Summary
Este protocolo detalha um procedimento em que as culturas neuronal humanas são transadas com construções lentivirais que codificam para o Tau humano do mutante. As culturas transadas exibem agregados Tau e patologias associadas.
Abstract
A agregação aberrante da proteína Tau é patogenicamente envolvida em um número de doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer (AD). Embora os modelos de rato de Taupatia forneceram um recurso valioso para investigar os mecanismos neurotóxicos da Tau agregada, está tornando-se cada vez mais aparente que, devido às diferenças do entre espécies na neurofisiologia, o cérebro do rato é inadequado para modelar a condição humana. Os avanços nos métodos de cultura celular tornaram as culturas neuronais humanas acessíveis para uso experimental in vitro e ajudaram no desenvolvimento de neuroterapêutica. No entanto, apesar da adaptação de culturas de células neuronais humanas, in vitro modelos de tauopatia humana ainda não estão amplamente disponíveis. Este protocolo descreve um modelo celular da agregação da Tau em que os neurônios humanos são transfundidos com os vetores lentiviral-derivados esse código para Tau patogenicamente mutado fundido a um repórter amarelo da proteína fluorescente (YFP). Culturas transdoadas produzem agregados Tau que mancham positivamente para a tioflavina e exibem marcadores de neurotoxicidade, tais como diminuição do comprimento axonal e aumento do volume lisossomal. Este procedimento pode ser um modelo útil e rentável para estudar tauopathies humanas.
Introduction
A agregação patológica da proteína Tau microtubule-associada é uma característica definidora de muitas doenças neurodegenerativas, incluindo a AD, a demência frontotemporal (FTD), a doença de pick, e a paralisia supranuclear progressiva (PSP)1. Em um estado não-doente, a Tau liga-se e estabiliza os filamentos de microtúse em axônios neuronais2. No entanto, a hiperfosforilação associada à doença da Tau promove a agregação de Tau, a dissociação dos microtúbulos e a toxicidade neuronal3. Os efeitos tóxicos da Tau agregada podem envolver a ativação aberrante de4 e receptores glutamatérgicos colinérgicos5 resultando na desregulação do cálcio intracelular e, eventualmente, morte celular. Em modelos animais, a redução da Tau cerebral melhora a patologia em camundongos AD6 e em modelos de mouse de lesão cerebral traumática leve repetitiva7.
A evidência da montagem demonstra que a estrutura e a afinidade obrigatória da Tau rato-derivada são distintas da Tau Human-derivada e que o Tau do rato é inadequado para modelar Tauopatias humanos8. Entretanto, os modelos Taupatia da pilha humana não são extensamente disponíveis comercialmente. O objetivo geral deste trabalho é descrever um modelo in vitro de agregação Tau em que os neurônios humanos são transviados com vetores derivados de lentivirais contendo construções de Tau humanas mutantes9. Tau agregado causando lentivirais constrói codifica para o domínio de repetição Tau abrigando P301L e V337M mutações fundidas a um repórter YFP (Tau-rdlm-YFP) enquanto o controle constrói código para o Wild-Type (WT) Tau repetir domínio fundido a um repórter YFP (Tau-WT-YFP). As culturas neuronal transectoadas usando este método expressam aproximadamente nove vezes mais Tau do que culturas nontransemadas. Embora a quantidade de expressão de Tau superexpressa seja aproximadamente igual entre as células Tau-RDLM-YFP-e Tau-WT-YFP-transvadas, apenas os neurônios transvados com agregados de exibição de Tau-RDLM-YFP. As culturas transvadas com Tau-RDLM-YFP mancham positivamente para a tioflavina e apresentam reduções no comprimento axonal e na densidade sináptica. Portanto, este modelo celular pode ser uma ferramenta útil para estudar a agregação de Tau in vitro.
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Protocol
1. preparação de meios de comunicação e reagentes
- Descongelar o revestimento da matriz da membrana do porão para placas da cultura em 4 ° c (não permita que a matriz da membrana do porão aqueça acima ou solidify). Fazer alíquotas de 1 mL e armazená-las a-20 ° c ou-70 ° c.
