Summary
Burada, Dmdmdx fare kaynaklı deri fibroblastlarından iPSC'de distrofin ekspresyonunu geri yüklemek ve Tet-on MyoD aktivasyon sistemini kullanarak iPSC'leri doğrudan miyojenik progenitor hücrelerine (MPC) ayırmak için Cas9 tabanlı ekson23 silme protokolü salıyoruz.
Abstract
Duchenne musküler distrofi (DMD) distrofin genimutasyonları nedeniyle ciddi bir ilerleyici kas hastalığıdır, sonuçta kas atalarının tükenmesine yol açar. Kümelenmiş düzenli olarak uzaydan kısa palindromik tekrarlar/CRISPR ilişkili 9 (CRISPR/Cas9) gen düzenleme distrofin geninin ekspresyonunu geri getirme potansiyeline sahiptir. Otolog indüklenen pluripotent kök hücreler (iPSCs)-türetilmiş kas progenitor hücreleri (MPC) kök / progenitor hücre havuzu doldurmak, onarım hasarı, ve bir bağışıklık yanıtı neden olmadan DMD daha fazla komplikasyonları önlemek. Bu çalışmada, recovered distrofin protein ekspresyonu ile kas ataları elde etmek için CRISPR/Cas9 ve entegre olmayan iPSC teknolojilerinin bir kombinasyonunu sokulduk. Kısaca, Dmdmdx farelerin dermal fibroblastlarından bir iPSC hattı oluşturmak için entegre olmayan bir Sendai vektörü kullanıyoruz. Daha sonra, yeniden çerçevelenmiş distrofin geninin homolog olmayan bir uçla distropin ekspresyonunu geri yüklemek için CRISPR/Cas9 silme stratejisini kullanırız. 94 seçilmiş iPSC kolonisinden üç kolonide exon23 tükenmesinin PCR doğrulanmasından sonra, kas farklılaşmasının düzenlenmesinde önemli rol oynayan önemli bir transkripsiyon faktörü olan MyoD'nin doksisiklin (Dox) indüklenen ekspresyonu ile iPSC'yi MPC'ye ayırırız. Sonuçlarımız, DMD tedavisi için gelecekteki tedavilerin geliştirilmesi için önemli bir potansiyele sahip olan iPSC kaynaklı MPC'de distrofin ekspresyonunu geri yüklemek için CRISPR/Cas9 silme stratejisini kullanmanın fizibilitesini göstermektedir.
Introduction
Duchenne musküler distrofi (DMD) en sık görülen kas distrofilerinden biridir ve distrofin yokluğu ile karakterizedir, dünya çapında yaklaşık 5.000 yenidoğan erkek 1 etkileyen1. Distrofin gen fonksiyonunun kaybı ilerleyici miyofiberdejenerasyona yol açan yapısal kas defektleri ile sonuçlanır1,2. Rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAV) aracılı gen terapi sistemi, distrofin ekspresyonunu geri getirmek ve mikro-distrofinler (μ-Dys) kullanılarak gen replasmanı gibi kas fonksiyonlarını iyileştirmek için test edilmiştir. Ancak, rAAV yaklaşımı fonksiyonel protein ekspresyonunu sürdürmek için tekrarlanan enjeksiyonlar gerektirir3,4. Bu nedenle DMD'li hastalarda distrofin gen ekspresyonunu etkin ve kalıcı olarak kurtarabilecek bir stratejiye ihtiyacımız var. DMD için bir fare modeli olan Dmdmdx fare, erken sonlandırma kodonu ile sonuçlanan ve C-terminal distroglisan bağlayıcı etki alanından yoksun fonksiyonel olmayan bir kesilmiş proteinle sonuçlanan distrofin geninin ekson 23'ünde bir nokta mutasyonuna sahiptir. Son çalışmalar, küçükve büyük hayvan5,6,7doğru gen düzeltme veya mutant ekson silme ile distrofin gen ekspresyonunu geri yüklemek için CRISPR/Cas9 teknolojisinin kullanımını göstermiştir. Long ve ark.8 homoloji yönelimli onarım (HDR) tabanlı CRISPR/Cas9 genom düzenleme ile Dmdmdx fare germline disttrophin gen mutasyonu düzeltmek için yöntem bildirdi. El Refaey ve ark.9 rAAV'nin distrofik farelerde mutant ekson 23'ü verimli bir şekilde çıkarabileceğini bildirdi. Bu çalışmalarda, gRNA'lar intronlar 20 ve 23'te çift iplikli DNA kırılmalarına neden olacak şekilde tasarlanmıştır ve bu da homolog olmayan son birleştirme (NHEJ) yoluyla DNA onarımı sonrası distrofin ekspresyonunu kısmen düzeltmiştir. Daha da heyecan verici, Amoasii veark. 10 son zamanlarda caninmodelleri, gelecekteki klinik uygulamada önemli bir adım distrofin ekspresyonu geri rAAV aracılı CRISPR gen düzenleme etkinliğini ve fizibilite bildirdi.
DMD de kök hücre bozukluklarına neden olur11. Kas hasarı için, konut kas kök hücreleri kas farklılaşması ndan sonra ölmekte olan kas hücrelerini doldurmak. Ancak, yaralanma ve onarım ardışık döngüleri kas kök hücrelerinde telomerlerin kısaltılmasına yol12, ve kök hücre havuzlarının erken tükenmesi13,14. Bu nedenle, distrofin ekspresyonunu geri yüklemek için genom düzenleme ile otolog kök hücre tedavisinin bir kombinasyonu DMD tedavisinde pratik bir yaklaşım olabilir. CRISPR/Cas9 teknolojisi, fonksiyonel kas rejenerasyonu için genetik olarak düzeltilmiş indüklenen pluripotent kök hücreler (iPSC) üretme ve immün reddedilmeye neden olmadan DMD'nin daha fazla komplikasyonunu önleme olanağı sağlar. Ancak, iPSC'lerin tümör oluşumu riski vardır, bu da iPSC'nin miyojenik progenitor hücrelere farklılaşması ile hafifletilebilir.
Bu protokolde, Dmdmdx farelerin dermal fibroblastlarının iPSC'lere yeniden programlanması ve daha sonra CRISPR/Cas9 genom deletion ile distrofin ekspresyonunun kurtarılması için sendai virüsünün entegre olmayan kullanımını açıklıyoruz. IPSC'de Exon23 deleasyonunun genotipleme ile doğrulanmasından sonra, genom düzeltilmiş iPSC'yi MyoD kaynaklı miyojenik farklılaşma yoluyla miyojenik progenitörlere (MPC) ayırdık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan işleme ve cerrahi işlemler Augusta Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan bir protokol ile gerçekleştirildi. Fareler standart diyet ve su reklam libitum beslendi.
1. Erişkin Dmdmdx farelerden birincil fare fibroblastlarının izolasyonu
- Eutaize yetişkin Dmdmdx fareler (erkek, 2 aylık) CO2 boğulma ve torakotomi Tarafından IACUC Göre Georgia Tıp Koleji tarafından onaylanan, Augusta Üniversitesi. Laminar başlık altında steril bir durumda steril bir neşter ile kuyruk kesin. 5 dakika boyunca% 70 etanol ile kuyruk durulayın ve sonra steril fosfat tamponlu salin ile yıkayın (PBS) 6 cm çanak.
- Kuyruk derisini tabandan kuyruk derisi boyunca kuyruk ucuna keskin bir kesi ile soyun ve ardından cımbızla kuyruk derisini hafifçe soyun. Steril bir neşter kullanarak 1 mm3 boyutunda cilt kıyma ve dulbecco minimal temel orta / Ham's F12 (DMEM / F12) içeren 6 cm çanak için kıyma cilt dokusu taşımak 0.1% kollajenaz IV ve 1 U / mL dispase.
- Bir kültür kabındaki deri dokusunu %5 CO2 kuluçka makinesinde 37 °C'de 2 saat boyunca sindirin.
- Kap fibronektin ve 0.2% jelatin ile 6-iyi plaka (1 99 mL fibronektin 1 mL% 0.2 jelatin; Malzeme Tablosu) ve 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
- Sindirilmiş deri dokusunu 1 mL pipet ucu ile ayırın ve dokuyu ve süpernatantı steril 15 mL konik santrifüj tüpüne aktarın. Oda sıcaklığında 3 dakika için 217 x g santrifüj, supernatant atın ve fibroblast orta 1,5 mL pelet resuspend(Malzeme Tablosu).
- Kültür 6-iyi plaka fibronektin ile kaplanmış 6-iyi plaka üzerinde adım 1.5 ve 37 ° C, 5% CO2 kuluçka adım 1.4 gelen% 0.2 jelatin eksik sindirilmiş deri dokusu içeren pelet. İlk kaplamadan sonra 24 saat ortayı değiştirin ve her 48 saatte bir ortayı değiştirin.
2. Fare derisi fibroblastlarının iPSC'lere yeniden programlanması
- Transdüksiyondan iki gün önce, 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde hücre ayırma çözeltisi(Malzeme Tablosu)ile 1.6 adımdan fare dermal fibroblastlarını sindirin ve 5 dakika boyunca %5 CO2 nemli bir atmosfere sahip.
- 3 dk için 217 x g bir hemacytometer ve santrifüj kullanarak hücreleri saymak.
- 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde bulunan ve %5 CO2nemli atmosfere sahip fibroblast orta(Malzeme Tablosu)ile 6 kuyulu bir plaka ve kültür üzerine her kuyuda 1−2 x 105 hücre yoğunluğunda bulunan tohum hücreleri.
- Transdüksiyon gününde (0. gün), hücreleri tahmin edin ve ticari kılavuza göre 5, 5 ve 3 (yani KOS MOI = 5, hc-Myc MOI = 5, hKlf4 MOI = 3) enfeksiyonun hedef çokluğuna (MOI) ulaşmak için gereken her virüsün hacmini hesaplayın.
- 37 °C'lik bir su banyosunda üç Sendai tüpünü 5−10 s'ye erteleyin ve üç Sendai tüpünün hesaplanan hacimlerini 1 mL fibroblast orta(Malzeme Tablosu)ekleyin.
- Adım 2.3 fibroblast orta çıkarın ve hücreleri içeren kuyulara yeniden programlama virüs karışımı ekleyin. Hücreleri bir gecede 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde %5 CO2nemli bir atmosfere sahip olarak kuluçkaya yatırın.
- Transdüksiyondan sonra orta yı taze fibroblast orta 24 saat ile değiştirin. Kültür bir hafta boyunca orta değişimi ile hücreleri her gün.
- Transdüksiyondan sonra 7.
- Kültür enfekte fare fibroblastlar adım 2.6 tam fare embriyonik kök hücre ile (ES) büyüme ortamı(Tablo Malzemeler)bir 37 °C inkübatör ile nemli bir atmosfer ile 5% CO2 ve günlük orta değiştirin.
- 8. günden itibaren, fare ES morfolojisi ile hücre kümelerinin görünümünü belirlemek için her gün ters bir mikroskop altında plaka gözlemleyin.
3. Alkali fosfataz canlı leke ve akış sitometri kullanarak yeniden programlama verimliliğini ölçmek için
- Kültür ortamını her kuyudan çıkarın ve DMEM/F-12 ile 2−3 dakika boyunca durula.
- 2 mL 1x alkalin fosfataz (AP) canlı leke çalışma solüsyonu (DMEM/F-12'de 1:500 seyreltme) yapışık hücrelere uygulayın ve 30 dakika boyunca %5 CO2 nemli atmosfere sahip 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.
- AP canlı leke aspire ve 5 dakika her pbs ile iki kez yıkayın.
- Hücreleri hücre ayırma çözeltisi(Tablo Malzemeler)ile 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde ve 5 dk için %5 CO2 nemli atmosfere sahip sindirin.
4. ES benzeri hücrelerin seçilmesi ve toplanması
- 2.8. basamaktaki kolonileri ters bir mikroskop altında inceleyin.
- Yemeğin altındaki kolonileri kendi kendine mürekkepli nesne işaretiyle işaretleyin.
- İşaretli hücre kolonilerini kapsayacak şekilde yağlanmış klonlama halkaları uygulayın. 37 °C'de 5 dakika boyunca her klonlama halkasına %0,05 tripsin/EDTA 100 μL ekleyin ve sindirilmiş hücreleri 100 μL pipet uçları yla mES büyüme ortamı içeren 48 kuyulu kültür plakalarına aktarın.
- Hücreleri 48 kuyulu kültür plakalarında 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde %5 CO2nemli atmosfere sahip olarak kuluçkaya yatırın. Hücreleri %70'e ulaştıklarında 6 cm'lik bir tabağa kadar geçin.
- Tek tip yurt şeklindeki klonlar elde edilene kadar 4.3 ve 4.4 adımlarını birkaç kez tekrarlayın.
5. Kriyopreservation için dondurucu iPSCs
- Seçilen iPSC'leri 4.5 adımından trypsin, versene ve civciv plazması (TVP; Malzeme Tablosu) %5 CO2 kuluçka makinesinde 37 °C'de 30 dk çözeltisi.
- Hücreleri steril 15 mL konik tüpte toplayın ve oda sıcaklığında 3 dk için 217 x g'de santrifüj edin.
- Supernatant aspire ve tekrar şarjedici es dondurulmuş orta 2 mL hücre pelet askıya(Tablo Malzemeler) cryovial başına 1 mL elde etmek için.
- Cryovials hücreleri ekleyin ve kritik sağlayan bir dondurucu konteyner kullanarak dondurma, tekrarlanan -1 °C/dk soğutma oranı kriyopreservation için gerekli gecede -80 °C.
- Donmuş şişeleri sıvı nitrojen tankına aktarın.
6. IPSC'lerde kök hücre belirteçleri için immünofloresan boyama
- MES ortamı ile kültürlenmiş 5.1 adımdan, poli-D-lizin/laminin(Malzeme Tablosu)ile kaplanmış 8 kuyulu bir hazneye kadar tohum iPSC'leri, kuyu başına 1−2 x 104 hücre ve 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırmak için uygun yoğunlukta 48 saat için %5 CO2 nemlendirilmiş atmosfer.
- Slaytları oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %4 formaldehite batırın ve slaytları her seferinde 5 dakika boyunca iki kez PBS'ye batırın.
- Fare IgG-bloke reaktifi(Malzeme Tablosu)ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca %5 keçi serumu ile kuluçka bölümleri.
- Protein seyrelticilerinde primer antikorları seyreltin (fare-anti-SSEA1, 1:100, tavşan-anti-Nanog, 1:500; tavşan-anti-POU sınıf 5 homeobox 1 [OCT4], 1:500; tavşan-anti-SRY-box 2 [SOX2], 1:500; tavşan-anti-Lin-28 homolog A [Lin28A], 1:400) (Tablo Malzemeler). Hücrelere antikor uygulayın ve nemlendirilmiş bir odada gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Birincil antikor çözeltisini atın ve slaytları PBS'de 3x yıkayın.
- İkinci antikorlar uygulayın (Alexa488-konjuge keçi-anti-fare antikor ve Alexa555-konjuge keçi-anti-tavşan, 1:400 her) M.O.M. protein dilüent slaytlar ve oda sıcaklığında 45 dakika kuluçka.
- Slaytları PBS ve montaj bölümlerinde 4'6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) içeren montaj ortamı ile yıkayın.
- Konfokal mikroskopla fotoğraf çek.
7. In vivo iPSCs pluripotency araştırılması
- 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde TVP çözeltisi kullanarak 5.1 adımdan tek hücrelere ayırın ve 30 dk boyunca %5 CO2 nemli bir atmosfere sahip.
- 3 dk için 217 x g bir hemacytometer ve santrifüj kullanarak hücreleri saymak.
- Hücre nakli için 5 x 105 hücre/30 μL konsantrasyonda 1,5 mL steril santrifüj tüpte mES ortası ile pele'yi aspire edin ve yeniden askıya alın.
- Saç makası kullanarak immünoeksik farelerin her iki arka ekstremitesinden saç çıkarın.
- Ketamin (100 mg/kg) ile fareleranestezi ve% 75 alkol ile enjeksiyon sitesi temizleyin.
- Gastroknemiiçine 31 G iğne kullanarak 7.3 adımdan 30 μL iPSC süspansiyonenjekte edin.
- Enjeksiyondan iki hafta sonra fare gastroknemisini hasat edin ve optimum kesme sıcaklığına (OCT) bileşik, çabuk donma ve 5-μm kesitler15,16içine gömmek.
- Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %4 formaldehitteki bölümleri düzeltin ve slaytları her seferinde 5 dakika pbs'de iki kez yıkayın.
- Oda sıcaklığında 1 saat için% 5 keçi serum protein dilüent ile hücreleri bloke.
- Slaytlara seyreltilmiş birincil antikor (tavşan anti-AFP, 1:50; tavşan anti-SMA, 1:50; tavşan anti-TH, 1:50) ekleyin ve nemlendirilmiş bir odada bir gecede 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Birincil antikor çözeltisini atın, PBS'deki hücreleri 3x (5 dk/yıkama) yıkayın, 1:400 adet seyreltilmiş Alexa555-konjuge keçi-anti-tavşan antikorlarını slaytlara ekleyin ve oda sıcaklığında 45 dakika kuluçkaya yatırın.
- PBS'de slaytları 3x (5 dk/yıkama) yıkayın ve DAPI içeren montaj ortamına sahip montaj bölümleri.
8. CRISPR/Cas9 lentiviral vektör hedefleme intronlarının distrofin eksexin eksyonu ile çevrili yapımı 23
- http://crispor.tefor.net/crispor.py yoluyla intron kanatlı distrofin ekson 23 hedefleyen gRNA oligos iki çift tasarla.
NOT: Tasarlanan çiftler aşağıdaki gibidir:
i22sense: 5'-CACCGTTAAGCTTAGGTAAAATCAA- 3'
i22anti-sense: 5'-AAACTTGATTTTACCTAAGCTTAAC-3'
i23sense: 5'-CACCGAGTAATGTGTCATACCTCT- 3'
i23anti-sense: 5'-AAACAGAAGGTATGACACATTACTC-3'). - Sindirimi ve defosforilat 5 g lentiviral CRISPR plazmid (lenti-CRISPRv2-blast [Mohan Babu bir hediye] ve lenti-Guide-Hygro-iRFP670 [Kristen Brennand bir hediye]) (Malzeme Tablosu) BsmB1/Esp3I ile 30 dk 37 °C. 5 μg plazmid için, 3 μL BsmB1 enzimi kısıtlayın, 3 μL hızlı alkali fosfataz, 6 μL 10x enzim sindirimi tamponve 0.6 μL 100 mM DTT 60 μL reaksiyon ekleyin.
- Reaksiyonları %0.8 agarose jelüzerine yükleyin. Jeli 100−150 V'de 30 dk çalıştırın.
- Bir jel ekstraksiyon kiti(Malzeme Tablosu)ve 20 μL H2O içinde eute kullanarak sindirilmiş plazmid in-jel arındırın.
- 100 μM'de her oligonükleotitten 1 μL, 10x T4 ligasyon tamponunun 1 μL'sini, 0,5 μL T4 polinükleotid kinazını (PNK), 6,5 μL ddH 2 O ddH2O 37 °C'de 30 dk ve sonra 95 °C'lik dinve 5 m rampa için 95 °C'yi içeren gRNA oligonükleotidlarının her çifti fosforilasyon ve anneal 5 °C/dk'da 25 °C'ye kadar kendi
- PlentiCRISPR V2-Blast veya plentiGuide-Hygro-iRFP670 içine annealed gRNA oligonükleotidlerin bir 1:200 seyreltme ligate. BsmB1/Esp3I sindirilmiş vektörlerin 50 ng'sini 1 μL seyreltilmiş oligo dubleks ve 5°L 2x ligase tampon artı 1 000 ligaz 11 μL reaksiyon sisteminde karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın.
- Üreticinin talimatlarına göre 3 μL ligasyon ürünü ile 50 μL yetkili hücrelere(Malzeme Tablosu)dönüştürme yapın.
- Dönüştürülmüş yetkin hücreleri 100 μg/mL carbenicillin ile bir agar plakaya yayın ve 31,5 °C'de 18 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
- 31,5 °C'de 100 μg/mL carbenicillin içeren 5 mL'lik müthiş et suyu(Malzeme Tablosu)içinde 10 μL steril pipet uçları ve kültürü olan kolonileri 31,5 °C,185 rpm bir shaker inkuvatörde 21 saat seçin.
- Plazmid DNA mini-hazırlık ve midi-hazırlık kitleri(Tablo Malzemeler)kullanarak arındırın.
- Mini hazırlık plazmidlerini kısıtlama sindirimine göre doğrulayın. 20 μL reaksiyon sistemi için 1 μg plazmid DNA, 2 μL sindirim reaksiyonu tamponu(Malzeme Tablosu)ve 1 μL restriksiyon enzim karışımı (0.5 μL KpnI-HF ve plentiCRISPR V2-Blast-i22 için AgeI-HF 0.5 μL; 0.5 μL NotI-HF ve 0.5 μL EcoHF-HRI-HRI için 0.5 μL plentiGuide-Hygro- iRFP670- i23). Reaksiyon sistemini 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
- Reaksiyonları %0.8 agarose jelüzerine yükleyin. Jeli 100−150 V'de 30 dk çalıştırın.
NOT: PlentiCRISPR V2-Blast-i22 için doğru bantlar 622 bp ve 12,2 kb, plentiGuide-Hygro- iRFP670- i23 için doğru bantlar 2,6 kb ve 7,1 kb olmalıdır.
9. Lentiviral vektör ambalajı
- Kültür 7 x 105 293FT hücreler 5 mL DMEM media içeren 10% fetal sığır serumu içeren 6 cm çanak gecede 37 °C, 5% CO2.
- Bir kokteyl hazırlayın (1 μg plentiCRISPR V2-Blast-i22 veya plentiGuide-Hygro-iRFP670-i23, psPAX2 ambalaj plazmid 750 ng, pMD2.G zarf plazmid 250 ng ve transfeksiyon reaktif A 5 μL [Malzeme Tablosu] azaltılmış serum MEM media 100 μL).
- Azaltılmış serum MEM media'da 5 μL transfeksiyon reaktifi B(Malzeme Tablosu)karışımını hazırlayın.
- Adım 9.2 plazmid karışımına 100 μL transfeksiyon reaktif B karışımı ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka.
- 293FT hücrelere DNA-lipid kompleksi (adım 9.4) dropwise ekleyin. Bir gecede %5 CO2ile 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Ertesi gün her çanağa virüs üretim arttırıcı (500x)(Malzeme Tablosu)ekleyin ve 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırın, %5 CO2.
- Önümüzdeki iki gün boyunca pipetler kullanarak hücrelerden orta toplayın ve hücreleri kaldırmak için 0,45 μm filtre ile orta filtre.
10. Lentiviral vektörlerin konsantrasyonu ve saflaştırılması
- 5x polietilen glikol 4000 (PEG4000, % 8,5 nihai konsantrasyon) ve 4 M NaCl (0,4 M son konsantrasyon) ile 4 °C'de bir gecede 9.7 adım ın ortasında lentiviral vektörü çökeltin.
- PEG4000 çözeltisini içeren viral ortamı 2.095 x g ve 4 °C'de 30 dk için santrifüj edin, süpernatantı çıkarın ve atın.
- 500 μL serum azaltılmış MEM media (lentivirus titreşin: lenti-CRISPR V2-gRNAi22: 1.56 x 108, lenti-iRFP67 0-gRNAi23: 1.3 x 108, lenti-CRISPR V2-kontrol: 3.13 x 107, lenti-iRFP670-kontrol: 5.9 x 107 ). Kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.
11. Cas9 ile birleştiğinde iki kılavuz RNA (gRNA) ile fare iPSCs exon 23 silme
- Fibronektin ve jelatin ile kaplanmış 24 kuyulu bir plaka içinde adım 4.5'ten fare iPSC'leri plakalayın.
- Hücreler %50 birleştiğinde, 8 g/mL polibren içeren taze kültür ortamına (tam fare embriyonik kök hücre büyüme ortamı) geçiniz.
- Lenti-CRISPR V2-gRNAi2, lenti-iRFP670-gRNAi23 ve kontrol (boş vektör: lenti-CRISPR V2, lenti-iRFP670) fare iPSC'lerine dahil olmak üzere 10.3 adımdan merceksi partikül çözeltisinin 100 μL'sini ekleyin. 37 °C'de %5 CO2ile 3 gün boyunca kuluçka ya.
- Enfekte olmayan hücreyi öldürmek için gerekli olan blasticidin ve higromisin B konsantrasyonunun minimum konsantrasyonu belirleyerek 2,5 g/mL blasticidin ve 100 μg/mL higromisin B içeren ortama sahip enfekte hücreleri seçin.
NOT: Enfekte olmayan hücreler blasticidin ve higromisin B tarafından öldürülür. - Seçilen fare iPSC'lerini her biri iyi (24 kuyuplaka) 0,5 mL TVP çözeltisi ile sindirin ve 30 dk 37 °C'de %5 CO2ile inkübasyon hücreleri.
- IPSC'leri pipetleme yaparak tek hücrelere ayırın, hücreleri hücre sayma odasıyla sayın ve daha sonra mES ortası ile 150 sindirilmiş tek hücreyi %5 CO2ile 37 °C'de kültür için 10 cm'lik bir tabağa seyreltin.
- Yaklaşık 10 gün sonra, 10 μL steril pipet uçları kullanarak ters mikroskop altında tek koloniler seçin (96 koloninin seçilmesi gerekir).
- Toplanan kolonileri her kuyuda 50°L TVP çözeltisine (96 kuyulu plaka, her kuyuda bir koloni) aktarın, 37 °C'de 30 dakika sindirin ve sindirilmiş hücreleri kültürü korumak için iki adet 96 kuyulu kültür plakasına (biri genotipleme için) yerleştirin.
- 37 °C'de %70'e kadar co2 kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.
12. exon23 silme ile iPSC kolonilerinin tanımlanması
- Hücre kolonileri %70 birleştiğinde 96 kuyulu plakadaki ortamı çıkarın.
- Her kuyuya proteinaz K çözeltisi(1mL proteinaz K in 100 mL lysis reaktifinde 1 mL proteinaz K) içeren 25 μL lysis reaktifi ekleyin ve lysate'yi 96 kuyulu bir PCR plakasına aktarın.
- PCR plakasını kapatın ve plakaları 55 °C'de 30 dk, sonra 95 °C'de 45 dk'da inkübe edinerek hücreleri inceleyin ve proteinase K'yi denadirin.
- 12.3 adımdan 2 μL lysate ile PCR reaksiyonu gerçekleştirin. 20 μL PCR reaksiyonu için 2 μL lysate, 10 μL 2x DNA polimeraz premixi(Malzeme Tablosu),7 μL DNase içermeyen su ve 1 μL DMD ekson 23 astar(Tablo 1)ekleyin.
- PCR reaksiyonu için aşağıdaki parametreleri kullanın: 1 dk için 98 °C, 10 s için 98 °C'nin 35 döngüsü, 15 s için 60 °C, 30 s için 72 °C ve 1 dk için 72 °C'de son bir uzatma.
- PCR reaksiyonu %2'lik agarose jelüzerine yükleyin. Jeli 100−150 V'de 30 dk çalıştırın.
- UV ışığı altında jel inceleyin (nakavt verimliliği 3/94).
13. IPSC'yi doğrudan miyojenik progenitor hücrelere (MPC) ayırmak için Tet-on MyoD aktivasyon sistemini kullanma
- Paket LV-TRE-VP64-fare MyoD-T2A-dsRedExpress2 ve LV-TRE-VP16 fare MyoD-T2A-dsRedExpress2 (Charles Gersbach bir hediye) (Malzeme Tablosu) daha önce lenti-CRISPRv2-blast ve lenti-gRNA-iRFP670 vektörleri bölümlerde açıklandığı gibi 9 ve 10.
- Fare iPSC'ye lentivirus-TRE-VP64-MyoD-T2A-dsRed-Express2 veya lentivirus-TRE-VP16-MyoD-T2A-dsRedExpress2 daha önce lenti-CRISPRv2-blast ve lenti-gRNA-iRFP670 vektörleri için 11.1−11.3 adımlarında açıklandığı gibi bulaştırın.
- Saf transdükse hücre popülasyonu elde etmek için üç günlük enfeksiyondan sonra 1 μg/mL puromisin içeren hücreleri seçin.
- MPC farklılaşmasına kültür ortamına (%10 FBS DMEM) 3 g/mL doksisiklin ekleyin. Her iki günde bir doksisiklin ile takviye taze orta değiştirin.
14. Dinamik kas farklılaşması ve DMD ekson 22-24 ekspresyonu değerlendirmek için kantitatif ters transkripsiyon PCR
- RNA izolasyon reaktifi kullanılarak doksisiklin tedavisinden sonra 0, 3, 6 ve 10 gün sonra hücresel RNA ayıklayın, ilk iplikçik cDNA sentez kiti(Tablo Malzemeler)kullanılarak tersten RNA'yı cDNA'ya dönüştürün.
- 20 μL qPCR reaksiyon sistemi için 1°L cDNA, 10 μL PCR reaksiyon tamponu(Malzeme Tablosu),8 μL DNA H2O ve 1 μL ileri ve ters astar karışımı (gliserindehit-3-fosfat dehidrogenaz [GAPDH], iskelet kası [ACTA1], OCT4 ve DMD exon22, DMD exon23 ve DMD exon24, bkz.
- PCR reaksiyonu için aşağıdaki parametreleri kullanın: 2 dk için 50 °C, 2 dk için 95 °C, 15 s için 95 °C'nin 40 döngüsü, 1 dk için 60 °C, erime eğrisi 65,0 °C ila 95,0 °C, artış 0,5 °C.
15. Miyozin ağır zincir 2 (MYH2) ve distrofin protein ekspresyonunun immünoresans boyantisi
- Plaka doksisiklin indüklenen, lenti-TRE-MyoD modifiye hücreleri adım 13.4 8-iyi kültür slaytlar üzerine.
- Hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %4 formaldehit halinde sabitlayın ve slaytları her seferinde 5 dakika boyunca PBS'de iki kez yıkayın.
- Oda sıcaklığında 1 saat için% 5 keçi serum protein dilüent ile hücreleri bloke.
- Kaydıralara tavşan-anti-distrofin antikor (1:300) ve fare-anti-MYH2 antikor (1:100) ekleyin, nemlendirilmiş bir odada bir gecede 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Birincil antikor çözeltisini atın, PBS'deki hücreleri 3x (5 dk/yıkama) yıkayın, 1:400 seyreltilmiş Alexa488-konjuge keçi-anti-tavşan antikorve Alexa555-konjuge keçi-anti-fare antikorslaytlar ve oda sıcaklığında 45 dakika kuluçka ekleyin.
- PBS'deki slaytları 3x (5 dk/yıkama) ve DAPI içeren montaj ortamına monte eden bölümleri yıkayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dmdmdx deri fibroblastlarının kurulması iPSC türetilmiştir. Dmdmdx farelerden, entegrasyoniçermeyen yeniden programlama vektörlerini kullanarak deri fibroblastından elde edilen fare iPSC'lerinin üretilmesinin verimliliğini gösterdik. Şekil 1A, embriyonik kök hücre (ESC) benzeri kolonilerin enfeksiyondan üç hafta sonra ortaya çıktı. Canlı alkali fosfataz (AP) lekesi ile iPSC indüksiyonunun etkinliğini değerlendiriyoruz; Şekil 1B, AP-pozitif hücrelerin insiyatiyarı FACS analizi ile %1.8 civarında olduğunu göstermektedir. SSEA1, Lin28, Nanog, OCT4 ve SOX2, fare embriyonik kök hücreleri için pluripotens belirteçleri, immünofloresan boyama tarafından iPSC kolonileri için pozitif, (Şekil 1C). In vivo iPSC'lerin üç germline farklılaşmasını araştırmak için, fare gastroknemisine intramüsküler olarak iPSC enjekte ettik. Enjekte edilen iPSC'lerin karaciğer hücrelerine (endoderm), düz kas hücreleri (mezoderm) ve adrenerjik nöron hücrelerine (ektoderm)(Şekil 1D)farklılaştığını gözlemledik.
CRISPR/Cas9 aracılı exon23 silme. Mutant exon 23'ü çevreleyen iki kılavuz RNA tasarladık. Cas9 aracılı çift iplikçikli molalar (DSB) ve homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) sonra, mutant exon 23 silindi, kesilmiş ama fonksiyonel distrofin üretimi için izin(Şekil 2A). Exon 23 silinen fare iPSC tanımlamak için, hücreler seyrek tohumlu ve tek tek koloniler seçilmiş ve yayılır. Bu kolonilerden çıkarılan genomik DAA'lar PCR genotiplemeye tabi tutuldu. Şekil 2B, koloni #1 ve #2 ekson 23'ün başarılı bir şekilde silindiğini gösteren ekson 23 silme işlemine sahip olduğunu göstermiştir.
Fare iPSC'lerini miyojenik bir soya ayırıp distrofin ekspresyonunu geri. Biz iPSCs miyojenik farklılaşma neden tetrasiklin indüklenebilir MyoD ifade sistemi kullanın. Doksisiklin iPSCs MyoD ekspresyonu indüklemek için kullanılmıştır. Şekil 3A, Dox-treated iPSC'lerde kas farklılaşmasının zaman rotasını gösterir. qRT-PCR, pluripotent bir belirteç olan OCT4'ün mRNA seviyesinin kademeli olarak azaldığını, iskelet selami olan ACTA1'in ifadesinin Dox indüksiyonundan sonra arttığını göstermiştir. Ayrıca Dox tedavisinden iki hafta sonra miyotüplerin oluşumunu gözlemledik(Şekil 3B). Daha da önemlisi, qRT-PCR tayini, Cas9 kontrol hattına kıyasla Dox indüklenen, Cas9 aracılı Exon23 silinmiş çizgide DMD eksonu 24 mRNA ekspresyonunun geri kazanılmasını gösterdi(Şekil 3C). QRT-PCR ile tutarsız olan immünofloresan boyama, Cas9 aracılı ekson 23 silinmiş hücrelerde distrofin protein ekspresyonu gösterirken, distrofin ekspresyonu kontrol hücrelerinde bulunmaz(Şekil 3D).
Şekil 1: Dmdmdx farelerden deri fibroblastlarının iPSC'lere yeniden programlanması.
(A) ES benzeri kolonilerin temsili görüntüsü (ölçek çubuğu = 200 μm). (B) Canlı AP boyama ile Sendai virüs transdüksiyon 8 gün sonra iPSCs içine fare cilt fibroblastların yeniden programlama verimliliği FACS analizi. (C) SSEA1, Lin28, Nanog, Oct4 ve SOX2'nin immünofloresan boyaması iPSC'lerde (ölçek çubuğu = 50 μm). (D) IPSC enjeksiyonundan 2 hafta sonra afp (endoderm), SMA (mezoderm) ve tirozin hidrolaz (TH) (ektoderm) için immünfloresan boyama gastroknemi (ölçek çubuğu = 20 μm). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: CRISPR/Cas9 aracılı exon23 silme.
(A) CRISPR/Cas9 aracılı ekson 23 silme şeması. Cas9 nükleaz, intron 22 ve intron 23'ü iki gRNA ile hedefler. Cas9 tarafından çift iplikli molalar (DSBs) mutant ekson 23 eksizyonu ile sonuçlanır. Distal uçlar homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) ile onarılır ve bu da distrofin geninin okuma çerçevesinin restorasyonuyla sonuçlanır. (B) Exon 23'ün PCR genotipleme analizi. Ok, exon 23'ün PCR ürününün olduğunu gösterir. GAPDH bir referans olarak hizmet vermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Fare iPSC'lerinin miyojenik soya farklıhale getirilmesi ve distrofin ekspresyonunun geri difofin ekspresyonunun geri diforili.
(A) qRT-PCR Dox-tedavi exon 23-silinmiş Dmdmdx iPSC (*P < 0.05 vs D0, D6, D10, #P < 0.05 vs D0, D3, D10, $P < 0.05 vs D0, D3, D6, n = 4 Ekim 4) (*P < 0.05 vs D6 ve D10 , #P < 0,05 vs D0, D3 ve D10, $P < 0,05 vs D0, D3 ve D6, n = 3 ACTA1 için). (B) Sol: Dox'a bağlı fare iPSC'lerinden miyotüp oluşumunun temsili görüntüsü (ölçek çubuğu = 200 μm). Sağ: Dox kaynaklı fare iPSCs (ölçek çubuğu = 20 μm) myotube oluşumunda MYH2 immünofloresan analizi. (C) Üst: DMD Exon22, Exon23 ve Exon24 için PCR astar pozisyonları; Alt: MPC'de DMD Exon22, Exon23 ve Exon24 ifadesinin mRNA düzeyinin qRT-PCR analizi (****P < 0.0001, n = 3). (D) IPSCCas9-Ctrl ve iPSCCas9-gRNA 'dan Dox'a bağlı MPC'de distrofin ekspresyonunun immünüfülasyon analizi (ölçek çubuğu = 50 μm). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Kılavuz astarlar | |
| i22 anlamda | 5'-CACCGTTAAGCTTAGGTAAAATCAA- 3' |
| i22 antisense | 5'-AAACTTGATTTTACCTAAGCTTAAC-3' |
| i23 anlamda | 5'-CACCGAGTAATGTCATACCTCt- 3' |
| I23 antisense | 5'-AAACAGAAGGTATGACACATTACTC-3' |
| PCR astarlar | |
| OCT4-İleri | 5'-AGCTGCTGAAGCAGAAGAGGATCA-3' |
| OCT4-Ters | 5'-TCTCATTGTTGTCGGCTTCCTCCA-3' |
| ACTA1-İleri | 5'-GATCCATGAGACCACCTACAAC-3' |
| ACTA1-Ters | 5'-TCAGCGATACCAGGGTACAT-3' |
| Exon22-İleri | 5'-TTACCACCAATGCGCTATCA-3' |
| Exon22-Ters | 5'-CCGAGTCTCTCCTCCATTATTTC-3' |
| Exon23-İleri | 5'-CCAAGAAAGCACCTTCAGAAATATG-3' |
| Exon23-Ters | 5'-TTTGGCAGCTTTCCACCA-3' |
| Exon24-İleri | 5'-AAC CTT ACA GAA ATG GAT GGC-3' |
| Exon24-Ters | 5'-TTTCAGGATTTCAGCATCCC-3' |
| GAPDH-İleri | 5'-TGACAAGCTTCCCATTCTCG-3' |
| GAPDH-Ters | 5'-CCCTTCATTGACCTCAACTACAT-3' |
Tablo 1: Astar dizisi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Duchenne Musküler Distrofi (DMD) yıkıcı ve sonuçta ölümcül kalıtsal bir hastalık distrofin eksikliği ile karakterize, ilerleyici kas atrofisi yol1,2. Sonuçlarımız, CRISPR/Cas9 aracılı ekson23 silme yaklaşımı ile Dmdmdx iPSC kaynaklı miyojenik progenitor hücrelerinde geri yüklenen distrofin gen ekspresyonunu göstermektedir. Bu yaklaşımın üç avantajı vardır.
İlk olarak, entegre olmayan bir RNA vektörü kullanarak Dmdmdx fare kaynaklı dermal fibroblastlardan iPSC'ler oluşturduk. Lentiviral ve retroviral vektörler gibi iPSC'ler üretmek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir, bu da yeniden programlama genlerini ifade etmek için konak kromozomlara entegre olacak ve böylece güvenlik kaygıları doğuracaktır. Plazmid vektörleri, adenoilişkili virüsler ve adenovirüsler gibi DNA tabanlı vektörler entegre olmayan bir şekilde bulunur; ancak, yine de düşük bir frekansta konak kromozomentegre olabilir. Bu çalışmada, yeniden programlama için fibroblastlara kök hücre transkripsiyon faktörlerini güvenli ve etkili bir şekilde ulaştırmak için, entegre olmayan bir RNA vektörü olan değiştirilmiş, geçirilemeyen Sendai virüsünü kullandık.
Daha sonra, iPSC'lerde distrofin ekspresyonunu geri yüklemek için CRISPR/Cas9 aracılı hassas gen düzeltmesi yerine CRISPR aracılı genom silme işlemini kullanıyoruz. Bu yöntem uygulanabilir ve verimlidir; birçok insan DMD hastalarında meydana gelen birden fazla mutant exons silmek için birden fazla gRNA tasarlamak kolaydır17. Exon silme nispeten verimli olmayan homolog olmayan bitiş birleştirme yolu kullanır ve yöntem de bir DNA onarım şablonu sunmak için ihtiyaç önler. Bu nedenle, Cas9 aracılı hassas düzeltme ile karşılaştırıldığında, Cas9 aracılı ekson deletion birden fazla gen mutasyonu olan DMD hastalar için uygundur.
Son olarak, miyojenik progenitor hücrelerine farklılaşmamış iPSC'ler indükledik, bu da iPSC'lerin neden olduğu tümörigenez riskini azaltabilir. Bu protokolde, biz iskelet kas ataları içine iPSCs ayırt etmek için indüklenebilir tetrasiklin düzenlenmiş (Tet-On) vektör sistemi ile MyoD ifade indüklenen18,19.
Sonuç olarak, CRISPR/Cas9 genom düzenlemesinin Tet-on MyoD aktivasyon sistemi ile birleşimi, DMD hastalarında hücre nakli için kök hücrelerde mutant DMD-Exon23 desilinmesi için güvenli, uygulanabilir ve etkili bir strateji sağlayabilir.
ES benzeri hücreleri verimli bir şekilde seçmek ve toplamak için, kubbe benzeri morfolojileri ile farklılaşmamış iPSC hücrelerini belirlememiz gerekir ve mürekkepli bir nesne belirteci, iPSC'nin etrafındaki 1,8 mm'lik daireyle kültür çanağının alt kısmındaki tek tek klonları etiketlememize yardımcı olabilir. Klon. Tripsin çözeltisinin sızmasını önlemek için halkaların altına eşit yağ uygulamamız gerekir. Ayrıca, etiketli hücre kolonilerinin üstüne yağ kaplı halkalar yerleştirdikten sonra, halkalara dokunmamaya özen verilmelidir. Aksi takdirde, iPSC klonları müstakil olacaktır.
Protokolün kendi sınırlamaları vardır; örneğin, iPSC'ler oluşturmak için entegre olmayan bir RNA vektör sistemi seçtik. Ancak, dmd exon 23 ve iPSC miyojenik farklılaşma neden bir lentiviral CRISPR / Cas9 sistemi ve lentiviral tabanlı MyoD aktivasyon sistemi silmek için kullanılır; bu bütünleştirici lentiviral vektörlerin güvenlik kaygıları vardır. Ancak, bu sorunlar bir ribonükleoprotein uygulaması ile çözülebilir (RNP) bir rekombinant oluşan, yüksek saflıkta S. pyogenes Cas9 nükleaz bir crRNA ile:tracrRNA dubleks; iPSC'leri doğrudan miyojenik atalara ayırmak için kimyasal olarak modifiye edilmiş MyoD mRNA transfeksiyonu seçebiliriz, ancak verimlilik zor olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Tang ve Weintraub kısmen NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Instruments | |||
| 31-gauge needle | Various | ||
| Sharp Incision | Various | ||
| Sterile Scalpels | Various | ||
| Tweezers | Various | ||
| Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.1 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 1 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 87 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 10 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 1 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 1 mL |
| TVP solution (for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Chicken Serum | Gibco | 16110-082 | 5 mL |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | 186 mg |
| Phosphat-buffered saline | to 500 mL | ||
| Trypsin (2.5%) | Thermo | 15090046 | 5 mL |
| mES growth medium(for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.5 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 408.5 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 75 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 5 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 500 μL |
| MEK/GS3 Inhibitor Supplement | EMD Millipore Corp | CS210510-500UL | 500 μL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 5 mL |
| The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks. | |||
| mES frozen medium(for 50 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | SIGMA | D2650 | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 24.9 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 25 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 50 μL |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | RRID |
| 0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA | CORNING | 25-052-CI | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo scientific | J19943-k2 | |
| Accutase solution | SIGMA | A6964 | Cell detachment solution |
| AgeI-HF | NEB | R3552L | |
| Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody | Invitrogen | A32723 | AB_2633275 |
| Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32731 | AB_2633280 |
| Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32732 | AB_2633281 |
| anti-AFP | Thermo scientific | RB-365-A1 | AB_59574 |
| anti-α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP | CST | 19245S | AB_2734735 |
| anti-Dystrophin | Thermo | PA5-32388 | AB_2549858 |
| anti-LIN28A (D1A1A) XP | CST | 8641S | AB_10997528 |
| anti-MYH2 | DSHB | mAb2F7 | AB_1157865 |
| anti-Nanog-XP | CST | 8822S | AB_11217637 |
| anti-Oct-4A (D6C8T) | CST | 83932S | AB_2721046 |
| anti-Sox2 | abcam | ab97959 | AB_2341193 |
| anti-SSEA1(MC480) | CST | 4744s | AB_1264258 |
| anti-TH (H-196) | SANTA CRUZ | sc-14007 | AB_671397 |
| Alkaline Phosphatase Live Stain (500x) | Thermo | A14353 | |
| Blasticidin S | Sigma-Aldrich | 203350 | |
| BsmBI/Esp3I | NEB | R0580L/R0734L | |
| Carbenicillin | Millipore | 205805-250MG | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Competent Cells | TakaRa | 636763 | |
| CutSmart | NEB | B7204S | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo | A16517 | |
| DirectPCR Lysis Reagent (cell) | VIAGEN BIOTECH | 302-C | |
| Dispase (1 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP26535 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101L | |
| Fibronectin bovine plasma | SIGMA | F1141 | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit (500) |
QIAGEN | 20051 | |
| Gelatin from porcine skin, type A | SIGMA | G1890 | |
| HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1500 | |
| Hygromycin B (50 mg/mL) | Invitrogen | 10687010 | |
| Ketamine HCL Injection | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | 45822 | |
| KpnI-HF | NEB | R3142L | |
| lenti-CRISPRv2-blast | Addgene | 83480 | |
| lenti-Guide-Hygro-iRFP670 | Addgene | 99377 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000015 | |
| LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60625 | |
| LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60626 | |
| Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit | Vector | BMK-2202 | |
| NotI-HF | NEB | R3189L | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | ThermoFisher | 31985070 | |
| Polyethylene glycol 4,000 | Alfa Aesar | AAA161510B | |
| Polybrene | SIGMA | TR1003 | |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide | CORNING | CB354688 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | A25742 | |
| PrimeSTAR Max Premix | TakaRa | R045 | |
| Proteinase K | VIAGEN BIOTECH | 507-PKP | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals | ICN19453980 | |
| qPCR Lentivirus Titration Kit | abm | LV900 | |
| Quick ligation kit | NEB | M2200S | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100) | QIAGEN | 12945 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo scientific | K1691 | |
| RNAzol RT | Molecular Research Center, INC | RN 190 | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Terrific Broth Modified | Fisher BioReagents | BP9729-600 | |
| ViralBoost Reagent (500x) | ALSTEM | VB100 |
References
- Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).
- Batchelor, C. L., Winder, S. J. Sparks, signals and shock absorbers: how dystrophin loss causes muscular dystrophy. Trends Cell Biology. 16 (4), 198-205 (2006).
- Gregorevic, P., et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).
- Bengtsson, N. E., Seto, J. T., Hall, J. K., Chamberlain, J. S., Odom, G. L. Progress and prospects of gene therapy clinical trials for the muscular dystrophies. Human Molecular Genetics. 25 (R1), R9-R17 (2016).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351 (6271), 407-411 (2016).
- Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 400-403 (2016).
- Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 403-407 (2016).
- Long, C., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345 (6201), 1184-1188 (2014).
- El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circulation Research. 121 (8), 923-929 (2017).
- Amoasii, L., et al. Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 362 (6410), 86-91 (2018).
- Eisen, B., et al. Electrophysiological abnormalities in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes generated from Duchenne muscular dystrophy patients. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 2125-2135 (2019).
- Marion, R. M., et al. Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- Sacco, A., et al. Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice. Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).
- Su, X., et al. Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
- Su, X., et al. Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 412-419 (2018).
- Ousterout, D. G., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nature Communications. 6, 6244 (2015).
- Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
- Glass, K. A., et al. Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties. Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).
