Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

הפחתת גודל כירורגי של דג Zebrafish לחקר שינוי גודל של תבנית עובריים

Published: May 3, 2019 doi: 10.3791/59434
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Systems Biology, Harvard Medical School

Summary

כאן, אנו מתארים שיטה להפחתת הגודל של עוברי דגים מבלי להפריע תהליכים התפתחותיים נורמליים. טכניקה זו מאפשרת לימוד שינוי קנה מידה וחוסן התפתחותי נגד שינוי גודל.

Abstract

בתהליך ההתפתחותי, עוברים מייצגים יכולת יוצאת דופן להתאים את דפוס הגוף שלהם לגודל גופם; פרופורציה הגוף שלהם נשמרת גם בעוברים גדולים או קטנים יותר, בגבולות מסוימים. למרות שתופעה זו של שינוי קנה מידה משכה תשומת לב במשך יותר ממאה שנה, הבנת המנגנונים הבסיסיים הוגבלה, בשל היעדר תיאור כמותי של הדינמיקה ההתפתחותית בעוברים בגדלים מגוונים. כדי להתגבר על מגבלה זו, פיתחנו טכניקה חדשה בניתוח להפחית את הגודל של עוברי הדגים, אשר יש יתרונות גדולים עבור vivo live הדמיה. אנו מדגימים כי לאחר ההסרה מאוזנת של תאים וחלמון בשלב blastula בשלבים נפרדים, העוברים יכולים במהירות להתאושש תחת התנאים הנכונים ולהתפתח קטן יותר אך בדרך כלל נורמלי העוברים. מאחר שטכניקה זו אינה דורשת ציוד מיוחד, היא ניתנת להתאמה בקלות, וניתן להשתמש בה כדי ללמוד מגוון רחב של בעיות בקנה מידה, כולל החוסן של בתיווך מורפוגן.

Introduction

מדענים ידועים זמן רב כי עוברים יש יכולת יוצאת דופן ליצור פרופורציות גוף קבוע למרות גודל העובר יכול להשתנות במידה רבה בתנאים טבעיים וניסיוניים1,2,3. למרות עשורים של מחקרים תיאורטיים וניסיוניים, החוסן הזה לשינוי גודל, נקרא שינוי קנה מידה, והמנגנונים הבסיסיים שלהם נשארים בלתי ידועים ברקמות ובאיברים רבים. על מנת ללכוד באופן ישיר את הדינמיקה של המערכת המתפתחת, הקמנו טכניקה הפחתת גודל פשוט של הפחתה ב-דג זברה4, אשר יש את היתרון הגדול ב vivo live הדמיה5.

זברפיש שימש כבעל חוליות מודל לחקר דיסציפלינות מרובות של ביולוגיה, כולל ביולוגיה התפתחותית. בפרט, דג דג זברה הוא אידיאלי עבור vivo live הדמיה6 כי 1) הפיתוח יכול להמשיך בדרך כלל מחוץ לאם ואת קליפת הביצה, ו 2) העוברים שקופים. בנוסף, העוברים יכולים לעמוד בטמפרטורה ובתנודות סביבתיות, המאפשרים להם ללמוד בתנאי מעבדה. כמו כן, בנוסף הביטוי הגן הקונבנציונלי הפרטורציה על ידי הזרקת גוורסטינו ו mrna הזרקה7,8, ההתפתחויות האחרונות בטכנולוגיית crispr/Cas9 עשה גנטיקה הפוכה ב-דג זברה יעיל מאוד9. יתר על כן, טכניקות קלאסיות רבות ב אמבריולוגיה, כגון השתלת תאים או ניתוח רקמות ניתן להחיל4,10,11.

הפחתת גודל טכניקות פותחו במקור בעלי חיים שאינם בעלי חוליות12. לדוגמה, ב- xenopus זריזה, עוד מודל פופולרי בעלי חוליות בעלי החיים, החצייה לאורך ציר החי-ווגטל בשלב blastula, יכולים לייצר עוברים מופחתים בגודל12,13. עם זאת, בידינו זו גישה צעד אחד תוצאות העוברים מאואמים או מונאמים ב-zebrafish, ככל הנראה משום שהדטרמיניזם הדו מופץ ללא שינוי ואין לדעת את הלוקליזציה שלהם מתוך המבנה של העוברים. כאן אנו להדגים טכניקה חלופית דו-שלבים לחיתוך באמצעות הדגים המייצרת בדרך כלל אך עוברים קטנים יותר. עם טכניקה זו, תאים מוסרים לראשונה מן הקוטב חיה, אזור של תאים תמימים חסר פעילות ארגונית. כדי לאזן את כמות החלמון והתאים, שהוא חשוב עבור epiboly והבאים מורפוגנזה, חלמון מוסר לאחר מכן. כאן, אנו מפרטים פרוטוקול זה ולספק שתי דוגמאות של קבוע גודל במבנה תבנית; היווצרות הצינור העצבי הגחון. בשילוב עם הדמיה כמותית, אנו משתמשים בטכניקת הפחתת גודל כדי לבחון את האופן שבו גדלים של שפופרת העצבים והצינורית העצבית מושפעים מהעוברים מופחתים בגודל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים הקשורים לדג בוצעו באישור של הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) בבית הספר לרפואה של הרווארד.

1. הכנה לכלי ומגיב

  1. לעשות לולאת חוט לקצוץ עוברים
    1. קח 20 ס מ של חוט נירוסטה נוקשה ולא מאכל עם קוטר של 40 μm. לולאה התיל דרך לתוך נימי זכוכית (1.0 מ"מ קוטר חיצוני, 0.5 מ"מ קוטר פנימי, ללא פילמנט), עושה לולאה קטנה בראש (אורך הלולאה הוא 1.0 מ"מ)
    2. שים טיפה של לק מסמר ברור על קצה של נימי הזכוכית בין לולאת התיל כדי להחזיק אותו במקומו. . תן להתייבש ודא שלא לקבל לק ציפורניים על החלק לולאה, כפי שהוא עלול לגרום נזק לעוברים.
    3. חברו את נימי הזכוכית עם הלולאה אל המקל עץ (9 "במבוק מקלות אכילה שבורים לחצי) באמצעות קלטת מעבדה. השאירו כ 2.5 ס מ של נימי הזכוכית הארכת מעבר למקל, כך שהחלק של המקל של הכלי אינו טובלים במים. התאם אורך זה להעדפה.
  2. לחילופין, להכין מחט זכוכית כדי לקצוץ עוברים
    1. צביטה בקצה אחד של מיכל הזכוכית פסטר עם מלקחיים, תוך החזקת הצד השני עם יד. מחממים את החלק הדק של הפיפטה מעל מנורת רוח או מבער בונזן.
    2. . משוך את הזכוכית לצינורות הפיפטה האידיאלי כקוטר של כ -30 יקרומטר ועקומה עדינה (רדיוס של עקמומיות = כ-5 מ"מ). הקוטר והעקמומיות הנכונים מתקבלים עם תרגול והסיכוי כלשהו.
  3. הכנת מתיל תאית
    1. מתיל תאית משמש להחזיק את העוברים בזמן חיתוך. לעשות 2% מתיל תאית הפתרון 1/3x הפתרון של הצלצול (116 mM הנאקל, 2.9 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, ו 5 מ"מ 4-(2-הידרוקסיל) -1-piperazinefonic חומצה (hepes; pH 7.2)). שייק מתיל תאית בתמיסה 1/3x של הצלצול ב 4 ° c בלילה.
    2. באופן אופציונלי, להוסיף ~ 1.5 mL פנול אדום (0.5% בפתרון מניות DPBS) כדי 10 mL 2% מתיל תאית פתרון, עד אדום, כדי להפוך את הפתרון גלוי. טלטל אותו עד שהצבע יהפוך לאחיד.

2. הכנת עוברי דג העוברים עבור הפחתת גודל כירורגי

  1. לאסוף עוברים
    1. מניחים אחד או שניים זכר ואחת או שתיים דגים בחדר ההזדווגות מלא במים רבים. הפרד בין הזכרים והנקבות באמצעות מפצל פלסטי. השתמש בשורת ה-AB עבור הדמיה somite (סעיף 4) ושורת כתב טרנסגניים של הצינורית העצבית (nkx 2.2: מחבר-gfp, dbx1b: gfp, או Olig2: dsred) עבור דימות הצינור העצבי. . תשאירו אותם בחדר הלילה
      הערה: הבחירה של מבוגרים חשוב להשיג ביצים ששרדו היטב ניתוח. בדרך כלל, נקבות בריאות צעירות לייצר ביצים בריאות.
    2. בבוקר שלמחרת, העבירו את החדר למים רדודים והניחו את החדר בהטיה קלה. הסר את המחיצה כך שהדג יוכל להזדווג.
    3. לאסוף את הביצים על ידי לשפוך לתוך מסננת תה. להעביר את הביצים לתוך צלחת פטרי עם מי ביצה (עבור 20x ביצים מים, 6 גרם מלח ים מיידית, 1.5 g CaSO4 ו 1 L H2O; שימוש ב-1x). לקבלת היערכות טובה יותר, לאסוף את הביצים מיד לאחר ההשריץ. מניחים את העוברים בחממה 28.5 ° c.
    4. במקרה הצורך, הכנס את המספר שלבים, בשלבים של 1 עד 4 בעקבות פרוטוקול משותף7,8. הכנס mRNA לתווית ממברנה פלואורסצנטית (הגברת מצ, מmBFP1, או הגברת-מקאיטארין) עבור דימות הצינור העצבי (סעיף 5).
  2. דורגון באמצעות הפרואז
    1. סביב 128-cell כדי 256-הבמה התא, להעביר עוברים בריאים לצלחת מזכוכית 35 מ"מ מלא במי ביצה. להסיר את כל מי ביצים ככל האפשר מן המנה.
    2. הוסף 1 מ ל של 20 מ"ג/mL בכיוון. העוברים מערבולת בעדינות סביב על ידי הזזת הצלחת ומצנקת בעדינות את הפתרון למעלה ולמטה כדי לסייע בביטול השימוש בצנרת זכוכית.
    3. כאשר מתחילים לאבד אלסטיות (בדרך כלל 1-4 דקות לאחר הוספת התכונות, בהתאם לכמות של ביצים ומים), להוסיף כמו מי ביצה הרבה ככל האפשר כדי לדלל את התכונות. להעריך את האובדן אלסטיות על ידי נגיעה בעדינות chorion עם מלקחיים; הצ צריך להחזיק את השקע. בלי לחזור מיד להעביר את הביצים לתבשיל אחר עם מי ביצה באמצעות פיפטה זכוכית (בשלב זה, רוב הורמונים לא שבורים).
      1. לחילופין, שופכים בעדינות את העוברים ממנה לתוך מיכל זכוכית 400 mL גדול ממולא במי ביצה מבלי לחשוף עוברים לאוויר. ואז, תן לעוברים להתיישב לחלוטין. להטות את הגביע כדי לאפשר לעוברים ליפול לצד אחד. לאסוף את העוברים הללו באמצעות הצינורות זכוכית ולהעביר לצלחת זכוכית חדשה 35 מ"מ מלא עם הפתרון של 1/3x צלצול.
    4. המתן מספר דקות עד שרוב הורמונים מאבדים גמישות מוחלטת. להסיר את שאר הורמונים מעוברים על ידי ללטף בעדינות את הביצים. הסרת עוברים פגומים והדגירה של העוברים בחממה 28.5 ° c.

3. הפחתת גודל כירורגי ושחזור

  1. להכין אחד נקי 35 מ"מ צלחת זכוכית. מורחים כ 0.5 mL של 2% מתיל תאית (ב 1/3x הפתרון של הצלצול, עם אדום פנול כדי לעזור להמחיש) ליד מרכז החלק התחתון של המנה הגדולה יותר באמצעות מרית פלסטיק. דק ושווה להפיץ את מתיל תאית לעובי של כ 0.5 מ"מ.
  2. יוצקים כ 30 מ ל של 1/3x הפתרון של הצלצול לצד של המנה ולאפשר להתפשט על שאר המנה, כיסוי מתיל תאית.
  3. הציבו עוברים ב256-תא-1k-תא בשלב 2% מתיל תאית. התאימו את כיוון העוברים אל הצד כדי להמחיש את התאים ואת החלמון. (איור 1)
  4. קוצצים כ 30%-40% של תאים מן הבלסטועור ליד הקוטב בעלי חיים על ידי חיתוך בניצב לציר החי-וצמחי באמצעות לולאת התיל (או מחט זכוכית) (איור 1, לוחות העליון). לאחר הסרת התאים, הקש בעדינות את הקצוות יחד כדי לסייע לתאים הנותרים להיצמד לאחור. בתוך דקות, התאים המתים צריכים. להיות מתים כשהעובר מתחיל להחלים
  5. הפוך פצע קטן לחלמון ליד הקוטב הצמחי במקום "לקצוץ" את החלמון (איור 1 לוחות הביניים). הפצע את החלמון על ידי הטלת קרום הביצה בתיל הטעון. חלמון יתרפא לכמה דקות לאחר פציעתו, ואז הפצע ירפא (איור 1 לוחות התחתון).
  6. כאשר החלמון מפסיק נוטף החוצה, להזיז את העובר באמצעות pipet מחוץ התאית מתיל באותו תבשיל כדי לאפשר להם להתאושש טוב יותר.
  7. חזור על שלבים 3.4-3.6 עבור כל העוברים. להשאיר את הצלחת יציבה 30 דקות בזמן העוברים להתאושש.
  8. העבר את העוברים לצלחת חדשה עם הפתרון החדש של 1/3x מתחזה ולשים אותם בחממה 28.5 ° c כדי לאפשר להם להתאושש לחלוטין.
    1. אופציונלי אם השלב של העניין הוא השלב המוקדם מוקדם, העוברים יכולים להיות מודטים ב 20 ° c לאחר שהוא מודב 28.5 ° c עד שלב המגן, כדי להתאים את העיתוי לניסויים והדמיה.

4. הדמיה חיה של בריידג סומאיטאוגנזה

  1. הכן 100 mL של 1% הפתרון על ידי הוספת 1 גרם של agarose כדי 100 mL של מי ביצים, חימום עד התפרקה הוא הומס המלא. תנו מצננים עבור 5-10 דקות לטמפרטורה של 62-72 ° c.
  2. הכינו הר להדמיה.
    הערה:     מדריך זה פותחה לשימוש עם מיקרוסקופ שדה רחב הפוך.
    1. יוצקים ~ 15 מ ל של 1% התעוררה ב-100 מ"מ x 15 מ"מ צלחת פטרי פלסטיק.
    2. מניחים בעדינות תבנית כייר V1 על גבי הראש5 על החלק התחתון של צלחת פטרי. לשמור על העובש בתחתית באמצעות משקל, כגון 15 מ ל שפופרת עם מים.
      הערה: כך העוברים קרובים לתחתית צלחת פטרי ככל האפשר, כאשר משתמשים במיקרוסקופ הפוך. למרות העוברים מותקן מחוץ לתמונה עבור הדמיה somite, כאן מאונט V1 התמונה5 משמש מאז הוא מחזיק את העוברים טוב יותר בשלבים המוקדמים somite.
    3. תנו להתקרר עד שהוא. מתחזק לגמרי יוצקים ב ~ 30 מ ל של מי ביצה עם 0.01% tricaine, ובזהירות להסיר עובש על ידי בעדינות לחטט עם מלקחיים.
  3. מאונט העוברים עבור הדמיה somite
    1. הכינו 1% התכה נמוכה בתמיסה של 1/3x (או מי ביצים) ושמור אותו ב 42 ° c. המתן עד שטמפרטורת הטמפרטורה יורדת ל-42 ° c.
    2. , תחת מיקרוסקופ לחיתוך. הציבו עובר אחד לכל הטוב פיפטה בקירוב 1 μL של התכה נמוכה בבאר כדי להתאים את גודל הבאר לגודל של עוברים בודדים המשתנים בגודל, במיוחד בין אלה עם ובלי גודל הפחתה.
    3. במהירות האוריינט העוברים לפני המסת התכה הנמוכה מתחזק כך שפני העוברים התחלפו לחלוטין למנה. לאחר לטעון עוברים, בעדינות למקם את שובר הכיסוי בהר העלה כדי להחזיק את העוברים במקומם. האוריינטציה חשובה במיוחד להדמיה ארוכת הטווח, כי העוברים צריכים להיות מורכבים בדיוק לאורך כל הגבולות הסומטים לצורך הדמיה מהירה בשלבים מאוחרים יותר.
    4. הרחק מן האזור ההרכבה ולטפל 25 מ"מ x 25 מ"מ זכוכית כיסוי כגון זה 45 מעלות היסט מכיוון כניסת הכיכר שנעשו על ידי העובש. החלק את הכיסויים על העובש בכיוון זה עד שכל פינה מונחת בצד שונה של התבנית.
      הערה: למרות פרוטוקול זה הוא עבור מיקרוסקופ הפוך, הצבת זכוכית כיסוי על גבי העובש הוא עדיין חשוב כך העוברים לא לזוז בעת העברת למיקרוסקופ.
  4. הדמיה של תהליך היווצרות התמונות
    1. חמם את המיקרוסקופ ל -28 ° c בחממה שנבנתה עם לוחות מוקצף ומחמם הקבינט.
    2. מניחים את צלחת פטרי עם העוברים רכוב על במת המיקרוסקופ. מצא את העובר רכוב על הטוב השמאלי העליון של הר agarose עם עדשת הגדלה נמוכה, ואז לעבור את המטרה 10x.
    3. הגדר רכישת תמונות.
      הערה: הוראה זו היא לשדה בהיר.
    4. מצא תנאים עבור כוח האור, זמן חשיפה, והעבה, כך שגבול somite ניתן לראות בבירור. שימוש בהגדרות z-מחסנית מגדיר את מישור ההדמיה הרצוי ביותר והגבוה ביותר. הגדר את מרווח הזמן והשעה הכולל. למצוא ולרשום את המיקומים של xy של כל העוברים רכוב כל כך העוברים מרובים ניתן לבצע תמונה בו.
  5. למדוד את האורכים של PSM ו מסוענים באמצעות פיג'י16.

5. הדמיה של מעצבי צינור עצביים

  1. הכן 100 mL של 1% הפתרון על ידי הוספת 1 גרם של agarose כדי 100 mL של מי ביצים, חימום עד התפרקה הוא הומס המלא. אפשר להתקרר עבור 5-10 דקות עד 62-72 ° c. . התאימו את טריקיין ל 0.01%
  2. הכן מטען להדמיה.
    הערה:     מדריך זה מפותח לשימוש עם מיקרוסקופ זריחה זקופה. עבור מיקרוסקופים הפוכה שמיכות מנות התחתונה הם נחוצים וכיוון ההרכבה בשלב 3 מתהפך.
    1. שופכים ב-~ 15 מ ל של 1% מעלה ל-100 מ"מ x 15 מ"מ בצלחת פטרי מפלסטיק. בעדינות לצוף העובש הV1 על גבי המשטח של הצמח כדי למנוע בועות אוויר. תנו להתקרר עד שהוא. מתחזק לגמרי
    2. הסר בזהירות את העובש עם מלקחיים או סכין גילוח. ממלאים את הצלחת עם מי ביצה עם 0.01% tricaine ולכסות עד השימוש.
  3. . עוברים לדימות הצינור העצבי
    1. אפשר טרנסגניים או מוזרק בגודל פלורסנט-מופחת העוברים שליטה לפתח עד השלב 20-25 somite (בערך 18-22 h לאחר הפריה). עוברים המבטאים תווית של ממברנה פלואורסצנטית (גברתמצ, גברת-mBFP1, או הגברת מקאיטרין) וכתבת טרנסגניים של הצינורית העצבית (nkx 2.2: הגברת-gfp, dbx1b: gfp, או Olig2: dsred) משמשים להדמיה.
    2. החלפת בינונית מים ביצה ב מוכן הר מוכנים עם 0.01% tricaine פתרון העבודה. בעדינות פיפטה בעוברים להיות התמונה כדי בארות של ההר הגבי.
    3. מניפולציות עוברים לכיוון הנכון, כך שהראש פונה קדימה להר והזנב מצביע לעבר העורף עם החלק האחורי הפונה לכיוון משטח המים.
    4. המזרח העובר כך הזנב הוא שוכב שטוח ולא מופנה כלפי מטה לכיוון התחתון של המנה. זה לפעמים מועיל להניח את החלק האחורי של הזנב על אדן הצד של ההרכבה היטב כדי למנוע את הזנב מטביעה בשוגג הדמיה המוח הישבן. . אני חוזר על כל עובר להיות מסוימים עם מופחתת גודל העוברים כי הם לא נופלים עמוק לתוך הבארות כדי להיות בתמונה.
    5. הרחק מן האזור להרכבה ולטפל 25 מ"מ x 25 מ"מ זכוכית כיסוי כגון זה הוא 45 ° היסט מכיוון הכניסה הכיכר שנעשו על ידי העובש. החלק את הכיסויים על העובש בכיוון זה עד שכל פינה מונחת בצד שונה של התבנית.
    6. סובב לאט את שמיכות הזכוכית עד שהיא תיפול בעדינות לאזור ההרכבה. בדוק כדי להיות בטוח עוברים עדיין מותקן במיקומים ובכיוונים הנכונים. אם תנועה יותר מדי נגרמת על ידי נפילת שמיכות, להסיר בעדינות ולחזור על הרכבה משלב C.
  4. תמונה בתלת-מימד את חוט השדרה המתפתח.
    1. בעדינות להעביר את המנה המכילה עוברים רכוב למיקרוסקופ קונפוקלית וקד. להדמיה לטווח ארוך, הקפידו להשתמש במיקרוסקופ מודגר. . אחרת, הטמפרטורות הנמוכות נסבלים
    2. תחת האור הברייטאלי, נווט אל העובר לתמונה ומרכז את שדה הראיה בעמדה המועדפת האחורי הקדמית. כדי לאפשר השוואה מפורטת בין עוברים, עמדה זו על כל עובר חייבת להיות עקבית.
    3. הגדר את פרמטרי ההדמיה כדי להלהיב וללכוד אות מחלבונים פלורסנט להיות בתמונה. פרמטרים ניתן לכוונן על ידי עין כדי ליצור תמונה רצויה על המדגם הראשוני. כדי לאפשר עקביות מדידה, החל הגדרות אלה על כל העוברים בערכת הנתונים. אם הרבה מערימות z נדרשים למטב את ההגדרות עבור מהירות.
    4. באמצעות הגדרות z-מחסנית, הגדר את מישור ההדמיה הרצוי ביותר והגבוה ביותר. לאיכות תמונה אופטימלית במחסנית z, הגדר את רזולוציית z לגבוהה ביותר המיטבית עבור הגדרת הצמצם. ניתן ליצור תמונות טובות עם מרווח של 1 יקרומטר.
  5. ניתוח נתוני הדמיה לפי כל שיטה מועדפת.
    הערה: במקרה זה, הניתוח בוצע עם סקריפטים MATLAB מותאמים אישית המאפשרים פילוח פשוט של החלקים העצביים של תמונה וכימות של אות הדמיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפחתת נפח חלמון חשוב עבור מורפולוגיה נורמלית
כפי שמתואר לאחרונה באלמואדו-קסטיליו ואח '.17, הפחתת גודל העוברים יכולה להיות מושגת ללא צמצום נפח החלמון. כדי להשוות עם וללא הפחתת נפח החלמון, בוצעו שני שלבים חיתוך (הן blastula וחלמון) ו blastula בלבד חיתוך (איור 2 ו המשלים סרט 1). שני צעדים קצוצים עוברים הראו מורפולוגיה כללית נורמלית לכאורה לעומת השליטה (בלבד) עוברים, מלבד הבדל גודל, לאורך השלבים ההתפתחותיים (ראה לוחות העליון והאמצעי באיור 2). מצד שני, עוברים blastula בלבד הראו מורפולוגיה מוזרה, במיוחד בשלבים מוקדמים יותר. במהלך אפיבוולי, העוברים הופיעו מראה מכווץ ומדורג (ראה פאנל התחתון עבור 70% epiboly באיור 2). בשלב השונה הבא, נמצאו מבנים של קו האמצע שישוטחו (כלומר אורך DV הוא קצר יחסית מאורך ML) ברמות צירית רבות (ראה לוחות התחתית עבור 8 ו 20 somite באיור 2). בשלבים מאוחרים יותר, מבני הגוף הסמוכים לחלמון, כגון המוח האמצע והקודם, והראשון ~ 10 מסוענים, עדיין הראה צורה משוטח יחסית, אולי עקב מתח מוגבר מהחלמון הגדול יחסית.

