Summary
该协议详细介绍了用慢病毒结构编码为突变体人类 tau 转换人类神经元培养的过程。诱导的区域性显示 tau 聚合和相关的病理。
Abstract
蛋白 tau 的异常聚集是病因参与了一些神经退行性疾病, 包括阿尔茨海默氏症 (AD)。尽管小鼠的病状模型为研究聚集 tau 的神经毒性机制提供了宝贵的资源, 但越来越明显的是, 由于神经生理学的物种间差异, 小鼠的大脑不适合模拟人类的状况。细胞培养方法的进步使人类神经元培养物可用于体外实验, 并有助于神经疗法的发展。然而, 尽管人类神经元细胞培养的适应性, 体外模型的人类程度病还没有得到广泛的应用。该协议描述了一种细胞模型的 tau 聚集, 其中人类神经元被移植与生命病毒衍生的载体, 代码的病原性突变 tau 融合到一个黄色荧光蛋白 (YFP) 记者。诱导培养产生对硫代黄素呈阳性染色的 tau 集合体, 并显示出神经毒性标志物, 如轴突长度缩短和溶酶体体积增加。这个程序可能是一个有用的和具有成本效益的模型, 研究人类的泰氏病。
Introduction
微管相关蛋白 tau 的病理聚集是许多神经退行性疾病的一个决定性特征, 包括 AD、额叶痴呆 (FTD)、拾取病和进行性核上麻痹 (PSP)1.在非病变状态下, tau 结合并稳定神经元轴突2 中的微管丝。然而, 与疾病相关的 tau 高磷酸化促进 tau 聚集、与微管的离解和神经元毒性3。聚集 tau 的毒性作用可能包括胆碱能4和谷氨酸受体5的异常激活, 导致细胞内钙的失调, 并最终导致细胞死亡。在动物模型中, 减少脑 tau 改善了 AD小鼠 6和重复轻度创伤性脑损伤的小鼠模型7的病理。
越来越多的证据表明, 鼠源 tau 的结构和结合亲和力与人类衍生的 tau 不同, 并且鼠标 tau 不适合模拟人类的 taudiies8。然而, 人类细胞病模型并没有在商业上广泛提供。这项工作的总体目标是描述一个体外模型的 tau 聚集, 其中人体神经元被转化与生命病毒衍生的载体包含突变的人 tau 构造9。Tau 集料导致 lentiviral 构造编码的 TAU 重复域窝藏 P301L 和 V337M 突变融合到 YFP 记者 (Tau-rdllm-yfp), 而控制构造代码的野生类型 (Wt) tau 重复域融合到 YFP 记者 (Tau-Wt-YFP)。用这种方法转化的神经元培养物表达的 tau 大约是非转换培养体的9倍。虽然 tau 表达的多度在 Tau-rdlm-yfp-和 To-wt-yfp 移植细胞之间大致相等, 但只有用 To-rdlm-yfp 显示聚合而传导的神经元。用 To-rdlm-yfp 染色对硫代黄素进行了积极的培养, 并在轴突长度和突触密度上表现出减少。因此, 这种细胞模型可能是研究牛生聚集的有用工具。
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Protocol
1. 介质和试剂的制备
- 在4°C 时解冻培养板的基底膜基质涂层 (不允许基底膜基质升温或固化)。制作1毫升的等价物, 并将其存放在-20°c 或-70°c。
- 在 10Μg/ml 的无菌磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中重新构建碱性成纤维细胞生长因子 (bfgf), 并制成 10μl aliquots。将它们存放在4°c。
- 在一个新的, 未开封的, 500 毫升瓶 DMM/F12 与谷氨酰胺, 加入 B27 (10 毫升), N2 (5 毫升), 青霉素链霉素 (5 毫升)。将这种神经干细胞 (NSC) 介质的50毫升放入锥形管中, 加入 10μgμμμl (2μgml 最终) bFGF。将 NSC (+) bFGF 介质存放在4°c。
- 要制作 (-) bFGF 介质, 请使用步骤1.3 中描述的相同配方, 但不要添加 bFGF。这种培养基将用于区分 Nsc 到神经元, 并在分化后维持神经元培养。
2. 慢病毒构造
请注意:在开始使用慢病毒结构之前, 请确保实验室已被批准使用生物安全 2级 (BSL-2) 剂。此外, 在使用慢病毒载体时, 必须使用 BSL-2 培养罩、个人防护设备和处置方法。
- 从首选来源获取包装成慢病毒的 tau 构造 (有关构造信息, 请参阅 Sanders 等人。
