Summary
여기서, 우리는 정상적인 발달 과정을 방해 하지 않고 제 브라 피시 배아의 크기를 감소 시키는 방법을 설명 한다. 이 기술을 사용 하면 크기 변경에 대 한 패턴 스케일링 및 개발 견고성을 연구할 수 있습니다.
Abstract
발달 과정에서, 배아는 자신의 신체 크기에 자신의 신체 패턴을 일치 시키는 현저한 능력을 나타낸다; 그들의 신체 비율은 특정 한계 내에서 더 크거나 작은 배아 에서도 유지 됩니다. 이 스케일링 현상은 한 세기 동안 주목을 받고 있지만, 근본적인 메커니즘을 이해 하는 것은 다양 한 크기의 배아에서 발달 역학에 대 한 정량적 인 설명의 부족으로 인해 제한 되었습니다. 이 한계를 극복 하기 위해, 우리는 생체 내 라이브 이미징에 대 한 큰 이점이 zebrafish 배아의 크기를 감소 시키는 새로운 기술을 개발 했습니다. 우리는 별도의 단계에서 blastula 단계에서 세포와 노 른 자의 균형 잡힌 제거 후, 배아는 신속 하 게 올바른 조건에서 회복 하 고 더 작은 하지만 그렇지 않으면 정상적인 배아로 발전 할 수 있음을 보여줍니다. 이 기술은 특별 한 장비가 필요 하지 않기 때문에 쉽게 적응 할 수 있으며, 형태 적 매개 패터 닝의 견고성을 포함 하 여 광범위 한 스케일링 문제를 연구 하는 데 사용 됩니다.
Introduction
과학자 들은 배아 크기가 자연 및 실험 조건1,3에서 크게 다를 수 있지만 태아가 일정 한 신체 비율을 형성 하는 현저한 능력을가지고 있다고 오랫동안 알려져 있다. 이론 및 실험적 연구의 수십 년에도 불구 하 고, 크기 변화에이 견고성, 불리는 스케일링, 그리고 그것의 근본적인 메커니즘은 많은 조직과 기관에서 알 수 없는 남아. 직접 개발 시스템의 역학을 포착 하기 위해, 우리는 생체 내 라이브 이미징5에서 큰 이점을가지고 zebrafish4에서 재현 가능 하 고 간단한 크기 감소 기술을 확립 했다.
Zebrafish는 발달 생물학을 포함 하 여 생물학의 여러 학문을 연구 하는 동물 모델 척추 동물 역임 했습니다. 특히, 제 브라 피쉬는 생체 내 라이브 이미징 (6 ) 때문에 1) 개발이 정상적으로 진행 될 수 있으며 모와 달걀 껍질, 그리고 2) 배아가 투명 하다. 또한, 배아는 일부 온도 및 환경 변동을 견딜 수 있으며,이는 실험실 조건에서 공부 하는 것을 허용 한다. 또한, 모 르 폴 리노와 mRNA 주입7,8에의 한 종래의 유전자 발현 섭 동에 더하여, 최근 CRISPR/Cas9 기술의 진보는 제 브라 피쉬 고효율9에서 역 유전학을 만들었다. 더욱이, 세포 이식 또는 조직 수술과 같은 발생 학의 많은 고전 기술이4,10,11에 적용 될 수 있다.
원래 크기 감소 기법은 수 륙 양용 및 기타 비 척추 동물 동물12에서 개발 되었다. 예를 들어, xenopus laevis에서 또 다른 인기 있는 척추 동물 동물 모델 인 blastula 단계에서 동물-식물성 축을 따라 양분는 크기 감소 배아12,13을 생산할 수 있다. 그러나, 우리의 손에서이 한 단계 접근은 제 브라 물고기에 있는도 배 화 된 배아를 초래 하 고, 아마도 등 쪽 결정 개미는 불균일 하 게 분포 하 고 하나는 배아의 형태학에서 그들의 현지화를 알 수 없습니다. 여기에서 우리는 일반적으로 개발 하지만 작은 배아를 생산 zebrafish에 대 한 대안 2 단계 베 지 기법을 보여줍니다. 이 기술을 통해 세포는 처음에는 동물 극에서 제거 되 고, 조직자 활동에서 부족 한 순진한 세포의 영역입니다. 노 른 자와 세포의 양을 균형을 유지 하기 위해,이는 상피와 이후의 형태 형성에 중요 한, 노 른 자는 제거. 여기서는이 프로토콜에 대해 상세히 설명 하 고, 패턴 형성에서의 크기 불변의 두 가지 예를 제공 합니다. 솜 사이트 형성 및 복 부 신경 튜브 패터 닝. 정량적 이미징과 결합 하 여 크기 감소 기법을 활용 하 여 진드기와 신경 관의 크기가 감소 된 배아의 크기에 미치는 영향을 조사 했습니다.
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Protocol
모든 어류 관련 절차는 하버드 의과대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 승인을 받아 수행 하였다.
1. 공구 및 시 약 준비
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배아를 잘라 와이어 루프를 확인
- 직경 40 μ m의 견고 하 고 부식성이 없는 스테인레스 스틸 와이어 20cm를 사용 하십시오. 와이어를 통해 유리 모 세관 (1.0 mm 외경, 0.5 mm 내경, 필 라 멘 트 없음)을 반복 하 여 상단에 작은 루프를 작성 합니다 (루프 길이는 1.0 mm입니다).
- 제자리에 고정 하기 위해 와이어 루프 사이의 유리 모 세관의 끝에 명확한 매니큐어의 약간의 방울을 넣어. 건조 시켜 주세요. 배아를 손상 시킬 수 있으므로 루프 부분에 매니큐어를 주지 않도록 하십시오.
- 나무 젓가락 (9 "대나무 일회용 젓가락 반으로 깨진)에 루프와 유리 모 세관을 부착 실험실 테이프를 사용 하 여. 유리 모 세관의 약 2.5 cm 정도를 두고 젓가락을 넘어, 도구 젓가락 부분이 물에 담 그 지 않도록 하십시오. 이 길이를 기본 설정으로 조정 합니다.
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또는, 유리 바늘을 만들어 배아를 잘라
- 손으로 다른 쪽을 잡고 유리 파스퇴르 피 펫의 한쪽 끝을 집게로 핀치 하십시오. 파이 펫의 얇은 부분을 영 램프 또는 분 젠 버너 위에가 열 하십시오.
- 유리 피 펫을 손으로 당깁니다. 이상적인 파이 펫은 약 30 μ m의 지름과 완만 한 곡선 (곡률 반경 = 약 5mm)입니다. 적절 한 직경과 곡률은 연습과 약간의 기회와 함께 얻어진 다.
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메 틸 셀 룰로 오 스 준비
- 메 틸 셀 룰로 오 스는 자르고 있는 동안 배아를 보유 하는데 사용 된다. ⅓ x 링거 용액에 2% 메 틸 셀 룰로 오 스 용액을 만든다 (116 mm 염화 나트륨, 2.9, 1.8 mm cacl 2 및 에틸 piperazineethanesulfonic 7.2 산). 메 틸 셀 룰로 오 스 분말을 ⅓ x 링거 용액에서 밤새 4°c에서 흔들어 주세요.
- 선택적으로, 용액을 볼 수 있도록, 적색까지 10 mL 2% 메 틸 셀 룰로 오 스 용액에 ~ 1.5 mL의 페 놀 레드 (0.5% DPBS 원 액)를 첨가 한다. 색이 균일 해질 때까지 흔들어 주세요.
2. 수술 크기 감소를 위한 제 브라 피쉬 배아의 제조
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배아 수집
- 한 두 개의 수 컷과 하나 또는 두 개의 암컷 제 브라 피쉬를 많은 물로 채워진 결합 챔버에서 배치 하십시오. 플라스틱 분배기를 사용 하 여 남성과 여성을 분리 합니다. Somite 이미징 (섹션 4)과 신경 튜브 이미징에 대 한 신경 관 패터 닝의 형질 전환 리포터 라인 (nkx dbx1b: gfp또는 Olig2)을 위한 AB 라인을 사용 한다. 밤새 챔버에 두십시오.
참고: 성인의 선택은 수술을 잘 견 뎌 내는 계란을 얻는 데 중요 합니다. 일반적으로, 젊은 건강 한 여성은 건강 한 계란을 생산. - 다음날 아침, 챔버를 얕은 물로 옮겨 놓고 약간의 기울기로 챔버를 놓습니다. 물고기가 짝을 수 있도록 구분선을 제거 합니다.
- 차 여과기에 붓고 계란을 수집 합니다. 계란 물이 있는 페 트리 접시에 계란을 전달 (20배 계란 물, 6 g 인스턴트 바다 소금, 1.5 g caso4 및 1lh2o; 1x에서 사용). 더 나은 준비를 위해, 산란 직후 계란을 수집 합니다. 배아를 28.5 ° c 인큐베이터에 넣습니다.
- 필요한 경우 일반적인 프로토콜7,8에 따라 1 ~ 4 개의 세포 단계에서 모 폴 리노, mRNA 등을 주사 하십시오. 신경 관 화상 진 찰을 위한 형광 막 상표 (mem-mCherry, mem-mBFP1또는 mCitrine)를 위한 mRNA를 주입 하십시오 (단면도 5).
- 한 두 개의 수 컷과 하나 또는 두 개의 암컷 제 브라 피쉬를 많은 물로 채워진 결합 챔버에서 배치 하십시오. 플라스틱 분배기를 사용 하 여 남성과 여성을 분리 합니다. Somite 이미징 (섹션 4)과 신경 튜브 이미징에 대 한 신경 관 패터 닝의 형질 전환 리포터 라인 (nkx dbx1b: gfp또는 Olig2)을 위한 AB 라인을 사용 한다. 밤새 챔버에 두십시오.
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Dechorionate를 사용 하 여
- 128-세포 주위에 256-세포 단계, 계란 물이 채워진 35 mm 유리 접시에 건강 한 배아를 전달 하십시오. 접시에서 가능한 한 많은 계란 물을 제거 하십시오.
- 20 밀리 그램/mL의 대명사 1 mL를 추가 합니다. 접시를 이동 하 여 배아를 부드럽게 소용돌이 치고, 유리 피 펫을 사용 하 여 dechor이온화를 돕기 위해 용액을 부드럽게 피 펫 합니다.
- Chorions가 탄력성을 잃기 시작 하면 (일반적으로 계란과 물의 양에 따라의 대명사를 첨가 한 후 1-4 분), 가능한 한 많은 계란 물을 추가 하 여 프로 네 나를 희석 시킨다. 집게로 chorion을 부드럽게 만져 서 탄력성 손실을 평가 하십시오. chorion은 즉시 다시 튀는 없이 덴트를 보유 해야 합니다. 유리 파이 펫을 사용 하 여 계란 물을 다른 접시에 전달 하십시오 (이 시점에서 대부분의 chorions는 파손 되지 않음).
- 또는, 배아를 공기에 노출 시 키 지 않고 계란 물로 채워진 큰 400 mL 유리 비 커에 접시에서 부드럽게 붓 습니다. 그런 다음 배아를 완전히 침전 시킵니다. 배아가 한쪽으로 떨어질 수 있도록 비 커를 기울입니다. 유리 피 펫을 사용 하 여이 배아 들을 모으고 ⅓ x 링거 용액으로 채워진 새로운 35 mm 유리 접시로 옮겨 보세요.
- 대부분의 chorions가 탄력성을 완전히 잃을 때까지 몇 분간 기다리십시오. 계란을 부드럽게 피 펫 팅 하 여 배아에서 남은 융 삭을 제거 합니다. 손상 된 배아를 제거 하 고 28.5 ° c 배양 기에서 배아를 배양 한다.
3. 수술 크기 감소 및 회복
- 깨끗 한 35 mm 유리 접시를 준비 하십시오. 플라스틱 주걱을 사용 하 여 더 큰 요리의 바닥 중앙 근처에 약 0.5 mL의 메 틸 셀 룰로 오 스 (⅓ x 링거 용액에 페 놀 레드를 사용 하 여)를 넓게 펴 주세요. 메 틸 셀 룰로 오 스를 얇고 고르게 약 0.5 mm의 두께로 펴 바릅니다.
- 약 30 mL의 ⅓ x 링거 용액을 접시의 측면에 붓고 나머지 접시에 펴 넣고 메 틸 셀 룰로 오 스를 덮어 줍니다.
- 2% 메 틸 셀 룰로 오 스에 256 세포 1k-세포 단계에서 dechorated 배아를 놓습니다. 양쪽에 배아의 방향을 조정 하 여 세포와 노 른 자 모두를 가시화 한다. (그림 1)
- 와이어 루프 (또는 유리 바늘)를 사용 하 여 동물-식물성 축에 수직으로 절단 하 여 동물 폴 근처의 배 반 덤 으로부터 약 30% ~ 40%의 세포를 잘라 냅니다 (그림 1, 상단 패널). 세포를 제거한 후, 끝을 가볍게 두 드려 나머지 세포가 다시 붙을 수 있도록 돕습니다. 몇 분 안에 배아가 치유 되기 시작할 때 죽은 세포가 벗 겨 야 합니다.
- 노 른 자를 "자르고" 대신 식물성 극 근처의 노 른 자에 게 작은 상처를 만듭니다 (그림 1 중간 패널). 장착 된 철사로 계란 막을 nicking으로 난 황을 감 겨 냅니다. 노 른 자는 부상 후 몇 분 동안 밖으로 스며 나 고 상처가 치유 됩니다 (그림 1 하단 패널).
- 노 른 자가 밖으로 나 가지 않는 것을 멈출 때, 동일한 접시에 메 틸 셀 룰로 오 스 외부의 pipet를 사용 하 여 배아를 이동 하 여 더 나은 회복을 가능 하 게 합니다.
- 모든 배아에 대해 3.4-3.6 단계를 반복 합니다. 배아가 회복 되는 동안에는 접시를 30 분 동안 안정 하 게 두십시오.
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배아를 신선한 ⅓ x 링거 용액으로 새 접시에 옮겨 넣고 28.5 ° c 인큐베이터에 넣어 완전히 회복할 수 있도록 하십시오.
- 선택적 관심 단계가 초기 somite 단계 인 경우, 배아는 보호막 단계까지 28.5 ° c에서 인큐베이션 된 후 20°c에서 인큐베이션 될 수 있으며, 실험 및 이미징에 대 한 타이밍을 조정 한다.
4. 제 브라 피시 Somitogenesis의 라이브 이미징
- 달걀 물 100에 1 g의 아가 로스를 첨가 하 고, 아가 로스가 완전히 용 해 될 때까지가 열 하 여 1% 아가 로스 용액 100 ml를 준비 합니다. 5-10 분의 온도를 62-72 ° c로 식혀 주세요.
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이미징 용 마운트를 준비 합니다.
참고: 이 가이드는 반전 와이드 필드 현미경과 함께 사용 하기 위해 개발 되었다.- 100 mm x 15mm 플라스틱 페 트리 디쉬에 15 mL의 1% 아가 로스를 붓 습니다.
- 조심 스럽게 등 쪽 마운트 V1 몰드 템플릿5 를 페 트리 디쉬의 바닥에 놓는다. 물에 15 mL 튜브와 같은 무게를 사용 하 여 바닥에 곰 팡이를 유지 합니다.
참고: 이는 배아가 거꾸로 현미경을 사용 하는 경우 가능한 한 페 트리 디쉬의 바닥에 가깝게 되도록 하기 때문 이다. 배아가 somite 이미징을 위해 횡 방향으로 장착 되어 있지만, 여기 등 쪽 마운트 V15 는 초기 somite 단계에서 배아를 더 잘 보유 하 고 있기 때문에 사용 됩니다. - 아가 로스가 완전히 응고 될 때까지 식혀 주세요. ~ 30 mL의 달걀 물에 0.01%의 트리 라인을 붓고 집게로 조심 스럽게 벗으 면 서 몰드를 제거 합니다.
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솜 사이트 이미징 용 배아 산
- ⅓ x 링거 용액 (또는 계란 물)에 1% 낮은 용융 아가 로스를 준비 하 고 42 ° c에서 보관 하십시오. 온도가 42 ° c로 내려 올 때까지 기다리십시오.
- 해 부 현미경에서, 잘 당 하나의 배아를 배치 합니다. 피 펫은 약 1 μ l의 저 융 점 아 피 오 스를 잘 미세 하 게 조절 하 여 크기가 달라 지는 개별 배아의 크기, 특히 크기 감소 유무에 상관 없이 잘 크기를 조정 한다.
- 배아가 고 화 되기 전에 배아를 신속 하 게 정위 시켜 태아가 접시에 완전히 횡 방향으로 향하도록 한다. 배아를 장착 한 후, 아가 로스 산에 커버 슬립을 부드럽게 배치 하 여 배아를 제자리에 고정 시킵니다. 배 향은 나중 단계에서 명확 하 게 이미지화 될 모든 somite 경계를 위해 정확 하 게 횡 방향으로 거치 되어야 하기 때문에 장기 somite 화상 진 찰을 위해 특히 중요 합니다.
- 장착 영역에서 떨어진 곳에서 하위 병합 하 고 25mm x 25mm 커버 글래스를 조작 하 여 몰드에 의해 만들어진 정사각형 들여쓰기의 방향에서 45도 오프셋 되도록 합니다. 각 모서리가 몰드의 다른 면이 될 때까지이 방향으로 몰드를 통해 커버 슬립을 밉니다.
참고: 이 프로토콜은 도립 현미경에 대 한 것 이지만, 현미경으로 전달 하는 동안 배아가 움직이지 않도록 곰 팡이 위에 커버 글래스를 배치 하는 것이 여전히 중요 하다.
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이미징 솜 사이트 형성 과정
- Foamcore 보드와 캐비닛 히터로 만들어진 인큐베이터에서 현미경을 28°c로 미리 따뜻하게 합니다.
- 장착 된 배아와 함께 페 트리 디쉬를 현미경 단계에 놓는다. 낮은 배율로 아가 로스 산의 상단 왼쪽에 장착 된 배아를 찾은 다음 대물 렌즈를 10 배로 전환 하십시오.
- 이미지 수집을 설정 합니다.
참고: 이 명령은 밝은 필드입니다. - Somite 경계를 명확 하 게 볼 수 있도록 광 량, 노출 시간 및 응축 기에 대 한 조건을 찾으십시오. Z 스택 설정을 사용 하 여 가장 낮은 및 가장 높은 원하는 이미징 평면을 설정 합니다. 총 시간 및 시간 간격을 설정 합니다. 모든 배아의 xy 위치를 찾아 등록 하 여 다중 배아를 한 번에 영상 촬영 할 수 있습니다.
- 피지를 사용 하 여 PSM과 진드기의 길이를 측정16.
5. 신경 관 패터 닝의 이미징
- 달걀 물 100에 1 g의 아가 로스를 첨가 하 고, 아가 로스가 완전히 용 해 될 때까지가 열 하 여 1% 아가 로스 용액 100 ml를 준비 합니다. 5-10 분을 62-72 ° c로 식혀 주세요. 트리 네이를 0.01%로 조정 하십시오.
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이미징 용 등 쪽 거치대를 준비 합니다.
참고: 본 가이드는 직 립 형광 현미경과 함께 사용 하도록 개발 되었습니다. 거꾸로 된 현미경의 경우 커버 슬립 바닥 접시가 필요 하 고 3 단계에서 장착 방향이 뒤집힙니다.- 100 mm x 15mm 플라스틱 페 트리 디쉬에 1% 아가 로스의 15 mL를 붓고 있습니다. 공기 방울을 피하도록 아가 로스 표면에 등 쪽 마운트 V1 몰드를 부드럽게 떠 줍니다. 아가 로스가 완전히 응고 될 때까지 식혀 주세요.
- 핀셋 또는 면도날로 몰드를 조심 스럽게 제거 하십시오. 접시에 달걀 물과 함께 0.01% 트리 네를 채우고 사용 될 때까지 덮습니다.
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신경 튜브 이미징에 대 한 배아를 마운트합니다.
- 형질 전환 또는 주사 된 형광 크기 감소 및 조절 배아는 20-25 somite 단계 (풍부 하 게 함 후 약 18-22 시간)까지 개발 될 수 있다. 형광 막 라벨 (mem-mCherry, mem-mBFP1또는 mCitrine)과 신경 관 패터 닝의 형질 전환 리포터를 발현 하는 배아 (nkx: mem-gfp, dbx1b또는 Olig2)가 사용 됨 이미징.
- 준비 된 등 쪽 산에 계란 물 매체를 대체 하는 0.01% 트리 네 스 작업 솔루션. 등 쪽 산의 우물에 이미지 되는 배아에서 부드럽게 피 펫.
- 배아를 올바른 방향으로 조작 하 여 헤드가 마운트에서 앞으로 향하게 하 고 꼬리는 등 쪽 부분을 물 표면 쪽으로 향하게 하 여 뒤쪽을 향합니다.
- 꼬리를 평평 하 게 눕 히 고 접시 바닥 쪽으로 향하게 하지 않도록 배아의 방향을 잡습니다. 꼬리를 가라앉 고 부주의 하 게 이미징 하는 것을 막기 위해 마운팅의 측면 선반에 꼬리의 뒤쪽 부분을 잘 쉬게 하는 것이 때때로 도움이 됩니다. 각 배아에 대해 반복 합니다. 크기가 감소 된 배아를 사용 하 여 이미지를 만들 우물 깊숙이 떨어지지 않도록 하십시오.
- 마운팅 영역에서 멀리 떨어진 부분을 조정 하 고 25mm x 25mm 커버 글래스를 조작 하 여 몰드에 의해 만들어진 정사각형 들여쓰기의 방향에서 45 ° 오프셋 되도록 합니다. 각 모서리가 몰드의 다른 면이 될 때까지이 방향으로 몰드를 통해 커버 슬립을 밉니다.
- 커버 유리가 천천히 장착 영역에 떨어질 때까지 서서히 돌립니다. 배아가 올바른 위치와 방향으로 여전히 장착 되어 있는지 확인 하십시오. 커버 글래스의 낙하로 인해 움직임이 너무 많으면 부드럽게 제거 하 고 C 단계에서 장착을 반복 합니다.
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개발 척수의 3 차원 이미지.
- 거치 된 배아를 포함 하는 접시를 공초점 현미경으로 부드럽게 운반 한다. 장기 라이브 이미징의 경우, 인큐베이션 현미경을 사용 하십시오. 그렇지 않으면, 낮은 온도는 견딜.
- 명시 야 조명 아래에서 배아를 이미지로 이동 하 고 선호 하는 전방 후방 위치에서 시야를 중심에 놓습니다. 배아 간의 세부적인 비교를 가능 하 게 하기 위해 각 배아에 대 한이 위치는 일관성이 있어야 합니다.
- 이미징 매개 변수를 설정 하 여 이미지화 되는 형광 단백질의 신호를 자극 하 고 포착 합니다. 매개 변수를 눈으로 조정 하 여 초기 샘플에 원하는 이미지를 만들 수 있습니다. 측정 일관성을 사용 하려면 데이터 세트의 모든 배아에 이러한 설정을 적용 합니다. 많은 z 스택이 필요한 경우 속도에 대 한 설정을 최적화 합니다.
- Z 스택 설정을 사용 하 여 가장 낮은 및 가장 높은 원하는 이미징 평면을 설정 합니다. Z 스택에서 최적의 이미지 품질을 위해 z 해상도를 조리개 설정에 가장 적합 한 가장 높은 값으로 설정 합니다. 좋은 이미지는 1 μ m z 간격으로 생성 될 수 있습니다.
- 선호 하는 방법으로 이미징 데이터를 분석 합니다.
참고: 이 경우 이미지의 신경 부분을 간단 하 게 세분화 하 고 이미징 신호의 정량화를 가능 하 게 하는 사용자 정의 MATLAB 스크립트로 분석이 수행 되었습니다.
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Representative Results
노 른 자 부피 감소는 일반적인 형태학을 위해 중요 합니다
최근 알 무에도 카스 티 요 외17에 기재 된 바와 같이, 배아의 크기 감소는 노 른 자 부피를 감소 시 킴으로써 달성 될 수 있다. 노 른 자 부피 감소와 비교 하기 위해, 우리는 2 단계 장작 패기와 황 반도 (그림 2 와 보조 영화 1)를 모두 수행 했습니다. 2 단계 다진 배아는 발달 단계 전반에 걸쳐 크기 차이를 제외한 대조 군 (dechor이온화만) 배아에 비해 겉보기에 정상적인 전체적인 형태학을 보여 주었다 ( 도 2의 상단 및 중간 패널 참조). 다른 한편으로, blastula만 다진 배아는 특히 초기 단계에서 특이 한 형태를 보였다. 상피 내에서 배아는 수축 하 고 들여쓴 모습 ( 그림 2에서 70%에 대 한 하단 패널 참조). 다음 somite 단계에서 중간 선 구조는 여러 축 수준에서 평면화 (즉, DV 길이가 ML 길이 보다 상대적으로 짧음) 되는 것으로 확인 되었습니다 ( 그림 2의 하단 패널 참조). 나중 단계에서, 중간 및 후 뇌와 같은 노 른 자에 인접 한 신체 구조 및 첫 번째 ~ 10 개의 소 진드기는 상대적으로 큰 노 른 자 로부터 증가 된 장력으로 인해 비교적 평평한 모양을 보였다.
솜 사이트 크기 감소 배아 크기가 감소
진드기는 배아 발생 동안 일시적으로 나타나고 척추와 골격 근을 야기 하는 분절 구조입니다. Presomitic 중 배 엽 (PSM) 로부터, 소 진드기는 주기적인 방법으로 전방에서 후방 방향으로 하나씩 형성 된다 (예를 들어 제 브라 피시, 쥐에 대 한 경우에는25 분) (그림 3a). 우리는 대조 및 잘게 자른 배아 모두에 대 한 솜 사이트 형성의 시간 경과 이미징을 수행 하 고 새로 형성 된 진드기의 크기를 측정 했습니다 (그림 3b). 대조 군과 다진 배아 모두에서, 이후 단계에서 형성 된 소 진드기의 크기는 이전 단계의 것 들에 비해 더 작은 것으로 밝혀졌다. 또한, 솜 사이트 형성 단계 전반에 걸쳐, 다진 배아는 대조 배아에 있는 것 보다 더 작은 소 진드기를 가졌다 (도 3c).
신경 관 높이가 감소 하는 다음 크기 감소
신경 관 크기에 대 한 배아 크기 감소의 효과를 보기 위해, 우리는 mem-mCherry 주입 배아에 대 한 2 단계도 마 기법을 수행 하 고 공초점 이미징 시스템을 사용 하 여 20 hpf에서 척수를 이미지화 했습니다 (그림 4A, B). 이 데이터 세트에서 신경 튜브 높이는 사용자 이미지 분석 코드를 사용 하 여 수동으로 측정 한 후 크기 감소를 12.4% ± 3.2% 감소 시켰습니다 (그림 4C). 이 데이터를 함께 촬영 하면 크기 감소가 신경 튜브 높이를 줄이는 것으로 나타납니다. 이 기술은 신경 패터 닝에 대 한 크기 감소의 효과를 측정 하는 데 사용할 수 있습니다.
그림 1 : 크기 감소 기법. 약 30%-40%의 세포를 동물 극에서 절단 하였다 (상단 패널). 노 른 자를 둘러싼 막이 조심 스럽게 상처를 입 었으 므로 노 른 자 (중간 패널)가 나옵니다. 다음 몇 분 동안, 노 른 자는 두 배 엽과 노 른 자 모두에서 상처를 내 고 난 후 (바닥 패널). 스케일 바 = 200 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 크기 감소의 두 가지 방법 간의 비교. 대조 배아 (상부 패널, 24 hpf 및 30hpf에 대 한 상단 배아) 및 크기 감소 된 배아 (블 라스와 노 른 자, 중간 패널, 24 hpf 및 30hpf에 대 한 중간 배아) 및 크기 감소 배아 (바닥 패널, 하단 배아) (24 hpf 및 30hpf)를 개발 단계에 따라 비교 합니다. Blastula만 다진 배아에서, 배 반 배 볼륨은 노 른 자에 비해 훨씬 작습니다 (70%). 결과적으로, 배아는 솜 사이트 단계에서 불균형 하 게 평탄 화 된 형태를 가진다 (즉, DV 축은 블 라스 볼 라만 다진 배아의 AP 축에 비해 상대적으로 짧아 대조 군 또는 2 단계 다진 것에 비해). 스케일 바 = 200 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 크기 감소 감소 소 진드기의 길이. (A) 솜 사이트 형성을 개략적으로 나타낸 그림. (B) 시간이 지남에 따라 대조 및 다진 배아의 밝은 전계 이미지. 노란색 화살표는 각 somite 단계에서 가장 새로 형성 된 somite를 나타냅니다. (C) 제어 및 다진 배아 모두에 대해 시간 경과에 따른 솜 사이트 길이 (전방 후부 축에서의 측정). 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 크기 감소는 신경 관의 높이를 감소 시킵니다. (A-B) 정상 크기 (A)의 이미지 및 크기 감소 (B) tg (ptch2) 배아는 단일 세포 단계에서 mem-mcherry mRNA로 주입 되었다. 스케일 바 = 20 μ m. (C) 신경 관의 높이를 각 z-스택에 있는 신경 관의 수동 분할에서 추출 하였다. 값이 짝이 없는 t 검정을 사용 하 여 비교 되는 경우 평균 신경 높이에서 통계적으로 유의 한 차이가 관찰 됩니다 (p = 0.0397). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보조 동영상 1:2 단계 장작 패기와 블 라이 단 장작 패기의 비교. 상단 행 = 대조 배아, 중간 행 = 크기 감소 된 배아 2 단계 장작을 사용 하 여, 하단 행 = 크기가 감소 된 배아에만 자르고. 영화는 12 시간 동안 3 분 마다 촬영 되었다. 스케일 바 = 1mm. 이 동영상을 보려면 여기를 클릭 하십시오. (마우스 오른쪽 버튼을 클릭 하 여 다운로드 합니다.)
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Discussion
역사적으로, 척추 동물 동물 들 중에서, 크기 감소는 주로 배아를 수 륙 양용으로 사용 하 여 수행 되었으며, blastula 스테이지 (12)에서 동물-식물성 축을 따라 배아를 양분 하였다. 그러나, 우리는 배아를 이등분 때 개구리와 제 브라 피쉬 배아 사이에는 주로 두 가지 차이점이 있습니다. 첫째, 제 브라이 어 배아가 비 대 한 (blastula 단계)의 관용이 되는 단계에서 주최자는 blastula 여백18,20,21의 제한 된 지역에 위치 하 고 있습니다. 배아의 형태에서 주최자의 위치를 알 수 없기 때문에, 무작위로 동물-식물성 축을 따라 배아를 절단 하는 것은도 살자 또는 독 화 된 배아를 생산 합니다. 둘째, 개구리 배아와는 달리, 제 브라 피쉬 배아는 세포에 완전히 둘러싸여 있을 때까지 분리 된 노 른 자 주위의 식물성 극을 향해 세포가 이동 하는 상피에 불리는 과정을 통해 이동 합니다. 배 반 덤의 일부분만 제거 되 면 상대적으로 큰 부피의 노 른 자를 삼 킬 수 있는 세포가 줄어들고 결과적으로 형태학에 영향을 받게 됩니다. 따라서 우리는 2 단계 장작 패기를 사용 하 여 동물 기둥 근처에서 blastulae를 자르고, 주최자의 절단을 피하고 노 른 자 막에 상처를 내 고 난 황 크기를 blastula에 비례 하 게 만듭니다.
2 단계 장작 패기 외에도 수술 후의 배아 회복에 중요 한 크기 감소 수술이 수행 되는 매개체를 발견 했습니다. 우리는 (계란 물, 계란 물 + 알 부 민, Danieau 버퍼, L15 L15 + FBS ⅓ x 링거, 1x 링거)에 대 한 여러 미디어 중에서 높은 생존 율을 산출 한 ⅓ x 링거와 1x 링거만을 시도 했다. 그밖 매체에서, 배아는 상처에서 복구 하는 것을 실패 했습니다.
낮은 생존 율에 대 한 중요 한 문제 해결 팁 건강 하 고 젊은 부모 물고기에서 건강 한 배아를 사용 하는 것입니다. 우리는 비 크기 감소 배아가 거의 100%의 생존 율을 보이는 경우에도, 크기가 감소 하면, 오래 된 어류의 배아는 낮은 생존 율을 보이는 경향이 있다고 지적 했다. 또한, 모 폴 리노 주사와 같은 추가적인 교란과 크기 감소가 결합 되 면 생존 율이 감소 하는 경향이 있음을 유의 하십시오.
여기에 설명 된 크기 감소 기술의 단순성을 통해 연구원은 전문 장비나 집중적인 교육 없이이 기술을 적용할 수 있습니다. 또한, 크기 감소 배아는 개발의 이후 단계까지 더 작게 남아 있기 때문에 (일단 그들이 먹기 시작 하면, 그들의 크기는 대조 물고기를 잡을 것으로 보인다),이 기술은 많은 조직과 장기의 스케일링 연구에 적용 될 수 있다. 따라서,이 기술은 크기 감소 및 정량적 생체 내 라이브 이미징을 결합 하 여 다양 한 시스템의 스케일링 및 크기 제어를 연구할 수 있게 한다.
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Disclosures
저자는 경쟁 또는 재정적 이해관계를 선언 하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 일본 과학 기술 기구 (JPMJPR11AA)의 프레스 프로그램 및 건강 보조금 (R01GM107733)의 국가 학회에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm PYREX Petri dish | CORNING | 3160-60 | |
| Agarose | affymetrix | 75817 | For making a mount for live imaging |
| Agarose, low gelling temperature Type VII-A | SIGMA-ALDRICH | A0701-25G | |
| CaCl2 | EMD | CX0130-1 | For 1/3 Ringer's solution |
| CaSO4 | For egg water | ||
| Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1) | CORNING | 2845-25 | |
| Disposable Spatula | VWR | 80081-188 | |
| Foam board | ELMER'S | 951300 | For microscope incubator |
| Forcept (No 55) | FST | 11255-20 | |
| Glass pipette | VWR | 14673-043 | |
| HEPES | SIGMA Life Science | H4034 | For 1/3 Ringer's solution |
| INCUKIT XL for Cabinet Incubators | INCUBATOR Warehouse.com | For microscope incubator | |
| Instant sea salt | Instant Ocean | 138510 | For egg water |
| KCl | SIGMA-ALDRICH | P4504 | For 1/3 Ringer's solution |
| Methyl cellulose | SIGMA-ALDRICH | M0387-100G | |
| NaCl | SIGMA-ALDRICH | S7653 | For 1/3 Ringer's solution |
| Petri dish | Falcon | 351029 | For making a mount for live imaging |
| Phenol red | SIGMA Life Science | P0290 | |
| Pipette pump | BEL-ART PRODUCTS | F37898 | |
| Pronase | EMD Millipore Corp | 53702-250KU | |
| Tricaine-S (MS222) | WESTERN CHEMICAL INC | NC0135573 | |
| Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires | Sandra | The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use. |
References
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