Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

מודל בלתי מתורבת לחקר הצבירה של הטאו באמצעות מתווך-התמרה בתיווך של הנוירונים האנושיים

doi: 10.3791/59433 Published: May 23, 2019

Summary

פרוטוקול זה מפרט הליך שבו התרבויות הנוירואליות של האדם מוטדיקות באמצעות בנייה ויראלית קידוד עבור מוטציה האדם האנושי. התמרה של תרבויות התצוגה ביחידות האוניברסיטה והפתווגיות הקשורות.

Abstract

צבירה חריגה של החלבון טאו מעורב באופן פתולוגי במספר מחלות ניווניות, כולל מחלת אלצהיימר (AD). למרות שדגמי העכבר של טאונופתיה סיפקו משאב בעל ערך לחקירת מנגנוני הנוירורעילים של האוניברסיטה הנצברת, הוא הופך להיות יותר ויותר ברור כי, בשל הבדלים בין מינים נוירופיזיולוגיה, המוח בעכבר אינו מתאים ל מידול המצב האנושי. ההתקדמות בשיטות תרבות התאים הפכו את התרבויות העצבי האנושיות לנגישות לשימוש ניסיוני בתחום החוץ וסייעו בפיתוח הneurotherapeutics. עם זאת, למרות ההסתגלות של תרבויות התאים הנוירואליות האנושית, במודלים של מבחנה של הטאופתיה האנושית עדיין אינם זמינים באופן נרחב. פרוטוקול זה מתאר את המודל התאי של הצבירה של הטאו שבו הנוירונים האנושיים מותמרים עם וקטורים הנגזרים מהאנטי-ויראליות הקוד עבור מוטציה בפתוניים התמזגו לכתב חלבון פלורסנט צהוב (YFP). תרבויות התמרה לייצר אגרגטים טאו הכתם באופן חיובי עבור thioflavin ולהציג סמנים של רעילות נוירולית, כגון אורך האקסון הופחת ונפח ליסוזומגדל. הליך זה עשוי להיות מודל שימושי וחסכוני ללימוד tauopathies אנושיים.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

צבירה פתולוגית של המיקרו-מחלות החלבון המקושר היא תכונה מוגדרת של הרבה במחלות ניווניות, כולל לספירה, דמנציה מתקדמת (ftd), מחלת ברים, ושיתוק מוחין גרעיני (PSP)1. במדינה שאינה חולה, מאוגד הטאו ומייצב את החוטים המיקרוסיבים העצביים ב-2. עם זאת, היפרזילציה הקשורים למחלות של הטאו מקדמת את צבירת הטאו, דיסוציאציה ממיקרוטובולים ורעילות עצבית3. ההשפעות הרעילות של הטאו הצבור עשוי להיות כרוך הפעלה חריגה של cholinergic4 ו glutamatergic קולטנים5 וכתוצאה מכך דיסתקנה של סידן תאיים ובסופו של דבר, מוות תאים. במודלים של בעלי חיים, הפחתת המוח המוחי משפרת את הפתולוגיה בעכברי לספירה6 ובדגמי העכבר של פגיעה מוחית טראומטית מתונה וחוזרת7.

ראיות הרכבה מעידות על כך שהמבנה והזיקה המחייבים של הטאו הנגזר מהעכבר נבדלים מטאו שנגזר על ידי האדם והעכבר טאו אינו מתאים לדוגמנות האדם tauopathies8. עם זאת, מודלים של תאי תאים אנושיים אינם זמינים מבחינה מסחרית. המטרה הכוללת של עבודה זו היא לתאר מודל בלתי מתורבת של הצבירה של הטאו שבו הנוירונים האנושיים מותמרים עם וקטורים הנגזרים המכילים מוטציה האדם בונה9. טאו הצבירה גרימת בנייה ויראלי מקודד לתחום החוזר של טאו מחסה P301L ו V337M מוטציות התמזגו כתבת YFP (טאו-RDLM-YFP) תוך שליטה בונה קוד עבור מסוג פראי (Wt) טאו לחזור התחום התמזגו לכתב YFP (טאו-Wt-YFP). התרבויות הנוירואליות משדיקות בשיטה זו מבטאות כתשע פעמים יותר טאו מאשר תרבויות שאינן מנתמרים. למרות שכמות הביטוי של הטאו מתבטאת במידה רבה בין התאים של טאו-RDLM-YFP-ובין טאו-אווט-יfp, רק נוירונים מותמרים ביחידות התצוגה של הטאו-RDLM. התרבויות התמרה את האור בעזרת טאו-rdlm-yfp באופן חיובי עבור thioflavin ולהציג הנחות באורך סיבי וצפיפות סינפטית. לכן, המודל התאי הזה עשוי להיות כלי שימושי לחקר הצבירה של הטאו בתוך מבחנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. הכנת מדיה וריאגנטים

  1. הפשרת ציפוי מטריצות של קרום המרתף ללוחות התרבות ב-4 ° צ' (אל תאפשר למטריצת הממברנה להתחמם או שהיא תפדה). הפוך את 1 mL ואחסן אותם ב-20 ° c או-70 ° c.
  2. מהווה מחדש את גורם הצמיחה פיברוהפיצוץ בסיסי (bFGF) ב מלוחים סטרילית מחסני פוספט (PBS) ב 10 μg/mL ולעשות 10 μL aliquots. אחסן אותם ב-4 ° c.
  3. לבקבוק חדש, לא נפתח, 500 mL של DMEM/F12 עם גלוטמין, להוסיף (10 מ ל), N2 (5 מ ל), ו פניצילין-סטרפטומיצין (5 mL). מקום 50 mL של תא גזע זה (המועצה לבטחון לאומי) מדיה בצינור חרוט ולהוסיף 10 μL של 10 μg/μL (2 μg/mL סופי) bFGF. אחסן את המדיה לבטחון לאומי (+) bFGF ב-4 ° c.
  4. כדי לבצע (-) bFGF מדיה, להשתמש באותו מתכון כפי שמתואר בשלב 1.3, אבל לא להוסיף bFGF. מדיה זו ישמש כדי להבדיל NSCs לנוירונים ולשמור על תרבויות עצבי לאחר בידול.

2. בנייה ויראלית

הערה: לפני תחילת העבודה עם מבנים לנטינגיניים, ודא שהמעבדה אושרה להשתמש בסוכני רמת בטיחות 2 (BSL-2). יתר על כן, BSL-2 ביגוד תרבות, ציוד הגנה אישית (PPE), ושיטות השמטה יש להשתמש כאשר עובדים עם וקטורים לעדשה.

  1. השגת מבנה הטאו הארוזה לתוך וירוס ממקור מועדף (ראו "סנדרס et al.10 " לבניית מידע).

3. האדם מתאים גזע עצבי האנושי

הערה: NSCs הם בדרך כלל נזרע ב-100,000 – 150000 תאים/cm2 והNSCs המסחרי הזמין ביותר נמכרים כמו 1 x 106 תאים/בקבוקון. פרוטוקול זה הותאם במיוחד עבור 10 ס מ מנות תרבות התא (אם כי בגדלים אחרים של מנות ניתן להשתמש); לכן, אם בשימוש NSCs מסחרית, הNSCs עשוי להיות מורחב על ידי להיות מתורבת בגיל שש-היטב מנות על מנת לגרום מספיק תאים לזרעים 10 ס"מ מנות. פרוטוקול זה ניתן להתאמה לחילופין עבור מגוון רחב של מידות התרבות תאים (אבל זה לא מכיל הוראות passaging NSCs כמו פרוטוקולים אלה זמינים במקומות אחרים11,12).

  1. להכנת לוחיות התרבות התא, להסיר אחד סדרת מחלקים של מטריצה קפואה ממברנה ציפוי מטריקס עבור לוחות תרבות התא ולאפשר לו להפשיר ב 4 ° צ' (האליבטים ניתן למקם ב 4 ° c לילה ביום לפני התאים הם להיות הזרע). הוסף 385 μL של ציפוי מטריצה מרתף ממברנה 5 מ ל של DMEM/F12 מדיה + פניצילין-.
    הערה:
    5 מ ל של dmem/F12 מדיה + פניצילין-הוא מספיק כדי מעיל אחד 10 ס מ צלחת (1 מ ל של המרתף הזה ממברנה ציפוי מטריצה מספיקה לעיל אחד טוב של מאכל שש-טוב). לחילופין, אם התאים הם להיות קבועים ומוכתם חיסוני, או מוכתם thioflavin, התרבות תאים על שמיכות זכוכית ב 24-היטב תרבות מנות.
    1. השאר את המדיה ואת ציפוי המטריקס קרים לפני ובזמן הוספתם למנות תרבות. הוסיפו את ציפוי מטריצת הממברנה למנות תרבות והניחו את המנות בחממה (ב37 ° c) במשך 1 h. לציפוי אופטימלי, לא מודתיאת מטריצת קרום המרתף עבור יותר או פחות מ 1 h. אחרי 1 שעות, משמסת את ציפוי מטריקס ממברנה מתוך מנות התרבויות תאים. ודא כי זה בסדר עם NSCs להיות מוכן להיות מצופה.
      הערה: אם התאים אינם מופשרים ממניות קפוא, לדלג על שלב 3.2 ולהמשיך עם שלב 3.3.
  2. אם התאים מופקרים ממניות המועצה לבטחון לאומי קפואים, לקחת בקבוקון של תאים קפואים ולחמם אותו באמבט מים מחומם 37 ° c על ידי הזזת הבקבוקון הלוך ושוב במים. לאחר הסדר, לרסס את המבחנה עם 70% אתנול ולמקם אותו לתוך המכסה התרבותי של התאים. העבר את התאים ~ 10 מ ל של Dמאמ/F12 + פניצילין-סטרפטומיצין מדיה ו צנטריפוגה את הצינור בטמפרטורת החדר ב 1,000 x g עבור 5 דקות. משלחים את התקשורת ומעבירים מחדש את התאים במדיה של המועצה לבטחון לאומי.
  3. דלל את התאים במדיית המועצה לבטחון לאומי כדי לקבל את צפיפות הזריעה המתאימה לכלי התרבות של התאים הנמצאים בשימוש.
    הערה: לדוגמה, אם NSCs מצופה על צלחת שש-היטב-אחת היטב על צלחת התרבות שש-היטב יש שטח שטח של 9 ס מ2-900,000 כדי 1,350,000 תאים נדרשים זרע. כך, בקבוקון אחד המכיל 1,000,000 תאים ניתן להשעות מחדש 2 מ ל של מדיה והוסיף לבאר אחת של שישה היטב צלחת.
  4. הוסף מספיק תאים הושעו בתקשורת המועצה לבטחון לאומי כדי לזרע את מנות המרתף מצופה מטריקס מלאי התרבות (100,000 תאים/cm2) ולשנות את המדיה בכל יום אחר (אם באמצעות מלאי קפוא, לשנות את התקשורת יום לאחר הציפוי ובכל יום אחר לאחר מכן). לגדל את התאים עד שהם 75% – 80% שוטפת.
    הערה: התאים צפויים להגיע 75% – 80% המפגש זמן קצר לאחר הציפוי, אבל זה עשוי להימשך זמן רב יותר אם מניות קפואות משמשות.
  5. לאחר שNSCs הינם 75% – 80%, התחילו בידול עצבי על-ידי הסרת המדיה ההמועצה לבטחון לאומי (+) bFGF והחלפתו במדיית המועצה לבטחון לאומי (-) bFGF. תרבות התאים במדיה זו (החלפת המדיה בכל יום אחר) למשך 4 שבועות לפחות.
    הערה: התאים ימשיכו להתחלק כמה ימים לאחר הנסיגה של bFGF; לפיכך, תאים עשויים להגיע ל-90-100% זרימה. לאחר culturing במשך 4 שבועות, התאים יהיו השיגו גורל עצבי יהיה מוכן לטיפול של הנגיף.

4. התמרה ואחזקה של תרבויות נירואליות

  1. כדי לשנות את הנוירונים עם וירוס, להשתמש בספירה סיכוייו של 3.4 x 105 יחידות הגלגול/תא (a 100% confluent 10 התבשיל ס"מ יכיל ~ 10,000,000 נוירונים). יש לדלל את היחידות הנוספות לריכוז הדרוש במדיית התרבות התאית ולהוסיפם לתאים (להשתמש בנפח המדיה הרגיל לצלחת תרבות התא). יומיים לאחר הוספת הווירוס, לשטוף את התאים 1x עם טרי (-) bFGF מדיה (ללא וירוס) ולהמשיך culturing ב (-) bFGF מדיה כרגיל.
  2. לטיפול פוסט-לנטינגיל, האכילו את הנוירונים באמצעות שינוי מדיה לתרבות התא ([-] bFGF מדיה) בכל יום אחר. שמור על התאים במשך ~ 8 שבועות לאחר התמרה. להמחיש באופן שגרתי את התאים תחת מיקרוסקופ קל כדי להבטיח קיום.
    הערה: השבירה Sparseness או הדנדריטים הם סימנים כי התאים הם כבר לא קיימא.

5. הדמיה של תאים

  1. הדמיה של תא חי
    1. לאחר התמרה (4 ימים לאחר התוספת של הנגיף), להתבונן אותות YFP תחת מיקרוסקופ פלורסנט המסוגל הדמיה בשידור חי. קחו את מנות התרבות הסלולרית אל מחוץ לחממה וודאו שבארות התרבות נשארות סטריליות על ידי שמירה על מכסה המטבח העליון. המחש את התאים באמצעות מטרה 10x עם אורך גל עירור של ~ 514 ננומטר ו מסנן פליטה של ~ 527 nm.
      הערה: אגרגטים נראים בדרך כלל בתרבויות תאים מותמרים 6 – 8 ימים לאחר היישום של הנגיף.
  2. תא קבוע צביעת (β-טובולין III תיוג ו thioflavin כתמים)
    1. כדי לתקן את התאים של פאראפורמלדהיד (בתוך הקופה), להסיר את התקשורת התרבותית מפני מתאי נוירונים גדלו על כיסוי זכוכית. לשטוף את התאים 1x עם PBS, להסיר את הכביסה, ולהוסיף 300 – 500 μL (אם באמצעות הצלחות 24-טוב) של 4% בתחתית (מדולל ב-PBS) כדי כיסוי עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר. להסיר את הה, ולשטוף את הכיסויים 2x עם PBS.
    2. הכנת פתרון חסימה המורכב של PBS, 3% בסרום שור (BSA), ו 0.3% טריטון X-100. הוסף 300 – 500 μL של הפתרון לבארות והדגירה את הכיסויים עבור 2 h ב 4 ° c. לאחר 2 h, לדלל נוגדנים ראשוניים (בריכוז נוגדן של 1:500) בפתרון חסימה ולהוסיף 300 – 500 μL של פתרון הנוגדן העיקרי לכל טוב. מניחים את הצלחת על רציף נדנדה או מסתובב (במהירות נמוכה) לילה ב 4 ° c.
    3. למחרת, להסיר את הפתרון העיקרי נוגדן ולשטוף את 3x שמיכות עבור 5 דקות כל אחד עם PBS. לדלל נוגדנים משניים בפתרון מאגר חוסם (בריכוז של 1:1000) ולהוסיף פתרון נוגדן משני כל טוב. בחר את הנוגדן המשני המתאים באמצעות תג פלורסנט שאינו חופף לאות YFP (CY-3, לדוגמה). דגירה את התאים בטמפרטורת החדר עבור 2 על על הנדנדה או פלטפורמת מסתובבת. לאחר 2 h, להסיר את הפתרון נוגדן משני ולשטוף את 3x שמיכות עבור 10 דקות כל אחד עם PBS.
    4. שטוף את הכיסויים במים כפולים (DDW) עבור 10 דקות. הסר את DDW ולהוסיף 300 μL/טוב של 0.015% thioflavin-S מדולל ב 50% אתנול עבור 10 דקות. הסר את הפתרון thioflavin ולשטוף את שמיכות 2x עבור 4 דקות כל אחד עם 50% אתנול, ואחריו 1 4 דקות לשטוף עם 30% אתנול ושני שטיפת עבור 5 דקות כל אחד עם 30% אתנול. לשטוף את שמיכות 1x עם DDW לפני הרכבה.
      הערה: הצביעת העצמי המתואר בשלב 5.2.4 היא אופציונלית.
    5. כדי לטעון את הכיסויים לשקופיות זכוכית, הנח טיפה יחידה של מדיה המתקנת בצידו "+" של שקופית זכוכית. להסיר את כל הנוזל מן הבאר המכילה את שמיכות זכוכית, באמצעות מלקחיים עדינים, בזהירות להסיר את שמיכות זכוכית, שמירה על מסלול של איזה צד יש תאים מתורבתים.
    6. לחץ בעדינות על הקצה של הכיסויים כנגד Kimwipe כדי להסיר לחות עודפת. עדיין מרתק את coverslip עם מלקחיים עדינים, לגעת בקצה (עם צד התא פונה לכיוון טיפת מדיה הרכבה) של coverslip למדיה הרכבה, ולאחר מכן, בעדינות למקם את coverslip על מדיה הרכבה (הצבת תאים מתורבתים לתוך הרכבה תקשורת וsandwiching אותם בין הכיסויים לבין שקופית הזכוכית). הניחו למדיה המתקנת להיות הבשלה למשך 30 דקות לפני ההדמיה. ניתן לאחסן את השקופיות ב-20 ° c לשימוש עתידי.
    7. התמונה התאים באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט ואת מגוון עירור/פליטה המתאים (YFP = ~ 514/527 ננומטר, CY-3 = ~ 555/568 nm, ו thioflavin S = ~ 390/426 nm).

6. שיטות אופציונליות

  1. כל יומיים, לאסוף מדיה ממוזג מן התרבויות ולאחסן אותו ב-20 ° c לניתוח עתידי של מינים טאו שפורסמו על ידי תרבויות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

טאו-RDLM-YFP-התמרה הנוירונים הייתה מתוייגת בעזרת YFP, ו RDLM-התמרה תרבויות הציג אגרגטים לאחר התמרה. אלה הכללות מוכתם חיובי עבור thioflavin (איור 1). כפי שאיור 1 ממחיש, פרוטוקול זה מייצר תרבויות נוירואליות המציגות את האגרגטים החיוביים של הטאו. עבור ניסויים ראשוניים, מומלץ כי בידול עצבי הוא אישר על ידי אימונויניום לסמן את העצב הספציפי β-טובולין III בתרבויות. חשוב מכך, פלואור מתויג באמצעות נוגדנים משניים צריך להיות הספקטרום עירור/פליטה כי אינו חופף עם זה של YPF (Cy3, למשל). למרות הפלורסנט הצהובה אגרגטים הניאון יהיה גלוי בהעדר של כתמים, thioflavin צריך לשמש גם עבור הדמיה כדי לאשר את האות הניאון הוא צבור טאו ולא פסולת סלולרית. בנוסף, הדוגמה באיור 1 אינה כוללת כתמים של dapi כדי לתייג את גרעיני התא כעירור/פליטה של dapi חופפים לאלה של thioflavin-S; כתמי גרעינים חלופיים יש להשתמש עם thioflavin-S אם הצורך.

Figure 1
איור 1: Thioflavin כתמים של תרבויות התמרה. נוירונים מרוטרים עם ה-"טאו-RDLM-YFP-וירוס" היו קבועים ואימונויניום עם β-טובולין III (אדום). בנוסף, יחידות הטאו (אות YFP בירוק) היו מוכתמות עבור thioflavin (כחול). קנה מידה של פסים = 25 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

פרוטוקול זה מתאר את הדור של מודל בלתי מתורבת של טאונופתיה האנושית שמוצגים כסף-כתם חיובי אגרגטים ו thioflavin-חיובי נוירופיבריליאן סבך. יתר על כן, תאים התמרה להציג הפתולוגית המושרה טאו כגון פגמים מורפולוגיים, synaptogenesis מופחתת, ונפח ליסוזוממוגבר. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שהוא מספק מודל נגיש וחסכוני של טאונופתיה עצבית, שניתן להשתמש בו ללימודי סינון סמים, כמו גם לניתוח רעילות של הטאו. מודל זה ממלא את הצורך החומרי במחקר ניווניות כמו קווי התאים של טאונופתיה אנושיים עדיין לא זמין באופן נרחב והשימוש של הטאו טרנסגניים מפני העכבר הנגזרים הנוירונים דורש גידול בעלי חיים והוא מוגבל בשל הבדלים עצביים מאפיינים בין מינים.

בנוסף לאלה המפורטים לעיל, קיימים מספר שלבים קריטיים להצלחת הליך זה. ראשית, לוודא את סיכוייו הנגיפי הנכון משמש כי אם סיכוייו הנגיפי נמוך מדי, התרבויות לא יוצרים אגרגטים. שנית, ודא שתרביות המועצה לבטחון לאומי נשמרות כראוי ואינן חורגות מ-~ 80% זרימה. גידול יתר של NSCs יגרום לבידול מוקדמת. אחרון, לחכות 4 שבועות מלא עבור תרבויות עצבי להבדיל לאחר נסיגה מדיה bFGF מן NSCs. משך זה הוא הכרחי כדי להבטיח התבגרות של הנוירונים.

למרות שההליך המתואר לעיל הוא שיטה יעילה להפקת מודל טאונופתיה של הפריה חוץ גופית, קיימות מספר מגבלות הקשורות לפרוטוקול זה. ראשון, כפי שמתואר קודם לכן, שיטה זו מייצרת בתרי האדם בתאי גזע המושרה האנושי pluriפוטנטי, אך לא עובריים (E18), הנגזרות הנוירונים. גם לאחר שימוש שלוש פעמים יותר וירוס לשנות את הנוירונים עכברוש מאשר שימש הנוירונים האדם, מכרסמים תאים תרבויות נשאר שלילי עבור thioflavin כתמים, אשר מציע כי שיטה זו לא ניתן להתאים עבור תרבויות מכרסמים. ההבדלים בין תאי עכבר מתתמרים לבין הנוירונים האנושיים עשויים להיות בשל הנטייה המוגברת של הטאו האנושי כלפי צבירת13. המגבלה השנייה של הליך זה היא שלמרות שאגרגטים באוניברסיטת תל-אביב מיוצרים בתרבויות, שינויים בתאי זירחון בין התאים בטאו-RDLM ו-טאו-Wt-YFP-התרבויות לא ניתן לגילוי באמצעות חלבון PHF-1 (המזהה את טאו (מ404) ו-CP13 נוגדנים (המאתרות את הטאו ב-Ser 202). ממצאים אלה מראים כי הצבירה של הטאו בתרבויות האוניברסיטה-RDLM-YFP בשל P301L ו V337M כרוך מנגנון כי הוא עצמאי של היפרלציה, או את רמת הזירחון טאו אנדוגניים הוא תחת הרמה לזיהוי על ידי בכתם חיסוני. בשל היעדר הבדלים PHF-1 ו CP13 החיסונית בין הטאו-RDLM-YFP ו-טאו-Wt-YFP תרבויות, לא ברור אם מודל זה יהיה שימושי עבור מחקרים ניתוח ההשפעות של טאו קינאז/פוספאטואז פעילות על פתולוגיה. עם זאת, שני הנוגדנים PHF-1 ו CP13 לזהות אזורים מחוץ לתחום החוזר מחסה את המוטציות; לפיכך, נוגדנים נוספים המוגדלים נגד אתרי הזילציה השונים עשויים להועיל ללימודים עתידיים.

בנוסף לתרבות התא assays, מודל זה עשוי להיות כלי רב ערך למחקרים מעבר לפרדיגמת תרבות התא. למשל, אקסוזומים מבודדים מאמצעי התקשורת של תאים מתתמרים מכילים מינים רעילים של הטאו. אקסוזומים הם הסוד הקטן ושלפוחיות שפורסמו כמעט כל סוג תא, ו האקסוזומים היו מעורבים בשנת הפצת הטאו14. טאו-RDLM עצבי הגוף מכילים את הטאו האנושי אשר מוכרים על ידי כתמים מערביים9, ו האקסוזומים אלה מספיקים כדי לייצר הכללות טאו במוח העכבר נאיבי. ההכללות הללו הן מערכת חיסונית עבור נוגדנים ספציפיים של האדם (K9JA), אבל לא ברור אם ההכללות כוללות מצבור העכבר טאו. הממצא תיאר כאן כי ההליך אינו מייצר thioflavin-חיובי מכתים אגרגטים בנוירונים מכרסמים מציע כי ההכללות נצפתה במוח העכבר מורכבים כולו של האדם טאו, למרות מחקרים עתידיים נדרשים לאשר הרכב בהפקדות vivo.

בהתחשב בתפקיד לכאורה של הטאו הנגזר אקסוחלק ב tauopathies, המודל המתואר כאן עשוי להיות משאב שימושי לבדיקת התפקיד של האקסוחלק הנגרמת ניוון שמקורם באוניברסיטת טאו. לסיכום, הליך זה מייצר מודל בלתי מתורבת של הטאונופתיה האנושית שיש לו יתרונות משמעותיים על פני מערכות עצבי העכבר הטרנסגניים והוא יכול להיות מועסק למגוון ניתוחים פרה-קליניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

המחברים רוצים להודות לד ר פיטר דייויס במכללת אלברט איינשטיין לרפואה בגין אספקת הנוגדנים PHF-1 ו-CP13 ו ד ר מארק דיאמונד באוניברסיטת טקסס, בדרום-מערב, למתן מבנים של הטאו. עבודה זו נתמכת על ידי מענקים של האגודה לאלצהיימר (נירנברג g-14-322164) כדי S.H.Y. ומהמכון קליפורניה לרפואה רגנרטיבית (TB1-01193) ליחסי ציבור

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm culture dishes Thermofisher 12556002
15 mL tubes Biopioneer CNT-15
16% paraformaldehyde Thermofisher 50-980-487
24 well culture plates Thermofisher 930186
50 mL tubes Biopioneer CNT-50
70% ethanol in spray bottle Various sources NA
B27 supplement Thermofisher 17504044
Basement membrane matrix (Matrigel) Corning 356231
Basic FGF Biopioneer HRP-0011
Bovine serum albumin Sigma A7906
Cell culture incubator Various sources NA
Centrifuge Various sources NA
DMEM-F12 culture media with glutamine Thermofisher 10565042
Ethanol (50% concentration or higher) Various sources NA
Flourescently labeled secondary antibodies Various Sources, experiment dependent NA
Fluorescent microscope Various sources NA
Glass coverslips Thermofisher 1254581
Glass slides Thermofisher 12-550-15
Human neural stem cells Various sources NA
Lentiviral vectors Various sources custom order
Mounting media Thermofisher P36934
N2 supplement Thermofisher 17502048
Penicillin-Streptomycin Thermofisher 15140122
Phosphate buffered saline Thermofisher 14190250
Primary antibodies Various Sources, experiment dependent NA
Rocking or rotating platform Various sources NA
Sterile cell culture hood Various sources NA
Thioflavin S Sigma T1892-25G
Triton X-100 Thermofisher BP151-100
Water bath Various sources NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rojas, J. C., Boxer, A. L. Neurodegenerative disease in 2015: Targeting tauopathies for therapeutic translation. Nature Reviews Neurology. 12, (2), 74-76 (2016).
  2. Kadavath, H., et al. Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (24), 7501-7506 (2015).
  3. Wang, Y., Mandelkow, E. Tau in physiology and pathology. Nature Reviews Neurology. 17, (1), 5-21 (2016).
  4. Gomez-Ramos, A., et al. Characteristics and consequences of muscarinic receptor activation by tau protein. European Neuropsychopharmacology. 19, (10), 708-717 (2009).
  5. Warmus, B. A., et al. Tau-mediated NMDA receptor impairment underlies dysfunction of a selectively vulnerable network in a mouse model of frontotemporal dementia. Journal of Neuroscience. 34, (49), 16482-16495 (2014).
  6. DeVos, S. L., et al. Tau reduction in the presence of amyloid-beta prevents tau pathology and neuronal death in vivo. Brain. 141, (7), 2194-2212 (2018).
  7. Cheng, J. S., et al. Tau reduction diminishes spatial learning and memory deficits after mild repetitive traumatic brain injury in mice. PLOS ONE. 9, (12), e115765 (2014).
  8. Ando, K., et al. Accelerated human mutant tau aggregation by knocking out murine tau in a transgenic mouse model. The American Journal of Pathology. 178, (2), 803-816 (2011).
  9. Reilly, P., et al. Novel human neuronal tau model exhibiting neurofibrillary tangles and transcellular propagation. Neurobiology of Disease. 106, 222-234 (2017).
  10. Kfoury, N., Holmes, B. B., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. I. Trans-cellular Propagation of Tau Aggregation by Fibrillar Species. The Journal of Biological Chemistry. 287, (23), 19440-19451 (2012).
  11. Yuan, S. H., et al. Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells. PLOS ONE. 6, (3), e17540 (2011).
  12. Marchenko, S., Flanagan, L. Passaging human neural stem cells. Journal of Visualized Experiments. (7), e263 (2007).
  13. Lathuiliere, A., et al. Motifs in the tau protein that control binding to microtubules and aggregation determine pathological effects. Scientific Reports. 7, (1), 13556 (2017).
  14. Asai, H., et al. Depletion of microglia and inhibition of exosome synthesis halt tau propagation. Nature Neuroscience. 18, (11), 1584-1593 (2015).
מודל בלתי מתורבת לחקר הצבירה של הטאו באמצעות מתווך-התמרה בתיווך של הנוירונים האנושיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aulston, B., Liu, Q., Reilly, P., Yuan, S. H. An In Vitro Model for Studying Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons. J. Vis. Exp. (147), e59433, doi:10.3791/59433 (2019).More

Aulston, B., Liu, Q., Reilly, P., Yuan, S. H. An In Vitro Model for Studying Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons. J. Vis. Exp. (147), e59433, doi:10.3791/59433 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter