Summary
Detta protokoll specificerar ett förfarande där mänskliga neuronala kulturer är transducerade med lentiviral konstruktioner kodning för muterade mänskliga Tau. Transduced kulturer visar Tau aggregat och tillhör ande patologier.
Abstract
Aberrant agg regering av proteinet Tau är patogeniskt involverad i ett antal neurodegenerativa sjukdomar, inklusive Alzheimers sjukdom (AD). Även mus modeller av tauopati har gett en värdefull resurs för att undersöka de neurotoxiska mekanismerna för aggregerade Tau, det blir alltmer uppenbart att, på grund av skillnader mellan arterna i neurofysiologi, mus hjärnan är olämplig för modellering av människans tillstånd. Framsteg inom cell odlings metoder har gjort humana neuronala kulturer tillgängliga för experimentell användning in vitro och har hjälpt till med utvecklingen av neurotherapeutics. Men trots anpassningen av mänskliga neuronala cell kulturer, in vitro-modeller av mänsklig tauopati är ännu inte allmänt tillgängliga. Detta protokoll beskriver en cellulär modell av Tau agg regering där mänskliga nerv celler är transducerade med lentiviral-derived vektorer som kod för patogent muterade Tau smält till en gul fluorescerande protein (YFP) reporter. Transduced kulturer producerar Tau aggregat som fläcken positivt för tioflavin och Visa markörer för neurotoxicitet, såsom minskad axonal längd och ökad lysosomala volym. Detta förfarande kan vara en användbar och kostnads effektiv modell för att studera mänskliga tauopatier.
Introduction
Patologisk agg regering av det mikrotubuliassocierade proteinet Tau är ett utmärkande drag för många neurodegenerativa sjukdomar, inklusive AD, frontotemporallobsdemens DEMENS (FTD), Pick ' s disease, och Progressiv Supranukleär Pares (PSP)1. I ett nondiseased tillstånd binder Tau till och stabiliserar mikrotubulefilament i neuronala axoner2. Emellertid, sjukdomsassocierad hyperfosforylering av Tau främjar Tau aggregation, dissociation från Mikrotubuli, och neuronala toxicitet3. De toxiska effekterna av aggregerade Tau kan innebära avvikande aktivering av kolinerga4 och glutamatergic receptorer5 resulterar i Dysreglering av intracellulära kalcium och, så småningom, celldöd. I djur modeller förbättrar minskningen av hjärnan Tau patologi i AD-möss6 och i mus modeller av repetitiva mild traumatisk hjärn skada7.
Montering bevis visar att strukturen och bindningsaffinitet av mus-härledda Tau skiljer sig från mänskligt framställda Tau och att musen Tau är olämpligt för modellering mänskliga tauopatier8. Emellertid, mänskliga celler tauopati modeller är inte allmänt kommersiellt tillgängliga. Det övergripande målet med detta arbete är att beskriva en in vitro-modell av Tau agg regering där mänskliga nerv celler är transducerade med lentiviral-härledda vektorer som innehåller muterade mänskliga Tau konstruktioner9. Tau aggregat orsakar lentiviral konstruktioner kodar för Tau upprepa domän hyser P301L och V337M mutationer smält till en yfp reporter (Tau-rdlm-yfp) medan kontroll konstruerar kod för Wild-Type (WT) Tau upprepa domän smält till en yfp reporter (Tau-WT-yfp). Neuronala kulturer transducerade med denna metod uttrycka cirka nio gånger mer Tau än icke-transducerade kulturer. Även om mängden Tau uttryck överuttrycks är ungefär lika mellan Tau-RDLM-YFP-och Tau-WT-YFP-transducerade celler, endast neuroner transducerade med Tau-RDLM-YFP Visa aggregat. Kulturer transducerade med Tau-RDLM-YFP fläcken positivt för thioflavin och Visa minskningar i axonal längd och synaptisk densitet. Därför kan denna cellulära modell vara ett användbart verktyg för att studera Tau aggregation in vitro-.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av media och reagenser
- Tina källaren membran matris beläggning för kultur tallrikar vid 4 ° c (Låt inte källaren membranet matris för att värma upp eller det kommer att stelna). Gör 1 mL Ali kvoter och förvara dem vid-20 ° c eller-70 ° c.
- Bered grundläggande fibroblasttillväxtfaktor (bFGF) i steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid 10 μg/mL och gör 10 μL Ali kvoter. Förvara dem vid 4 ° c.
- Till en ny, oöppnad, 500 mL flaska DMEM/F12 med glutamin, tillsätt B27 (10 mL), N2 (5 mL), och penicillin-streptomycin (5 mL). Placera 50 mL av detta neurala stamceller (NSC) i ett koniskt rör och tillsätt 10 μL 10 μg/μL (2 μg/mL slutlig) bFGF. Förvara NSC (+) bFGF-mediet vid 4 ° c.
- För att göra (-) bFGF media, Använd samma recept som beskrivs i steg 1,3 men inte lägga till bFGF. Denna media kommer att användas för att differentiera NSCs till nerv celler och för att upprätthålla neuronala kulturer efter differentiering.
2. lentiviral konstruktioner
Anmärkning: Innan du börjar arbeta med lentivirala konstruktioner, se till att labbet har godkänts för att använda biosäkerhet nivå-2 (BSL-2) agenter. Dessutom måste BSL-2 kultur kåpor, personlig skyddsutrustning (PPE) och bortskaffningsmetoder användas vid arbete med lentivirala vektorer.
- Få Tau konstruktioner förpackade i lentivirus från en föredragen källa (se Sanders et al.10 för konstruera information).
3. odling av mänskliga neurala stamceller
Anmärkning: NSCs är vanligt vis seedade på 100000 – 150000 celler/cm2 och de flesta kommersiellt tillgängliga nscs säljs som 1 x 106 celler/flaska. Detta protokoll har optimerats för 10 cm cell kultur rätter (även om andra storlekar av rätter kan användas); Därför, om kommersiellt tillgängliga NSCs används, kan NSCs behöva utökas genom att först odlas i sex väl rätter för att resultera i tillräckligt med celler till utsäde 10 cm rätter. Detta protokoll kan alternativt anpassas för en mängd olika cell kulturer mat rätter (men det innehåller inte instruktioner för passaging nscs eftersom dessa protokoll är tillgängliga någon annan stans11,12).
-
För beredning av cell odlings plattor, ta bort en alikvot av frysta källare membran matris beläggning för cell odlings plattor och låt den Tina vid 4 ° c (Ali kvoter kan placeras vid 4 ° c över natten dagen innan cellerna ska seedas). Tillsätt 385 μL av källaren membran Matrix beläggning till 5 mL DMEM/F12 Media + penicillin-streptomycin.
Obs: 5 ml DMEM/F12 Media + penicillin-streptomycin är tillräckligt för att belägga en enda 10 cm mat rätt (1 ml av denna källare membran Matrix beläggning lösning är tillräckligt för att belägga en brunn av en sex-väl skålen). Alternativt, om cellerna skall vara fast och immunofärgade, eller färgas för tioflavin, kultur celler på glas täckglasen i 24-well kultur rätter.- Håll media och Matrix beläggning kallt före och samtidigt lägga dem till kulturen rätter. Tillsätt källaren membran Matrix beläggning till kultur rätter och placera rätter i en inkubator (vid 37 ° c) för 1 h. För optimal beläggning, Inkubera inte källaren membran matris för mer än eller mindre än 1 h. Efter 1 h, aspirera källaren membran matris beläggning från cell kulturer rätter. Se till att detta sammanfaller med NSCs är redo att vara klädd.
Anmärkning: Om cellerna inte Tinas från frysta bestånd, hoppa över steg 3,2 och fortsätt med steg 3,3.
- Håll media och Matrix beläggning kallt före och samtidigt lägga dem till kulturen rätter. Tillsätt källaren membran Matrix beläggning till kultur rätter och placera rätter i en inkubator (vid 37 ° c) för 1 h. För optimal beläggning, Inkubera inte källaren membran matris för mer än eller mindre än 1 h. Efter 1 h, aspirera källaren membran matris beläggning från cell kulturer rätter. Se till att detta sammanfaller med NSCs är redo att vara klädd.
- Om cellerna Tinas från frysta NSC bestånd, ta en flaska med frysta celler och värma den i ett vatten bad uppvärmt till 37 ° c genom att flytta injektions flaskan fram och tillbaka i vattnet. När tinat, spraya flaskan med 70% etanol och placera den i en cell kultur huva. Överför cellerna till ~ 10 mL DMEM/F12 + penicillin-streptomycin media och centrifugera röret vid rums temperatur vid 1 000 x g i 5 min. aspirera mediet och omsuspendera cellerna i NSC media.
- Späd cellerna i NSC-mediet för att få lämplig sådd densitet för det cell odlings kärl som används.
Anmärkning: Till exempel, om NSCs är att vara klädd på en sex-brunn tallrik-en väl på en sex-väl kultur rätt har en yta på 9 cm2-900 000 till 1 350 000 celler krävs för att utsäde. Så, en flaska som innehåller 1 000 000 celler kan resuspenderas i 2 mL av media och läggas till en enda brunn av en sex-väl skålen. - Lägg tillräckligt celler suspenderade i NSC media till utsäde källaren membran matris-belagda kulturen rätter (100 000 celler/cm2) och ändra Media varannan dag (om du använder en fryst lager, ändra Media dagen efter plätering och varannan dag därefter). Odla cellerna tills de är 75% – 80% konflytande.
Anmärkning: Cellerna kommer sannolikt att nå 75% – 80% sammanflödet kort efter plätering, men detta kan ta längre tid om frysta bestånd används. - När NSCs är 75%-80% confluent, börja neuronala differentiering genom att ta bort NSC (+) bFGF media och ersätta den med NSC (-) bFGF media. Kultur cellerna i detta medium (ersätter Media varannan dag) i minst 4 veckor.
Anmärkning: Cellerna kommer att fortsätta att dela sig under några dagar efter utsättning av bFGF; Därför kan cellerna nå 90 – 100% sammanflöde. Efter odling i 4 veckor, cellerna kommer att ha uppnått en neuronala öde och kommer att vara redo för behandling av lentivirus.
4. transduktion och underhåll av neuronala kulturer
- Att omvandlar nerv celler med lentivirus, använda en titer greve av 3,4 x 105 transducerbara enheter/cell (en 100% konfluenta 10 cm skålen kommer att innehålla ~ 10 000 000 neuroner). Späd de transducerbara enheterna till den nödvändiga koncentrationen i cell odlings mediet och tillsätt dem till cellerna (Använd den normala medie volymen för cell odlings skålen). Två dagar efter tillsats av lentivirus, tvätta cellerna 1x med färska (-) bFGF media (utan lentivirus) och fortsätta odling i (-) bFGF media som vanligt.
- För post-lentiviral behandling, mata transducerade nerv celler genom att ändra cell odlings mediet ([-] bFGF Media) varannan dag. Underhålla cellerna för ~ 8 veckor efter transduktion. Visualisera regelbundet cellerna under ett lätt Mikroskop för att säkerställa lönsamheten.
Anmärkning: Glesa eller dendritiska brytskador är tecken på att cellerna inte längre är livskraftiga.
5. avbildning av celler
-
Livecell-avbildning
- Efter transduktion (4 dagar efter tillsats av lentivirus), Observera YFP-signaler under ett fluorescerande Mikroskop som kan leva-cell Imaging. Ta cell kultur rätter ur inkubator och se till att kulturbrunnar förblir sterila genom att hålla locket ovanpå kulturen rätter. Visualisera cellerna med en 10x mål med en excitation våglängd av ~ 514 nm och ett emissions filter på ~ 527 nm.
Anmärkning: Aggregat är vanligt vis synliga i transducerade cell kulturer 6 – 8 dagar efter applicering av lentivirus.
- Efter transduktion (4 dagar efter tillsats av lentivirus), Observera YFP-signaler under ett fluorescerande Mikroskop som kan leva-cell Imaging. Ta cell kultur rätter ur inkubator och se till att kulturbrunnar förblir sterila genom att hålla locket ovanpå kulturen rätter. Visualisera cellerna med en 10x mål med en excitation våglängd av ~ 514 nm och ett emissions filter på ~ 527 nm.
-
Fast-cell färgning (β-tubulin III märkning och tioflavin färgning)
- För att fixera cellerna i paraformaldehyd (PFA), ta bort odlings mediet från omvandlade neuroner som odlas på täckglas. Tvätta cellerna 1x med PBS, ta bort tvätten och tillsätt 300 – 500 μL (om du använder 24-well-plattor) på 4% PFA (utspätt i PBS) till täckglasen i 20 min vid rums temperatur. Ta bort PFA och tvätta täckglasen 2x med PBS.
- Bered en blockerande lösning bestående av PBS, 3% bovint serumalbumin (BSA) och 0,3% Triton X-100. Tillsätt 300 – 500 μL av lösningen i brunnarna och inkubera täckglasen i 2 h vid 4 ° c. Efter 2 timmar, späd primära anti kroppar (vid en anti kropps koncentration på 1:500) i blockerande lösning och tillsätt 300 – 500 μL primär anti kropps lösning till varje brunn. Placera plattan på en gungande eller roterande plattform (vid låg hastighet) över natten vid 4 ° c.
- Nästa dag, ta bort den primära anti kropps lösningen och tvätta täckglasen 3x för 5 min vardera med PBS. Späd sekundära anti kroppar i en blockerande buffertlösning (vid en koncentration på 1:1000) och tillsätt sekundär anti kropps lösning till varje brunn. Välj lämplig sekundär anti kropp genom att använda en fluorescerande tagg som inte överlappar med YFP-signalen (t. ex. CY-3). Inkubera cellerna i rums temperatur i 2 timmar på en gungande eller roterande plattform. Efter 2 timmar, ta bort den sekundära anti kropps lösningen och tvätta täckglasen 3x i 10 min vardera med PBS.
- Tvätta täckglasen i dubbelavjoniserat vatten (DDW) i 10 min. ta bort DDW och tillsätt 300 μL/brunn av 0,015% tioflavin-S utspädd i 50% etanol i 10 min. ta bort tioflavin-lösningen och tvätta täckglasen 2x för 4 min vardera med 50% etanol, följt av en 4 min Tvätta med 30% etanol och två tvättar i 5 min vardera med 30% etanol. Tvätta täckglasen 1x med DDW före montering.
Anmärkning: Den tioflavin färgning som beskrivs i steg 5.2.4 är frivilligt. - Montera täckglasen på glas rutsch banorna genom att placera en enda droppe monterings material på "+"-sidan av en glas bild. Ta bort all vätska från brunnen som innehåller glas täckglaset och, med hjälp av fina pincett, försiktigt bort glas täckglasen, hålla reda på vilken sida har de odlade cellerna.
- Tryck försiktigt på täckglaskanten mot en Kimwipe för att avlägsna överflödig fukt. Fortfarande gripande täckglasen med fina pincett, rör vid kanten (med cell sidan vänd mot droppe av monterings material) av täckglasen till monterings mediet, och sedan försiktigt placera täckglasen på monterings mediet (placera de odlade cellerna i monteringen och sandwicherar dem mellan täckglasen och glas glaset). Låt monterings mediet härda i 30 minuter före bild tagning. Bilderna kan förvaras vid-20 ° c för framtida bruk.
- Bild cellerna med hjälp av ett fluorescerande Mikroskop och lämpliga excitation/emissions spektra (YFP = ~ 514/527 nm, CY-3 = ~ 555/568 nm, och tioflavin S = ~ 390/426 nm).
6. valfria metoder
- Var 2: a dag, samla konditionerade medier från kulturerna och förvara den vid-20 ° c för framtida analyser av Tau arter som släpps ut av kulturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tau-rdlm-yfp-transduced neuroner var fluorescensmarkerade märkta med yfp, och rdlm-transduced kulturer visas aggregat efter transduktion. Dessa inne slutningar färgade positivt för tioflavin (figur 1). Som figur 1 visar, producerar detta protokoll neuronala kulturer som visar thioflavin-positiva Tau aggregat. För initiala experiment rekommenderas att neuronala differentiering bekräftas av immunolabeling den neuron-specifika markörer β-tubulin III i kulturer. Viktigt, fluorescensmarkerade taggade sekundära anti kroppar bör ha en excitation/emission spektrum som inte överlappar med det av YPF (Cy3, till exempel). Även om gul fluorescerande Tau aggregat kommer att synas i avsaknad av färgning, bör tioflavin också användas för avbildning för att bekräfta att den fluorescerande signalen är aggregerad Tau och inte cellulära skräp. Dessutom innehåller exemplet i figur 1 inte DAPI-färgning för att märka cell kärningarna eftersom excitation/utsläpp av DAPI överlappar med tioflavin-S; alternativa kärnor bör användas med thioflavin-S om så önskas.
Figur 1: Thioflavin färgning av transducerade kulturer. Neuroner transducerade med Tau-RDLM-YFP lentivirus var fast och immunolabeled med neuron-specifik markör β-tubulin III (röd). Dessutom, Tau aggregat (YFP signal i grönt) färgas för tioflavin (blå). Skal streck = 25 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver generering av en in vitro-modell av mänsklig tauopati som uppvisar silver-fläck-positiva aggregat och tioflavin-positiva neurofibrillär trasor (NFTs). Dessutom, transducerade celler visar Tau-inducerad patologier såsom morfologiska defekter, minskad synaptogenes, och en ökad lysosomala volym. Den största fördelen med detta protokoll är att det ger en tillgänglig och kostnads effektiv modell av neuronala tauopati, som kan användas för drog screening studier, samt för analys av Tau toxicitet. Denna modell fyller ett material behov i neurodegenerativa forskning som mänskliga tauopati cellinjer är ännu inte allmänt tillgängliga och användningen av transgena Tau från mus-härledda nerv celler kräver djur uppfödning och är begränsad på grund av skillnader i neuronala egenskaper mellan arterna.
Utöver de som anges ovan finns det ett antal kritiska steg för att lyckas med detta förfarande. Först, se till att rätt viral titer används för om viral titer är för låg, kulturer kommer inte att bilda aggregat. För det andra, se till att NSC kulturer är korrekt underhållna och inte överstiger ~ 80% sammanflödet. Överväxt av de nationella kontakt punkterna kommer att orsaka för tidig differentiering. Sist, vänta en hel 4 veckor för neuronala kulturer att differentiera efter uttag av bFGF media från NSCs. Denna varaktighet är nödvändig för att säkerställa mognads lagring av nerv celler.
Även om det förfarande som beskrivs ovan är en effektiv metod för att producera en in vitro-modell tauopati, det finns vissa begränsningar i samband med detta protokoll. Först, som beskrivits tidigare, producerar denna metod NFTs i humana inducerade pluripotenta stamceller-derived neuroner men inte i råtta embryonala (E18)-härledda nerv celler. Även efter att ha använt tre gånger mer virus för att omvandlar råtta neuroner än användes för mänskliga nerv celler, gnagare cell kulturer förblev negativ för tioflavin färgning, vilket tyder på att denna metod inte kan anpassas för gnagare kulturer. Skillnaderna mellan transducerade mus celler och mänskliga nerv celler kan bero på den ökade benägenheten av mänskliga Tau mot agg regering13. Den andra begränsningen av detta förfarande är att även om Tau aggregat bildas i kulturer, förändringar i Tau fosforylering mellan Tau-RDLM-transduced celler och Tau-WT-YFP-transduced kulturer var omöjlig att upptäcka med protein PHF-1 (som detekterar Tau fosforyleras i ser 396/ser 404) och CP13-antikroppar (som detekterar Tau-fosforylerat i ser 202). Dessa fynd tyder på att Tau agg regering i Tau-RDLM-YFP kulturer på grund av P301L och V337M innebär en mekanism som är oberoende av hyperfosforylering, eller nivån av endogena Tau fosforylering är under detekterbara nivå av immunoblot. På grund av bristen på skillnader i PHF-1 och CP13 immunoreaktivitet mellan Tau-rdlm-yfp och Tau-WT-yfp kulturer, är det oklart huruvida denna modell skulle vara användbart för studier som analyserar effekterna av Tau Kinas/fosfatas aktivitet på patologi. Emellertid, både PHF-1 och CP13 anti kroppar erkänner regioner utanför upprepa domän hyser mutationer; Därför kan ytterligare anti kroppar som tas upp mot olika Tau-fosforylationssorter vara användbara för framtida studier.
Förutom cell kultur analyser, kan denna modell vara ett värdefullt verktyg för studier bortom cell kultur paradigmet. Till exempel, exosomer isolerade från medierna av transducerade celler innehåller giftiga Tau arter. Exosomer är små sekretoriska vesikler frigörs från nästan varje cell typ, och exosomer har varit inblandad i Tau för ökning14. Tau-RDLM neuronala exosomer innehåller humant Tau som kan upptäckas av Western blot9, och dessa exosomer är tillräckliga för att producera Tau inne slutningar i naiva mus hjärna. Dessa inne slutningar är immunoreaktiva för anti kroppar specifika för humant Tau (K9JA), men det är oklart om inne slutningar inkluderar aggregerade mus Tau. Konstaterandet som beskrivs här att förfarandet inte producerar tioflavin-positiva färgning aggregat i gnagare nerv celler tyder på att inne slutningar observerats i musen hjärnan består helt av mänskliga Tau, även om framtida studier krävs för att bekräfta sammansättningen av in vivo-insättningar.
Med tanke på den uppenbara rollen av exosome-härledda Tau i tauopatier, den modell som beskrivs här kan vara en användbar resurs för att undersöka rollen av exosome i medla Tau-inducerad neurodegeneration. Sammanfattnings vis, detta förfarande ger en in vitro-modell av mänsklig tauopati som har betydande fördelar jämfört med transgena mus neuronala system och kan användas för en mängd olika prekliniska analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr Peter Davies på Albert Einstein College of Medicine för att leverera PHF-1 och CP13 anti kroppar och Dr Marc Diamond vid University of Texas, sydvästra, för att ge Tau konstrukter. Detta arbete stöddes av bidrag från Alzheimer ' s Association (NIRG-14-322164) till S.H.Y. och från California Institute for regenerativ Medicine (TB1-01193) till P.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm culture dishes | Thermofisher | 12556002 | |
| 15 mL tubes | Biopioneer | CNT-15 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermofisher | 50-980-487 | |
| 24 well culture plates | Thermofisher | 930186 | |
| 50 mL tubes | Biopioneer | CNT-50 | |
| 70% ethanol in spray bottle | Various sources | NA | |
| B27 supplement | Thermofisher | 17504044 | |
| Basement membrane matrix (Matrigel) | Corning | 356231 | |
| Basic FGF | Biopioneer | HRP-0011 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| Cell culture incubator | Various sources | NA | |
| Centrifuge | Various sources | NA | |
| DMEM-F12 culture media with glutamine | Thermofisher | 10565042 | |
| Ethanol (50% concentration or higher) | Various sources | NA | |
| Flourescently labeled secondary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
| Fluorescent microscope | Various sources | NA | |
| Glass coverslips | Thermofisher | 1254581 | |
| Glass slides | Thermofisher | 12-550-15 | |
| Human neural stem cells | Various sources | NA | |
| Lentiviral vectors | Various sources | custom order | |
| Mounting media | Thermofisher | P36934 | |
| N2 supplement | Thermofisher | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline | Thermofisher | 14190250 | |
| Primary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
| Rocking or rotating platform | Various sources | NA | |
| Sterile cell culture hood | Various sources | NA | |
| Thioflavin S | Sigma | T1892-25G | |
| Triton X-100 | Thermofisher | BP151-100 | |
| Water bath | Various sources | NA |
References
- Rojas, J. C., Boxer, A. L. Neurodegenerative disease in 2015: Targeting tauopathies for therapeutic translation. Nature Reviews Neurology. 12 (2), 74-76 (2016).
- Kadavath, H., et al. Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).
- Wang, Y., Mandelkow, E. Tau in physiology and pathology. Nature Reviews Neurology. 17 (1), 5-21 (2016).
- Gomez-Ramos, A., et al. Characteristics and consequences of muscarinic receptor activation by tau protein. European Neuropsychopharmacology. 19 (10), 708-717 (2009).
- Warmus, B. A., et al. Tau-mediated NMDA receptor impairment underlies dysfunction of a selectively vulnerable network in a mouse model of frontotemporal dementia. Journal of Neuroscience. 34 (49), 16482-16495 (2014).
- DeVos, S. L., et al. Tau reduction in the presence of amyloid-beta prevents tau pathology and neuronal death in vivo. Brain. 141 (7), 2194-2212 (2018).
- Cheng, J. S., et al. Tau reduction diminishes spatial learning and memory deficits after mild repetitive traumatic brain injury in mice. PLOS ONE. 9 (12), e115765 (2014).
- Ando, K., et al. Accelerated human mutant tau aggregation by knocking out murine tau in a transgenic mouse model. The American Journal of Pathology. 178 (2), 803-816 (2011).
- Reilly, P., et al. Novel human neuronal tau model exhibiting neurofibrillary tangles and transcellular propagation. Neurobiology of Disease. 106, 222-234 (2017).
- Kfoury, N., Holmes, B. B., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. I. Trans-cellular Propagation of Tau Aggregation by Fibrillar Species. The Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19440-19451 (2012).
- Yuan, S. H., et al. Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells. PLOS ONE. 6 (3), e17540 (2011).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Passaging human neural stem cells. Journal of Visualized Experiments. (7), e263 (2007).
- Lathuiliere, A., et al. Motifs in the tau protein that control binding to microtubules and aggregation determine pathological effects. Scientific Reports. 7 (1), 13556 (2017).
- Asai, H., et al. Depletion of microglia and inhibition of exosome synthesis halt tau propagation. Nature Neuroscience. 18 (11), 1584-1593 (2015).
