Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

En in vitro model for at studere Tau aggregering ved hjælp af Lentiviral-medieret transduktion af humane neuroner

doi: 10.3791/59433 Published: May 23, 2019

Summary

Denne protokol beskriver en procedure, hvor menneskelige neuronal kulturer er transduceret med lentiviral konstruktioner kodning for mutant menneske Tau. Transduceret kulturer display Tau aggregater og tilknyttede patologier.

Abstract

Aberrant aggregering af protein Tau er patetisk involveret i en række neurodegenerative sygdomme, herunder Alzheimers sygdom (AD). Selv om musemodeller af tauopati har givet en værdifuld ressource for at undersøge neurotoksiske mekanismer i aggregeret Tau, det bliver mere og mere klart, at på grund af interspecies forskelle i Neuro fysiologi, muse hjernen er uegnet til modellering af den menneskelige tilstand. Fremskridt i cellekultur metoder har gjort menneskelige neuronal kulturer tilgængelige for eksperimentel brug in vitro og har hjulpet i udviklingen af neurotherapeutics. Men på trods af tilpasningen af humane neuronal cellekulturer, in vitro modeller af human tauopati er endnu ikke bredt tilgængelige. Denne protokol beskriver en cellulær model af Tau aggregering, hvor menneskelige neuroner er transduceret med lentiviral-afledte vektorer, at koden for patogenisk muteret Tau smeltet til en gul fluorescerende protein (YFP) reporter. Transduceret kulturer producerer Tau aggregater, der pletter positivt for thioflavin og display markører for neurotoksicitet, såsom nedsat axonal længde og øget lysosomale volumen. Denne procedure kan være en nyttig og omkostningseffektiv model for at studere menneskelige tauopathier.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Patologisk aggregering af den mikrotubule-associerede protein Tau er et definerende træk ved mange neurodegenerative sygdomme, herunder AD, frontotemporal demens (FTD), pick 's sygdom, og progressiv supranuclear parese (PSP)1. I en ikke-syg tilstand binder Tau sig til og stabiliserer mikrotubulære filamenter i neuronale axoner2. Men, sygdoms associeret hyperfosforylering af Tau fremmer Tau aggregering, afkobling fra microtubules, og neuronal toksicitet3. De toksiske virkninger af aggregeret Tau kan indebære afvigende aktivering af kolinerge4 og glutamatergic receptorer5 resulterer i dysregulering af intracellulære calcium og i sidste ende, celledød. I dyremodeller forbedrer reduktionen af hjernen Tau patologi i AD-mus6 og i musemodeller af repetitive mild traumatisk hjerneskade7.

Montering beviser viser, at strukturen og bindende affinitet af mus-afledte Tau adskiller sig fra menneske-afledte Tau og at musen Tau er uegnet til modellering menneskelige tauopathies8. Men, humane celle tauopati modeller er ikke almindeligt kommercielt tilgængelige. Det overordnede mål med dette arbejde er at beskrive en in vitro model af Tau aggregering, hvor menneskelige neuroner er transduceret med lentiviral-afledte vektorer, der indeholder mutant Human Tau konstruktioner9. Tau aggregat forårsager lentiviral konstruktioner koder for Tau gentage domæne husly P301L og V337M mutationer smeltet til en yfp reporter (Tau-rdlm-yfp) mens kontrol konstruerer kode for Wild-type (WT) Tau gentage domæne fusioneret til en yfp reporter (Tau-WT-yfp). Neuronal kulturer transduceret ved hjælp af denne metode udtrykke cirka ni gange mere Tau end ikke-transduceret kulturer. Selv om mængden af Tau udtryk over udtrykkes er nogenlunde lige mellem Tau-RDLM-YFP-og Tau-WT-YFP-transduceret celler, kun neuroner transduceret med Tau-RDLM-YFP display aggregater. Kulturer transduceret med Tau-RDLM-YFP bejdse positivt for thioflavin og display reduktioner i axonal længde og synaptisk tæthed. Derfor, denne cellulære model kan være et nyttigt redskab til at studere Tau aggregering in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. klargøring af medier og reagenser

  1. Optø kælderen membran matrix belægning for kultur plader ved 4 °C (Lad ikke kælderen membran matrix til at varme op, eller det vil størkne). Der fremstille 1 mL aliquoter, og opbevar dem ved-20 °C eller-70 °C.
  2. Den grundlæggende fibroblast vækstfaktor (bFGF) rekonstruere i sterilt fosfat-bufferet saltvand (PBS) ved 10 μg/mL og fremstille 10 μL aliquoter. Opbevar dem ved 4 °C.
  3. Til en ny, uåbnet, 500 mL flaske DMEM/F12 med glutamin, tilsæt B27 (10 mL), N2 (5 mL), og penicillin-streptomycin (5 mL). Der anbringes 50 mL af dette neurale stamcelle medie (NSC) i et konisk rør, og der tilsættes 10 μL 10 μg/μL (2 μg/mL endelig) bFGF. Opbevar NSC (+) bFGF-mediet ved 4 °C.
  4. For at gøre (-) bFGF medier, bruge den samme opskrift som beskrevet i trin 1,3, men ikke tilføje bFGF. Dette medie vil blive brugt til at differentiere NSCs til neuroner og til at opretholde neuronal kulturer efter differentiering.

2. lentiviral konstruktioner

Bemærk: Før påbegyndelse arbejde med lentiviral konstruktioner, sikre, at laboratoriet er blevet godkendt til at bruge biosikkerhed niveau-2 (BSL-2) agenter. Endvidere skal BSL-2-kulturemhætter, personlige værnemidler (PV) og bortskaffelsesmetoder anvendes, når der arbejdes med lentivirale vektorer.

  1. Anskaf Tau konstruktioner pakket i lentivirus fra en foretrukken kilde (Se Sanders et al.10 for konstruktionsinformation).

3. culturing humane neurale stamceller

Bemærk: Nsc'er er typisk seedede ved 100000 – 150000 celler/cm2 , og de fleste kommercielt tilgængelige nscs sælges som 1 x 106 celler/hætteglas. Denne protokol er blevet optimeret til 10 cm cellekultur retter (selv om andre størrelser af retter kan anvendes); Hvis der anvendes kommercielt tilgængelige Nsc'er, kan de nationale statistiske kontorer derfor være nødt til at blive udvidet ved først at blive dyrket i seks-brønd retter for at kunne resultere i nok celler til at lægge 10 cm tallerkener. Denne protokol kan alternativt tilpasses til en række cellekultur parabol størrelser (men det indeholder ikke instruktioner til passage nscs da disse protokoller er tilgængelige andetsteds11,12).

  1. Til fremstilling af cellekultur plader, fjerne en alikvot af frosne kælder membran matrix belægning til cellekultur plader og tillade det at tø ved 4 °c (Aliquots kan placeres ved 4 °c natten over dagen før cellerne skal seedet). Der tilsættes 385 μL af kælderen membran matrix belægning til 5 mL DMEM/F12 Media + penicillin-streptomycin.
    Bemærk:
    5 ml DMEM/F12 Media + penicillin-streptomycin er nok til at belægge en enkelt 10 cm skål (1 ml af denne kælder membran matrix belægning løsning er tilstrækkelig til at belægge en brønd af en seks-brønd skål). Alternativt, hvis cellerne skal fastgøres og immunobejdsede, eller farves for thioflavin, kultur celler på glas coverglider i 24-Well kultur retter.
    1. Hold medier og matrix belægning koldt før og samtidig tilføje dem til kultur retter. Tilsæt kælderen membran matrix belægning til kultur retter og placere retterne i en inkubator (ved 37 °C) i 1 time. For optimal belægning, skal du ikke inkuere kælderen membran matrix for mere end eller mindre end 1 time. Efter 1 h, Aspirer den kælder membran matrix belægning fra cellekulturer retter. Sørg for, at dette falder sammen med, at NSCs er klar til at blive belagt.
      Bemærk: Hvis cellerne ikke bliver optøet fra frosne bestande, skal du springe trin 3,2 over og fortsætte med trin 3,3.
  2. Hvis cellerne bliver optøet fra frosne NSC-bestande, skal du tage et hætteglas med frosne celler og varme det i et vandbad, der opvarmes til 37 °C, ved at flytte hætteglasset frem og tilbage i vandet. Når optøet, spray hætteglasset med 70% ethanol og placere det i en cellekultur hætte. Cellerne overføres til ~ 10 mL DMEM/F12 + penicillin-streptomycin og centrifugeres ved stuetemperatur ved 1.000 x g i 5 min. Aspirér mediet, og genopslæk cellerne i NSC-mediet.
  3. Fortynd cellerne i NSC-mediet for at opnå den passende såning tæthed for det cellekultur fartøj, der anvendes.
    Bemærk: For eksempel, hvis NSCs bliver belagt på en seks-brønd plade-en brønd på en seks-brønd kultur skål har et areal på 9 cm2-900.000 til 1.350.000 celler er forpligtet til frø. Så et hætteglas indeholdende 1.000.000 celler kan resuspenderes i 2 mL medier og tilsættes til en enkelt brønd af en seks-brønd skål.
  4. Tilføj nok celler suspenderet i NSC medier til frø kælderen membran matrix belagt kultur retter (100.000 celler/cm2) og ændre medierne hver anden dag (hvis du bruger en frossen bestand, ændre medierne dagen efter plating og hver anden dag derefter). Vokse cellerne, indtil de er 75%-80% konflydende.
    Bemærk: Cellerne vil sandsynligvis nå 75%-80% sammenløbet kort efter plating, men det kan tage længere tid, hvis frosne bestande anvendes.
  5. Når NSCs er 75%-80% konflydende, begynde neuronal differentiering ved at fjerne NSC (+) bFGF medier og erstatte det med NSC (-) bFGF medier. Kultur cellerne i dette medie (udskiftning af medierne hver anden dag) i mindst 4 uger.
    Bemærk: Cellerne vil fortsætte med at dividere i et par dage efter tilbagetrækningen af bFGF; Derfor kan cellerne nå op på 90 – 100% sammen løb. Efter dyrkning i 4 uger, cellerne vil have opnået en neuronal skæbne og vil være klar til behandling af lentivirus.

4. transduktion og vedligeholdelse af neuronal kulturer

  1. At transduce neuroner med lentivirus, bruge en titer Count af 3,4 x 105 transducerble enheder/celle (en 100% konflydende 10 cm skål vil indeholde ~ 10.000.000 neuroner). Fortynd transducerens enheder til den nødvendige koncentration i cellekultur medier og tilføje dem til cellerne (brug den normale volumen af medier til cellekultur skålen). To dage efter tilsætning af lentivirus, vask cellerne 1x med friske (-) bFGF medier (uden lentivirus) og fortsætte dyrkning i (-) bFGF medier som sædvanlig.
  2. For post-lentiviral behandling, fodre transduceret neuroner ved at ændre cellekultur medier ([-] bFGF medier) hver anden dag. Vedligehold cellerne i ~ 8 uger efter transduktion. Rutinemæssigt visualisere cellerne under et let mikroskop for at sikre levedygtighed.
    Bemærk: Sparnærhed eller dendritiske brud er tegn på, at cellerne ikke længere er levedygtige.

5. Imaging af celler

  1. Afbildning af levende celler
    1. Efter transduktion (4 dage efter tilsætning af lentivirus) observeres YFP-signaler under et fluorescerende mikroskop, der kan afbilde levende celler. Tag cellen kultur retter ud af inkubator og sørg for kultur brønde forblive sterile ved at holde låget på toppen af kultur retter. Visualiser cellerne ved hjælp af en 10x mål med en excitation bølgelængde på ~ 514 nm og et emissions filter på ~ 527 nm.
      Bemærk: Aggregater er typisk synlige i transduceret cellekulturer 6 – 8 dage efter påføring af lentivirus.
  2. Fast celle farvning (β-Tubulin III mærkning og thioflavin farvning)
    1. At fastsætte cellerne i PARAFORMALDEHYD (PFA), fjerne kultur medier fra transduceret neuroner dyrket på glas dæksedler. Vask cellerne 1x med PBS, Fjern vasken, og tilsæt 300 – 500 μL (hvis du bruger 24-brønd plader) på 4% PFA (fortyndet i PBS) til dæksedlerne i 20 minutter ved stuetemperatur. Fjern PFA og vask dæksedlerne 2x med PBS.
    2. Der tilberedes en blokerende opløsning bestående af PBS, 3% bovint serumalbumin (BSA) og 0,3% Triton X-100. Der tilsættes 300 – 500 μL af opløsningen til brøndene, og dæksedlerne inkubedes i 2 timer ved 4 °C. Efter 2 timer fortyndes primære antistoffer (ved en antistofkoncentration på 1:500) i blokerende opløsning, og der tilsættes 300 – 500 μL primær antistof opløsning til hver brønd. Anbring pladen på en gynge-eller roterende platform (ved lav hastighed) natten over ved 4 °C.
    3. Den næste dag skal du fjerne den primære antistof opløsning og vaske dæksedlerne 3x i 5 min hver med PBS. Sekundære antistoffer fortyndes i en blokerende bufferopløsning (i en koncentration på 1:1000), og der tilsættes sekundær antistof opløsning til hver brønd. Vælg det relevante sekundære antistof ved hjælp af et fluorescerende mærke, der ikke overlapper med YFP-signalet (CY-3, f. eks.). Cellerne inkupereres ved stuetemperatur i 2 timer på en gynge-eller roterende platform. Efter 2 timer fjernes den sekundære antistof opløsning, og dæksedlerne vaskes med 3x i 10 min hver med PBS.
    4. Dæksedlerne vaskes i dobbelt deioniseret vand (DDW) i 10 min. Fjern DDW og tilsæt 300 μL/brønd af 0,015% thioflavin-S fortyndet i 50% ethanol i 10 min. Fjern thioflavin opløsningen og vask dæksedlerne 2x i 4 min hver med 50% ethanol, efterfulgt af en 4 min vaskes med 30% ethanol og to skyller i 5 min hver med 30% ethanol. Vask dæksedlerne 1x med DDW før montering.
      Bemærk: Den thioflavin-farvning, der er beskrevet i trin 5.2.4, er valgfri.
    5. For at montere dæksedlerne på glas slides skal du placere en enkelt dråbe af monterings mediet på "+" siden af et glas slide. Fjern al væske fra brønden, der indeholder glas dæksedlen, og fjern forsigtigt glas dæksedlen ved hjælp af fine pincet, og hold styr på, hvilken side der har de kultiverede celler.
    6. Tryk forsigtigt på kanten af dækglas mod en kimwipe for at fjerne overskydende fugt. Stadig griber dækglas med fine pincet, røre kanten (med celle siden vendt mod dråbe af monterings medier) af dækglas til monterings mediet, og derefter forsigtigt placere dækglas på monterings mediet (placere de kultiverede celler i monterings medier og klemme dem mellem dækglas og glas sliden). Lad monterings mediet hærde i 30 minutter før billeddannelse. Diasene kan opbevares ved-20 °C til fremtidig brug.
    7. Billede cellerne ved hjælp af et fluorescerende mikroskop og passende excitation/emission spektre (YFP = ~ 514/527 nm, CY-3 = ~ 555/568 nm, og thioflavin S = ~ 390/426 nm).

6. valgfri metoder

  1. Hver 2 dage, indsamle konditioneret medier fra kulturerne og opbevare det ved-20 °C for fremtidige analyser af Tau arter frigivet af kulturer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tau-rdlm-yfp-transduceret neuroner blev optælling tagget med yfp, og rdlm-transduceret kulturer viste aggregater efter transduktion. Disse inklusioner farves positivt for thioflavin (figur 1). Som figur 1 demonstrerer, denne protokol producerer neuronal kulturer, der viser thioflavin-positive Tau aggregater. For indledende eksperimenter, anbefales det, at neuronal differentiering bekræftes ved immun mærkning af neuron-specifikke markør β-Tubulin III i kulturer. Det er vigtigt, at optælling mærkede sekundære antistoffer har et excitation/emissions spektrum, der ikke overlapper med YPF (f. eks. Cy3). Selv om gule fluorescerende Tau aggregater vil være synlige i fravær af farvning, bør thioflavin også anvendes til billeddannelse for at bekræfte, at det fluorescerende signal er aggregeret Tau og ikke cellulære vragrester. Desuden omfatter eksemplet i figur 1 ikke dapi farvning til at mærke cellekerner som excitation/emission af dapi overlapper med thioflavin-S; alternative nuklei pletter bør anvendes med thioflavin-S hvis det ønskes.

Figure 1
Figur 1: Thioflavin farvning af transduceret kulturer. Neuroner transduceret med Tau-RDLM-YFP lentivirus blev fast og immun mærket med den neuron-specifikke markør β-Tubulin III (rød). Derudover, Tau aggregater (YFP signal i grøn) blev plettet for thioflavin (blå). Skala stænger = 25 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne protokol beskriver dannelsen af en in vitro-model af human tauopati, der udviser sølv-bejdde-positive aggregater og thioflavin-positive neurofibrillære tangles (NFTS). Desuden, transducerede celler viser Tau-induceret patologier såsom morfologiske defekter, reduceret synaptogenesis, og en øget lysosomale volumen. Den største fordel ved denne protokol er, at det giver en tilgængelig og omkostningseffektiv model af neuronal tauopati, som kan bruges til Drug screening undersøgelser, samt til analyse af Tau toksicitet. Denne model fylder et materielt behov i neurodegenerative forskning som humane tauopati cellelinjer er endnu ikke bredt tilgængelige og brugen af transgene Tau fra mus-afledte neuroner kræver dyreopdræt og er begrænset på grund af forskelle i neuronal karakteristika mellem arterne.

Ud over dem, der er anført ovenfor, er der en række kritiske skridt for en vellykket gennemførelse af denne procedure. Først skal du sikre, at den korrekte viral titer anvendes, fordi hvis den virale titer er for lav, vil kulturer ikke danne aggregater. For det andet skal du sørge for, at NSC kulturer vedligeholdes korrekt og ikke overstiger ~ 80% sammen løb. Overvækst af Nsc'er vil medføre for tidlig differentiering. Sidste, vente en fuld 4 uger for neuronal kulturer til at skelne efter at trække bFGF medier fra NSCs. Denne varighed er nødvendig for at sikre modning af neuroner.

Selv om den procedure, der er beskrevet ovenfor, er en effektiv metode til at fremstille en in vitro-tauopati-model, er der visse begrænsninger forbundet med denne protokol. Først, som beskrevet tidligere, denne metode producerer NFTs i menneskeskabte pluripotente stamcelle-afledte neuroner, men ikke i rotte embryonale (E18)-afledte neuroner. Selv efter brug af tre gange mere virus til transduce rotte neuroner end blev brugt til menneskelige neuroner, gnaver cellekulturer forblev negativ for thioflavin farvning, hvilket tyder på, at denne metode ikke kan tilpasses til gnavere kulturer. Forskellene mellem transduceret museceller og menneskelige neuroner kan skyldes den øgede tilbøjelighed af menneskelige Tau mod sammenlægning13. Den anden begrænsning af denne procedure er, at selv om Tau aggregater dannes i kulturer, ændringer i Tau fosforylering mellem Tau-RDLM-transduceret celler og Tau-WT-YFP-transduceret kulturer var målbart ved hjælp af protein PHF-1 (som opdager Tau fosforyleret på ser 396/ser 404) og CP13 antistoffer (som detekterer Tau fosforyleret ved ser 202). Disse fund tyder på, at Tau aggregering i Tau-RDLM-YFP kulturer på grund af P301L og V337M involverer en mekanisme, der er uafhængig af hyperfosforylering, eller niveauet af endogene Tau fosforylering er under detekterbart niveau ved immunoblot. På grund af manglen på forskelle i PHF-1 og CP13 immunoreactivity mellem Tau-RDLM-YFP og Tau-WT-YFP kulturer, er det uklart, hvorvidt denne model ville være nyttigt for undersøgelser analysere virkningerne af Tau kinase/fosfataseaktivitet på patologi. Men, både PHF-1 og CP13 antistoffer genkende regioner uden for det gentagne domæne husly mutationer; Derfor kan yderligere antistoffer rejst mod forskellige Tau fosforyleringsteder være nyttige for fremtidige undersøgelser.

Ud over cellekultur assays, denne model kan være et værdifuldt redskab for undersøgelser ud over cellekultur paradigme. For eksempel, exosomer isoleret fra medierne af transduceret celler indeholder giftige Tau arter. Exosomer er små sekretoriske vesikler frigivet fra næsten hver celletype, og exosomer har været impliceret i Tau formering14. Tau-RDLM neuronal exosomer indeholder menneskelige Tau, som kan påvises ved Western blot9, og disse exosomer er tilstrækkelige til at producere Tau inklusioner i den naive mus hjernen. Disse inklusioner er immunoreaktive for antistoffer specifikke for human Tau (K9JA), men det er uklart, om inklusioner omfatter aggregeret mus Tau. Den konstatering, der er beskrevet her, at proceduren ikke producerer thioflavin-positive farvning aggregater i gnaver neuroner tyder på, at inklusioner observeret i muse hjernen er sammensat udelukkende af menneskelige Tau, selv om fremtidige undersøgelser er nødvendige for at bekræfte sammensætningen af in vivo-indskud.

I betragtning af den tilsyneladende rolle exosomvesikler-afledt Tau i tauopatiies, den model, der er beskrevet her kan være en nyttig ressource for at undersøge den rolle, exosomvesikler i mæske Tau-induceret neurodegeneration. Afslutningsvis, denne procedure producerer en in vitro model af human tauopati, der har betydelige fordele i forhold til Transgene mus neuronal systemer og kan anvendes til en række prækliniske analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Dr. Peter Davies på Albert Einstein College of Medicine for at levere PHF-1 og CP13 antistoffer og Dr. Marc Diamond på University of Texas, Southwestern, for at give Tau konstruktioner. Dette arbejde blev understøttet af tilskud fra Alzheimer's Association (NIRG-14-322164) til S.H.Y. og fra California Institute for regenerative Medicine (TB1-01193) til P.R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm culture dishes Thermofisher 12556002
15 mL tubes Biopioneer CNT-15
16% paraformaldehyde Thermofisher 50-980-487
24 well culture plates Thermofisher 930186
50 mL tubes Biopioneer CNT-50
70% ethanol in spray bottle Various sources NA
B27 supplement Thermofisher 17504044
Basement membrane matrix (Matrigel) Corning 356231
Basic FGF Biopioneer HRP-0011
Bovine serum albumin Sigma A7906
Cell culture incubator Various sources NA
Centrifuge Various sources NA
DMEM-F12 culture media with glutamine Thermofisher 10565042
Ethanol (50% concentration or higher) Various sources NA
Flourescently labeled secondary antibodies Various Sources, experiment dependent NA
Fluorescent microscope Various sources NA
Glass coverslips Thermofisher 1254581
Glass slides Thermofisher 12-550-15
Human neural stem cells Various sources NA
Lentiviral vectors Various sources custom order
Mounting media Thermofisher P36934
N2 supplement Thermofisher 17502048
Penicillin-Streptomycin Thermofisher 15140122
Phosphate buffered saline Thermofisher 14190250
Primary antibodies Various Sources, experiment dependent NA
Rocking or rotating platform Various sources NA
Sterile cell culture hood Various sources NA
Thioflavin S Sigma T1892-25G
Triton X-100 Thermofisher BP151-100
Water bath Various sources NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rojas, J. C., Boxer, A. L. Neurodegenerative disease in 2015: Targeting tauopathies for therapeutic translation. Nature Reviews Neurology. 12, (2), 74-76 (2016).
  2. Kadavath, H., et al. Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (24), 7501-7506 (2015).
  3. Wang, Y., Mandelkow, E. Tau in physiology and pathology. Nature Reviews Neurology. 17, (1), 5-21 (2016).
  4. Gomez-Ramos, A., et al. Characteristics and consequences of muscarinic receptor activation by tau protein. European Neuropsychopharmacology. 19, (10), 708-717 (2009).
  5. Warmus, B. A., et al. Tau-mediated NMDA receptor impairment underlies dysfunction of a selectively vulnerable network in a mouse model of frontotemporal dementia. Journal of Neuroscience. 34, (49), 16482-16495 (2014).
  6. DeVos, S. L., et al. Tau reduction in the presence of amyloid-beta prevents tau pathology and neuronal death in vivo. Brain. 141, (7), 2194-2212 (2018).
  7. Cheng, J. S., et al. Tau reduction diminishes spatial learning and memory deficits after mild repetitive traumatic brain injury in mice. PLOS ONE. 9, (12), e115765 (2014).
  8. Ando, K., et al. Accelerated human mutant tau aggregation by knocking out murine tau in a transgenic mouse model. The American Journal of Pathology. 178, (2), 803-816 (2011).
  9. Reilly, P., et al. Novel human neuronal tau model exhibiting neurofibrillary tangles and transcellular propagation. Neurobiology of Disease. 106, 222-234 (2017).
  10. Kfoury, N., Holmes, B. B., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. I. Trans-cellular Propagation of Tau Aggregation by Fibrillar Species. The Journal of Biological Chemistry. 287, (23), 19440-19451 (2012).
  11. Yuan, S. H., et al. Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells. PLOS ONE. 6, (3), e17540 (2011).
  12. Marchenko, S., Flanagan, L. Passaging human neural stem cells. Journal of Visualized Experiments. (7), e263 (2007).
  13. Lathuiliere, A., et al. Motifs in the tau protein that control binding to microtubules and aggregation determine pathological effects. Scientific Reports. 7, (1), 13556 (2017).
  14. Asai, H., et al. Depletion of microglia and inhibition of exosome synthesis halt tau propagation. Nature Neuroscience. 18, (11), 1584-1593 (2015).
En in vitro model for at studere Tau aggregering ved hjælp af Lentiviral-medieret transduktion af humane neuroner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aulston, B., Liu, Q., Reilly, P., Yuan, S. H. An In Vitro Model for Studying Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons. J. Vis. Exp. (147), e59433, doi:10.3791/59433 (2019).More

Aulston, B., Liu, Q., Reilly, P., Yuan, S. H. An In Vitro Model for Studying Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons. J. Vis. Exp. (147), e59433, doi:10.3791/59433 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter