g de plentiCRISPR V2-Blast-i22 o plentiGuide-Hygro-iRFP670-i23, 750 ng de plásmido de envase psPAX2, 250 ng de plásmido de sobre pMD2.G y 5 l de reactivo de transfección A [Tabla de materiales] en 100 ol de suero reducido MEM).
- Preparar una mezcla de 5 ml de reactivo de transfección B(Tabla de materiales)en 100 ml de medios MEM séricos reducidos.
- Añadir 100 ml de mezcla B del reactivo de transfección a la mezcla de plásmido del paso 9.2 e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
- Agregue el complejo de lípidos de ADN (del paso 9.4) con gota a las células 293FT. Incubar durante la noche a 37oC con 5% deCO2.
- Añadir potenciador de la producción de virus (500x)(Tabla de materiales)a cada plato al día siguiente e incubar durante 24 h a 37 oC, 5% CO2.
- Recoja el medio de las células usando pipetas en los próximos dos días y filtre el medio a través de un filtro de 0,45 m para eliminar las células.
10. Concentración y purificación de vectores lentivirales
- Precipitar el vector lentiviral en el medio del paso 9,7 durante la noche a 4oC con 5x polietilenglicol 4000 (PEG4000, 8,5% de concentración final) y 4 M de NaCl (0,4 M de concentración final).
- Centrifugar los medios virales que contienen la solución PEG4000 a 2.095 x g y 4 oC durante 30 min, retirar y desechar el sobrenadante.
- Resuspender los gránulos con 500 ml de medios MEM reducidos en suero (titer de lentivirus: lenti-CRISPR V2-gRNAi22: 1.56 x 108, lenti-iRFP670-gRNAi23: 1.3 x 108, lenti-CRISPR V2-control: 3.13 x 107, lenti-iRFP670-control: 5.9 x70 ). Conservar a -80oC hasta su uso.
11. Eliminación del exón 23 en iPSCs de ratón con dos ARN guía (gRNAs) junto con Cas9
- Placar los iPSCs del ratón desde el paso 4.5 en una placa de 24 pocillos recubierta con fibronectina y gelatina.
- Después de que las células alcancen una confluencia del 50%, cambie al medio de cultivo fresco (medio completo de crecimiento de células madre embrionarias de ratón) que contiene 8 g/ml de polibreno).
- Añadir 100 l de la solución de partículas lentivirales desde el paso 10.3, incluyendo lenti-CRISPR V2-gRNAi22, lenti-iRFP670-gRNAi23 y control (vector vacío: lenti-CRISPR V2, lenti-iRFP670) a iPSCs de ratón. Incubar células durante 3 días a 37oC con 5% deCO2.
- Seleccione células infectadas de forma estable con medios que contengan blasticidina de 2,5 g/ml y higromicina B de 100 g/ml determinando la concentración mínima de blasticidina e higromicina B necesaria para matar la célula no infectada.
NOTA: Las células no infectadas morirían por blasticidina e higromicina B. - Digerir los iPSCs de ratón seleccionados con 0,5 ml de solución TVP cada poca (placa de 24 pocillos) e incubar celdas durante 30 min a 37 oC con un 5% de CO2.
- Disociar los IPSC en células individuales pipeteando, contar las células con una cámara de recuento celular y luego diluir alrededor de 150 células individuales digeridas con medio mES en plato de 10 cm para cultivo a 37 oC con 5% de CO2.
- Después de unos 10 días, recoger colonias individuales bajo un microscopio invertido usando puntas de pipeta estéril de 10 l (96 colonias necesitan ser recogidas).
- Transfiera las colonias escogidas a 50 l de solución tvP cada pocillo (placa de 96 pocillos, una colonia cada pocillo), digiere a 37 oC durante 30 minutos y luego siembre las células digeridas en dos placas de cultivo de 96 pocillos para mantener el cultivo (uno para el genotipado).
- Incubar en una incubadora de CO2 a 37oC hasta un 70% de confluente.
12. Identificación de colonias iPSC con eliminación de exón23
- Retire el medio en la placa de 96 pocillos cuando las colonias celulares alcancen el 70% de confluencia.
- Añadir 25 l de reactivo de lisis(Tabla de materiales)que contenga solución de proteinasa K (1 ml de proteinasa K en 100 ml de reactivo de lisis) a cada pocil, y transferir el lisado a una placa PCR de 96 pocillos.
- Sellar la placa pcR e incubar las placas a 55 oC durante 30 min, y luego a 95 oC durante 45 minutos para cargar las células y desnaturalizar la proteinasa K.
- Llevar a cabo la reacción de PCR con 2 l de lisato desde el paso 12.3. Para la reacción de PCR de 20 l, añadir 2 l de lisato, 10 l de premezcla de polimerasa de ADN 2x(Tabla de materiales),7 l de agua libre de DNase y 1 l de imprimación DMD exon 23 (Tabla 1).
- Utilice los siguientes parámetros para la reacción de PCR: 98 oC para 1 min, 35 ciclos de 98 oC para 10 s, 60 oC para 15 s, 72 oC para 30 s y una extensión final a 72 oC durante 1 min.
- Cargue la reacción de PCR en un gel de agarosa del 2%. Ejecuta el gel a 100 x 150 V durante 30 min.
- Inspeccione el gel bajo luz UV (la eficiencia de eliminación es 3/94).
13. Uso del sistema de activación MyoD Tet-on para diferenciar directamente iPSC en células progenitoras miogénicas (MPC)
- Empaquete el ratón LV-TRE-VP64 MyoD-T2A-dsRedExpress2 y el ratón LV-TRE-VP16 MyoD-T2A-dsRedExpress2 (un regalo de Charles Gersbach)(Tabla de Materiales)como se describió anteriormente para los vectores lenti-CRISPRv2-blast y lenti-gRNA-iRFP670 en secciones 9 y 10.
- Infectar el ratón iPSC con lentivirus-TRE-VP64-MyoD-T2A-dsRed-Express2 o lentivirus-TRE-VP16-MyoD-T2A-dsRedExpress2 como se describió anteriormente para los vectores lenti-CRISPRv2-blast y lenti-gRNA-iRFP670 en los pasos 11.1-11.3.
- Seleccione las células con 1 g/ml de puromicina después de tres días de infección para obtener una población celular transducida pura.
- Añadir 3 g/ml de doxiciclina en los medios de cultivo (10% FBS DMEM) a la diferenciación MPC. Reemplace el medio fresco complementado con doxiciclina cada dos días.
14. PCR de transcripción inversa cuantitativa para evaluar la diferenciación muscular dinámica y la expresión DMD exon 22-24
- Extraer el ARN celular después de 0, 3, 6 y 10 días después del tratamiento con doxiciclina utilizando el reactivo de aislamiento de ARN, transcribir el ARN en el ADNc de primera hebra utilizando el kit de síntesis de ADNc de primera hebra(Tabla de materiales).
- Para el sistema de reacción qPCR de 20 l, añadir 1 l de ADNc, 10 l de tampón de reacción de PCR (Tabla de materiales), 8 ml de ADN H2O, y 1 l de mezcla de imprimaciones delanteras y inversas (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa [GAPDH], músculo esquelético [ACTA1], OCT4 y DMD exon22, DMD exon23 y DMD exon24, ver Tabla 1).
- Utilice los siguientes parámetros para la reacción de PCR: 50 oC durante 2 min, 95 oC para 2 min, 40 ciclos de 95 oC para 15 s, 60 oC durante 1 min, curva de fusión de 65,0 oC a 95,0 oC, incremento de 0,5 oC.
15. Manchado de inmunofluorescencia de la cadena pesada de miosina 2 (MYH2) y la expresión de proteína distrofina
- Placa de la placa inducida por doxiciclina, lenti-TRE-MyoD células modificadas desde el paso 13.4 sobre diapositivas de cultivo de 8 pocillos.
- Fijar las células en 4% formaldehído durante 15 minutos a temperatura ambiente, y luego lavar las diapositivas dos veces en PBS durante 5 minutos cada vez.
- Bloquear las células con un diluyente de proteína sérica de cabra al 5% durante 1 h a temperatura ambiente.
- Añadir el anticuerpo conejo-anti-distrofina (1:300) y el anticuerpo ratón-anti-MYH2 (1:100) a los portaobjetos, incubar a 4oC durante la noche en una cámara humidificada.
- Deseche la solución primaria de anticuerpos, lave las células 3x (5 min/lavado) en PBS, agregue 1:400 anticuerpos conjugados Alexa488 conjugados y anticuerpos de cabra anti-ratón conjugados Alexa555 a diapositivas, e incubar durante 45 minutos a temperatura ambiente.
- Lave los portaobjetos 3x (5 min/lavado) en PBS, y monte las secciones con medio de montaje que contenga DAPI.
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Representative Results
Establecimiento de fibroblastos cutáneos Dmdmdx derivados de iPSC. Demostramos la eficiencia de generar iPSCs de ratón a partir de ratones Dmdmdx derivados de fibroblastos cutáneo utilizando los vectores de reprogramación sin integración. La Figura 1A demostró que la aparición de colonias similares a células madre embrionarias (ESC) a las tres semanas después de la infección. Evaluamos la eficiencia de la inducción de iPSC por mancha de fosfatasa alcalina viva (AP); La Figura 1B muestra que el porcentaje de células AP positivas fue de alrededor del 1,8% por el análisis FACS. SSEA1, Lin28, Nanog, OCT4 y SOX2, marcadores de pluripotencia para células madre embrionarias de ratón, fueron positivos para las colonias iPSC por tinción inmunofluorescente,(Figura 1C). Para investigar la diferenciación de tres germinales de los iPSC in vivo, inyectamos por vía intramuscular iPSC en el ratón gastrocnemii. Observamos que los iPSC inyectados se diferenciaban en células hepáticas (endoderm), células musculares lisas (mesoderm) y células de neuronas adrenérenérgicas (ectoderm)(Figura 1D),que acusaban la pluripotencia de los iPSC.
Eliminación de exon23 mediada por CRISPR/Cas9. Diseñamos dos ARN guía que flanquean al exón 23 mutante. Después de los descansos de doble cadena mediados por Cas9 (DSB) y la unión final no homóloga (NHEJ), se eliminó el exón 23 mutante, lo que permitió la producción de distrofina truncada pero funcional(Figura 2A). Para identificar el iPSC de ratón eliminado exón 23, las celdas se sembraron escasamente y se seleccionaron y propagaron colonias individuales. Los ADN genómicos extraídos de estas colonias fueron sometidos a genotipado de PCR. La Figura 2B demostró que los #1 de colonias y #2 tienen eliminaciones de exón 23 que indican una eliminación exitosa del exón 23.
Diferenciar los iPSC del ratón en un linaje miogénico y restaurar la expresión de la distrofina. Utilizamos un sistema de expresión MyoD inducible en tetraciclina para inducir la diferenciación miogénica de los ISC. La doxiciclina se utilizó para inducir la expresión MyoD en iPSC. La Figura 3A muestra el curso de tiempo de diferenciación muscular en iPSCtratados tratados con Dox. qRT-PCR mostró que el nivel de ARNm de OCT4, un marcador pluripotente, disminuyó gradualmente, mientras que la expresión de ACTA1, un marcador muscular esquelético, aumentó después de la inducción Dox. Además, observamos la formación de miotubos a las dos semanas después del tratamiento con Dox(Figura 3B). Es importante destacar que el ensayo qRT-PCR mostró la recuperación de la expresión de MRNA de 24 exon exon dMD en la línea eliminada Exon23, mediada por Cas9, inducida por Dox, en comparación con la línea de control Cas9(Figura 3C). Incoherente con el qRT-PCR, la tinción inmunofluorescente muestra la expresión de proteína distrofina en las células eliminadas del exón 23 mediado por Cas9, mientras que la expresión de distrofina no estaba en las células de control(Figura 3D).
Figura 1: Reprogramación de fibroblastos cutáneos de ratones Dmdmdx en isPC.
(A) Imagen representativa de colonias similares a ES (barra de escala de 200 m). (B) Análisis FACS de la eficiencia de reprogramación de fibroblastos de piel de ratón en iPSCs después de 8 días de transducción del virus Sendai por tinción de AP en vivo. (C) Tinción inmunofluorescenta de SSEA1, Lin28, Nanog, Oct4 y SOX2 en iPSCs (barra de escala de 50 m). (D) Tinción inmunofluorescente para AFP (endoderm), SMA (mesoderm) e tirosina hidrolasa (TH) (ectodermo) de teratoma 2 semanas después de la inyección de iPSC en gastrocnemii (barra de escala de 20 m). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Eliminación de exon23 mediada por CRISPR/Cas9.
(A) Diagrama esquemático de eliminaciones de 23 eliminaciones de 23 exón mediados por CRISPR/Cas9. La nucleasa Cas9 se dirige a intron 22 e intron 23 por dos gRNA. Las roturas de doble cadena (DSB) de Cas9 dan como resultado la escisión del mutante exon 23. Los extremos distales son reparados por unión final no homóloga (NHEJ), lo que resulta en la restauración del marco de lectura del gen de la distrofina. (B) Análisis de genotipado PCR del exón 23. La flecha indica el producto PCR del exón 23. GAPDH sirve como referencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Diferenciar los iPSC del ratón en el linaje miogénico y restaurar la expresión de la distrofina.
(A) qRT-PCR mostró el curso de tiempo del nivel de ARNm de Oct4 y ACTA1 en exon 23-deleted Dmdmdx iPSC (*P < 0.05 vs D0, D6, D10, #P < 0.05 vs D0, D3, D10, $P < 0.05 vs D0, D3, D6, n 4 para Oct4) (*P < 0.05 vs D6 y D10 , #P < 0,05 frente a D0, D3 y D10, $P < 0,05 frente a D0, D3 y D6, n a 3 para ACTA1). (B) Izquierda: Imagen representativa de la formación de miotubos a partir de iPSCs de ratón inducidos por Dox (barra de escala de 200 m). Derecha: Análisis inmunofluorescente de MYH2 en formación de miotubos a partir de iPSCs de ratón inducidos por Dox (barra de escala de 20 m). (C) Superior: las posiciones de imprimación de PCR para DMD Exon22, Exon23 y Exon24; Parte inferior: análisis qRT-PCR del nivel de ARNm de la expresión DMD Exon22, Exon23 y Exon24 en MPC (****P < 0.0001, n a 3). (D) Análisis inmunofluorescente de la expresión de distrofina en MPC inducido por Dox de iPSCCas9-Ctrl e iPSCCas9-gRNA (barra de escala de 50 m). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Imprimaciones guía | |
| sentido i22 | 5'-CACCGTTAAGCTTAGGTAAAATCAA- 3' |
| i22 antisentido | 5'-AAACTTGATTTTACCTAAGCTTAAC-3' |
| sentido i23 | 5'-CACCGAGTAATGTACATACCTTCT- 3' |
| I23 antisentido | 5'-AAACAGAAGGTATGACACATTACTC-3' |
| Imprimaciones PCR | |
| OCT4-Forward | 5'-AGCTGCTGAAGCAGAAGAGGATCA-3' |
| OCT4-Reverse | 5'-TCTCATTGTTGTCGGCTTCCTCCA-3' |
| ACTA1-Forward | 5'-GATCCATGAGACCTACAAC-3' |
| ACTA1-Reverse | 5'-TCAGCGATACCAGGGTACAT-3' |
| Exon22-Forward | 5'-TTACCACCAATGCGCTATCA-3' |
| Exon22-Reverse | 5'-CCGAGTCTCTCCTCCATTATTTC-3' |
| Exon23-Forward | 5'-CCAAGAAAGCACCTTCAGAAATAtG-3' |
| Exon23-Reverse | 5'-TTTGGCAGCTTTCCACCA-3' |
| Exon24-Forward | 5'-AAC CTT ACA GAA ATG GAT GGC-3' |
| Exon24-Reverse | 5'-TTTCAGGATTTCAGCATCCC-3' |
| GAPDH-Forward | 5'-TGACAAGCTTCCCATTCTCG-3' |
| GAPDH-Reverse | 5'-CCCTCATTCTCTCAACTACAT-3' |
Tabla 1: Secuencia de imprimación.
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Discussion
La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad hereditaria destructiva y, en última instancia, mortal caracterizada por la falta de distrofina, lo que conduce a la atrofia muscular progresiva1,2. Nuestros resultados demuestran la expresión del gen de la distrofina restaurada en las células progenitoras miogénicas derivadas de Dmdmdx iPSC mediante el enfoque de la eliminación del exón23 mediado por CRISPR/Cas9. Este enfoque tiene tres ventajas.
En primer lugar, generamos iPSC a partir de fibroblastos dérmicos derivados delratón Dmd utilizando un vector de ARN no integrado. Se han desarrollado una variedad de métodos para generar iPSC, como vectores lentivirales y retrovirales, que se integrarán en los cromosomas anfitriones para expresar genes de reprogramación, soportando así preocupaciones de seguridad. Los vectores basados en el ADN, como los vectores plásmidos, los virus asociados a los adenoos y los adenovirus, existen de manera no integrada; sin embargo, todavía pueden integrarse en el cromosoma huésped a baja frecuencia. En este estudio, utilizamos un virus Sendai modificado y no transmisible, un vector de ARN no integrado, para entregar de forma segura y eficaz factores de transcripción de células madre a fibroblastos para su reprogramación.
A continuación, utilizamos la eliminación del genoma mediada por CRISPR, en lugar de la corrección del gen de precisión mediada por CRISPR/Cas9, para restaurar la expresión de distrofina en los ISPC. Este método es factible y eficiente; es fácil diseñar múltiples gRNAs para eliminar múltiples exons mutantes, que ocurren en muchos pacientes humanos DMD17. La eliminación de exon utiliza una vía de unión final no homóloga relativamente eficiente, y el método también evita la necesidad de entregar una plantilla de reparación de ADN. Por lo tanto, en comparación con la corrección de precisión mediada por Cas9, la deleción de exón mediada por Cas9 es adecuada para pacientes con DMD con múltiples mutaciones genéticas.
Por último, inducimos iPSC indiferenciados a las células progenitoras miogénicas, lo que puede reducir el riesgo de tumorigenesis causada por iPSC. En este protocolo, inducimos la expresión de MyoD a través de un sistema vectorial inducible regulado por tetraciclina (Tet-On) para diferenciar los ISPS en progenitores musculares esqueléticos18,19.
En conclusión, la combinación de la edición del genoma CRISPR/Cas9 con el sistema de activación Tet-on MyoD puede proporcionar una estrategia segura, factible y eficiente para la eliminación mutada de DMD-Exon23 en células madre para trasplante de células en pacientes con DMD.
Para seleccionar y cosechar células similares a ES de manera eficiente, debemos identificar las células iPSC indiferenciadas a través de su morfología similar a la cúpula, y un marcador de objeto de tinta puede ayudarnos a etiquetar clones individuales desde la parte inferior del plato de cultivo con un círculo de 1,8 mm alrededor del iPSC Clones. Para evitar fugas de solución de trippsina, necesitamos aplicar la grasa uniformemente en la parte inferior de los anillos. Además, después de colocar los anillos recubiertos de grasa en la parte superior de las colonias celulares etiquetadas, se debe tener cuidado de no tocar los anillos. De lo contrario, los clones de iPSC se separarán.
El protocolo tiene sus limitaciones; por ejemplo, elegimos un sistema vectorial de ARN no integrado para generar iPSC. Sin embargo, utilizamos un sistema lentiviral CRISPR/Cas9 para eliminar DMD exon 23 y un sistema de activación MyoD basado en lentivirales para inducir la diferenciación miogénica iPSC; estos vectores lentivirales integrativos tienen problemas de seguridad. Sin embargo, estos problemas se pueden resolver mediante la aplicación de un complejo de ribonucleoproteína (RNP) que comprende una centraldeas Recombinante, de alta pureza S. pyogenes Cas9 con un dúplex crRNA:tracrRNA; podemos elegir la transfección de arNM MyoD modificada químicamente para diferenciar directamente los iPSC en progenitores miogénicos, aunque la eficiencia puede ser un desafío.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Tang y Weintraub fueron parcialmente compatibles con NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Instruments | |||
| 31-gauge needle | Various | ||
| Sharp Incision | Various | ||
| Sterile Scalpels | Various | ||
| Tweezers | Various | ||
| Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.1 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 1 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 87 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 10 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 1 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 1 mL |
| TVP solution (for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Chicken Serum | Gibco | 16110-082 | 5 mL |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | 186 mg |
| Phosphat-buffered saline | to 500 mL | ||
| Trypsin (2.5%) | Thermo | 15090046 | 5 mL |
| mES growth medium(for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.5 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 408.5 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 75 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 5 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 500 μL |
| MEK/GS3 Inhibitor Supplement | EMD Millipore Corp | CS210510-500UL | 500 μL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 5 mL |
| The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks. | |||
| mES frozen medium(for 50 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | SIGMA | D2650 | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 24.9 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 25 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 50 μL |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | RRID |
| 0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA | CORNING | 25-052-CI | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo scientific | J19943-k2 | |
| Accutase solution | SIGMA | A6964 | Cell detachment solution |
| AgeI-HF | NEB | R3552L | |
| Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody | Invitrogen | A32723 | AB_2633275 |
| Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32731 | AB_2633280 |
| Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32732 | AB_2633281 |
| anti-AFP | Thermo scientific | RB-365-A1 | AB_59574 |
| anti-α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP | CST | 19245S | AB_2734735 |
| anti-Dystrophin | Thermo | PA5-32388 | AB_2549858 |
| anti-LIN28A (D1A1A) XP | CST | 8641S | AB_10997528 |
| anti-MYH2 | DSHB | mAb2F7 | AB_1157865 |
| anti-Nanog-XP | CST | 8822S | AB_11217637 |
| anti-Oct-4A (D6C8T) | CST | 83932S | AB_2721046 |
| anti-Sox2 | abcam | ab97959 | AB_2341193 |
| anti-SSEA1(MC480) | CST | 4744s | AB_1264258 |
| anti-TH (H-196) | SANTA CRUZ | sc-14007 | AB_671397 |
| Alkaline Phosphatase Live Stain (500x) | Thermo | A14353 | |
| Blasticidin S | Sigma-Aldrich | 203350 | |
| BsmBI/Esp3I | NEB | R0580L/R0734L | |
| Carbenicillin | Millipore | 205805-250MG | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Competent Cells | TakaRa | 636763 | |
| CutSmart | NEB | B7204S | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo | A16517 | |
| DirectPCR Lysis Reagent (cell) | VIAGEN BIOTECH | 302-C | |
| Dispase (1 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP26535 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101L | |
| Fibronectin bovine plasma | SIGMA | F1141 | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit (500) |
QIAGEN | 20051 | |
| Gelatin from porcine skin, type A | SIGMA | G1890 | |
| HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1500 | |
| Hygromycin B (50 mg/mL) | Invitrogen | 10687010 | |
| Ketamine HCL Injection | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | 45822 | |
| KpnI-HF | NEB | R3142L | |
| lenti-CRISPRv2-blast | Addgene | 83480 | |
| lenti-Guide-Hygro-iRFP670 | Addgene | 99377 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000015 | |
| LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60625 | |
| LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60626 | |
| Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit | Vector | BMK-2202 | |
| NotI-HF | NEB | R3189L | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | ThermoFisher | 31985070 | |
| Polyethylene glycol 4,000 | Alfa Aesar | AAA161510B | |
| Polybrene | SIGMA | TR1003 | |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide | CORNING | CB354688 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | A25742 | |
| PrimeSTAR Max Premix | TakaRa | R045 | |
| Proteinase K | VIAGEN BIOTECH | 507-PKP | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals | ICN19453980 | |
| qPCR Lentivirus Titration Kit | abm | LV900 | |
| Quick ligation kit | NEB | M2200S | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100) | QIAGEN | 12945 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo scientific | K1691 | |
| RNAzol RT | Molecular Research Center, INC | RN 190 | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Terrific Broth Modified | Fisher BioReagents | BP9729-600 | |
| ViralBoost Reagent (500x) | ALSTEM | VB100 |
References
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