הפחתת גודל מופחת בגודל העוברים מופחתת
סומניטים הם מבנים הסנטלית המופיעים בembryogenesis ומעניקים החוליות ושריר השלד. מתוך מחשוב מאוד (PSM), מסוענים הם הקימו אחד אחד מן הקדמי לכיוון האחורי באופן תקופתי (כגון 25 דקות לדגים zebrafish, 2 h עבור עכברים) (איור 3א). ביצעת הדמיה של הזמן להדמיה של היווצרות somite הן עבור שליטה ועוברי העוברים והוא נמדד בגודל של מרבית הסוענים שנוצרו לאחרונה (איור 3ב). הן בשליטה והן בעוברים קצוצים, הגדלים של הסומונים שנוצרו בשלבים מאוחרים יותר נמצאו קטנים יותר בהשוואה לאלה משלבים קודמים. כמו כן, לאורך שלבי היווצרות somite, עוברים קצוץ היו מסוענים קטנים יותר מאלה העוברים שליטה (איור 3ג).

הגבהים של הצינורית העצבית מופחתים הפחתת גודל הבאה
כדי לראות את ההשפעה של הפחתת גודל העובר על גודל הצינור העצבי, בוצעו שלנו בשיטת חיתוך שני שלבים על העוברים מוזרק מזרק -mcherry והדמיה שלהם מיתרי השדרה ב 20 hpf באמצעות מערכת הדמיה קונפוקלית וקד שלנו (איור 4א, ב). בערכת נתונים זו, גבהים שפופרת עצביים הופחת בעקבות הפחתת גודל על-ידי 12.4% ± 3.2%, כפי שנמדד באופן ידני באמצעות קוד ניתוח תמונה מותאם אישית (איור 4ג). ביחד, נתונים אלה מראים כי הפחתת גודל מפחיתה את גובה הצינור העצבי. טכניקה זו יכולה לשמש כדי למדוד את ההשפעות של הפחתת גודל על העצבים העצביים.