3. 培养人的神经干细胞
请注意:Nsc 的播种量通常为 100000–150, 000 cellscm 2, 大多数市售的 Nsc 以 1 x10 6 cellsle 的形式出售.该协议已针对10厘米细胞培养皿进行了优化 (尽管可以使用其他尺寸的培养皿);因此, 如果正在使用市售的 Nsc, 则可能需要首先在六井菜肴中进行培养, 以获得足够的细胞来播种10厘米的菜肴, 从而扩大 Nsc。此协议也可以适用于各种细胞培养盘大小 (但它不包含传递 nsc 的说明, 因为这些协议可在其他地方使用11,12)。
-
对于细胞培养板的制备, 取出细胞培养板的冷冻基底膜基质涂层的一个, 并允许其在4°c 下解冻 (在细胞播种的前一天, 可以在4°c 过夜放置)。在 dmmméf12 培养基 + 青霉素链霉素中加入385Μl 基底膜基质涂层。
注: 5 毫升的 dmméf12 培养基 + 青霉素链霉素足以覆盖一个10厘米的盘 (1 毫升的基底膜基质涂层溶液是足以覆盖一个六井盘的井)。或者, 如果细胞被固定和免疫染色, 或染色硫代黄素, 培养细胞在玻璃覆盖物在24井培养皿。- 保持培养基和基体涂层冷之前和同时添加到培养菜肴。将基底膜基质涂层添加到培养皿中, 并将其放入孵化器 (37°c) 1小时。为了获得最佳涂层, 不要孵育基底膜基质超过或少于1小时。1小时后, 从细胞培养皿中吸气基底膜基质涂层。请确保这与准备好进行电镀的 Nsc 相吻合。
请注意:如果细胞没有从冷冻库存中解冻, 请跳过步骤3.2 并继续执行步骤3.3。
- 保持培养基和基体涂层冷之前和同时添加到培养菜肴。将基底膜基质涂层添加到培养皿中, 并将其放入孵化器 (37°c) 1小时。为了获得最佳涂层, 不要孵育基底膜基质超过或少于1小时。1小时后, 从细胞培养皿中吸气基底膜基质涂层。请确保这与准备好进行电镀的 Nsc 相吻合。
- 如果细胞从冷冻 NSC 库存中解冻, 则取一小瓶冷冻细胞, 在加热到37°c 的水浴中加热, 在水中来回移动小瓶。解冻后, 用70% 乙醇喷洒小瓶, 并将其放入细胞培养罩中。将细胞转移到 dmm2 f12 + 青霉素链霉素培养基的 ~ 10 毫升, 并在室温下将管在 1, 000 x 克 g 下离心 5分钟 , 使培养基吸气, 并在 nsc 培养基中重新悬浮细胞。
- 稀释 NSC 培养基中的细胞, 以获得正在使用的细胞培养容器的适当种子密度。
请注意:例如, 如果 Nsc 被镀到六井板上--六井培养盘上的一口井的表面积为9厘米,需要 900, 000 至 150, 000个细胞来播种。因此, 一个含有 1, 000, 000个细胞的小瓶可以在2毫升的培养基中重新悬浮, 并添加到一个六井的井里。 - 添加足够的细胞悬浮在 NSC 培养基种子基底膜基质涂层培养盘 (100, 000 cells/cm 2), 并改变介质每隔一天 (如果使用冷冻股票, 改变培养基的一天, 电镀后的一天和每隔一天).生长细胞, 直到它们是 75%-80% 融合。
请注意:电镀后不久, 细胞可能会达到 75%-80% 的融合, 但如果使用冷冻库存, 这可能需要更长的时间。 - 一旦 Nsc 融合了 75%-80%, 就开始神经元分化, 去除 nsc (+) bFGF 介质, 代之以 NSC (-) bFGF 介质。在此介质中培养细胞 (每隔一天更换一次介质) 至少4周。
请注意:在 bFGF 撤出后, 细胞将继续分裂几天;因此, 细胞可能达到90–100% 融合。经过4周的培养, 细胞将获得神经元的命运, 并将准备治疗慢病毒。
4. 神经培养的传导和维持
- 要通过慢病毒传递神经元, 请使用 3.4 x 10 5 可还原单位细胞 ( 100% 融合10厘米的盘将包含约1000万个神经元) 的滴数。将可还原单位稀释到细胞培养培养基中的必要浓度, 并将其添加到细胞中 (使用正常体积的培养基进行细胞培养盘)。添加慢病毒两天后, 用新鲜 (-) bFGF 培养基 (无慢病毒) 清洗细胞 1x, 并像往常一样继续在 (-) bFGF 培养基中培养。
- 对于慢病毒后的治疗, 每隔一天通过改变细胞培养培养基 ([-] bFGF 培养基) 来喂养被诱导的神经元。转导后保持细胞约8周。在光镜下对细胞进行定期可视化, 以确保细胞的活力。
请注意:稀疏或树突断裂是细胞不再存活的迹象。
5. 细胞成像
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活细胞成像
- 转导后 (添加慢病毒后 4天), 在能够活细胞成像的荧光显微镜下观察 YFP 信号。将细胞培养皿从孵化器中取出, 并通过在培养皿的顶部盖上, 确保培养井保持无菌状态。使用激发波长约 514 nm 的10倍目标和 ~ 514 nm 的发射滤波器来可视化细胞。
请注意:在应用慢病毒6-8天后, 在转染细胞培养物中通常可以看到聚集物。
- 转导后 (添加慢病毒后 4天), 在能够活细胞成像的荧光显微镜下观察 YFP 信号。将细胞培养皿从孵化器中取出, 并通过在培养皿的顶部盖上, 确保培养井保持无菌状态。使用激发波长约 514 nm 的10倍目标和 ~ 514 nm 的发射滤波器来可视化细胞。
-
固定细胞染色 (β-管蛋白 III 标签和硫代黄素染色)
- 要修复聚甲醛 (PFA) 中的细胞, 请去除玻璃覆盖物上生长的被诱导神经元的培养基。用 PBS 清洗细胞 1x, 取出清洗, 并在室温下将 300–500μl (如果使用24孔板) 添加到盖板上20分钟。取下 PFA, 用 PBS 清洗2倍的盖板。
- 准备由 PBS、3% 牛血清白蛋白 (BSA) 和 0.3% Triton X-100 组成的阻滞溶液。在井上加入300–500Μl 溶液, 在4°C 下孵育覆盖物2小时。2小时后, 在阻断溶液中稀释原代抗体 (抗体浓度为 1:500), 并在每口井加入300–500Μl 的原代抗体溶液。将板材放置在摇杆或旋转平台上 (低速), 在4°C 下过夜。
- 第二天, 取出主要抗体溶液, 用 PBS 清洗盖板 3x, 每次5分钟。稀释阻塞缓冲液中的次生抗体 (浓度为 1:1000), 并在每口井中添加二级抗体溶液。使用不与 YFP 信号重叠的荧光标记 (例如 CY-3) 选择适当的二级抗体。在室温下在摇晃或旋转平台上沐浴细胞2小时。2小时后, 取出二级抗体溶液, 用 PBS 清洗盖板 3x, 每次10分钟。
- 用双去离子水 (DDW) 清洗盖板 10分钟, 取出 DDW, 加入300μlp 井, 用50% 乙醇稀释0.015 硫代黄素-s, 用50% 乙醇清洗2克, 每次清洗 2倍, 然后 1年, 然后 1年, 然后, 1 4分钟用30% 的乙醇和两个洗 5分钟, 每次用30% 的乙醇。安装前, 请使用 DDW 清洗盖板1x。
请注意:步骤5.2.4 中描述的硫代黄素染色是可选的。 - 要将盖板安装到玻璃滑梯上, 请在玻璃滑梯的 "+" 侧放置一滴安装介质。从井里取出含有玻璃盖板的所有液体, 用精细的钳子小心地取出玻璃盖板, 记录哪一侧有培养的细胞。
- 轻轻按下盖板的边缘对着金巾, 以去除多余的水分。仍然用精细的钳子抓住盖板, 触摸盖板的边缘 (电池侧朝下安装介质的下降) 到安装介质上, 然后轻轻地将盖板放在安装介质上 (将培养的细胞放置在安装介质中)介质和夹在它们之间的盖板和玻璃滑梯)。在成像前, 让安装介质变硬30分钟。幻灯片可在-20°c 下存储, 以备将来使用。
- 使用荧光显微镜和适当的发射光谱 (YFP = ~ 51427 纳米、CY-3 = ~ 55\ 568 纳米和硫代黄素 s = ~ 90%/426 纳米) 对细胞进行成像。
6. 可选方法
- 每隔 2天, 从文化中收集有条件的媒体, 并将其储存在-20°c, 以便将来分析文化释放的陶氏物种。
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Representative Results
用 YFP 荧光标记了 to-rdlm-yfp 诱导神经元, rdlm 诱导培养物在转导后显示出聚集物。这些内含物染色对硫代黄素呈阳性 (图 1)。如图 1所示, 该协议产生的神经元培养显示硫代黄素阳性 tau 集合体。对于初始实验, 建议通过在培养物中对神经元特异性标记Β-tubulin III 进行免疫标记来确认神经元分化。重要的是, 荧光标记的二级抗体应具有与 YPF (例如 Cy3) 不重叠的兴奋/发射光谱。虽然在没有染色的情况下可以看到黄色荧光 tau 集合体, 但硫代黄素也应用于成像, 以确认荧光信号是聚合 tau 而不是细胞碎片。此外,图 1中的示例不包括 dapi 染色, 以标记细胞核, 作为 dapi 与硫代黄素-s 重叠的兴奋性发射;如果需要, 应与硫代黄素-s 一起使用替代的核子污渍。
图 1: 诱导培养物的硫黄蛋白染色.用牛角-Rdlm-yfp 慢病毒对神经元进行固定和免疫标记, 并与神经元特异性标记Β-管蛋白 iii (红色) 进行免疫标记。此外, tau 集料 (YFP 信号为绿色) 被染色的硫代黄素 (蓝色)。刻度条 = 25μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
该协议描述了一个体外模型的人类神经病, 表现为银-静态阳性聚集物和硫代黄素阳性神经纤维缠结 (Nft) 的生成。此外, 转染细胞表现出诱导的疾病, 如形态缺陷, 减少突触发生, 并增加溶酶体体积。该方案的主要优点是, 它提供了一个可获得的和具有成本效益的神经元病模型, 可用于药物筛选研究, 以及牛毒性分析。这种模型满足了神经退行性研究的物质需求, 因为人类的神经病细胞系还没有得到广泛的应用, 从老鼠源神经元使用转基因 tau 需要动物繁殖, 而且由于神经元的差异而受到限制物种之间的特征。
除了上面列出的步骤外, 还有一些关键的步骤是使这一过程取得成功。首先, 确保使用正确的病毒滴度, 因为如果病毒滴度太低, 培养物就不会形成聚集体。其次, 确保 NSC 培养得到适当维护, 不超过 ~ 80% 的融合。Nsc 的过度生长会导致过早分化。最后, 在从 Nsc 中提取 bFGF 培养基后, 等待整整4周的神经元培养来区分。此持续时间是必要的, 以确保神经元的成熟。
尽管上述过程是生成体外病模型的有效方法, 但与此协议相关的有一些限制。首先, 如前所述, 该方法在人诱导的多能干细胞源神经元中产生 Nft, 但在大鼠胚胎 (E18) 衍生神经元中不产生 Nft。即使使用三倍以上的病毒来传递大鼠神经元比使用的人神经元, 啮齿类动物细胞培养物仍然是负的硫代黄素染色, 这表明这种方法不能适应啮齿类动物的培养。被移植的小鼠细胞和人类神经元之间的差异可能是由于人类 tau 对聚集13的倾向增加。这一程序的第二个限制是, 虽然 tau 聚集体是在培养过程中形成的, 但使用蛋白 Phf-1 检测 tau rdlm 转染细胞和 Tau-wt-yfp 转染培养物之间的 tau 磷酸化变化是无法检测到的 (用于检测 tau)在 Ser 越来越接数404和 CP13 抗体 (检测到 202号 Ser 磷酸化的 tau 磷酸化)。这些发现表明, 在 p301l 和 V337M 培养物中, tau 聚集涉及一种独立于高磷酸化的机制, 或者内源性 tau 磷酸化水平低于免疫印迹的可检测水平。由于 Tau-RDLM-YFP 和 TAU-WT-YFP 培养物在 Phf-1 和 cp13 免疫反应方面缺乏差异, 目前尚不清楚该模型是否有助于研究 tau kinasase\ 磷酸酶活性对病理的影响。然而, PHF-1 和 CP13 抗体都能识别存在突变的重复域之外的区域;因此, 针对各种 tau 磷酸化位点产生的额外抗体可能对未来的研究有用。
除了细胞培养检测外, 这种模式可能是超越细胞培养范式的有价值的研究工具。例如, 从被转移的细胞培养基中分离出的外显子含有有毒的。外显子体是几乎从所有细胞类型中释放出来的小分泌囊泡, 外显子体与 tau 繁殖14有关。Tau-RDLM 神经元外显子含有人类的 tau, 这是可检测到的西方印迹9, 这些外显子是足以产生 tau 内含物在天真的小鼠大脑。这些内含物是人类 tau 特异性抗体的免疫反应, 但不清楚这些内含物是否包括聚集的小鼠 tau。这里描述的研究结果表明, 这种方法不会在啮齿类动物神经元中产生硫代黄素阳性染色集料, 这表明在老鼠大脑中观察到的内含物完全由人类 tau 组成, 尽管未来的研究需要证实体内沉积物的组成。
鉴于外生 tau 在程度下的明显作用, 这里描述的模型可能是一个有用的资源, 以研究外生体在调解陶氏引起的神经退行性变的作用。总之, 该程序产生了一个体外模型的人类病变, 具有显著的优势比转基因小鼠神经元系统, 并可用于各种临床前分析。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者要感谢阿尔伯特·爱因斯坦医学院的彼得·戴维斯博士提供 PHF-1 和 CP13 抗体, 并感谢西南德克萨斯大学的 Marc Diamon 博士提供 tau 结构。这项工作得到了阿尔茨海默氏症协会 (NIRG-14-332164) 向 s. h. y. 提供的赠款和来自加州再生医学研究所 (TB1-01193) 到 p. r. 的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm culture dishes | Thermofisher | 12556002 | |
| 15 mL tubes | Biopioneer | CNT-15 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermofisher | 50-980-487 | |
| 24 well culture plates | Thermofisher | 930186 | |
| 50 mL tubes | Biopioneer | CNT-50 | |
| 70% ethanol in spray bottle | Various sources | NA | |
| B27 supplement | Thermofisher | 17504044 | |
| Basement membrane matrix (Matrigel) | Corning | 356231 | |
| Basic FGF | Biopioneer | HRP-0011 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| Cell culture incubator | Various sources | NA | |
| Centrifuge | Various sources | NA | |
| DMEM-F12 culture media with glutamine | Thermofisher | 10565042 | |
| Ethanol (50% concentration or higher) | Various sources | NA | |
| Flourescently labeled secondary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
| Fluorescent microscope | Various sources | NA | |
| Glass coverslips | Thermofisher | 1254581 | |
| Glass slides | Thermofisher | 12-550-15 | |
| Human neural stem cells | Various sources | NA | |
| Lentiviral vectors | Various sources | custom order | |
| Mounting media | Thermofisher | P36934 | |
| N2 supplement | Thermofisher | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline | Thermofisher | 14190250 | |
| Primary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
| Rocking or rotating platform | Various sources | NA | |
| Sterile cell culture hood | Various sources | NA | |
| Thioflavin S | Sigma | T1892-25G | |
| Triton X-100 | Thermofisher | BP151-100 | |
| Water bath | Various sources | NA |
References
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