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Neuroscience

मानव ंयूरॉंस के लेंटवायरल-मध्यस्थता ट्रांक्शन का उपयोग कर ताऊ एकत्रीकरण का अध्ययन करने के लिए एक इन विट्रो मॉडल

Published: May 23, 2019 doi: 10.3791/59433
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Neurosciences, University of California, San Diego

Summary

इस प्रोटोकॉल का विवरण एक प्रक्रिया है जिसमें मानव न्यूरोनल संस्कृतियों उत्परिवर्ती मानव ताऊ के लिए कोडिंग के साथ लेंट्रोवायरल constructs के साथ transduced हैं । Transduced संस्कृतियों ताऊ समुच्चय और संबंधित विकृतियों प्रदर्शित करते हैं ।

Abstract

प्रोटीन का aberrant एकत्रीकरण ताऊ pathogenically अल्जाइमर रोग (एडी) सहित न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों की एक संख्या में शामिल है । हालांकि tauopathy के माउस मॉडल एकत्रित ताऊ के तंत्रिआविषी तंत्र की जांच के लिए एक मूल्यवान संसाधन प्रदान की है, यह तेजी से स्पष्ट होता जा रहा है कि, neuroफिजियोलॉजी में interspecies मतभेदों के कारण, माउस मस्तिष्क के लिए अनुपयुक्त है मानव शर्त मॉडलिंग । कोशिका संस्कृति के तरीकों में अग्रिम मानव न्यूरोनल संस्कृतियों में प्रयोगात्मक उपयोग के लिए सुलभ बना दिया है विट्रो और neurotherapeutics के विकास में सहायता प्राप्त है. हालांकि, मानव न्यूरोनल कोशिका संस्कृतियों के अनुकूलन के बावजूद, मानव tauopathy के इन विट्रो मॉडल अभी तक व्यापक रूप से उपलब्ध नहीं हैं । इस प्रोटोकॉल ताऊ एकत्रीकरण के एक सेलुलर मॉडल का वर्णन करता है जिसमें मानव ंयूरॉंस के साथ transduced कर रहे है के साथ एक एक पीला फ्लोरिसेंट प्रोटीन (yfp) के लिए रोगजनक उत्परिवर्तित ताऊ के लिए कोड । Transduced संस्कृतियों ताऊ समुच्चय का उत्पादन है कि thioflavin और neurotoxicity के प्रदर्शन मार्कर के लिए सकारात्मक दाग, जैसे अक्षीय लंबाई और वृद्धि हुई लाइसोसोमल मात्रा के रूप में । यह प्रक्रिया मानव tauopathies के अध्ययन के लिए एक उपयोगी और लागत प्रभावी मॉडल हो सकता है ।

Introduction

माइक्रोटयूब से संबंधित प्रोटीन ताउ का रोगात्मक समुच्चय अनेक न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों का एक निर्धारक लक्षण है, जिनमें एडी, फ्रन्टोटेम्पोरल मनोभ्रंश (एफटीडी), पिक की बीमारी, और प्रगतिशील सुप्रानाभिकीय अंगघात (पीएसपी)1शामिल हैं । एक रोगग्रस्त अवस्था में ताऊ, न्यूरोनल एक्सऑन्स2में माइक्रोट्यूब्यूल तंतु को बाँधता है और स्थिर करता है । तथापि, ताऊ का रोग-संबद्ध हाइपरफॉस्फोरीलेशन ताऊ एकत्रीकरण, माइक्रोट्यूब्यूल्स से वियोजन और न्यूरोनल विषाक्तता3को बढ़ावा देता है । एकत्रित ताऊ के विषाक्त प्रभाव कोलीनर्जिक4 और ग्लूटामैटेजिक रिसेप्टर्स के ंयायपालिका सक्रियण शामिल हो सकते हैं5 intracellular कैल्शियम के डिस्रेग्युलेशन में जिसके परिणामस्वरूप और, अंत में, कोशिका मृत्यु. पशु मॉडल में, मस्तिष्क ताऊ की कमी विज्ञापन चूहों6 और दोहराव हल्के अभिघातजंय मस्तिष्क चोट7के माउस मॉडल में विकृति में सुधार ।

बढ़ते सबूत दर्शाता है कि संरचना और माउस की बाध्यकारी संबध-ताऊ व्युत्पंन मानव ताऊ से व्युत्पंन और है कि माउस ताऊ मानव tauopathies8मॉडलिंग के लिए अनुपयुक्त है । हालांकि, मानव कोशिका तौलविकृति मॉडल व्यापक रूप से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं । इस काम का समग्र लक्ष्य ताऊ एकत्रीकरण के इन विट्रो मॉडल का वर्णन करना है जिसमें मानव न्यूरॉन्स को मटैन्ट मानव ताऊ से युक्त लैंटवायरल व्युत्पन्न वैक्टर के साथ ट्रांसड्यूडेड किया जाता है । ताउ के कारण एक प्रकार का फल, ताउ दोहराने डोमेन के लिए encodes P301L और V337M म्यूटेशन एक yfp रिपोर्टर (ताऊ-rdlm-yfp) जबकि नियंत्रण के लिए कोड constructs जंगली तरह (wt) ताऊ दोहराने डोमेन के लिए एक yfp रिपोर्टर (ताऊ-wt-yfp) संगलित । Neuronal संस्कृतियों इस विधि का उपयोग कर transduced लगभग नौ बार और nontransduced संस्कृतियों से अधिक ताऊ व्यक्त करते हैं । हालांकि ताऊ अभिव्यक्ति की राशि है, ताऊ-RDLM-YFP-और ताऊ-Wt-YFP-transduced कोशिकाओं के बीच मोटे तौर पर बराबर है, केवल ंयूरॉंस ताऊ-RDLM-YFP प्रदर्शन समुच्चय के साथ transduced । ताउ के साथ transduced-RDLM-YFP थायोफ्लेविन के लिए सकारात्मक दाग और axonal लंबाई और synaptic घनत्व में कटौती प्रदर्शन । इसलिए, यह सेलुलर मॉडल ताऊ एकत्रीकरण इन विट्रो का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता है ।

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Protocol

1. मीडिया और अभिकर्मकों की तैयारी

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति प्लेटों के लिए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स कोटिंग पिघलना (तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को गर्म करने की अनुमति नहीं है या यह जमना होगा) । 1 मिलीलीटर aliquots बनाओ और उंहें-20 डिग्री सेल्सियस या-७० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  2. 10 μg/mL पर बाँझ फॉस्फेट-buffered खारा (PBS) में बुनियादी फाइकोब्लास्ट वृद्धि कारक (bFGF) का पुनर्गठन और 10 μL aliquots बनाते हैं । उंहें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  3. एक नया, unopened, ५०० के लिए DMEM की बोतल () glutamine के साथ, B27 जोड़ें (10 मिलीलीटर), N2 (5 मिलीलीटर), और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (5 मिलीलीटर) । इस तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) मीडिया के ५० मिलीलीटर को शंक्वाकार नली में रखें और 10-जी/μL (2 μg/mL अंतिम) बीएफजीएफ एनएससी (+) bFGF मीडिया 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  4. (-) BFGF मीडिया बनाने के लिए, चरण १.३ में वर्णित के रूप में एक ही नुस्खा का उपयोग करें, लेकिन bFGF जोड़ नहीं है । इस मीडिया के लिए nscs ंयूरॉंस में अंतर और अंतर के बाद न्यूरोनल संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।

2. लैंट्रोवायरल Constructs

नोट: लेंटीवायरल संरचनाओं के साथ काम शुरू करने से पहले, यह सुनिश्चित करें कि लैब जैव सुरक्षा स्तर-2 (बीएसएल-2) एजेंटों का उपयोग करने के लिए अनुमोदित किया गया है । इसके अलावा, BSL-2 संस्कृति डाकू, व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (PPE), और निपटान विधियों का इस्तेमाल किया जाना चाहिए जब लेंटीवायरल वैक्टर के साथ काम कर रहे ।

  1. ताउ एक वरीय स्रोत से लेंटवाइरस में पैक constructs प्राप्त (जानकारी के निर्माण के लिए सैंडर्स एट अल10 देखें) ।

3. मानव तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को culturing

नोट: NSCs आम तौर पर 100000 पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं-150000 कोशिकाओं/2 और सबसे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एनएससीएस 1 एक्स 106 कोशिकाओं के रूप में बेच रहे है/ इस प्रोटोकॉल 10 सेमी सेल संस्कृति व्यंजन के लिए अनुकूलित किया गया है (हालांकि व्यंजन के अंय आकार इस्तेमाल किया जा सकता है); इसलिए, यदि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एनएससीएस का उपयोग किया जा रहा है, तो एनएससीएस को पहले छह-कूप व्यंजन में सुसंस्कृत होने की आवश्यकता हो सकती है ताकि पर्याप्त कक्षों में 10 सेंटीमीटर के व्यंजन का परिणाम मिल सके । इस प्रोटोकॉल वैकल्पिक रूप से सेल संस्कृति डिश आकार की एक किस्म के लिए अनुकूलित किया जा सकता है (लेकिन यह के रूप में इन प्रोटोकॉल कहीं और11,12उपलब्ध हैं) के रूप में nscs passaging के लिए निर्देश शामिल नहीं है ।

  1. सेल संस्कृति प्लेटों की तैयारी के लिए, सेल संस्कृति प्लेटों के लिए जमे हुए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स कोटिंग के एक aliquot निकालें और यह 4 डिग्री सेल्सियस पर गल करने के लिए अनुमति देते हैं (aliquot 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है दिन भर से पहले कोशिकाओं को वरीयता प्राप्त करने के लिए कर रहे हैं) । DMEM/F12 मीडिया + पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के 5 मिलीलीटर के लिए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स कोटिंग के ३८५ μL जोड़ें ।
    नोट:     DMEM/F12 मीडिया + पेनिसिलिन के 5 मिलीलीटर-streptomycin एक 10 सेमी पकवान (इस तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स कोटिंग समाधान के 1 मिलीलीटर कोट करने के लिए पर्याप्त एक छह अच्छी तरह से पकवान की एक अच्छी तरह से कोट के लिए पर्याप्त है) । वैकल्पिक रूप से, यदि कोशिकाओं को तय किया जा रहे है और immunostained, या थायोफ्लेविन के लिए दाग, ग्लास पर संस्कृति कोशिकाओं 24-well संस्कृति व्यंजनों में coverslips ।
    1. मीडिया और मैट्रिक्स कोटिंग से पहले और जबकि उंहें संस्कृति के व्यंजनों को जोड़ने ठंडा रखो । संस्कृति व्यंजन के लिए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स कोटिंग जोड़ें और एक इनक्यूबेटर में बर्तन जगह (३७ डिग्री सेल्सियस पर) 1 ज के लिए । इष्टतम कोटिंग के लिए, से अधिक या कम 1 h के लिए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स नहीं सेते । 1 ज के बाद, कोशिका संस्कृतियों के व्यंजनों से तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स कोटिंग महाप्राण । सुनिश्चित करें कि यह NSCs के साथ मेल खाती है चढ़ाया जा करने के लिए तैयार किया जा रहा है ।
      नोट: यदि सेल जमे हुए स्टॉक से thawed नहीं किया जा रहा है, तो चरण ३.२ छोड़ें और चरण ३.३ के साथ जारी रखें ।
  2. यदि कोशिकाओं को जमे हुए एनएससी शेयरों से thawed जा रहा है, जमे हुए कोशिकाओं की एक शीशी ले और यह एक पानी में गरम स्नान ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म पानी में वापस और आगे की शीशी । एक बार thawed, ७०% इथेनॉल के साथ शीशी स्प्रे और यह एक सेल संस्कृति हुड में जगह है । कक्षों को ~ 10 मिलीलीटर DMEM/F12 + पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन मीडिया और सेंट्रलाइज करने के लिए 5 मिनट के लिए १,००० x g पर कमरे के तापमान पर ट्यूब स्थानांतरण । मीडिया को महाप्राण देना और एनएससी मीडिया में कक्षों को निलंबित करना ।
  3. उपयोग किए जा रहे सेल कल्चर वेसल के लिए उपयुक्त सीडिंग घनत्व प्राप्त करने के लिए एनएससी मीडिया में कक्षों को पतला करना ।
    नोट: उदाहरण के लिए, यदि एनएससीएस को एक छह-कूप प्लेट पर चढ़ाया जा रहा है-एक छह-कूप कल्चर डिश पर एक अच्छी तरह से 9 सेमी2-९००,००० से १,३५०,००० कोशिकाओं की सतह क्षेत्र है बीज के लिए आवश्यक हैं । तो, एक १,०००,००० कोशिकाओं युक्त शीशी मीडिया के 2 मिलीलीटर में फिर से निलंबित किया जा सकता है और एक छह अच्छी तरह से पकवान के एक भी अच्छी तरह से जोड़ा ।
  4. जोड़ने के लिए पर्याप्त एनएससी मीडिया में निलंबित करने के लिए बीज तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स लेपित संस्कृति व्यंजन (१००,००० कोशिकाओं/2) और हर दूसरे दिन मीडिया बदलने के लिए (यदि एक जमे हुए शेयर का उपयोग कर, मीडिया चढ़ाना के बाद दिन बदलने और हर दूसरे दिन के बाद) । कोशिकाओं जब तक वे 75%-80% संगम हो जाना ।
    नोट: कोशिकाओं की संभावना 75% तक पहुंच जाएगा-80% शीघ्र ही चढ़ाना के बाद संगम, लेकिन यह अब लग सकता है अगर जमे हुए शेयरों का इस्तेमाल किया जाता है ।
  5. एक बार एनएससीएस 75% – 80% संगम है, एनएससी (+) bFGF मीडिया को हटाकर और एनएससी (-) bFGF मीडिया के साथ प्रतिस्थापित करके न्यूरोनल विभेदन शुरू करें । संस्कृति इस मीडिया में कोशिकाओं (मीडिया की जगह हर दूसरे दिन) के लिए ंयूनतम 4 सप्ताह ।
    नोट: कोशिकाओं bFGF की वापसी के बाद कुछ दिनों के लिए विभाजित करने के लिए जारी रहेगा; इसलिए, कोशिकाओं 90 तक पहुंच सकते है-100% संगम । 4 सप्ताह के लिए संवर्धन के बाद, कोशिकाओं को एक न्यूरोनल भाग्य हासिल किया है और एक के लिए तैयार हो जाएगा ।

4. पारडक्शन और न्यूरोनल संस्कृतियों के रखरखाव

  1. एक ३.४ x 105 transducible इकाइयों के एक अनुमापांक गिनती का उपयोग करें (एक १००% संगम 10 सेमी डिश ~ १०,०००,००० ंयूरॉंस शामिल होंगे) सेल संस्कृति मीडिया में आवश्यक एकाग्रता के लिए transducible इकाइयों पतला और उंहें कोशिकाओं को जोड़ने के लिए (सेल संस्कृति पकवान के लिए मीडिया के सामांय मात्रा का उपयोग करें) । लेंसीवाइरस को जोड़ने के दो दिन बाद, ताजा (-) बीएफजीएफ मीडिया (बिना लेंसेवायरस) के साथ कोशिकाओं को धोएं और (-) बीएफजीएफ मीडिया में हमेशा की तरह ही
  2. बाद के लिए-लेंट्रोवायरल उपचार, सेल संस्कृति मीडिया ([-] bFGF मीडिया) हर दूसरे दिन बदलकर transduced ंयूरॉंस फ़ीड । Transduction के बाद ~ 8 सप्ताह के लिए कोशिकाओं को बनाए रखें । व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए नियमित रूप से एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं कल्पना ।
    नोट: निकटता या द्रुमाकृतिक टूटना संकेत है कि कोशिकाओं को अब व्यवहार्य नहीं हैं ।

5. कोशिकाओं की इमेजिंग

  1. लाइव सेल इमेजिंग
    1. पारक्रमण के बाद (4 दिनों के बाद लेंसीवाइरस), एक फ्लोरोसेंट लाइव सेल इमेजिंग में सक्षम माइक्रोस्कोप के तहत yfp संकेतों का निरीक्षण । सेल संस्कृति व्यंजन इनक्यूबेटर से बाहर ले लो और यकीन है कि संस्कृति के कुओं संस्कृति व्यंजनों के शीर्ष पर ढक्कन रखकर बाँझ रहना । 10x उद्देश्य का उपयोग करके कक्षों को विज़ुअलाइज़ करें ~ ५१४ एनएम के उत्तेजन तरंगदैर्ध्य और ~ ५२७ एनएम के उत्सर्जन निस्यंदक के साथ ।
      नोट: समुच्चय आमतौर पर transduced सेल संस्कृतियों में दिखाई देते हैं 6 – 8 दिन के बाद लेंटावायरस के आवेदन.
  2. फिक्स्ड सेल धुंधला (β-ट्यूब्युलिन III लेबलिंग और thioflavin धुंधला)
    1. पैराफॉर्मलेडिहाइड (पीएफए) में कोशिकाओं को ठीक करने के लिए, ग्लास coverslips पर उगाया transduced ंयूरॉंस से संस्कृति मीडिया को हटा दें । 1 x कोशिकाओं को पीबीएस से धोएं, धोने को निकालें, और 300-500 μL (यदि 24-कूप प्लेटों का उपयोग कर रहे हों) 4% पीएफए (पीबीएस में पतला) को कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए coverslips को जोड़ें । पीएफए निकालें और PBS के साथ 2x coverslips धोने ।
    2. एक अवरुद्ध समाधान pbs, 3% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (BSA), और ०.३% ट्राइटन एक्स-१०० से मिलकर तैयार करते हैं । कुओं के लिए समाधान के 300-500 μL जोड़ें और 2 ज के लिए 4 ° c पर coverslips सेते । 2 ज के बाद, प्राथमिक एंटीबॉडी (1:500 की एक एंटीबॉडी एकाग्रता पर) को रोकने के समाधान में और जोड़ने के लिए एक अच्छी तरह से प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 300-500 μL । प्लेट को एक कमाल या घूर्णन प्लेटफार्म पर (कम गति पर) 4 ° सेल्सियस पर रात भर रखें ।
    3. अगले दिन, प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और 5 मिनट PBS के साथ प्रत्येक के लिए 3x coverslips धोने । एक अवरुद्ध बफर समाधान में माध्यमिक एंटीबॉडी तनु (1 की एकाग्रता पर: 1000) और एक अच्छी तरह से माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें । उपयुक्त द्वितीयक एंटीबॉडी YFP संकेत (CY-3, उदाहरण के लिए) के साथ ओवरलैप नहीं एक फ्लोरोसेंट टैग का उपयोग करके का चयन करें । एक कमाल या घूर्णन मंच पर 2 ज के लिए कमरे के तापमान पर कोशिकाओं सेते । 2 ज के बाद, द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान निकालें और 10 मिनट PBS के साथ प्रत्येक के लिए 3x coverslips धोने ।
    4. 10 मिनट के लिए डबल deionized पानी (DDW) में coverslips धो लो । DDW निकालें और ०.०१५% thioflavin के ३०० μL/well को जोड़ने-एस 10 ५० मिनट के लिए ५०% इथेनॉल में पतला 30% इथेनॉल और 30% इथेनॉल के साथ प्रत्येक 5 मिनट के लिए दो washes के साथ धो लो । DDW बढ़ते से पहले के साथ 1x coverslips धो लो ।
      नोट: थिओफ्लेविन धुंधला कदम 5.2.4 में वर्णित वैकल्पिक है ।
    5. Coverslips कांच स्लाइड करने के लिए माउंट करने के लिए, "+" पर बढ़ते मीडिया की एक बूंद के लिए एक गिलास की ओर रखें । ग्लास coverslip युक्त अच्छी तरह से सभी तरल निकालें और, ठीक forceps का उपयोग कर, ध्यान से ग्लास coverslip हटाने, जो पक्ष के सभ्य कोशिकाओं है ट्रैक रखने.
    6. धीरे से एक Kimwipe के खिलाफ coverslip के किनारे दबाएं करने के लिए किसी भी अतिरिक्त नमी हटा दें । अभी भी ठीक forceps के साथ coverslip मनोरंजक, किनारे (सेल बढ़ते मीडिया की गिरावट की ओर का सामना करना पड़ के साथ) बढ़ते मीडिया को coverslip की ओर, और फिर, धीरे बढ़ते मीडिया पर coverslip जगह (बढ़ते में सुसंस्कृत कोशिकाओं को रखकर मीडिया और उंहें coverslip और ग्लास स्लाइड के बीच sandwiching) । बढ़ते मीडिया इमेजिंग करने से पहले 30 मिनट के लिए कठोर करने की अनुमति दें । स्लाइड्स को भविष्य में उपयोग के लिए-20 ° c पर संग्रहित किया जा सकता है ।
    7. छवि एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कोशिकाओं और उचित उत्तेजन/उत्सर्जन स्पेक्ट्रा (YFP = ~ 514/527 एनएम, CY-3 = ~ 555/568 एनएम, और thioflavin = ~ 390/426 एनएम) ।

6. वैकल्पिक तरीके

  1. हर 2 दिन, संस्कृतियों से संस्कारित मीडिया इकट्ठा करने और इसे-20 डिग्री सेल्सियस पर की दुकान ताऊ प्रजातियों के भविष्य के विश्लेषण के लिए संस्कृतियों द्वारा जारी की ।

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Representative Results

ताऊ-RDLM-YFP-transduced ंयूरॉंस थे fluorescently YFP के साथ टैग, और RDLM-transduced संस्कृतियों transक्रमण के बाद समुच्चय प्रदर्शित । इन inclusions थायोफ्लेविन के लिए सकारात्मक सना हुआ (चित्रा 1) । के रूप में चित्रा 1 दर्शाता है, इस प्रोटोकॉल न्यूरोनल संस्कृतियों कि प्रदर्शन thioflavin सकारात्मक ताऊ समुच्चय का उत्पादन । आरंभिक प्रयोगों के लिए, यह अनुशंसित है कि न्यूरोनल विभेदन की पुष्टि की है immunolabeling न्यूरॉन-विशिष्ट मार्कर β-ट्यूब्युलिन III संस्कृतियों में. महत्वपूर्ण बात है, fluorescently माध्यमिक एंटीबॉडी टैग एक उत्तेजना है कि (उदाहरण के लिए Cy3, YPF के साथ ओवरलैप नहीं करता है)/ हालांकि पीले फ्लोरोसेंट ताऊ समुच्चय धुंधला के अभाव में दिखाई देगा, thioflavin भी इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए ताकि पुष्टि करने के लिए कि फ्लोरोसेंट संकेत एकत्रित ताऊ और नहीं सेलुलर मलबे है । इसके अतिरिक्त, चित्र 1 में उदाहरण में dapi को कोशिका नाभिक को लेबल करने के लिए धुंधला करना शामिल नहीं है, क्योंकि dapi का उत्तेजन/उत्सर्जन थायोफ्लेविन-एस के साथ ओवरलैप करता है; वैकल्पिक नाभिक दाग थायोफ्लेविन के साथ प्रयोग किया जाना चाहिए-एस अगर वांछित ।

Figure 1
चित्रा 1: Thioflavin transduced संस्कृतियों का धुंधला । ताउ-आरडीएलएम-वाईएफपी लेन्डवाइरस के साथ न्यूरॉन्स को निर्धारित किया गया था और न्युरॉन-विशिष्ट मार्कर β-ट्यूब्युलिन III (लाल) के साथ immunolabeled थे । इसके अतिरिक्त, ताऊ समुच्चय (हरी में YFP संकेत) थायोफ्लेविन (नीला) के लिए दाग थे । स्केल पट्टियां = 25 μm । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल मानव तौपविकृति के एक इन विट्रो मॉडल की उत्पत्ति का वर्णन करता है जो सिल्वर-दाग-धनात्मक समुच्चय और थायोफ्लेविन-पॉजिटिव न्यूरोफाइनेन्शिलरी कोणों (एनएफएफटी) को दर्शाती है । इसके अलावा, transduced कोशिकाओं ताउ प्रेरित विकृतियों जैसे रूपात्मक दोष के रूप में, कम synaptogenesis, और एक वृद्धि हुई लाइसोसोमीय मात्रा । इस प्रोटोकॉल का मुख्य लाभ यह है कि यह न्यूरोनल टामोपैथी के एक सुलभ और लागत प्रभावी मॉडल प्रदान करता है, जो दवा स्क्रीनिंग अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही ताऊ विषाक्तता के विश्लेषण के लिए । इस मॉडल में एक सामग्री की जरूरत है न्यूरोडिजेनेरेटिव अनुसंधान में भर जाता है के रूप में मानव tauopathy सेल लाइनों अभी तक व्यापक रूप से उपलब्ध नहीं है और माउस-व्युत्पंन ंयूरॉंस से ट्रांसजेनिक ताऊ का उपयोग पशु प्रजनन की आवश्यकता है और न्यूरोनल में मतभेदों के कारण सीमित है प्रजातियों के बीच लक्षण ।

ऊपर सूचीबद्ध उन के अलावा, इस प्रक्रिया की सफलता के लिए महत्वपूर्ण कदम के एक नंबर रहे हैं । सबसे पहले, यह सुनिश्चित करें कि सही वायरल अनुमापांक इस्तेमाल किया जाता है क्योंकि अगर वायरल अनुमापांक बहुत कम है, संस्कृतियों समुच्चय फार्म नहीं होगा । दूसरा, सुनिश्चित करें कि एनएससी संस्कृतियों ठीक से बनाए रखा है और अधिक नहीं ~ ८०% संगम । एनएससीएस के अधिक विकास से समय से पहले अंतर पैदा होगा । पिछले, nscs से bfgf मीडिया को वापस लेने के बाद अंतर करने के लिए न्यूरोनल संस्कृतियों के लिए एक पूरे 4 सप्ताह रुको । यह अवधि ंयूरॉंस की परिपक्वता सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है ।

हालांकि प्रक्रिया ऊपर वर्णित एक इन विट्रो tauopathy मॉडल के उत्पादन के लिए एक कुशल तरीका है, इस प्रोटोकॉल के साथ जुड़े कुछ सीमाएं हैं । सबसे पहले, जैसा कि पहले वर्णित है, इस विधि मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल में NFTs उत्पादन-ंयूरॉंस व्युत्पंन लेकिन चूहे भ्रूणीय (E18) में नहीं-ंयूरॉंस व्युत्पंन । यहां तक कि तीन गुना अधिक वायरस का उपयोग करने से चूहे ंयूरॉंस के लिए इस्तेमाल किया गया था की तुलना में मानव ंयूरॉंस, कृंतक सेल संस्कृतियों के लिए नकारात्मक रहे thioflavin धुंधला है, जो पता चलता है कि इस विधि कृंतक संस्कृतियों के लिए अनुकूलित नहीं किया जा सकता है । Transduced माउस कोशिकाओं और मानव ंयूरॉंस के बीच अंतर13एकत्रीकरण की ओर मानव ताऊ की वृद्धि की प्रवृत्ति के कारण हो सकता है । इस प्रक्रिया की दूसरी सीमा यह है कि हालांकि ताऊ समुच्चय संस्कृतियों में बनते हैं, ताऊ-RDLM-transduced कोशिकाओं और ताऊ-Wt-YFP-transduced संस्कृतियों के बीच ताउ फॉस्फोरिलेशन में परिवर्तन प्रोटीन PHF-1 का उपयोग undetectable थे (जो का पता लगाता है ताऊ ४०४) और CP13 एंटीबॉडी (जो ताउ का पता लगाने के लिए Ser २०२ पर फॉस्फोलरेटेड) । इन निष्कर्षों का सुझाव है कि ताउ-RDLM में ताऊ एकत्रीकरण-YFP P301L और V337M के कारण संस्कृतियों एक तंत्र है कि hyperफॉस्फोरस के स्वतंत्र है शामिल है, या अंतर्जात ताऊ के स्तर फॉस्फोरिलेशन immunoblot द्वारा detectable स्तर के तहत है । क्योंकि पीएचएफ में मतभेद की कमी-1 और CP13 immunoreactivity के बीच ताऊ-RDLM-YFP और ताऊ-Wt-YFP संस्कृतियों, यह स्पष्ट नहीं है या नहीं इस मॉडल ताउ kinase के प्रभाव का विश्लेषण अध्ययन के लिए उपयोगी होगा/ हालांकि, दोनों PHF-1 और CP13 एंटीबॉडी दोहराने के परिवर्तन डोमेन के बाहर क्षेत्रों को पहचानो म्यूटेशन; इसलिए, विभिन्न टाउ फॉस्फोरिलेशन साइटों के खिलाफ उठाया अतिरिक्त एंटीबॉडी भविष्य के अध्ययन के लिए उपयोगी हो सकता है.

कोशिका संस्कृति के अलावा assays हैं, इस मॉडल कोशिका संस्कृति प्रतिमान से परे अध्ययन के लिए एक मूल्यवान उपकरण हो सकता है । उदाहरण के लिए, transduced कोशिकाओं के मीडिया से अलग exosomes विषाक्त ताऊ प्रजातियों होते हैं । Exosomes छोटे स्रावी पुटिका लगभग हर कोशिका प्रकार से जारी कर रहे हैं, और exosomes ताऊ प्रचार14में फंसाया गया है । ताऊ-rdlm न्यूरोनल exosomes मानव ताऊ जो वेस्टर्न ब्लॉट9द्वारा detectable है होते हैं, और इन exosomes को भोली माउस मस्तिष्क में ताऊ inclusions का उत्पादन करने के लिए पर्याप्त हैं । ये inclusions मानव ताऊ के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए immunoreactive हैं (K9JA), लेकिन यह स्पष्ट नहीं है कि क्या या नहीं inclusions एकत्रित माउस ताऊ शामिल हैं. खोज यहां वर्णित है कि प्रक्रिया thioflavin का उत्पादन नहीं करता है रोहताश ंयूरॉंस में सकारात्मक धुंधला समुच्चय पता चलता है कि मस्तिष्क में मनाया inclusions मानव ताऊ के पूरी तरह से बना रहे हैं, हालांकि भविष्य के अध्ययन की पुष्टि करने के लिए आवश्यक हैं vivo में जमा की संरचना ।

इस बारे में बताया गया है कि इस मॉडल के माध्यम से ताऊ-प्रेरित न्यूरोडिजनरेशन की मध्यस्थता में exosome की भूमिका की जांच के लिए एक उपयोगी संसाधन हो सकता है । अंत में, इस प्रक्रिया को मानव tauopathy कि ट्रांसजेनिक माउस न्यूरोनल सिस्टम पर महत्वपूर्ण लाभ है और पूर्व नैदानिक विश्लेषण की एक किस्म के लिए नियोजित किया जा सकता है की एक इन विट्रो मॉडल पैदा करता है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों को डॉ पीटर Davies शुक्रिया अदा करना चाहूंगा अल्बर्ट आइंस्टीन कॉलेज ऑफ मेडिसिन में PHF-1 और CP13 एंटीबॉडी और डॉ मार्क डायमंड की आपूर्ति के लिए टेक्सास, साउथैवेस्टर्न विश्वविद्यालय में, ताऊ constructs प्रदान करने के लिए । यह काम अल्जाइमर एसोसिएशन (NIRG-14-322164) से अनुदान के लिए S.H.Y. और कैलिफोर्निया संस्थान से पुनर्योजी चिकित्सा के लिए (TB1-01193) पीआर को समर्थन किया गया था

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm culture dishes Thermofisher 12556002
15 mL tubes Biopioneer CNT-15
16% paraformaldehyde Thermofisher 50-980-487
24 well culture plates Thermofisher 930186
50 mL tubes Biopioneer CNT-50
70% ethanol in spray bottle Various sources NA
B27 supplement Thermofisher 17504044
Basement membrane matrix (Matrigel) Corning 356231
Basic FGF Biopioneer HRP-0011
Bovine serum albumin Sigma A7906
Cell culture incubator Various sources NA
Centrifuge Various sources NA
DMEM-F12 culture media with glutamine Thermofisher 10565042
Ethanol (50% concentration or higher) Various sources NA
Flourescently labeled secondary antibodies Various Sources, experiment dependent NA
Fluorescent microscope Various sources NA
Glass coverslips Thermofisher 1254581
Glass slides Thermofisher 12-550-15
Human neural stem cells Various sources NA
Lentiviral vectors Various sources custom order
Mounting media Thermofisher P36934
N2 supplement Thermofisher 17502048
Penicillin-Streptomycin Thermofisher 15140122
Phosphate buffered saline Thermofisher 14190250
Primary antibodies Various Sources, experiment dependent NA
Rocking or rotating platform Various sources NA
Sterile cell culture hood Various sources NA
Thioflavin S Sigma T1892-25G
Triton X-100 Thermofisher BP151-100
Water bath Various sources NA

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References

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तंत्रिका विज्ञान मुद्दा १४७ ताऊ ंयूरॉन तंत्रिका स्टेम सेल अल्जाइमर रोग frontotemporal मनोभ्रंश neuroव्यपजनन लेंटीवायरस tauopathy
मानव ंयूरॉंस के लेंटवायरल-मध्यस्थता ट्रांक्शन का उपयोग कर ताऊ एकत्रीकरण का अध्ययन करने के लिए एक इन विट्रो मॉडल
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Aulston, B., Liu, Q., Reilly, P.,… More

Aulston, B., Liu, Q., Reilly, P., Yuan, S. H. An In Vitro Model for Studying Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons. J. Vis. Exp. (147), e59433, doi:10.3791/59433 (2019).

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