Summary
Здесь мы описываем метод уменьшения размера эмбрионов рыб данио без нарушения нормального процесса развития. Этот метод позволяет изучить масштабирование шаблона и устойчивость развития от изменения размера.
Abstract
В процессе развития, эмбрионы демонстрируют замечательную способность соответствовать их телу тела к их размеру тела; их доля тела поддерживается даже в эмбрионов, которые крупнее или меньше, в определенных пределах. Хотя это явление масштабирования привлекает к себе внимание на протяжении более века, понимание базовых механизмов ограничено, отчасти из-за отсутствия количественного описания динамики развития эмбрионов различных размеров. Чтобы преодолеть это ограничение, мы разработали новую технику, чтобы хирургически уменьшить размер зародышей рыб данио, которые имеют большие преимущества для в естественных условиях живой визуализации. Мы показываем, что после сбалансированного удаления клеток и желтка на стадии блабулы в отдельных шагах, эмбрионы могут быстро восстановиться при правильных условиях и развиться в меньшие, но в остальном нормальные эмбрионы. Так как этот метод не требует специального оборудования, он легко адаптируется, и может быть использован для изучения широкого спектра проблем масштабирования, в том числе устойчивость морфгена опосредованного паттерна.
Introduction
Ученые давно знают, что эмбрионы обладают замечательной способностью формировать постоянные пропорции тела, хотя размер эмбриона может сильно различаться как в естественных, так и в экспериментальных условиях1,2,3. Несмотря на десятилетия теоретических и экспериментальных исследований, эта устойчивость к размеру вариации, называется масштабирование, и его основные механизмы остаются неизвестными во многих тканях и органах. Для того, чтобы непосредственно захватить динамику развивающейся системы, мы создали воспроизводимые и простой метод уменьшения размера в данио4, который имеет большое преимущество в в естественных условиях живой визуализации5.
Рыба данио служила моделью позвоночных животных для изучения нескольких дисциплин биологии, включая биологию развития. В частности, рыба данио идеально подходит для в естественных условиях живой визуализации6 , потому что 1) развитие может протекать нормально вне матери и яичной скорлупы, и 2) эмбрионы прозрачны. Кроме того, эмбрионы могут выдерживать некоторые температурные и экологические колебания, что позволяет им изучаться в лабораторных условиях. Кроме того, в дополнение к обычному экспрессии генов возмущений Морфолино и мРНК инъекции7,8, последние достижения в области технологии криср/Cas9 сделал обратный генетики в данио рыб высокоэффективных9. Кроме того, многие классические методы эмбриологии, такие как трансплантация клеток или тканевой хирургии могут быть применены4,10,11.
Методы сокращения размера были первоначально разработаны в амфибии и других не позвоночных животных12. Например, в ксенопус laevis, другой популярной модели позвоночных животных, бискция вдоль оси животного растительного на стадии блазула может производить размер-сокращение эмбрионов12,13. Однако, в наших руках этот одноэтапный подход приводит к дорсизированных или вентризованных эмбрионов в рыбе данио, предположительно потому, что спинной детерминанты распределяются неравномерно и никто не может знать их локализацию от морфологии эмбрионов. Здесь мы демонстрируем альтернативный двухступенчатый рубящий технику для рыб данио, который производит обычно развивается, но меньше эмбрионов. С помощью этой техники, клетки сначала удаляются из животного полюса, область наивных клеток не хватает в органайзер деятельности. Чтобы сбалансировать количество желтка и клеток, что важно для эпибооли и последующего морфогенеза, желток удаляется. Здесь мы подробно этот протокол и представить два примера размера инности в формировании шаблона; формирование сомита и брюшной нервной трубки паттерн. В сочетании с количественной визуализации, мы использовали технику уменьшения размера, чтобы изучить, как размеры сомитов и нервной трубки страдают в размерах уменьшается эмбрионов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все связанные с рыбными процедурами процедуры были проведены с одобрения организационного комитета по уходу и использованию животных в Гарвардской медицинской школе.
1. подготовка инструмента и реагента
-
Сделать провод петли рубить эмбрионов
- Возьмите 20 см из нержавеющей стальной проволоки, которая жесткая и не коррозионные с диаметром 40 мкм. Петля проволоки через в стеклянные капилляры (1,0 мм Наружный диаметр, 0,5 мм внутренний диаметр, не нити), что делает небольшой цикл в верхней части (длина петли 1,0 мм)
- Положите немного капли четкого лака для ногтей на кончике стекла капилляров между проволочной петли, чтобы удержать его на месте. Дайте высохнуть. Убедитесь в том, чтобы не получить любой Лак для ногтей на часть петли, как это может повредить эмбрионы.
- Прикрепите стеклянную капилляры с петлей на деревянную палочку (9 "бамбуковых одноразовых палочек, разбитых пополам) с помощью лабораторной ленты. Оставьте около 2,5 см стекла капилляров, простирающихся за палочку, так что палочка часть инструмента не окунуться в воду. Отрегулируйте эту длину до предпочтения.
-
Кроме того, сделать стеклянную иглу, чтобы нарезать эмбрионов
- Щепотку одного из концов стекла пипетки Пастера с щипцами, удерживая другую сторону рукой. Нагрейте тонкую часть пипетки над светильником духа или горелкой Бунсена.
- Рука-потяните стеклянную пипетку. Идеальная Пипетка диаметром около 30 мкм и нежной кривой (радиус кривизны = примерно 5 мм). Надлежащий диаметр и кривизну получаются с практикой и некоторым шансом.
-
Подготовка метиловой целлюлозы
- Метиловая клетчатка используется для удержания эмбрионов при измельчении. Сделать 2% раствор метиловой целлюлозы в растворе 1/3x Рингера (116 mM Перламуфовый, 2,9 mM KCl, 1,8 мм Касл2, и 5 мм 4-(2-гидрокезитил)-1-пипиазинеязыческая кислота (HEPES; pH 7,2)). Встряхните метиловой целлюлозы порошка в 1/3x решение Рингера на 4 °C в одночасье.
- По желанию, добавить ~ 1,5 mL фенола красный (0,5% в DPBS складе решение) до 10 мл 2% раствора метильной целлюлозы, до красного, чтобы сделать раствор видимым. Встряхните его, пока цвет становится равномерным.
2. Приготовление рыбьего эмбрионов данио для хирургического уменьшения размера
-
Соберите эмбрионы
- Поместите один или два самца и одну или две самки данио в брачный зал, наполненный большим количеством воды. Отдельные самцы и самки используют пластиковый делитель. Используйте линию AB для визуализации сомитов (раздел 4) и трансгенных репортерских линий паттерна нервной трубки (НКХ 2.2: мем-GFP, dbx1b: GFP, или Olig2:ddкрасный) для визуализации нервной трубки. Оставьте их в камере на ночь.
Примечание: Выбор взрослых имеет важное значение для получения яиц, которые выживают хирургии хорошо. Как правило, молодые здоровые самки вырабатывают здоровые яйцеклетки. - На следующее утро, перенести камеру на мелководье и поместите камеру с небольшим наклоном. Удалите разделитель, чтобы рыба могла спариваться.
- Соберите яйца, вливая в чай стрейнер. Передача яиц в чашку Петри с яйцом воды (для 20x яйцо воды, 6 г мгновенного морская соль, 1,5 г CaSO4 и 1 L H2O; использование в 1x). Для лучшей постановки, собирать яйца сразу после нереста. Поместите эмбрионы в инкубатор 28,5 °C.
- При необходимости впрыснуть Морфолино, мРНК и т. д. на стадиях 1 – 4 клеток после общего протокола7,8. Впрыснуть мРНК для маркировки флуоресцентной мембраны (мем-mCherry, мем-mBFP1, или мем-макитрин) для визуализации нервной трубки (раздел 5).
- Поместите один или два самца и одну или две самки данио в брачный зал, наполненный большим количеством воды. Отдельные самцы и самки используют пластиковый делитель. Используйте линию AB для визуализации сомитов (раздел 4) и трансгенных репортерских линий паттерна нервной трубки (НКХ 2.2: мем-GFP, dbx1b: GFP, или Olig2:ddкрасный) для визуализации нервной трубки. Оставьте их в камере на ночь.
-
Дехорионат с использованием проназы
- Вокруг 128-клеток до 256-клеточный этап, передача здоровых эмбрионов 35 мм стеклянное блюдо заполнено с яйцом воды. Извлекайте как много воду яичка как возможно от тарелки.
- Добавьте 1 мл 20 мг/мл проназы. Мягко закружить эмбрионы вокруг, перемещая пластины и аккуратно пипетки раствора вверх и вниз, чтобы помочь дехорионирования с помощью стеклянной пипетки.
- Когда хорионы начинают терять эластичность (как правило, 1-4 мин после добавления проназы, в зависимости от количества яиц и воды), добавить столько же яйцо воды, как можно разбавить проназы. Оценка потери эластичности, нежно Касаясь chорион с щипцами; чорион должен удерживать вмятину, не сразу отскакивая назад. Передача яиц на другое блюдо с яйцом воды с помощью стеклянной пипетки (на данный момент, большинство хорионов не нарушается).
- Альтернативно, аккуратно вылейте эмбрионы из тарелки в большой стеклянный стакан 400 mL, наполненный яичной водой, не подвергая эмбрионы воздействию воздуха. Затем, пусть эмбрионы полностью урегулировать. Наклоните стакан, чтобы эмбрионы могли упасть в одну сторону. Соберите эти эмбрионы с помощью стеклянного пипетки и перенесите их на новое стеклянное блюдо 35 мм, наполненное раствором 1/3x.
- Подождите несколько минут, пока большинство хорионов теряют эластичность полностью. Удалите оставшиеся хорионы из эмбрионов, аккуратно поглади яйца. Удалите поврежденные эмбрионы и Инкубируйте эмбрионы в инкубаторе 28,5 ° c.
3. Хирургическое уменьшение размера и восстановление
- Подготовьте одно чистое блюдо из стекла 35 мм. Распределите приблизительно 0,5 mL 2% метильной целлюлозы (в растворе 1/3x, с фенолом красным, чтобы помочь визуализировать) вблизи центра нижней части более крупного блюда с помощью пластикового шпателя. Тонко и равномерно распределите метиловую клетчаткой толщиной примерно 0,5 мм.
- Налейте примерно 30 мл раствора 1/3x Рингера в сторону тарелки и дайте ему распространиться на остальную часть тарелки, покрывая метиловую целлюлозу.
- Размещаем эмбрионы дехорионированной на стадии 256-Cell-1 k-Cell на 2% метильной целлюлозы. Отрегулируйте ориентацию эмбрионов на сторону, чтобы визуализировать как клетки, так и желток. (Рис. 1)
- Чок около 30%-40% клеток от бластодермы вблизи животного полюса путем разрезания перпендикулярно животного-вегетатной оси с помощью проволочной петли (или стеклянная игла) (рис. 1, верхние панели). После удаления клеток, аккуратно коснитесь концы вместе, чтобы помочь оставшимся клеткам придерживаться обратно. Через несколько минут мертвые клетки должны шелушиться, когда эмбрион начинает исцелять.
- Сделать маленькую рану желток вблизи растительного полюса вместо "измельчения" желток (рис. 1 средние панели). Рана желтка, делая метку яичной мембраны с установленным проводом. Желток будет сочиться в течение нескольких минут после ранения, а затем рана заживает (рис. 1 нижние панели).
- Когда желток перестает сочиться, переместите эмбрион, используя пипетки за пределами метиловой целлюлозы в том же блюде, чтобы позволить им лучше восстановиться.
- Повторите шаги 3,4-3,6 для всех эмбрионов. Оставьте блюдо стабильным на 30 минут, пока эмбрионы восстанавливаются.
-
Перенесите эмбрионы на новое блюдо с новым раствором 1/3x и положите их в инкубатор 28,5 ° с, чтобы они могли полностью восстановиться.
- Дополнительный Если этап интереса является ранней стадии сомитов, эмбрионы могут быть инкубировали при температуре 20 °c после того, инкубировали при температуре 28,5 ° c до стадии щита, чтобы отрегулировать время для экспериментов и визуализации.
4. Живая съемка данио ФИО Социтогенеза
- Приготовить 100 мл 1% раствора агарозы, добавив 1 г агарозы до 100 мл яичной воды, подогрев до полного растворения агарозы. Дайте остыть в течение 5-10 мин до температуры 62-72 ° c.
-
Подготовьте крепление для визуализации.
Примечание: это руководство было разработано для использования с перевернутым широкополевым микроскопом.- Залить ~ 15 мл 1% агарозы в к 100 мм х 15 мм пластиковые чашки Петри.
- Аккуратно поместите в нижнюю часть чашки Петри шаблон5 -формы v1 на спинном горе. Держите плесень на дно с помощью веса, такие как 15 мл трубки с водой.
Примечание: Это значит, что эмбрионы как можно ближе к низу чашки Петри при использовании перевернутого микроскопа. Хотя эмбрионы с боков монтируются для визуализации сомитов, здесь используется спинной держатель v15 , так как он лучше удерживает эмбрионы на ранних стадиях сомита. - Пусть прохладно до агарозы полностью затвердевает. Налейте в ~ 30 мл яичной воды с 0,01% триукаин, и осторожно удалите плесень, осторожно любопытных с щипцами.
-
Эмбрионы для визуализации сомитов
- Подготовка 1% низкое таяние агарозы в 1/3x решение Рингера (или яйцо воды) и держать его на 42 ° c. Подождите, пока температура доходит до 42 ° c.
- Под микроскопом рассечения, поместите один эмбрион в колодец. Пипетка приблизительно 1 мкл низкого плавления агарозы в хорошо, чтобы тонко отрегулировать размер скважины до размера отдельных эмбрионов, которые различаются по размеру, особенно между теми, с и без уменьшения размера.
- Быстро ориентировать эмбрионы до того, как низкое таяние агарозы затвердевает, так что эмбрионы сталкиваются полностью с боково к блюду. После монтажа эмбрионов аккуратно поместите крышку скольжения на гору агарозы, чтобы удерживать эмбрионы на месте. Ориентация особенно важна для долгосрочного сомитов визуализации, потому что эмбрионы должны быть точно сбоку установлены для всех границ сомитов быть четко отображаемого на более поздних стадиях.
- Погрузите от монтажных области и манипулировать 25 мм х 25 мм крышку стекла таким образом, что это 45 градусов смещение от ориентации квадрат отступ сделанные плесени. Слайд маскировка над плесенью в этой ориентации до тех пор, пока каждый уголок отдыхает от другой стороны формы.
Примечание: Хотя этот протокол для перевернутого микроскопа, размещение крышки стекла на верхней части формы по-прежнему важно, чтобы эмбрионы не двигаются при переходе к микроскопу.
-
Процесс формирования изображений сомита
- Предварительно нагревают Микроскоп до 28 °C в инкубаторе, построенном с доски foamcore и обогреватель шкафа.
- Поместите чашку Петри с установленными эмбрионами на стадию микроскопа. Найти эмбрион, установленный в верхнем левом хорошо из агарозы крепление с меньшим увеличением объектива, затем переключить цель 10x.
- Настройка приобретения изображений.
Примечание: Эта инструкция для яркого поля. - Найдите условия для световой мощности, времени экспозиции и конденсатора, чтобы можно было четко увидеть границу сомита. С помощью настроек z-стека устанавливается самая низкая и самая высокая желаемая плоскость изображения. Установите общее время и промежуток времени. Найдите и зарегистрируйте позиции XY всех эмбрионов, установленных таким образом, что множественные эмбрионы могут быть одновременно отображаемого.
- Измерить длину PSM и сомитов с использованием Фиджи16.
5. изображений нервной трубки паттерн
- Приготовить 100 мл 1% раствора агарозы, добавив 1 г агарозы до 100 мл яичной воды, подогрев до полного растворения агарозы. Дайте остыть в течение 5-10 мин до 62-72 ° c. Отрегулируйте триакаин до 0,01%.
-
Подготовьте спинной держатель для визуализации.
Примечание: это руководство разработано для использования с вертикально флуоресцентного микроскопа. Для перевёрнутых микроскопов блюда нижнего кроя являются необходимыми, и монтаж ориентации в шаге 3 переворачивается.- Налейте в ~ 15 мл 1% агарозы в к 100 мм х 15 мм пластиковой чашке Петри. Аккуратно поплавок на поверхности агарозы спинная гора v1 плесень, чтобы избежать введения пузырьков воздуха. Пусть прохладно до агарозы полностью затвердевает.
- Аккуратно удалите форму щипцами или лезвием бритвы. Заполните блюдо с яйцом воды с 0,01% триакаин и крышка до использования.
-
Эмбрионы для визуализации нервной трубки.
- Разрешить трансгенных или вводили флуоресцентный размер-сокращение и контроль эмбрионов развиваться до 20-25 сомитов стадии (примерно 18-22 ч после оплодотворения). Эмбрионы, выражающие этикетку флуоресцентной мембраны (мем-mCherry, мем-mBFP1, или мем-макитрин) и трансгенного репортера паттерна нервной трубки(НКХ 2.2: мем-GFP, dbx1b: GFP, или Olig2:ddкрасный) используются для визуализации.
- Заменить яйцо воды среды в подготовленном спинной крепление с 0,01% трикейн рабочее решение. Аккуратно пипетки в зародыши, чтобы быть отображаемого в к колодцам спинной горы.
- Манипулирование эмбрионов в правильную ориентацию таким образом, что голова перед лицом вперед в гору и хвост указывает на заднюю часть с спинной части, обращеня к поверхности воды.
- Ориентировать эмбриона так, что хвост лежал плоский и не указал вниз к нижней части блюда. Иногда полезно отдохнуть задней части хвоста на боковой выступ монтажа хорошо, чтобы предотвратить хвост от погружения и непреднамеренно изображений заднего мозга. Повторите для каждого эмбриона. Сделать определенные с размером уменьшило эмбрионов, что они не попадают глубоко в скважины, чтобы быть отображаемого.
- Погрузите от монтажных области и манипулировать 25 мм х 25 мм крышку стекла таким образом, что это 45 ° смещение от ориентации квадрат отступ сделанные плесени. Слайд маскировка над плесенью в этой ориентации до тех пор, пока каждый уголок отдыхает от другой стороны формы.
- Медленно поверните покрывало, пока оно мягко не упадет на монтажный участок. Проверьте, чтобы убедиться, что эмбрионы все еще установлены в правильных позициях и ориентаций. Если слишком большое движение вызвано падением покрытого стекла, аккуратно удалите и повторите монтаж от шага C.
-
Изображение в 3-D развивающийся спинной мозг.
- Осторожно транспортируйте блюдо, содержащее установленные эмбрионы, в конфокальное микроскопа. Для долгосрочного живого изображения, обязательно используйте инкубировали Микроскоп. В противном случае, низкие температуры терпимы.
- При освещении яркости, перейдите к эмбриону к изображению и разбивоте поле зрения на предпочтительной передней-задней позиции. Чтобы обеспечить детальное сравнение эмбрионов, эта позиция на каждом эмбрионе должна быть последовательной.
- Установите параметры визуализации для возбуждения и захвата сигнала от флуоресцентных белков, отображаемого. Параметры могут быть настроены на глаз для создания желаемого изображения на начальной выборке. Чтобы включить последовательность измерений, примените эти параметры для всех эмбрионов в наборе данных. Если требуются многие z-стеков, Оптимизируйте параметры для скорости.
- Используя настройки z-стека, установите самый низкий и наивысший желаемый плоскость изображения. Для оптимального качества изображения в z-стеке установите z-разрешение на самое высокое, оптимальное для параметра диафрагмы. Хорошие изображения могут быть сгенерированные с 1 мкм z-интервал.
- Проанализируйте данные о визуализации любым предпочтительным методом.
Примечание: В этом случае анализ был выполнен с пользовательскими скриптами MATLAB, которые позволяют простую сегментирование нейронных частей изображения и количественную оценку сигнала изображения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Уменьшение объема желтка важно для нормальной морфологии
Как недавно описано в Альмуэдо-Кастильо et al.17, уменьшение размера эмбрионов может быть достигнуто без снижения объема желтка. Для сравнения с и без сокращения объема желтка, мы выполнили как двухступенчатый измельчения (как бладула и желток) и блаукула-только измельчения (рис. 2 и дополнительный фильм 1). Два шага прерванные эмбрионы показали, казалось бы, нормальная общая морфология по сравнению с контрольной (дехорионирования только) эмбрионов, кроме разницы в размерах, на протяжении всего этапа развития (см. верхнюю и среднюю панели на рисунке 2). С другой стороны, блаукула-только нарезанные эмбрионы показали своеобразную морфологию, особенно на более ранних стадиях. Во время эпиболия у эмбрионов был сужен и изрезан внешний вид (см. нижнюю панель для 70% эпиболы на рисунке 2). На следующем сомите стадии были обнаружены структуры средней линии (т.е. Длина ДВ относительно короче длины ml) на многих осевых уровнях (см. нижние панели для 8 и 20 сомитов на рисунке 2). На более поздних стадиях, структуры тела, прилегающие к желтку, такие как средний и задний мозг, и первые ~ 10 somites, по-прежнему показали относительно плоский вид, возможно, из-за увеличения напряжения от относительно большего желтка.
Somite уменьшения размера в размерах уменьшило зародыши
Сомиты – это сегментальные структуры, которые появляются во время эмбриогенеза и дают начало позвонкам и скелетной мышце. От presomitic мезодермы (PSM), somцит образуется один за другим от переднего до заднего направления в периодической манере (например, 25 мин для рыбы данио, 2 ч для мышей) (рис.3а). Мы провели промежуток времени изображений сомита образования как для контроля и измельченных эмбрионов и измеряется размер большинства вновь образованных сомитов (Рисунок 3B). Как в контрольных, так и в измельченных эмбрионах, размеры сомитов, образовавшаяся на поздних стадиях, оказались меньше по сравнению с предыдущими этапами. Кроме того, на протяжении стадий формирования сомитов, прерванные эмбрионы имели меньшие социты, чем у контрольных эмбрионов (рис. 3C).
Высота нервной трубки снижается после уменьшения размера
Чтобы увидеть эффект от уменьшения размера эмбриона на размер нервной трубки, мы выполнили наш двухступенчатый измельчения технику на мем-mCherry вводили эмбрионов и отображаемого их спинного шнуры на 20 HPF с помощью нашей системы conкоординационных изображений (Рисунок 4A, B). В этом наборе данных высота нейронных труб была снижена после уменьшения размера на 12,4% ± 3,2%, как измеряется вручную с помощью пользовательского кода анализа изображений (Рисунок 4C). Взятые вместе, эти данные показывают, что сокращение размера уменьшает нейронную трубку высотой. Этот метод может быть использован для измерения эффектов уменьшения размера на нейронные паттеры.
Рисунок 1 : Метод уменьшения размера. Приблизительно 30%-40% из клеток были отрезаны от животного полюса (верхних панелей). Мембрана вокруг желтка была тщательно ранена так, что желток сочилась из (средние панели). В течение следующих нескольких минут, желток сочилась, а затем раны на обоих бладодермы и желток исцелил (нижние панели). Шкала планка = 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 2 : Сравнение двух методов уменьшения размера. Контроль эмбрионов (верхние панели, верхние эмбрионы для 24 HPF и 30 HPF), размер уменьшается эмбрионов с двухступенчатый рубки (блаулы и желток, средние панели, средние эмбрионы для 24 HPF и 30 HPF) и размер уменьшается эмбрионов с блаукула-только измельчения (нижние панели, нижние эмбрионы для 24 HPF и 30 HPF) сравниваются по стадиям развития. Обратите внимание, что в бладула-только нарезанные эмбрионы, объем бладодермы гораздо меньше по сравнению с желтком (на 70% эпиболы). В результате, эмбрион имеет непропорционально уплощенная форма на этапах сомитов (то есть, ось DV относительно короче по сравнению с осью AP в бладулы-только прерванные эмбрионы, по сравнению с контролем или двухступенчатый нарезанный один). Шкала BA = 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 3 : Уменьшение размера уменьшает Длина сомитов. A) схематическая иллюстрация сомита. (B) Яркое поле изображения управления и измельченных эмбрионов с течением времени. Желтые наконечники стрел указывают на наиболее новообразованной сомите на каждом этапе сомитов. (C) somite Длина (в передней-задней оси) измерений с течением времени для обоих контрольных и измельченных эмбрионов. Бары ошибок представляют стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 4 : Уменьшение размера уменьшает высоту нервной трубки. (A-B) Пример снимков нормального размера (A) и размера уменьшило (B) тг (ptch2: Kaede) эмбрионы, которые были введены на одноклеточной стадии с мем-mcherry мРНК. Шкала планка = 20 мкм. (C) Нейронные высоты трубки извлечены из ручной сегментации нервной трубки в каждом z-стек. Статистически значимые отличия наблюдаются в среднем росте нервной системы при сравнении значений с использованием непарного t-теста (p = 0,0397). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Дополнительный фильм 1: сравнение между двухступенчатый измельчения против блаукула-только измельчения. Верхний ряд = контроль эмбрионов, средний ряд = размер уменьшается эмбрионов с двумя ступенчатой рубки, нижний ряд = размер уменьшается эмбрионов с блаулой только измельчения. Фильмы были приняты каждые 3 мин для 12 ч. Шкала штангистики = 1 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Щелкните правой кнопкой мыши для скачивания.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Исторически, среди позвоночных животных, размер сокращение было в основном осуществляется с использованием амфибий эмбрионов, путем рассеяние эмбрионов по оси животного растительного на блаукула этап12. Однако, есть в основном два различия между лягушки и эмбрионов рыб данио, когда мы bisect эмбрионов. Во-первых, на этапе, когда зародыши рыб зебраи становятся толерантными к рассечении (стадия блаукула), организатор находится в запретной зоне маржи18,19,20,21. Из-за того, что нельзя отличить положение организатора от морфологии эмбрионов, беспорядочно разрезание эмбриона вдоль оси животного растительного происхождения производит дорсизированные или вентризованные эмбрионы. Во-вторых, в отличие от лягушки эмбрионов, эмбрион рыб данио пройти процесс называется эпиболы, где клетки движутся в направлении растительного полюса вокруг разделенных желток, пока он полностью окружен клетками. Если только часть блатодермы удаляется, меньшее количество клеток остается поглотить желток относительно больший объем, и, как следствие, морфология появляется пострадавших после эпиболия. Таким образом, мы используем двухступенчатый измельчения, в котором мы рубить бладулы возле животного полюса, чтобы избежать отрезать организатора, и Рана мембраны желтка, чтобы сделать размер желтка пропорциональна бладула.
В дополнение к двухэтапной рубки, мы обнаружили, что среда, в которой выполняется операция по уменьшению размера, имеет решающее значение для восстановления эмбрионов после операции. Среди нескольких СМИ мы пробовали (яйцо воды, яйцо воды + альбумин, данио буфер, L15, L15 + ФПС, 1/3x звонарь, 1x звонарь), только 1/3x звонарь и 1x звонарь дали высокие показатели выживаемости; в других средствах массовой информации, эмбрионы не смогли оправиться от ран.
Важным Подсказка для устранения неполадок для низкой выживаемости является использование здоровых эмбрионов здоровых и молодых родительских рыб. Мы отметили, что даже тогда, когда контроль не-размер сокращен эмбрионов показывают почти 100% выживаемости, когда размер уменьшается, эмбрионы из старых рыб, как правило, показывают более низкую выживаемость. Кроме того, обратите внимание, что выживаемость, как правило, уменьшается, когда размер сокращения сочетается с дополнительными возмущений, таких как инъекции моролино.
Простота метода сокращения размера описано здесь позволяет исследователям применять эту технику без специализированного оборудования или интенсивной подготовки. Кроме того, так как размер уменьшается эмбрионы остаются меньше, до более поздних стадиях развития (как только они начинают есть, их размер, кажется, догнать рыбу контроля), этот метод может быть применен для изучения масштабирования многих тканей и органов. Таким образом, эта методика дает возможность сочетать сокращение размера и количественное в естественных условиях живой визуализации для изучения масштабирования и контроля размера различных систем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих или финансовых интересах.
Acknowledgments
Работа была поддержана программой вуаля японского агентства по науке и технике (JPMJPR11AA) и гранта национального института здравоохранения (R01GM107733).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm PYREX Petri dish | CORNING | 3160-60 | |
| Agarose | affymetrix | 75817 | For making a mount for live imaging |
| Agarose, low gelling temperature Type VII-A | SIGMA-ALDRICH | A0701-25G | |
| CaCl2 | EMD | CX0130-1 | For 1/3 Ringer's solution |
| CaSO4 | For egg water | ||
| Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1) | CORNING | 2845-25 | |
| Disposable Spatula | VWR | 80081-188 | |
| Foam board | ELMER'S | 951300 | For microscope incubator |
| Forcept (No 55) | FST | 11255-20 | |
| Glass pipette | VWR | 14673-043 | |
| HEPES | SIGMA Life Science | H4034 | For 1/3 Ringer's solution |
| INCUKIT XL for Cabinet Incubators | INCUBATOR Warehouse.com | For microscope incubator | |
| Instant sea salt | Instant Ocean | 138510 | For egg water |
| KCl | SIGMA-ALDRICH | P4504 | For 1/3 Ringer's solution |
| Methyl cellulose | SIGMA-ALDRICH | M0387-100G | |
| NaCl | SIGMA-ALDRICH | S7653 | For 1/3 Ringer's solution |
| Petri dish | Falcon | 351029 | For making a mount for live imaging |
| Phenol red | SIGMA Life Science | P0290 | |
| Pipette pump | BEL-ART PRODUCTS | F37898 | |
| Pronase | EMD Millipore Corp | 53702-250KU | |
| Tricaine-S (MS222) | WESTERN CHEMICAL INC | NC0135573 | |
| Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires | Sandra | The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use. |
References
- Cooke, J. Scale of body pattern adjusts to available cell number in amphibian embryos. Nature. 290, 775-778 (1981).
- Driesch, H. Entwicklungsmechanische Studien: I. Der Werthe der beiden ersten Furchungszellen in der Echinogdermenentwicklung. Experimentelle Erzeugung von Theil- und Doppelbildungen. Zeitschrift fur wissenschaftliche Zoologie. , (1892).
- Morgan, T. H. Half embryos and whole embryos from one of the first two blastomeres. Anatomischer Anzeiger. 10, 623-638 (1895).
- Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145, (2018).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments. (26), e1217 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), e1113 (2009).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of Visualized Experiments. (29), e1394 (2009).
- Mizuno, T., Shinya, M., Takeda, H. Cell and tissue transplantation in zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, 15-28 (1999).
- Cooke, J. Control of somite number during morphogenesis of a vertebrate, Xenopus laevis. Nature. 254, 196-199 (1975).
- Inomata, H., Shibata, T., Haraguchi, T., Sasai, Y. Scaling of dorsal-ventral patterning by embryo size-dependent degradation of Spemann's organizer signals. Cell. 153, 1296-1311 (2013).
- Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454, 335-339 (2008).
- Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., Francois, P., Aulehla, A. Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding. Nature. 493, 101-105 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Almuedo-Castillo, M., et al. Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signalling. Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).
- Koos, D. S., Ho, R. K. The nieuwkoid gene characterizes and mediates a Nieuwkoop-center-like activity in the zebrafish. Current Biology. 8, 1199-1206 (1998).
- Yamanaka, Y., et al. A novel homeobox gene, dharma, can induce the organizer in a non-cell-autonomous manner. Genes and Development. 12, 2345-2353 (1998).
- Jesuthasan, S., Stahle, U. Dynamic microtubules and specification of the zebrafish embryonic axis. Current Biology. 7, 31-42 (1997).
- Schier, A. F., Talbot, W. S. The zebrafish organizer. Current Opinion in Genetics and Development. 8, 464-471 (1998).