- Reconstituir o fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF) em soro fisiológico tampão fosfato estéril (PBS) a 10 μg/mL e fazer 10 μL de alíquotas. Guarde-os a 4 ° c.
- Para um novo, não aberto, 500 mL de frasco de DMEM/F12 com glutamina, adicione B27 (10 mL), N2 (5 mL), e penicilina-estreptomicina (5 mL). Coloque 50 mL deste meio de células-tronco neurais (NSC) em um tubo cônico e adicione 10 μL de 10 μg/μL (2 μg/mL final) bFGF. Armazene a mídia NSC (+) bFGF a 4 ° c.
- Para fazer (-) bFGF mídia, use a mesma receita descrita na etapa 1,3, mas não adicionar bFGF. Esta mídia será usada para diferenciar as NSCs para os neurônios e para manter as culturas neuronais após a diferenciação.
2. construções de Lentivirus
Nota: Antes de iniciar o trabalho com construções lentivirais, assegure-se de que o laboratório tenha sido aprovado para usar agentes de nível 2 (BSL-2) de biossegurança. Além disso, as capas de cultura BSL-2, o equipamento de proteção individual (EPI) e os métodos de descarte devem ser usados ao trabalhar com vetores lentivirais.
- Obtenha construções de Tau empacotadas em Lentivirus a partir de uma fonte preferida (ver Sanders et al.10 para informações de construção).
3. cultivando células-tronco neurais humanas
Nota: As NSCs são tipicamente semeadas em 100000 – 150000 células/cm2 e a maioria das NSCS comercialmente disponíveis são vendidas como 1 x 106 células/frasco. Este protocolo foi otimizado para pratos de cultura de células de 10 cm (embora outros tamanhos de pratos podem ser usados); Portanto, se os NSCs disponíveis comercialmente estiverem sendo usados, os NSCs podem precisar ser expandidos pela primeira vez sendo cultivados em pratos de seis poços, a fim de resultar em células suficientes para semear pratos de 10 cm. Este protocolo pode alternativamente ser adaptado para uma variedade de tamanhos do prato da cultura da pilha (mas não contem instruções para de NSCS porque estes protocolos estão disponíveis em outra parte11,12).
-
Para a preparação de placas da cultura da pilha, remova uma alíquota do revestimento congelado da matriz da membrana do porão para placas da cultura da pilha e permita que descongele a 4 ° c (as alíquotas podem ser coloc em 4 ° c durante a noite o dia antes que as pilhas estejam ser semeadas). Adicionar 385 μL de revestimento matricial de membrana basal a 5 mL de Media DMEM/F12 + penicilina-estreptomicina.
Nota: 5 ml de mídia DMEM/F12 + penicilina-estreptomicina é suficiente para revestir um único prato de 10 cm (1 ml desta solução de revestimento de matriz de membrana basal é suficiente para revestir um poço de um prato de seis poços). Alternativamente, se as células devem ser fixas e imunomanchadas, ou manchada para a tioflavina, células de cultura em coberturas de vidro em 24 pratos de cultura bem.- Mantenha os meios de comunicação e a matriz de revestimento frio antes e ao adicioná-los aos pratos de cultura. Adicione o revestimento da matriz da membrana do porão aos pratos da cultura e coloc os pratos em uma incubadora (em 37 ° c) para 1 h. Para o revestimento óptimo, não incubar a matriz da membrana do porão por mais do que ou menos de 1 h. Após 1 h, aspirar o revestimento da matriz da membrana do porão dos pratos das culturas da pilha. Certifique-se que isso coincide com as NSCs estar pronto para ser banhado.
Nota: Se as células não estiverem sendo descongeladas de estoques congelados, pule a etapa 3,2 e continue com a etapa 3,3.
- Mantenha os meios de comunicação e a matriz de revestimento frio antes e ao adicioná-los aos pratos de cultura. Adicione o revestimento da matriz da membrana do porão aos pratos da cultura e coloc os pratos em uma incubadora (em 37 ° c) para 1 h. Para o revestimento óptimo, não incubar a matriz da membrana do porão por mais do que ou menos de 1 h. Após 1 h, aspirar o revestimento da matriz da membrana do porão dos pratos das culturas da pilha. Certifique-se que isso coincide com as NSCs estar pronto para ser banhado.
- Se as células estão sendo descongeladas de estoques congelados de NSC, tomar um frasco de células congeladas e aquecê-lo em um banho de água aquecida a 37 ° c, movendo o frasco para a frente e para trás na água. Uma vez descongelado, pulverize o frasco com 70% de etanol e coloque-o em uma capa de cultura celular. Transfira as células para ~ 10 mL de DMEM/F12 + penicilina-estreptomicina Media e Centrifugue o tubo à temperatura ambiente em 1.000 x g por 5 min. aspirar a mídia e ressuscite as células em mídia NSC.
- Diluir as células na mídia NSC para obter a densidade de semeadura apropriada para a embarcação de cultura de células que está sendo usada.
Nota: Por exemplo, se os NSCs estão sendo chapeados em uma placa de seis poços-um poço em um prato da cultura de seis poços tem uma área de superfície de 9 cm2— 900.000 a 1.350.000 pilhas são exigidas para semear. Assim, um frasco contendo 1 milhão células pode ser ressuscipended em 2 mL de mídia e adicionado a um único poço de um prato de seis poços. - Adicionar células suficientes suspensas em mídia NSC para semear os pratos de cultura da membrana basal matriz-revestido (100.000 células/cm2) e mudar a mídia a cada outro dia (se estiver usando um estoque congelado, mudar a mídia no dia após o chapeamento e todos os dias depois disso). Cresça as células até que sejam 75% – 80% confluentes.
Nota: As células provavelmente chegarão 75%-80% confluência logo após o chapeamento, mas isso pode demorar mais tempo se os estoques congelados são usados. - Uma vez que os NSCs são 75% – 80% confluentes, começam a diferenciação neuronal removendo a mídia de NSC (+) bFGF e substituindo-o por mídia NSC (-) bFGF. Cultura as células nesta mídia (substituindo a mídia a cada outro dia) por pelo menos 4 semanas.
Nota: As células continuarão a se dividir por alguns dias após a retirada da bFGF; Portanto, as células podem chegar a 90 – 100% de confluência. Após a cultura durante 4 semanas, as células terão atingido um destino neuronal e estará pronto para o tratamento de Lentivirus.
4. transdução e manutenção de culturas neuronais
- Para transduce neurônios com Lentivirus, use uma contagem de titer de 3,4 x 105 unidades transducible/célula (um 100% confluente 10 cm prato conterá ~ 10 milhões neurônios). Diluir as unidades transducible à concentração necessária em meios de cultura da pilha e adicioná-las às pilhas (use o volume normal de meios para o prato da cultura da pilha). Dois dias após ter adicionado o Lentivirus, lave as pilhas 1x com meios (-) bFGF frescos (sem lentivirus) e continue cultivando em meios de (-) bFGF como usual.
- Para o tratamento pós-lentiviral, alimente os neurônios transviados alterando os meios de cultura celular ([-] bFGF Media) todos os dias. Manter as células para ~ 8 semanas após a transdução. Visualize rotineiramente as células um microscópio de luz para garantir a viabilidade.
Nota: A escassidade ou a ruptura dendrítica são sinais de que as células não são mais viáveis.
5. imagem latente das pilhas
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Imagens de células ao vivo
- Após a transdução (4 dias após a adição de Lentivirus), observe sinais de YFP um microscópio fluorescente capaz da imagem latente da vivo-pilha. Tome os pratos da cultura da pilha fora da incubadora e certifique-se que os poços da cultura permanecem estéreis mantendo a tampa sobre os pratos da cultura. Visualize as células usando um objetivo de 10x com um comprimento de onda de excitação de ~ 514 nm e um filtro de emissão de ~ 527 nm.
Nota: Os agregados são tipicamente visíveis em culturas de células transviadas 6 – 8 dias após a aplicação de Lentivirus.
- Após a transdução (4 dias após a adição de Lentivirus), observe sinais de YFP um microscópio fluorescente capaz da imagem latente da vivo-pilha. Tome os pratos da cultura da pilha fora da incubadora e certifique-se que os poços da cultura permanecem estéreis mantendo a tampa sobre os pratos da cultura. Visualize as células usando um objetivo de 10x com um comprimento de onda de excitação de ~ 514 nm e um filtro de emissão de ~ 527 nm.
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Coloração de células fixas (rotulagem de β-tubulina III e coloração de tioflavina)
- Para fixar as células em paraformaldeído (PFA), remova os meios de cultura de neurônios transados cultivados em coberturas de vidro. Lave as células 1x com PBS, retire a lavagem e adicione 300 – 500 μL (se estiver usando placas de 24 poços) de 4% de PFA (diluída em PBS) para as coberturas por 20 min à temperatura ambiente. Retire o PFA e lave os lamínulas 2x com PBS.
- Prepare uma solução de bloqueio consistindo de PBS, 3% de albumina sérica bovina (BSA) e 0,3% de Triton X-100. Adicionar 300 – 500 μL da solução aos poços e incubar os lamínulas durante 2 h a 4 ° c. Após 2 h, diluir anticorpos primários (a uma concentração de anticorpos de 1:500) na solução de bloqueio e adicionar 300 – 500 μL de solução de anticorpos primários a cada poço. Coloc a placa em uma plataforma de balanço ou girando (na baixa velocidade) durante a noite em 4 ° c.
- No dia seguinte, retire a solução de anticorpos primários e lave os lamínulas 3x durante 5 min cada um com PBS. Diluir anticorpos secundários em uma solução tampão de obstrução (em uma concentração de 1:1000) e adicionar a solução secundária do anticorpo a cada poço. Selecione o anticorpo secundário apropriado usando uma etiqueta fluorescente que não se sobreponha com o sinal de YFP (CY-3, por exemplo). Incubar as células à temperatura ambiente por 2 h em uma plataforma de balanço ou rotativa. Após 2 h, retire a solução de anticorpos secundários e lave os lamínulas 3x durante 10 min cada com PBS.
- Lave as lamelas em água dupla deionizada (DDW) durante 10 min. Retire o DDW e adicione 300 μL/poço de 0, 15% de tioflavina-S diluído em 50% de etanol por 10 min. Retire a solução de tioflavina e lave as lamelas 2x durante 4 min cada com 50% etanol, seguido por um 4 min Lave com 30% de etanol e duas lavagens por 5 min cada uma com 30% de etanol. Lave os lamínulas 1x com DDW antes da montagem.
Nota: A coloração de tioflavina descrita na etapa 5.2.4 é opcional. - Para montar as coberturas em lâminas de vidro, coloque uma única gota de suportes de montagem no lado "+" de uma lâmina de vidro. Remova todo o líquido do poço que contem o lamela de vidro e, usando o fórceps fino, remova com cuidado o lamela de vidro, mantendo a trilha de que lado tem as pilhas cultivadas.
- Pressione suavemente a borda da lamínula contra um Kimwipe para remover qualquer excesso de umidade. Ainda segurando o lamela com fórceps fino, toque a borda (com o lado da pilha que enfrenta para a gota de suportes de montagem) do lamela à mídia de montagem, e então, coloc delicadamente o lamela nos meios de montagem (colocando as pilhas cultivadas na montagem mídia e imprensando-os entre a lamínula e a corrediça de vidro). Deixe a mídia de montagem endurecer por 30 min antes da imagem. Os slides podem ser armazenados em-20 ° c para uso futuro.
- Imagem as pilhas usando um microscópio fluorescente e os espectros apropriados da excitação/emissão (YFP = ~ 514/527 nanômetro, CY-3 = ~ 555/568 nanômetro, e thioflavin S = ~ 390/426 nanômetro).
6. métodos opcionais
- A cada 2 dias, coletar mídias condicionadas das culturas e armazená-lo em-20 ° c para futuras análises de espécies Tau liberado por culturas.
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Representative Results
Os neurônios de Tau-RDLM-YFP-transdução foram marcados fluorescentamente com o YFP, e as culturas RDLM-dueadas apresentaram agregados após a transdução. Essas inclusões coradas positivas para a tioflavina (Figura 1). Como a Figura 1 demonstra, este protocolo produz culturas neuronais que exibem agregados de Tau tioflavina-positivos. Para experimentos iniciais, recomenda-se que a diferenciação neuronal seja confirmada Immunolabeling o marcador Neuron-específico β-tubulin III nas culturas. Importante, os anticorpos secundários etiquetados cDNAs devem ter um espectro da excitação/emissão que não sobreponha com o aquele de YPF (Cy3, por exemplo). Embora os agregados amarelos fluorescentes da Tau sejam visíveis na ausência de mancha, o thioflavin deve igualmente ser usado para a imagem latente a fim confirmar que o sinal fluorescente é Tau agregado e não restos celulares. Adicionalmente, o exemplo na Figura 1 não inclui a mancha de DAPI para etiquetar os núcleos da pilha como a excitação/emissão de DAPI sobrepõe com a aquela de thioflavin-s; as manchas alternativas dos núcleos devem ser usadas com thioflavin-S se desejado.
Figura 1: coloração de Tioflavina de culturas transdoadas. Os neurônios transados com Lentivirus Tau-RDLM-YFP foram fixados e imunolabeled com o marcador neurônio-específico β-tubulin III (vermelho). Adicionalmente, os agregados Tau (sinal de YFP no verde) foram manchados para o thioflavin (azul). Barras de escala = 25 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo descreve a geração de um modelo in vitro de Taupatia humano que exiba agregados prata-mancha-positivos e emaranhados neurofibrilary thioflavin-positivos (NFTS). Além disso, as pilhas transfuídas exibem patologias Tau-induzidas tais como defeitos morfológicos, synaptogenesis reduzido, e um volume lysosomal aumentado. A principal vantagem deste protocolo é que ele fornece um modelo acessível e rentável de tauopatia neuronal, que pode ser usado para estudos de triagem de drogas, bem como para a análise da toxicidade Tau. Este modelo preenche uma necessidade material na investigação neurodegenerativa como as linhas celulares de tauopatia humana ainda não estão amplamente disponíveis e o uso de Tau transgênica de neurônios derivados do mouse requer criação de animais e é limitado devido a diferenças no neuronal características entre as espécies.
Além dos listados acima, há uma série de etapas críticas para o sucesso deste procedimento. Primeiramente, assegure-se de que o Titer viral correto esteja usado porque se o Titer viral é demasiado baixo, as culturas não formarão agregados. Em segundo lugar, certifique-se de que as culturas NSC são mantidas corretamente e não exceda ~ 80% confluência. O crescimento excessivo de NSCs causará diferenciação prematura. Por último, aguarde um total de 4 semanas para que as culturas neuronais se diferenciem depois de retirar a mídia do bFGF dos NSCs. Esta duração é necessária para garantir a maturação dos neurônios.
Embora o procedimento descrito acima seja um método eficiente para produzir um modelo Taupatia in vitro, há algumas limitações associadas com este protocolo. Primeiramente, como descrito previamente, este método produz NFTS em neurônios pluripotentes induzidos humanos da pilha de haste mas não em neurônios embrionário (E18)-derivados do rato. Mesmo depois de usar três vezes mais vírus para transduce neurônios de ratos do que foi usado para neurônios humanos, culturas de células de roedores permaneceram negativas para a coloração de tioflavina, o que sugere que este método não pode ser adaptado para culturas de roedores. As diferenças entre as células de camundongo transmófica e os neurônios humanos podem ser devidas à maior propensão da Tau humana em direção à agregação13. A segunda limitação deste procedimento é que, embora os agregados Tau sejam formados em culturas, as alterações na fosforilação de Tau entre as células de Tau-RDLM-transceptível e as culturas de Tau-WT-YFP-transvadas foram indetectáveis usando a proteína PHF-1 (que detecta Tau fosforilado em ser 396/ser 404) e anticorpos CP13 (que detectam a Tau fosforilada na ser 202). Estes resultados sugerem que a agregação da Tau em culturas de Tau-rdlm-YFP devido a P301L e a V337M envolva um mecanismo que seja independente do hyperphosphorylation, ou o nível de fosforilação endógeno do Tau esteja o nível detectável pelo immunoblot. Por causa da falta das diferenças no PHF-1 e no immunoreactivity CP13 entre as culturas de Tau-RDLM-YFP e de Tau-WT-YFP, não é obscuro se ou não este modelo seria útil para estudos que analisam os efeitos da atividade da Tau kinase/phosphatase na patologia. Entretanto, ambos os anticorpos de PHF-1 e de CP13 reconhecem regiões fora do domínio da repetição que abrigando as mutações; Conseqüentemente, os anticorpos adicionais levantados de encontro a vários locais da fosforilação da Tau podem ser úteis para estudos futuros.
Além dos ensaios de cultura celular, esse modelo pode ser uma ferramenta valiosa para estudos além do paradigma da cultura celular. Por exemplo, os exosomas isolados dos meios de pilhas transexadas contêm espécies tóxicas da Tau. Os exosomas são pequenas vesículas secretoras liberadas de quase todos os tipos de células, e os exosomas têm sido implicados na propagação da Tau14. Os exossomos neuronal de Tau-rdlm contêm a Tau humana que é detectável pelo borrão ocidental9, e estes exossomos são suficientes para produzir inclusões da Tau no cérebro ingênuo do rato. Estas inclusões são immunoreactive para os anticorpos específicos para o Tau humano (K9JA), mas não é obscuro se ou não as inclusões incluem o Tau agregado do rato. O achado descrito aqui que o procedimento não produz agregados de coloração tioflavina-positivos em neurônios roedores sugere que as inclusões observadas no cérebro do rato são compostas inteiramente de Tau humana, embora estudos futuros sejam necessários para confirmar a composição dos depósitos in vivo.
Dado o papel aparente de Tau exossomo-derivado nas tauopathies, o modelo descrito aqui pode ser um recurso útil para examinar o papel do exossomo em mediando a neurodegeneração Tau-induzida. Em conclusão, este procedimento produz um modelo in vitro de Taupatia humano que tenha vantagens significativas sobre sistemas neuronal do rato transgênicas e possa ser empregado para uma variedade de análises pré-clínicas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Peter Davies no Albert Einstein College of Medicine por fornecer anticorpos PHF-1 e CP13 e Dr. Marc Diamond na Universidade do Texas, no sudoeste, por fornecer os constructos Tau. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Associação de Alzheimer (NIRG-14-322164) para S.H.Y. e do Instituto de medicina regenerativa da Califórnia (TB1-01193) para P.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm culture dishes | Thermofisher | 12556002 | |
| 15 mL tubes | Biopioneer | CNT-15 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermofisher | 50-980-487 | |
| 24 well culture plates | Thermofisher | 930186 | |
| 50 mL tubes | Biopioneer | CNT-50 | |
| 70% ethanol in spray bottle | Various sources | NA | |
| B27 supplement | Thermofisher | 17504044 | |
| Basement membrane matrix (Matrigel) | Corning | 356231 | |
| Basic FGF | Biopioneer | HRP-0011 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| Cell culture incubator | Various sources | NA | |
| Centrifuge | Various sources | NA | |
| DMEM-F12 culture media with glutamine | Thermofisher | 10565042 | |
| Ethanol (50% concentration or higher) | Various sources | NA | |
| Flourescently labeled secondary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
| Fluorescent microscope | Various sources | NA | |
| Glass coverslips | Thermofisher | 1254581 | |
| Glass slides | Thermofisher | 12-550-15 | |
| Human neural stem cells | Various sources | NA | |
| Lentiviral vectors | Various sources | custom order | |
| Mounting media | Thermofisher | P36934 | |
| N2 supplement | Thermofisher | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline | Thermofisher | 14190250 | |
| Primary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
| Rocking or rotating platform | Various sources | NA | |
| Sterile cell culture hood | Various sources | NA | |
| Thioflavin S | Sigma | T1892-25G | |
| Triton X-100 | Thermofisher | BP151-100 | |
| Water bath | Various sources | NA |
References
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