Figure 1
איור 1 : הפחתת גודל הטכניקה. כ -30%-40% מהתאים נחתכו ממוט החיות (לוחות עליונים). הקרום המקיף את החלמון נפצע בקפידה, כך שחלמון החוצה (לוחות הביניים). במשך הדקות הבאות, החלמון התגלה ולאחר מכן הפצעים בשני הצדדים ובחלמון החלימו (לוחות התחתית). סרגל קנה מידה = 200 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 : השוואה בין שתי שיטות של הפחתת גודל. עוברי שליטה (לוחות העליון, העוברים העליון עבור 24 hpf ו 30 hpf), גודל מופחת העוברים עם שני שלבים חיתוך (blastula וחלמון, לוחות באמצע, העוברים הביניים 24 hpf ו 30 hpf) וגודל העוברים מופחתת עם חיתוך blastula בלבד (לוחות התחתון, העוברים התחתונים עבור 24 hpf ו 30 hpf) מושווים לאורך שלבים התפתחותיים. שים לב כי בעוברים blastula בלבד, נפח בלסטועור הוא הרבה יותר קטן לעומת החלמון (ב 70% epiboly). כתוצאה מכך, לעובר יש צורה בעלת שיטוח באופן לא פרופורציונלי בשלבים השונים (כלומר, ציר DV הוא קצר יחסית לעומת ציר AP בעוברים blastula בלבד, לעומת הפקד או שני שלבים קצוצים אחד). קנה מידה ba = 200 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3 : הפחתת גודל מפחיתה אורך של מסוענים. (א) תרשים סכמטי של היווצרות הסומונייט. (ב) שדה בהיר תמונות של שליטה ועוברים קצוצים לאורך זמן. ראשי חץ צהובים מצביעים על הסומיט החדש ביותר שנוצר בכל שלב somite. (ג) אורך somite (בציר אחורי קדמי) מדידות לאורך זמן עבור שליטה ועוברים קצוצים. קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4 : הפחתת גודל מפחיתה את גובה הצינור העצבי. (א-ב) תמונות לדוגמה של העוברים בגודל רגיל (A) וגודל מופחת (ב) tg (ptch2: kaede) עוברי אשר הוזרק בשלב התא היחיד עם הגברת mcherry mrna. סרגל קנה מידה = 20 μm. (ג) הגבהים העצביים שחולצו מפילוח ידני של הצינור העצבי בכל מחסנית z. הבדלים משמעותיים סטטיסטית הם נצפו בגובה העצבי הממוצע כאשר הערכים מושווים באמצעות מבחן t מזווג (p = 0.0397). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Supplemental Movie 1
משלים סרט 1: השוואה בין חיתוך שני שלבים לעומת חיתוך blastula בלבד. השורה העליונה = עוברי בקרה, שורה אמצעית = מופחתת גודל העוברים עם שני צעד חיתוך, בשורה התחתונה = עוברים מופחתת גודל עם blastula רק חיתוך. סרטים נלקחו כל 3 דקות עבור 12 h. סרגל סרגל = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

היסטורית, בין בעלי חוליות, הפחתת גודל מבוצעת בעיקר באמצעות עוברי אמפיבי, על ידי ביצוע העוברים לאורך ציר החי-צמחי בשלב blastula12. עם זאת, ישנם בעיקר שני הבדלים בין הצפרדע לעוברים עוברי דגים כאשר אנו ביסעי עוברים. ראשון, על הבמה כאשר העוברים משתדגים להיות סובלני של ביסען (blastula stage), המארגן ממוקם באזור מוגבל של blastula שוליים18,19,20,21. מכיוון שאי אפשר לומר את המיקום של המארגן מתוך המבנה של העוברים, חיתוך אקראי של העובר לאורך הציר החי-הצמחי מייצרת עוברים מדורמיים או מונאמים. שנית, בניגוד עוברי הצפרדע, עוברי העוברים בתהליך הנקרא epiboly, שבו תאים לנוע לכיוון הקוטב הצמחי סביב חלמון מופרדים עד שהוא מוקף לחלוטין על ידי תאים. אם רק חלק מהעור מוסר, פחות תאים נשארים ליצור חלמון של נפח גדול יחסית, וכתוצאה מכך, מורפולוגיה נראה מושפע לאחר epiboly. לכן, אנחנו מעסיקים שני שלבים חיתוך שבו אנחנו חותכים בלולות ליד הקוטב בעלי חיים, כדי למנוע קיצוץ המארגן, ופצע את קרום החלמון, כדי להפוך את גודל החלמון פרופורציונלי לblastula.

בנוסף חיתוך שני שלבים, מצאנו את המדיום שבו ניתוח הפחתת גודל מבוצע הוא קריטי להתאוששות של עוברים אחרי הניתוח. בין מספר מדיה שניסינו (מי ביצים, מים ביצה + אלבומין, מאגר Danieau, L15, L15 + FBS, 1/3x הצלצול, 1x הצלצול), רק 1/3x הצלצול ו-1x צלצול הניבו שיעורי הישרדות גבוהים; באמצעי תקשורת אחרים, העוברים לא הצליחו להתאושש מהפצעים.

עצה חשובה לפתרון בעיות עבור שיעור ההישרדות נמוכה היא להשתמש עוברים בריאים דגים הורים בריאים וצעירים. ציינו כי גם כאשר השליטה ללא גודל העוברים מופחתת להראות כמעט 100% שיעור ההישרדות, כאשר גודל מופחת, עוברים מדגים מבוגרים נוטים להראות שיעור הישרדות נמוך. כמו כן, שים לב ששיעור ההישרדות נוטה להצטמצם כאשר הפחתת הגודל משולבת עם רטבאליות נוספים, כגון הזרקת גוורולסטינו.

הפשטות של טכניקת הפחתת הגודל המתוארת כאן מאפשרת לחוקרים ליישם טכניקה זו ללא ציוד מיוחד או הכשרה אינטנסיבית. יתר על כן, מאז העוברים מופחתת גודל להישאר קטן עד לשלבים מאוחרים יותר של התפתחות (ברגע שהם מתחילים לאכול, גודל שלהם נראה להדביק את הדג בקרה), טכניקה זו ניתן להחיל על שינוי קנה מידה של רקמות ואיברים רבים. לכן, טכניקה זו מאפשרת לשלב את הפחתת גודל וכמותית בהדמיה vivo live כדי ללמוד שינוי גודל ושליטה בגדלים של מערכות שונות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים לא מצהירים על אינטרסים כלכליים או מתחרים.

Acknowledgments

העבודה נתמכת על ידי תוכנית מפרסטו של יפן מדעי וטכנולוגיה הסוכנות (JPMJPR11AA) ומכונים לאומיים של מענק בריאות (R01GM107733).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
60 mm PYREX Petri dish CORNING  3160-60
Agarose affymetrix 75817 For making a mount for live imaging
Agarose, low gelling temperature Type VII-A SIGMA-ALDRICH A0701-25G
CaCl2 EMD CX0130-1 For 1/3 Ringer's solution
CaSO4 For egg water
Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1) CORNING 2845-25
Disposable Spatula VWR  80081-188
Foam board ELMER'S 951300 For microscope incubator
Forcept (No 55) FST 11255-20
Glass pipette VWR 14673-043
HEPES SIGMA Life Science H4034 For 1/3 Ringer's solution
INCUKIT XL for Cabinet Incubators INCUBATOR Warehouse.com For microscope incubator
Instant sea salt Instant Ocean 138510 For egg water
KCl SIGMA-ALDRICH P4504 For 1/3 Ringer's solution
Methyl cellulose SIGMA-ALDRICH M0387-100G
NaCl SIGMA-ALDRICH S7653 For 1/3 Ringer's solution
Petri dish Falcon 351029 For making a mount for live imaging
Phenol red SIGMA Life Science P0290
Pipette pump BEL-ART PRODUCTS F37898
Pronase EMD Millipore Corp 53702-250KU
Tricaine-S (MS222) WESTERN CHEMICAL INC NC0135573
Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires Sandra The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cooke, J. Scale of body pattern adjusts to available cell number in amphibian embryos. Nature. 290, 775-778 (1981).
  2. Driesch, H. Entwicklungsmechanische Studien: I. Der Werthe der beiden ersten Furchungszellen in der Echinogdermenentwicklung. Experimentelle Erzeugung von Theil- und Doppelbildungen. Zeitschrift fur wissenschaftliche Zoologie. , (1892).
  3. Morgan, T. H. Half embryos and whole embryos from one of the first two blastomeres. Anatomischer Anzeiger. 10, 623-638 (1895).
  4. Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145, (2018).
  5. Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
  6. Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments. (26), e1217 (2009).
  7. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
  8. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), e1113 (2009).
  9. Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
  10. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of Visualized Experiments. (29), e1394 (2009).
  11. Mizuno, T., Shinya, M., Takeda, H. Cell and tissue transplantation in zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, 15-28 (1999).
  12. Cooke, J. Control of somite number during morphogenesis of a vertebrate, Xenopus laevis. Nature. 254, 196-199 (1975).
  13. Inomata, H., Shibata, T., Haraguchi, T., Sasai, Y. Scaling of dorsal-ventral patterning by embryo size-dependent degradation of Spemann's organizer signals. Cell. 153, 1296-1311 (2013).
  14. Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454, 335-339 (2008).
  15. Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., Francois, P., Aulehla, A. Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding. Nature. 493, 101-105 (2013).
  16. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  17. Almuedo-Castillo, M., et al. Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signalling. Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).
  18. Koos, D. S., Ho, R. K. The nieuwkoid gene characterizes and mediates a Nieuwkoop-center-like activity in the zebrafish. Current Biology. 8, 1199-1206 (1998).
  19. Yamanaka, Y., et al. A novel homeobox gene, dharma, can induce the organizer in a non-cell-autonomous manner. Genes and Development. 12, 2345-2353 (1998).
  20. Jesuthasan, S., Stahle, U. Dynamic microtubules and specification of the zebrafish embryonic axis. Current Biology. 7, 31-42 (1997).
  21. Schier, A. F., Talbot, W. S. The zebrafish organizer. Current Opinion in Genetics and Development. 8, 464-471 (1998).

Tags

ביולוגיה התפתחותית סוגיה 147 שינוי קנה מידה הפחתת גודל אמבריולוגיה הפחתה חוסן פיתוח אורגאוגנזה
הפחתת גודל כירורגי של דג Zebrafish לחקר שינוי גודל של תבנית עובריים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ishimatsu, K., Cha, A., Collins, Z.… More

Ishimatsu, K., Cha, A., Collins, Z. M., Megason, S. G. Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling. J. Vis. Exp. (147), e59434, doi:10.3791/59434 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter