Summary
이 프로토콜은 인간 신경 배양이 돌연변이 인간 타우를 코딩 하는 렌 티 바이러스 컨스트 럭 트와 형질 도입 하는 절차를 자세히 설명 합니다. 형질 도입 배양은 타우 응집 체 및 관련 병 리를 표시 합니다.
Abstract
단백질 타우의 변종 응집은 병리학 적으로 알 츠 하이 머 병 (AD)을 비롯 한 다 수의 퇴행 성 신경 질환에 관여 한다. 동종 요법의 마우스 모델은 집계 된 타우의 신경 독성 메커니즘을 조사 하기 위한 귀중 한 자원을 제공 했지만, 신경 생리학의 종 간 차이로 인해 마우스 뇌는 적합 하지 않다는 것이 점차 명백 해지고 있습니다. 인간의 상태 모델링. 세포 배양 방법의 진보는 시험관에서 실험적인 사용을 위해 인간적 인 신경 배양을 접근 하 고 신경 치료제의 발달에 원조 했습니다 만들었습니다. 그러나, 인간 신경 세포 배양의 적응에도 불구 하 고, 인간 타우 병의 시험관 내 모델은 아직 널리 이용 되지 않는다. 이 프로토콜은 인간 뉴런이 황색 형광 단백질 (YFP) 리포터에 융합 된 병리학 적 돌연변이 타우에 대 한 코드를 렌 티 바이러스 유래 벡터로 형질 도입 하는 타우 응집의 셀룰러 모델을 기술 한다. 형질 도입 배양은 thioflavin에 대해 긍정적으로 얼룩을 발생 하는 타우 응집 체를 생산 하 고 신경 독성의 마커를 표시 합니다 (예: 감소 된 축 사 길이 및 증가 된 리소 소 양). 이 절차는 인간적 인 tauopathies를 공부 하기를 위한 유용 하 고 비용 효과적인 모형 일 수 있습니다.
Introduction
소 세관-관련 단백질 타우의 병리학 적 응집은 AD, 전방 측 두 성 치 매 (FTD), 픽의 질병 및 진보적인 수 아 핵 성 마비 (PSP)1을 포함 하는 많은 신경 변성 질환의 정의 특징 이다. 질병이 없는 상태에서, 타우는 뉴런 축 삭2에서 미세 구 필 라 멘 트에 결합 하 고 안정화 시킵니다. 그러나, 타우의 질병 관련과 인 산화는 타우 응집을 촉진 하 고, 미세 세관에서 해리 되며, 신경 독성3. 집계 된 tau의 독성 효과는 세포내 칼슘의 장애 조절을 초래 하 고, 최종적으로는 세포 사 멸을 유발 하는 콜린 성4 및 glutamatergic 수용 체의 변종 활성화를 수반할 수 있다. 동물 모델에서, 뇌 타우의 감소는 AD 마우스에서 병리학을 향상6 반복적 인 가벼운 외상 성 뇌 손상의 마우스 모델에서7.
장착 증거는 마우스 유래 타우의 구조와 결합 친화도가 인간 유래 타우와 구별 된다는 것을 보여주고, 마우스 타우는 인간 tauopathies 모델링에 부적합 하다8. 그러나, 인간 세포 동종 요법 모델은 널리 상업적으로 입수 가능 하지 않다. 이 작업의 전반적인 목표는 인간 뉴런이 돌연변이 인간 타우 컨스트 럭 트9를 포함 하는 렌 티 바이러스 유래 벡터로 형질 도입 타우 응집의 시험관 내 모델을 기술 하는 것 이다. 렌 티 바이러스 컨스트 럭 트를 유발 하는 타우 집합체는 yfp 리포터 (타우-wt-yfp)에 융합 된 야생 형 (wt) 타우 반복 도메인에 대 한 대조 군 코드를 생성 하는 반면, 타우 반복 도메인의 품고 P301L 및 V337M 돌연변이에 융합 하는 것 이다. 이 방법을 사용 하 여 형질 도입 신경 배양 물은 nontransduced 문화 보다 약 9 배 더 많은 타우를 표현 한다. 타우 발현의 과다 발현 양은 타우-르 DLM-YFP와 타우 Wt-형질 도입 세포 사이에서 대략적으로 동일 하지만, 타우-RDLM-YFP 디스플레이 응집 체로만 뉴런 형질 도입. 배양 액은 thioflavin 및 시 냅 스 밀도의 표시 감소에 대 한 긍정적 인 형질 도입-YFP 얼룩과 함께 제공 됩니다. 따라서,이 셀룰러 모델은 시험관 내에서 타우 응집을 연구 하기 위한 유용한 도구가 될 수 있다.
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Protocol
1. 미디어 및 시 약의 제조
- 배양 플레이트에 대 한 지 하 막 매트릭스 코팅을 4°c에서 해 동 (지 하 막 매트릭스를 따뜻하게 하거나 응고 하는 것을 허용 하지 않는다). 1 mL의 알리 쿠오를 만들고-20°c 또는-70 ° c에서 보관 하십시오.
- 10 µ g/mL에서 멸 균 인산 완충 식 염 액 (PBS)에 기본 섬유 아 세포 성장 인자 (bFGF)를 재구성 하 고 10 µ L 분 취를 만듭니다. 4°c에 보관 하십시오.
- 미 개봉 500 mL 병 DMEM, 글루타민을 사용 하 여 B27, 5ml(15 ml) 및 페니실린 streptomycin (5ml)을 첨가 하십시오. 이 신경 줄기 세포 (NSC) 매체의 50 mL을 원추형 튜브에 넣고 10 µ L의 10µ을 추가 합니다. NSC (+) bFGF 매체를 4°c에서 보관 한다.
- (-) BFGF 미디어를 만들려면 1.3 단계에서 설명한 것과 동일한 레시피를 사용 하 되 bFGF 추가 하지 마십시오. 이 매체는 뉴런에 대 한 NSCs를 차별화 하 고 분화 후 신경 배양을 유지 하는 데 사용 됩니다.
2. 렌 티 바이러스 구조
참고: 렌 티 바이러스 구문을 사용 하 여 작업을 시작 하기 전에 실험실에서 생물학적 안전 수준-2(BSL-2) 에이전트를 사용할 수 있도록 승인 되었는지 확인 하십시오. 또한 렌 티 바이러스 벡터로 작업할 때는 BSL-2 배양 후드, 개인 보호구 및 폐기 방법을 사용 해야 합니다.
- 선호 하는 공급원 으로부터 렌 티 바이러스으로 포장 된 타우 컨스트 럭 트를 구합니다 (구성 정보는 샌 더 스 외.10 참조).
3. 인간 신경 줄기 세포 배양
참고: NSCs는 전형적으로 100000-150000 세포/cm2 에서 시 딩 되 고, 시판 되는 대부분의 nscs는 1 x 106 세포/바이 알로 판매 된다. 이 프로토콜은 10cm 세포 배양 접시에 최적화 되어 있습니다 (다른 크기의 요리가 사용 될 수 있지만). 따라서 상업적으로 입수 가능한 NSCs가 사용 되는 경우, NSCs는 10 cm의 접시를 종자에 충분 한 세포를 초래 하기 위해 6-웰 디쉬에 먼저 배양 됨으로써 확장 될 필요가 있다. 이 프로토콜은 대안적으로 다양 한 세포 배양 접시 크기에 적용 될 수 있다 (그러나 이러한 프로토콜이11,12의 다른 곳에서 사용 가능 하므로 nscs를 통과 시키기 위한 지침이 포함 되어 있지 않습니다).
-
세포 배양 플레이트의 제조를 위해, 세포 배양 플레이트에 대 한 동결 된 지 하 막 매트릭스 코팅의 1 개의 취 액을 제거 하 고 4°c에서 해 동 할 수 있게 한다 (앨 리 쿠오 트는 세포가 시 딩 되기 전날 밤새 4°c에서 배치 가능). 지 하 멤브레인 매트릭스 코팅 385 µ L을 DMEM/F12 미디어 + 페니실린 streptomycin에 추가 하십시오.
참고: DMEM의 5ml/F12 미디어 + 페니실린-streptomycin은 단일 10cm 접시를 코팅 하기에 충분 합니다 (이 지 하 멤브레인 매트릭스 코팅 용액 1 mL은 6 웰 디쉬를 잘 코팅 하기에 충분 합니다). 대안적으로, 세포가 고정 되 고 면역 염색 되거나 thioflavin을 위해 염색 되는 경우, 유리 커버 상의 배양 세포는 24 웰 배양 접시에 슬립 된다.- 미디어와 매트릭스 코팅을 전 및 배양 접시에 추가 하는 동안 차갑게 유지 합니다. 지 하 막 매트릭스 코팅을 배양 접시에 넣고 요리를 1 시간 동안 인큐베이터 (37 ° c)에 넣습니다. 최적의 코팅을 위해 지 하 막 매트릭스를 1 h 이상 또는 미만으로 배양 하지 마십시오. 1 시간 후, 세포 배양 접시에서 지하실 막 매트릭스 코팅을 흡 기. 이것이 도금 될 준비가 된 것이 NSCs와 일치 하는지 확인 하십시오.
참고: 냉동 주식에서 세포를 해 동 하지 않는 경우, 3.2 단계를 건너 뛰고 단계 3.3.
- 미디어와 매트릭스 코팅을 전 및 배양 접시에 추가 하는 동안 차갑게 유지 합니다. 지 하 막 매트릭스 코팅을 배양 접시에 넣고 요리를 1 시간 동안 인큐베이터 (37 ° c)에 넣습니다. 최적의 코팅을 위해 지 하 막 매트릭스를 1 h 이상 또는 미만으로 배양 하지 마십시오. 1 시간 후, 세포 배양 접시에서 지하실 막 매트릭스 코팅을 흡 기. 이것이 도금 될 준비가 된 것이 NSCs와 일치 하는지 확인 하십시오.
- 세포가 동결 된 NSC 주식에서 해 동 되는 경우, 동결 된 세포의 유리병을 취하고 물에서 바이 알을 앞뒤로 이동 하 여 37 ° c로가 열 된 수조에 따뜻하게 합니다. 동결 해제 되 면, 바이 알을 70% 에탄올로 분무 하 여 세포 배양 후드에 넣습니다. 세포를 DMEM의 10 mL/F12 + 페니실린 streptomycin 매체에 전달 하 고 실 온에서 5 분 동안 1000 x g 의 튜브를 원심 분리 합니다. 미디어를 흡 인 하 고 NSC 매체에 있는 세포를 소생 시킵니다.
- 사용 되 고 있는 세포 배양 용기에 대 한 적절 한 시 딩 밀도를 얻기 위해 NSC 배지에서 세포를 희석 한다.
참고: 예를 들어, NSCs가 6 웰 플레이트에 도금 되는 경우-6 웰 배양 접시에 한 웰은 9 cm2-90만의 표면적을 가지 며 종자에는 135만 세포가 필요 하다. 따라서, 100만 세포를 함유 하는 1 개의 바이 알은 2 mL의 배지로 재현 탁 수 있으며 6 웰 디쉬의 단일 웰에 첨가 된다. - 지 하 멤브레인 매트릭스 코팅 배양 접시 (10만 셀/cm2)를 종자로 NSC 미디어에 부유 하는 충분 한 세포를 추가 하 고 매일 미디어를 변경 (냉동 재고를 사용 하는 경우, 그 이후 매일 도금 후 하루에 미디어를 변경). 80%의 confluent가 될 때까지 세포를 성장.
참고: 이 세포는 도금 직후에는 80%의 합류에 도달 하 게 될 것 이지만 냉동 주가 사용 되는 경우 더 오래 걸릴 수 있습니다. - 일단 NSCs가 75%-80% confluent가 되 면 NSC (+) bFGF 매체를 제거 하 고 NSC (-) bFGF 매체로 교체 하 여 뉴런 분화를 시작 합니다. 적어도 4 주 동안이 미디어의 세포를 배양 하 여 (매일 미디어 교체).
참고: 세포는 bFGF의 철수 후에 며칠 동안 계속 해 서 나눌 것입니다; 따라서 세포는 90-100% 합류에 도달 할 수 있습니다. 4 주 동안 배양 한 후, 세포는 신경 운명을 달성 하 고 렌 티 바이러스의 치료를 위한 준비가 될 것입니다.
4. 신경 배양 물의 형질 도입 및 유지
- 렌 티 바이러스를 사용 하 여 뉴런을 트랜스 코딩 하려면 역가 3.4 x 10 의 변환 가능한 장치/셀 (100% confluent 10 cm 접시에는 ~ 1000만의 뉴런이 포함 됩니다). 세포 배양 배지에서 필요한 농도로 생산 가능한 단위를 희석 하 여 세포에 추가 합니다 (세포 배양 접시에는 정상적인 분량의 배지 사용). 렌 티 바이러스를 첨가 한 후 이틀 후, 신선한 (-) bFGF 배지 (렌 티 바이러스 없이)로 1x 세포를 세척 하 고 평소와 같이 (-) bFGF 배지에서 계속 배양 합니다.
- 렌 티 바이러스 치료를 위해, 세포 배양 배지를 변경 하 여 형질 도입 뉴런을 먹이 ([-] bFGF 미디어) 매일. 형질 도입 후 8 주 동안 세포를 유지 한다. 생존을 보장 하기 위해 정기적으로 빛 현미경으로 세포를 시각화.
참고: 스파스 또는 수지상 파손은 세포가 더 이상 실행 가능 하지 않다는 징후입니다.
5. 세포의 이미징
-
살아있는 세포 화상 진 찰
- 형질 도입 후 (렌 티 바이러스의 첨가 후 4 일째), 살아있는 세포 이미징이 가능한 형광 현미경 하에서 YFP 신호를 관찰 한다. 배양 기에서 세포 배양 접시를 꺼내 배양 접시의 상단에 뚜껑을 유지 하 여 문화 우물이 살 균 남아 있는지 확인 합니다. ~ 514 nm의 여기 파장의 10 배 목표와 ~ 527 nm의 방출 필터를 사용 하 여 셀을 시각화 합니다.
참고: 집계는 일반적으로 형질 도입 세포 배양 물에서 렌 티 바이러스의 적용 후에 6-8 일에 보입니다.
- 형질 도입 후 (렌 티 바이러스의 첨가 후 4 일째), 살아있는 세포 이미징이 가능한 형광 현미경 하에서 YFP 신호를 관찰 한다. 배양 기에서 세포 배양 접시를 꺼내 배양 접시의 상단에 뚜껑을 유지 하 여 문화 우물이 살 균 남아 있는지 확인 합니다. ~ 514 nm의 여기 파장의 10 배 목표와 ~ 527 nm의 방출 필터를 사용 하 여 셀을 시각화 합니다.
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고정 세포 염색 (β-투 불 린 III 라벨링 및 thioflavin 염색)
- 파라 포름알데히드 (PFA)의 세포를 고정 하기 위해 유리 커버 슬립에서 자란 형질 도입 뉴런에서 배양 배지를 제거 합니다. PBS로 1x 셀을 세척 하 고 세척을 제거 하 고 µ의 4% PFA (24 웰 플레이트를 사용 하는 경우)를 실내 온도에서 20 분 동안 커버 슬립으로 300~500mb를 추가 하십시오. PFA를 제거 하 고 커버를 PBS로 2 배로 씻으십시오.
- PBS, 3% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 및 0.3% 트리톤 X-100으로 구성 된 블로킹 용액을 제조 하였다. 용액의 300 ~ 500 µ L을 웰에 추가 하 고, 4°c에서 2 시간 동안 커버 슬립을 배양 한다. 2 시간 후, 차단 용액에 1 차 항 체 (1:500의 항 체 농도에서)를 희석 하 고 각 웰에 1 차 항 체 용액을 300 ~ 500 µ L을 첨가 한다. 4 ° c에서 밤새 흔들 또는 회전 플랫폼 (저속)에 플레이트를 놓습니다.
- 다음날, 1 차 항 체 용액을 제거 하 고 각 PBS로 5 분 동안 커버 슬립 3을 세척 한다. 블로킹 완충 용액에 2 차 항 체를 희석 (1:1000의 농도로) 하 고 각각의 웰에 2 차 항 체 용액을 첨가 한다. YFP 신호와 겹치지 않는 형광 태그를 사용 하 여 적절 한 2 차 항 체를 선택 합니다 (예: CY-3). 흔들 또는 회전 플랫폼에서 2 시간 동안 실 온에서 세포를 배양 합니다. 2 시간 후, 이차 항 체 용액을 제거 하 고 각 PBS로 10 분 동안 커버 슬립 3을 세척 한다.
- 이중 탈 이온 수 (DDW)의 커버 슬립을 10 분간 세척 합니다. DDW를 제거 하 고 10 분 동안 50% 에탄올에 0.015% thioflavin 희석 한 300 µ를 추가 합니다. thioflavin 용액을 제거 하 고 4 분 동안 각각 50% 에탄올을 가진 커버 슬립 2 배를 세척 한 후 4 분 30% 에탄올로 세척 하 고 각각 30% 에탄올로 5 분 동안 두 번 세척 합니다. 마운팅 전에 DDW로 커버 슬립을 1x로 씻으십시오.
참고: 5.2.4 단계에서 설명 된 thioflavin 염색은 선택 사항입니다. - 커버 슬립을 유리 슬라이드에 장착 하려면 유리 슬라이드의 "+" 측면에 하나의 마운팅 미디어를 놓습니다. 유리 커버 슬립이 포함 된 우물에서 모든 액체를 제거 하 고 미세한 집게를 사용 하 여 유리 커버 슬립을 조심 스럽게 제거 하 고 배양 된 세포가 있는 쪽을 추적 합니다.
- 커버 슬립의 가장자리를 키 지움에 살짝 눌러 여분의 수 분을 제거 하십시오. 여전히 커버 슬립을 미세 집게로 파지 하 고 커버 슬립의 가장자리 (장착 용지 방울을 향하게 하 여 셀 쪽)를 장착 매체에 터치 한 다음 장착 용지에 커버 슬립을 부드럽게 배치 합니다 (배양 된 셀을 장착 커버와 글래스 슬라이드 사이에 두고 양측). 이미징 하기 전에 마운팅 미디어가 30 분 동안 강화 되도록 하십시오. 슬라이드는 추후 사용을 위해-20°c에 보관할 수 있습니다.
- 형광 현미경을 이용 하 여 세포를 이미지 하 고 적절 한 여기/방출 스펙트럼 (yfp = ~ 514/527 nm, CY-thioflavin = 555/568 ~ 390/426 nm).
6. 선택적 방법
- 2 일 마다 배양 물에서 컨디셔닝 된 배지를 수집 하 고 배양에 의해 방출 된 타우 종의 미래 분석을 위해-20°c에 보관 하십시오.
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Representative Results
형질 도입 뉴런은 형광을 YFP로 태깅 하였으며, RDLM-형질 도입 배양은 형질 도입 후 응집 체를 표시 하였다. 이러한 개재 물은 thioflavin을 위해 긍정적으로 염색 되었습니다 (그림 1). 그림 1 에서 알 수 있듯이이 프로토콜은 thioflavin 타우 응집 물을 표시 하는 뉴런 문화를 생성 합니다. 초기 실험의 경우, 신경 세포 분화는 배양 물에서 뉴런 특이 적 마커 β-투 불 린 III를 면역 표지 하 여 확인 하는 것이 좋습니다. 중요 하 게는, 형광으로 태그 된 이차 항 체는 YPF (Cy3 예를 들어)와 겹치지 않는 흥분/방출 스펙트럼을 가져야 합니다. 황색 형광 타우 응집 체는 염색의 부재에서 볼 수 있지만, thioflavin 또한 형광 신호가 타우 및 세포 잔해가 아니라 응집 되어 있음을 확인 하기 위해 이미징에 사용 되어야 한다. 추가적으로, 도 1 에 있어서의 예는 dapi가 thioflavin의 것과 중첩 하는 것으로 서의 여기/방출로 서 세포 핵을 라벨링 하기 위한 dapi 염색을 포함 하지 않는다; 원한다 면 대체 핵 얼룩은 thioflavin와 함께 사용 해야 합니다.
그림 1: 형질 도입 문화의 Thioflavin 염색 타우-RDLM-YFP 렌 티 바이러스와 형질 도입 뉴런은 신경 특이 적 마커 β-투 부 린 III (red)로 고정 및 면역 표지 되었다. 추가적으로, 타우 응집 체 (녹색의 YFP 신호)는 thioflavin (청색)을 위해 염색 되었다. 축척 막대 = 25 µm 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은은-얼룩 양성 응집 체 및 thioflavin 양성 신경 섬유의 엉 킴 (NFTs)을 전시 하는 인간 타우 병의 시험관 내 모델의 생성을 설명 합니다. 더욱이, 형질 도입 세포는 형태학 적 결함, 감소 된 synaptogenesis 및 증가 된 리소 소 부피와 같은 타우-유발 병 리를 표시 한다. 이 프로토콜의 주요 이점은 타우 독성의 분석 뿐만 아니라 약물 스크리닝 연구에 사용 될 수 있는 신경 병 증의 접근 및 비용 효율적인 모델을 제공 한다는 것입니다. 이 모델은 인체 타우 병 세포 주를 아직 널리 사용할 수 없고 마우스 유래 뉴런에서 형질 전환 타우를 사용 하 여 동물 사육이 필요 하 고 신경 세포의 차이로 인해 신경 변성 연구에 필요한 물질을 채 웁 니다. 종 사이의 특성.
위에 나열 된 것 외에도이 절차를 성공적으로 수행 하려면 여러 가지 중요 한 단계가 있습니다. 먼저, 바이러스 성 역가가 너무 낮으면 문화가 응집을 형성 하지 않기 때문에 올바른 바이러스 성 역가가 사용 되는지 확인 하십시오. 둘째, NSC 배양이 적절 하 게 유지 되는지 확인 하 고 합류를 ~ 80% 초과 하지 마십시오. NSCs의 자라 난은 조기 분화를 일으킬 것입니다. 마지막으로, 뉴런 배양 물이 NSCs 로부터 bFGF 배지를 인출 한 후 분화 할 수 있도록 4 주 동안 기다립니다. 이 기간은 뉴런의 성숙을 보장 하는 데 필요한.
위에서 설명한 절차는 시험관 내 동종 요법 모델을 생산 하는 효율적인 방법 이지만,이 프로토콜과 관련 된 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 먼저, 앞서 설명한 바와 같이,이 방법은 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 뉴런에서 NFTs를 생성 하지만 쥐 배아 (E18) 유래 뉴런에서는 아니다. 인간 뉴런에 사용 된 것 보다 쥐 뉴런을 트랜스 두 하는 3 배 이상의 바이러스를 사용한 후에도, 설치류 세포 배양 물은 thioflavin 염색을 위해 부정적으로 남아 있었고,이는이 방법이 설치류 배양에 적응 될 수 없다는 것을 시사 한다. 형질 도입 마우스 세포와 인간 뉴런의 차이는 응집 (13)을 향한 인간 타우의 증가 된 성향 때문일 수 있다. 이 절차의 두번째 제한은 타우 응집 체가 배양 물에서 형성 되기는 하지만, 타우-형질 도입 세포와 타우-Wt-형질 도입 배양 간의 타우 인 산화 변화는 단백질 PHF-1을 사용 하 여 감지할 수 없었다 (타우 ser 404) 및 CP13 항 체 (인 산화 된 202에서 타우 인 산화 된를 검출). 이러한 연구 결과는 P301L 및 V337M에의 한 타우-RDLM-YFP 배양에서의 타우 응집이 인 산화, 또는 면역에 의해 검출 가능한 수준 하에 내 인 성 타우 인 산화의 수준과 무관 한 메커니즘을 수반 한다는 것을 시사 한다. 때문에 CP13의 차이의 부족 및 타우-RDLM-YFP와 타우-Wt-예를 들어,이 모델의 경우,이 모델이 병 리에 대 한 타우 키나 제/인산 염 활성의 효과를 분석 하는 연구에 유용 할 것 인지 여부는 불분명 하다. 그러나, phf-1 및 CP13 항 체 모두는 반복 도메인의 외부 영역을 인식 하 여 돌연변이를 품고; 따라서, 다양 한 타우 인 산화 사이트에 대해 제기 된 추가 항 체는 향후 연구에 유용할 수 있다.
세포 배양 분석 외에도,이 모델은 세포 배양 패러다임을 넘어 연구를 위한 중요 한 도구가 될 수 있다. 예를 들면, 형질 도입 세포의 매체에서 고립 된 엑 소 솜은 유독한 타우 종을 포함 합니다. 엑 소 솜은 거의 모든 세포 유형에 서 방출 되는 작은 분 비 소포이 고, 외 염색체는 타우 전파14에 연루 되어 있다. Tau-RDLM 신경 외 상 염색체는 웨스턴 블랏에 의해 검출 되는인간 tau를 포함 하 고,이 외 각은 순진한 마우스 두뇌에 있는 타우 개재 물을 생성 하기에 충분 합니다. 이들 개재 물은 인간 타우 (K9JA)에 특이 적인 항 체에 대 한 면역 활성 이지만, 개재 물이 집계 된 마우스 타우를 포함 하는지는 불분명 하다. 이 과정에서 설명 하는 절차는 설치류 뉴런에서 thioflavin 염색 응집 체를 생성 하지 않는다는 것을 시사 하며, 마우스 뇌에서 관찰 되는 개재 물이 전적으로 인간 타우로 구성 되어 있다고 제안 하지만, 향후 연구가 확인을 요구 하는 것은 생체 내 침전 물의 조성 물.
Tauopathies에서 엑 소 좀 유래 타우의 명백한 역할을 감안할 때, 여기에 설명 된 모델은 타우-유도 신경 변성을 중재 하는 엑 소 좀의 역할을 검사 하는데 유용한 자원이 될 수 있다. 결론적으로,이 절차는 형질 전환 마우스 뉴런 시스템에 비해 상당한 이점이 있고 다양 한 전 임상 분석을 위해 채택 될 수 있는 인간 타우 병의 시험관 내 모델을 생성 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 PHF-1과 CP13 항 체를 공급 하 고, 사우스 웨스턴 텍사스 대학교에서 마크 다이아몬드 박사를 제공 하 고, 타우의 구조를 제공할 수 있는 피터 데이비스 박사에 게 감사를 드립니다. 이 작품은 알 츠 하이 머 협회에서 보조금에 의해 지원 되었다 (니 렝-14-322164) S.H.Y. 및 재생 의학에 대 한 캘리포니아 연구소에서 (TB1-01193) P.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm culture dishes | Thermofisher | 12556002 | |
| 15 mL tubes | Biopioneer | CNT-15 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermofisher | 50-980-487 | |
| 24 well culture plates | Thermofisher | 930186 | |
| 50 mL tubes | Biopioneer | CNT-50 | |
| 70% ethanol in spray bottle | Various sources | NA | |
| B27 supplement | Thermofisher | 17504044 | |
| Basement membrane matrix (Matrigel) | Corning | 356231 | |
| Basic FGF | Biopioneer | HRP-0011 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| Cell culture incubator | Various sources | NA | |
| Centrifuge | Various sources | NA | |
| DMEM-F12 culture media with glutamine | Thermofisher | 10565042 | |
| Ethanol (50% concentration or higher) | Various sources | NA | |
| Flourescently labeled secondary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
| Fluorescent microscope | Various sources | NA | |
| Glass coverslips | Thermofisher | 1254581 | |
| Glass slides | Thermofisher | 12-550-15 | |
| Human neural stem cells | Various sources | NA | |
| Lentiviral vectors | Various sources | custom order | |
| Mounting media | Thermofisher | P36934 | |
| N2 supplement | Thermofisher | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline | Thermofisher | 14190250 | |
| Primary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
| Rocking or rotating platform | Various sources | NA | |
| Sterile cell culture hood | Various sources | NA | |
| Thioflavin S | Sigma | T1892-25G | |
| Triton X-100 | Thermofisher | BP151-100 | |
| Water bath | Various sources | NA |
References
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- Kadavath, H., et al. Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).
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