Summary
Hier beschrijven we een methode om de grootte van zebravis embryo's te verkleinen zonder de normale ontwikkelingsprocessen te verstoren. Deze techniek maakt de studie van het patroon schalen en ontwikkelingsstoornissen robuustheid tegen grootte te veranderen.
Abstract
In het ontwikkelingsproces, vertonen de embryo's een opmerkelijke capaciteit om hun lichaams patroon aan hun lichaamsgrootte te passen; hun lichaamsdeel wordt gehandhaafd, zelfs in embryo's die groter of kleiner zijn, binnen bepaalde grenzen. Hoewel dit fenomeen van de schaalvergroting heeft de aandacht getrokken voor meer dan een eeuw, het begrijpen van de onderliggende mechanismen is beperkt, deels als gevolg van een gebrek aan kwantitatieve beschrijving van de ontwikkelingsdynamiek in embryo's van verschillende grootte. Om deze beperking te overwinnen, ontwikkelden we een nieuwe techniek om chirurgisch de grootte van zebravis embryo's te verminderen, die grote voordelen hebben voor in vivo Live Imaging. Wij tonen aan dat na een evenwichtige verwijdering van cellen en dooier in de blastula fase in afzonderlijke stappen, embryo's snel kunnen herstellen onder de juiste omstandigheden en zich ontwikkelen tot kleinere, maar anders normale embryo's. Aangezien deze techniek geen speciale apparatuur nodig heeft, is het gemakkelijk aanpasbaar, en kan worden gebruikt om een breed scala van schaling problemen studie, met inbegrip van robuustheid van morphogen gemedieerde patroon.
Introduction
Wetenschappers weten al lang dat embryo's een opmerkelijke mogelijkheid hebben om constante lichaamsverhoudingen te vormen, hoewel de embryo grootte sterk kan variëren, zowel onder natuurlijke als experimentele omstandigheden1,2,3. Ondanks decennia van theoretische en experimentele studies, blijft deze robuustheid aan grootte variatie, genoemd het schrapen, en zijn onderliggende mechanismen onbekend in vele weefsels en organen. Om de dynamiek van het ontwikkelingssysteem direct vast te leggen, hebben we een reproduceerbare en eenvoudige grootte reductie techniek in zebravis4, die het grote voordeel in in vivo Live Imaging5heeft.
Zebravis heeft gediend als een model gewervelde dier om meerdere disciplines van de biologie studie, met inbegrip van ontwikkelingsbiologie. In het bijzonder, zebravis is ideaal voor in vivo Live Imaging6 omdat 1) ontwikkeling kan normaal te werk gaan buiten de moeder en de eierschaal, en 2) de embryo's zijn transparant. Bovendien zijn de embryo's bestand tegen temperatuur-en milieu fluctuaties, waardoor ze in laboratoriumomstandigheden kunnen worden bestudeerd. Ook, in aanvulling op conventionele genexpressie verstoring door morpholino en mRNA injectie7,8, recente vooruitgang in de Crisper/Cas9 technologie heeft omgekeerde genetica in zebravis zeer efficiënte9. Bovendien kunnen vele klassieke technieken in embryologie, zoals cel transplantatie of weefsel chirurgie worden toegepast4,10,11.
De de verminderings technieken werden van de grootte oorspronkelijk ontwikkeld in amfibie en andere niet-gewervelde dieren12. Bijvoorbeeld, in Xenopus laevis, een ander populair gewervelde dierlijk model, Bisectie langs de dierlijk-plantaardige as in blastula stadium kan grootte-verminderde embryo's12,13produceren. Echter, in onze handen deze One-Step benadering resulteert in dorsale of ventralized embryo's in zebravis, vermoedelijk omdat dorsale determinanten ongelijk verdeeld en men kan niet weten wat hun lokalisatie van de morfologie van embryo's. Hier tonen we een alternatieve twee-staps hakken techniek voor zebravis die normaal ontwikkelt, maar kleinere embryo's produceert. Met deze techniek worden cellen voor het eerst verwijderd uit de dierlijke pool, een gebied van naïeve cellen ontbreekt in organisator activiteit. Om de hoeveelheid dooier en cellen in evenwicht te brengen, die voor epiboly en verdere morfogenese belangrijk is, wordt de dooier dan verwijderd. Hier, we detail dit protocol en bieden twee voorbeelden van grootte onveranderlijkheid in patroonvorming; Somiet vorming en buik neurale buis patroon. Gecombineerd met kwantitatieve beeldvorming, gebruikten we de grootte reductie techniek om te onderzoeken hoe de grootte van somieten en neurale buis worden beïnvloed in grootte verminderde embryo's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle met de visserij verband houdende procedures werden uitgevoerd met de goedkeuring van de institutionele Commissie van het Dierzorg en van het gebruik (DEC) bij de medische school van Harvard.
1. voorbereiding van gereedschap en reagens
-
Maak een draad lus om embryo's te hakken
- Neem 20 cm roestvrijstalen draad die stijf en niet corrosief is met een diameter van 40 μm. Loop de draad door in glas capillaire (1,0 mm buitendiameter, 0,5 mm binnendiameter, geen gloeidraad), het maken van een kleine lus aan de bovenkant (lus lengte is 1,0 mm)
- Zet een kleine druppel van duidelijke nagellak op het puntje van het glas capillaire tussen de draad lus om het te houden op zijn plaats. Laat drogen. Zorg ervoor dat u geen nagellak te krijgen op de lus gedeelte, omdat het kan schade aan de embryo's.
- Bevestig het glas capillaire met de lus op een houten Chopstick (9 bamboe wegwerp eetstokjes gebroken in de helft) met behulp van Lab tape. Laat ongeveer 2,5 cm van het glas capillaire uitbreiding buiten de Chopstick, zodat de Chopstick deel van het gereedschap niet dip in het water. Pas deze lengte aan voorkeur.
-
Alternatief, maak een glas naald om embryo's te hakken
- Knijp een uiteinde van glas Pasteur pipet met een tang, terwijl de andere kant met een hand. Verhit het dunne deel van de pipet over een Spirit lamp of broodjes brander.
- Hand-trek de glazen pipet. De ideale pipet als een diameter van ongeveer 30 μm en een zachte kromme (kromtestraal = ongeveer 5 mm). Juiste diameter en kromming wordt verkregen met de praktijk en een kans.
-
Bereid methylcellulose
- Methyl cellulose wordt gebruikt om de embryo's te houden tijdens het hakken. Maak 2% methylcellulose oplossing in de oplossing van ⅓ x Ringer (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, en 5 mm 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic zuur (Hepes; pH 7,2)). Schud methylcellulose poeder in de oplossing van ⅓ x Ringer bij 4 °C 's nachts.
- Optioneel, voeg ~ 1,5 mL fenol rood (0,5% in DPBS Stock Solution) tot 10 mL 2% methylcellulose oplossing, tot rood, om de oplossing zichtbaar te maken. Schud het tot de kleur uniform wordt.
2. bereiding van zebravis embryo's voor chirurgische verkleinen
-
Verzamel embryo's
- Plaats een of twee mannelijke en een of twee vrouwelijke zebravis in een paarse kamer gevuld met veel water. Aparte mannetjes en vrouwtjes met behulp van een plastic Divider. Gebruik de AB lijn voor Somiet Imaging (sectie 4) en een transgene reporter lijn van neurale buis patroon (nkx 2.2: mem-GFP, dbx1b: GFP, of Olig2: dsred) voor neurale buis Imaging. Laat ze 's nachts in de kamer.
Opmerking: De keuze van de volwassenen is belangrijk voor het verkrijgen van eieren die een operatie goed overleven. Typisch, jonge gezonde vrouwen produceren gezonde eieren. - Op de volgende ochtend, de overdracht van de kamer in ondiep water en plaats de kamer met lichte kantelen. Verwijder de divider, zodat de vis kan paren.
- Verzamel de eieren door het gieten in een theezeef. Breng de eieren in een Petri schaaltje met ei water (voor 20x ei water, 6 g Instant zeezout, 1,5 g CaSO4 en 1 L H2O; gebruik bij 1x). Voor een betere enscenering, het verzamelen van de eieren direct na paaien. Plaats de embryo's in een incubator van 28,5 °C.
- Indien nodig, injecteren morpholino, mRNA, enz., op 1-4 cel stadia na een gemeenschappelijk protocol7,8. Injecteer mRNA voor fluorescent membraan etiket (mem-mCherry, mem-mBFP1, of mem-mCitrine) voor neurale buis beeldvorming (sectie 5).
- Plaats een of twee mannelijke en een of twee vrouwelijke zebravis in een paarse kamer gevuld met veel water. Aparte mannetjes en vrouwtjes met behulp van een plastic Divider. Gebruik de AB lijn voor Somiet Imaging (sectie 4) en een transgene reporter lijn van neurale buis patroon (nkx 2.2: mem-GFP, dbx1b: GFP, of Olig2: dsred) voor neurale buis Imaging. Laat ze 's nachts in de kamer.
-
Dechorionate met behulp van pronase
- Rond de 128-cel tot 256-Cell stadium, overdracht gezonde embryo's naar een 35 mm glazen schaal gevuld met ei water. Verwijder zo veel mogelijk ei water van de schotel.
- Voeg 1 mL 20 mg/mL pronase toe. Zachtjes wervelen embryo's rond door het bewegen van de plaat en voorzichtig Pipet de oplossing op en neer om te helpen dechorionation met behulp van een glazen pipet.
- Wanneer de chorions beginnen te elasticiteit verliezen (meestal 1-4 min na toevoeging van pronase, afhankelijk van de hoeveelheid eieren en water), voeg zo veel mogelijk ei water te verdunnen pronase. Beoordeel het elasticiteitsverlies door de chorion met een tang voorzichtig aan te raken; de chorion moet de deuk te houden zonder onmiddellijk stuiteren terug. Breng de eieren naar een ander gerecht met ei water met behulp van een glazen pipet (op dit punt, de meeste van de chorions zijn niet gebroken).
- Als alternatief, giet voorzichtig de embryo's van de schotel in een grote 400 mL glas beker gevuld met ei water zonder bloot embryo's aan de lucht. Dan, laat de embryo's volledig te regelen. Kantel het bekertje om embryo's aan de ene kant te laten vallen. Verzamel deze embryo's met behulp van een glazen pipet en breng aan een nieuwe 35 mm glas schaal gevuld met ⅓ x beltoon oplossing.
- Wacht enkele minuten tot de meeste van de chorions verliezen elasticiteit volledig. Verwijder de resterende chorions uit embryo's door de eieren voorzichtig te pipetteren. Verwijder beschadigde embryo's en Incubeer de embryo's in een incubator van 28,5 °C.
3. chirurgische grootte vermindering en terugwinning
- Bereid een schone 35 mm glazen schaal. Verspreid ongeveer 0,5 mL van 2% methylcellulose (in ⅓ x beltoon oplossing, met fenol rood te helpen visualiseren) in de buurt van het centrum van de bodem van de grotere schaal met behulp van een plastic spatel. Dun en gelijkmatig verspreid de methylcellulose tot een dikte van ongeveer 0,5 mm.
- Giet ongeveer 30 mL van de ⅓ x beltoon oplossing aan de zijkant van de schotel en laat zich verspreiden op de rest van de schotel, met betrekking tot de methylcellulose.
- Plaats dechorionated embryo's op de 256-cel-1k-Cell fase op 2% methylcellulose. Pas de oriëntatie van de embryo's op de zijkant om zowel de cellen en de dooier te visualiseren. (Figuur 1)
- Hak ongeveer 30%-40% van de cellen van de blastoderm in de buurt van de dierlijke paal door te snijden loodrecht op de dier-plantaardige as met behulp van de draad lus (of de glazen naald) (Figuur 1, top panelen). Na het verwijderen van de cellen, tik zachtjes de uiteinden samen om de resterende cellen stok terug te helpen. Binnen enkele minuten, de dode cellen moet Slough uit wanneer het embryo begint te genezen.
- Maak een kleine wond aan de dooier in de buurt van de plantaardige paal in plaats van "hakken" de dooier (Figuur 1 middelste panelen). Wond de dooier door het ei membraan met de opgezette draad te inkepingen. Dooier zal sijpelen uit voor enkele minuten na het verwonden, en dan de wond zal genezen (Figuur 1 onderste panelen).
- Wanneer de dooier stopt lekt uit, verplaats het embryo met behulp van een pipet buiten de methylcellulose in dezelfde schotel om hen in staat stellen om beter te herstellen.
- Herhaal stap 3.4-3.6 voor alle embryo's. Laat de schotel stabiel gedurende 30 minuten, terwijl de embryo's te herstellen.
-
Breng de embryo's naar een nieuwe schotel met verse ⅓ x beltoon oplossing en leg ze in 28,5 ° c incubator om ze volledig te herstellen.
- Optionele Als het stadium van belang de vroege Somiet stadium is, kunnen de embryo's bij 20 °C worden uitgebroed na wordt uitgebroed bij 28,5 °C tot het schild stadium, om timing voor experimenten en beeldvorming aan te passen.
4. live beeldvorming van zebravis Somitogenesis
- Bereid 100 mL van 1% agarose oplossing door 1 g van agarose aan 100 mL van ei water toe te voegen, verwarmend tot agarose volledig wordt opgelost. Laat afkoelen voor 5-10 min tot een temperatuur van 62-72 ° c.
-
Bereid een mount voor Imaging.
Opmerking: deze handleiding is ontwikkeld voor gebruik met een omgekeerde Wide-veld Microscoop.- Giet ~ 15 mL van 1% agarose in een 100 mm x 15 mm plastic Petri schaaltje.
- Plaats voorzichtig een dorsale Mount v1 mal template5 op de bodem van de Petri schaal. Houd de mal op de bodem met behulp van een gewicht, zoals 15 mL buis met water.
Opmerking: Dit is zo de embryo's zijn zo dicht mogelijk bij de onderkant van de Petri schaal als mogelijke, bij gebruik van een omgekeerde Microscoop. Hoewel de embryo's worden gemonteerd lateraal voor Somiet Imaging, hier dorsale Mount v15 wordt gebruikt, omdat het houdt de embryo's beter in de vroege Somiet stadia. - Laat afkoelen tot agarose volledig is verhard. Giet in ~ 30 mL ei water met 0,01% tricaine, en zorgvuldig te verwijderen schimmel door zachtjes nieuwsgierige af met een tang.
-
Mount embryo's voor Somiet Imaging
- Bereid 1% laag smeltende agarose in de oplossing van ⅓ x Ringer (of ei water) voor en houd het bij 42 °C. Wacht tot de temperatuur neerkomt op 42 °C.
- Onder een dissectie Microscoop, plaats een embryo per well. Pipetteer ongeveer 1 l van laag smeltend agarose in de put om de goed grootte fijn aan te passen aan de grootte van individuele embryo's die variëren in grootte, vooral tussen die met en zonder grootte vermindering.
- Snel oriënteren de embryo's voor de lage smelten agarose is hard gemaakt, zodat de embryo's gezicht volledig lateraal aan de schotel. Na de montage van embryo's, voorzichtig plaats de cover slip in de agarose monteren op de embryo's op zijn plaats te houden. De oriëntatie is bijzonder belangrijk voor de lange-termijn Somiet Imaging, omdat de embryo's moeten precies lateraal worden gemonteerd voor alle Somiet grenzen duidelijk worden afgebeeld in latere stadia.
- Dompel uit de buurt van de montage gebied en manipuleren van een 25 mm x 25 mm cover glas zodanig dat het 45 graden offset van de oriëntatie van het plein inspringen gemaakt door de mal. Schuif de dekglaasje over de mal in deze oriëntatie tot elke hoek is rust van een andere kant van de mal.
Opmerking: Hoewel dit protocol is voor een omgekeerde Microscoop, het plaatsen van een cover glas op de top van de mal is nog steeds belangrijk, zodat de embryo's niet bewegen, terwijl de overdracht naar de Microscoop.
-
Imaging Somiet vorming proces
- Verwarm de Microscoop tot 28 °C in een incubator gebouwd met foamcore platen en een kabinet kachel.
- Plaats de Petri schaal met de gemonteerde embryo's op de Microscoop fase. Vind het embryo gemonteerd in de top-links goed van de agarose monteren met een lagere vergroting lens, dan is de doelstelling te schakelen naar 10x.
- Afbeeldings overname instellen.
Opmerking: Deze instructie is voor helder gebied. - Vind voorwaarden voor de lichte macht, blootstellingstijd, en condensator zodat de Somiet grens duidelijk kan worden gezien. Met de z-stack instellingen stelt u het laagste en hoogste gewenste beeldvlak in. Stel het totale tijd-en tijdinterval in. Zoek en registreer de xy-posities van alle embryo's gemonteerd, zodat meerdere embryo's kunnen worden timelapse beeld in een keer.
- Meet de lengtes van PSM en somieten met Fiji16.
5. beeldvorming van neurale buis patroon
- Bereid 100 mL van 1% agarose oplossing door 1 g van agarose aan 100 mL van ei water toe te voegen, verwarmend tot agarose volledig wordt opgelost. Laat afkoelen voor 5-10 min tot 62-72 ° c. Pas tricaine aan 0,01% aan.
-
Bereid een dorsale Mount voor Imaging.
Opmerking: deze handleiding is ontwikkeld voor gebruik met een oprechte fluorescentiemicroscoop. Voor omgekeerde microscopen dekglaasje bodem gerechten zijn noodzakelijk en montage oriëntatie in stap 3 is omgedraaid.- Giet in ~ 15 mL van 1% agarose in een 100 mm x 15 mm plastic Petri schaaltje. Vlotter een dorsale Mount v1 mal op het oppervlak van de agarose om te voorkomen dat de invoering van luchtbellen. Laat afkoelen tot agarose volledig is verhard.
- Verwijder voorzichtig de mal met een tang of een scheermesje. Vul de schotel met ei water met 0,01% tricaine en dekking tot gebruik.
-
Mount embryo's voor neurale buis Imaging.
- Laat transgene of geïnjecteerde fluorescerende maat-verminderde en controle embryo's te ontwikkelen tot de 20-25 Somiet stadium (ongeveer 18-22 h na de bevruchting). Embryo's die een fluorescent membraan etiket uitdrukken (mem-mCherry, mem-mBFP1, of mem-mCitrine) en een transgene verslaggever van neurale buis patroon (nkx 2.2: mem-GFP, dbx1b: GFP, of Olig2: dsred) worden gebruikt voor Imaging.
- Vervang ei water medium in geprepareerde dorsale Mount met 0,01% tricaine werkende oplossing. Voorzichtig Pipetteer in embryo's te worden afgebeeld in de putten van de dorsale monteren.
- Manipuleer embryo's in de juiste oriëntatie zodanig dat het hoofd naar voren wordt gericht in de berg en de staart wijst naar de achterzijde met de dorsale gedeelte naar het wateroppervlak gericht.
- Oriënteer het embryo zodanig dat de staart plat ligt en niet naar beneden gericht naar de onderkant van de schotel. Het is soms nuttig om het achterste gedeelte van de staart rust op de zijkant richel van de montage goed om de staart te voorkomen zinken en per ongeluk beeldvorming van de achterhersenen. Herhaal voor elk embryo. Zorg ervoor dat met de grootte verminderde embryo's dat ze niet vallen om diep in de putten worden afgebeeld.
- Dompel uit de buurt van de montage gebied en manipuleren van een 25 mm x 25 mm cover glas zodanig dat het 45 ° offset van de oriëntatie van het plein inspringen gemaakt door de mal. Schuif de dekglaasje over de mal in deze oriëntatie tot elke hoek is rust van een andere kant van de mal.
- Roteer langzaam de coverglass tot het zachtjes op het het opzetten gebied valt. Controleer of de embryo's nog steeds in de juiste standen en oriëntaties zijn gemonteerd. Als te veel beweging wordt veroorzaakt door de val van de coverglass, verwijder voorzichtig en herhaal de montage van stap C.
-
Afbeelding in 3-D het ontwikkelende ruggenmerg.
- Vervoer de schotel met opgezette embryo's voorzichtig naar de confocale Microscoop. Voor de lange termijn Live Imaging, moet u een uitgebroede Microscoop te gebruiken. Anders, lage temperaturen aanvaardbaar zijn.
- Onder helderveld verlichting, navigeer naar het embryo om het beeld en het centrum van het gezichtsveld op de voorkeur anterior-posterior positie. Om een gedetailleerde vergelijking tussen embryo's mogelijk te maken, moet deze positie op elk embryo consistent zijn.
- Stel de imaging parameters op te wekken en te vangen signaal van de fluorescente eiwitten worden afgebeeld. Parameters kunnen worden afgestemd op het oog om een gewenste afbeelding te maken op de eerste steekproef. Als u de meting consistentie wilt inschakelen, past u deze instellingen toe op alle embryo's in de gegevensset. Als veel z-Stacks zijn vereist optimaliseren instellingen voor snelheid.
- Met de z-stack instellingen stelt u het laagste en hoogste gewenste beeldvlak in. Voor een optimale beeldkwaliteit in de z-stack stelt u de z-resolutie in op het hoogste niveau dat optimaal is voor de diafragma-instelling. Goede beelden kunnen worden gegenereerd met 1 μm z-afstand.
- Analyseer Imaging data op elke gewenste manier.
Opmerking: In dit geval, analyse werd uitgevoerd met aangepaste MATLAB scripts die eenvoudige segmentatie van de neurale gedeelten van een beeld en kwantificering van Imaging signaal mogelijk te maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dooier volume reductie is belangrijk voor de normale morfologie
Zoals onlangs beschreven in Almuedo-Castillo et al.17, kan de grootte vermindering van embryo's worden bereikt zonder het volume van de dooier te verminderen. Om te vergelijken met en zonder dooier volume reductie, voerden we zowel twee-Step hakken (zowel blastula en dooier) en blastula-only hakken (Figuur 2 en supplementaire film 1). In twee stappen gehakte embryo's bleken schijnbaar normale algehele morfologie ten opzichte van de controle (dechorionation alleen) embryo's, andere dan de grootte verschil, gedurende de ontwikkelingsstadia (zie boven-en middelste panelen in Figuur 2). Aan de andere kant, blastula-only gehakte embryo's toonde een eigenaardige morfologie, vooral in eerdere stadia. Tijdens de epiboly hadden de embryo's een vernauwde en ingesprongen verschijning (Zie onderste paneel voor 70% epiboly in Figuur 2). Op de volgende Somiet stadium, middellijn structuren bleken te worden afgevlakt (dwz DV-lengte is relatief korter dan ML lengte) op vele axiale niveaus (Zie onderste panelen voor 8 en 20 Somiet in Figuur 2). In latere stadia, het lichaam structuren grenzend aan de dooier, zoals de mid-en achterhersenen, en de eerste ~ 10 somieten, toonde nog steeds een relatief afgeplatte vorm, mogelijk als gevolg van verhoogde spanning van de relatief grotere dooier.
Somiet grootte reductie in grootte verminderde embryo's
Somieten zijn segmentale structuren die tijdelijk verschijnen tijdens embryogenese en geven aanleiding tot wervels en skeletspieren. Van presomitic mesoderm (PSM), somieten worden gevormd een voor een van de voorste naar achterste richting op een periodieke wijze (bijv. 25 min voor zebravis, 2 h voor muizen) (Figuur 3a). We uitgevoerd time lapse beeldvorming van Somiet vorming, zowel voor de controle en gehakte embryo's en gemeten de grootte van de meest nieuw gevormde somieten (Figuur 3B). In zowel de controle en gehakte embryo's, de maten van somieten die werden gevormd in latere stadia bleken te zijn kleiner in vergelijking met die van eerdere stadia. Ook gedurende de Somiet formatie stadia, gehakte embryo's hadden kleinere somieten dan die in de controle embryo's (Figuur 3C).
De neurale buis hoogten worden verminderd na grootte vermindering
Om het effect van embryo grootte vermindering op neurale buis grootte te zien, voerden wij onze twee-stap het hakken techniek op mem-mCherry ingespoten embryo's uit en beeldden hun ruggenmerg op 20 HPF gebruikend ons confocale beeldvormings systeem (Figuur 4A, B). In deze DataSet, neurale buis hoogten werden verlaagd na grootte reductie met 12,4% ± 3,2%, zoals handmatig gemeten met behulp van aangepaste afbeelding analyse code (Figuur 4C). Samen genomen, tonen deze gegevens aan dat de grootte vermindering neurale buis hoogte vermindert. Deze techniek kan worden gebruikt om de gevolgen van grootte vermindering op neurale patroon te meten.
Figuur 1 : Grootte reductie techniek. Ongeveer 30%-40% van de cellen werden gesneden van de dierlijke pool (hoogste panelen). Het membraan rond de dooier werd zorgvuldig verwond zodat de dooier uit (midden panelen) uitstraalde. Voor de volgende paar minuten, dooier straalde uit en vervolgens de wonden op zowel blastoderm en dooier genezen (onderste panelen). Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Vergelijking tussen twee methoden van verkleinen. Controle embryo's (bovenste panelen, Top embryo's voor 24 HPF en 30 HPF), grootte verminderde embryo's met twee-staps hakken (blastula en dooier, middelste panelen, middelste embryo's voor 24 HPF en 30 HPF) en grootte verminderde embryo's met blastula-only hakken (onderste panelen, bodem embryo's voor 24 HPF en 30 HPF) worden vergeleken langs ontwikkelingsstadia. Merk op dat in blastula-only gehakte embryo's, de blastoderm volume is veel kleiner in vergelijking met de dooier (op 70% epiboly). Dientengevolge, heeft het embryo een onevenredig afgeplatte vorm bij Somiet stadia (d.w.z., is de DV as vrij korter ten opzichte van AP as in blastula-slechts gehakte embryo's, in vergelijking met de controle of een twee-stap gehakte). Schaal ba = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Verkleinen vermindert de lengte van somieten. ASchematische illustratie van de Somiet vorming. (B) heldere veld beelden van de controle en gehakte embryo's in de tijd. Gele pijlpunten wijzen op de meest nieuw gevormde Somiet in elk Somiet stadium. (C) Somiet lengte (in anterior-posterior as) metingen in de tijd voor zowel de controle en gehakte embryo's. Foutbalken staan voor standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : De vermindering van de grootte vermindert de hoogte van de neurale buis. (a-B) Voorbeelden van normale afmetingen (a) en grootte verlaagd (B) TG (ptch2: Kaede) embryo's die werden geïnjecteerd in de single cell fase met mem-mCherry mRNA. Schaalbalk = 20 μm. (C) neurale buis hoogten geëxtraheerd uit handmatige segmentatie van de neurale buis in elke z-stack. Statistisch significante verschillen worden waargenomen in de gemiddelde neurale hoogte wanneer waarden worden vergeleken met behulp van een niet-gepaarde t-toets (p = 0,0397). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende film 1: vergelijking tussen twee-stap hakken versus blastula-alleen hakken. Bovenste rij = controle embryo's, middelste rij = grootte verminderde embryo's met twee stap hakken, onderste rij = grootte verminderde embryo's met blastula alleen hakken. Films werden genomen om de 3 minuten voor 12 h. schaal bar = 1 mm. gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Historisch, onder gewervelde dieren, is de grootte vermindering hoofdzakelijk uitgevoerd gebruikend amfibie embryo's, door de embryo's langs dierlijk-plantaardige as in een blastula stadium12te doorsnijdt. Echter, er zijn voornamelijk twee verschillen tussen kikker en zebravis embryo's als we bisect embryo's. Eerst, in het stadium wanneer de zebravis embryo's tolerant van doorsnijdt (blastula stadium) worden, wordt de organisator gevestigd in een beperkt gebied van blastula marge18,19,20,21. Omdat men de positie van de organisator van de morfologie van embryo's niet kan vertellen, produceert het willekeurig snijden van het embryo langs de dierlijk-plantaardige as dorsale of ventralized embryo's. In de tweede plaats, in tegenstelling tot de kikker embryo's, zebravis embryo's gaan door een proces genaamd epiboly, waar cellen naar de plantaardige paal rond een gescheiden dooier totdat het volledig is omgeven door cellen. Als slechts een deel van blastoderm wordt verwijderd, minder cellen blijven een dooier van vrij groter volume overspoelen, en dientengevolge, lijkt de morfologie beïnvloed na epiboly. Daarom hebben we in twee stappen hakken waarin we hakken blastulae in de buurt van de dierlijke paal, om te voorkomen dat het afsnijden van de organisator, en wond de dooier membraan, om de dooier grootte evenredig aan de blastula te maken.
Naast de twee-stap hakken, vonden we het medium waarin de grootte reductie operatie wordt uitgevoerd is van cruciaal belang voor de terugwinning van embryo's na de operatie. Onder verschillende media hebben we geprobeerd (ei water, ei water + albumine, Danieau buffer, L15, L15 + FBS, ⅓ x beltoon, 1x beltoon), alleen ⅓ x beltoon en 1x beltoon leverde een hoge overlevingskansen; in andere media, embryo's niet te herstellen van de wonden.
Een belangrijke tip voor het oplossen van een laag overlevingspercentage is het gebruik van gezonde embryo's van gezonde en jonge ouderlijke vissen. We merkten op dat zelfs wanneer de controle niet-grootte verminderde embryo's blijkt bijna 100% overleving, wanneer de grootte verminderd, embryo's van oudere vissen hebben de neiging om lagere overlevingskans te tonen. Merk ook op dat de overlevingskans neigt te verminderen wanneer de grootte vermindering met extra verstoringen, zoals morpholino injectie wordt gecombineerd.
De eenvoud van de hier beschreven grootte reductie techniek laat onderzoekers toe deze techniek toe te passen zonder gespecialiseerde apparatuur of intensieve training. Verder, aangezien de grootte verminderde embryo's kleiner blijven tot latere stadia van ontwikkeling (zodra ze beginnen te eten, hun grootte lijkt in te halen met de controle vis), deze techniek kan worden toegepast op de studie schaalvergroting van de vele weefsels en organen. Daarom maakt deze techniek het mogelijk om de grootte reductie en kwantitatieve in vivo Live Imaging te combineren om schaalvergroting en grootte controle van verschillende systemen te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende of financiële belangen.
Acknowledgments
Het werk werd ondersteund door het PRESTO-programma van het Japan Science and Technology Agency (JPMJPR11AA) en een nationale instituten van Health Grant (R01GM107733).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm PYREX Petri dish | CORNING | 3160-60 | |
| Agarose | affymetrix | 75817 | For making a mount for live imaging |
| Agarose, low gelling temperature Type VII-A | SIGMA-ALDRICH | A0701-25G | |
| CaCl2 | EMD | CX0130-1 | For 1/3 Ringer's solution |
| CaSO4 | For egg water | ||
| Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1) | CORNING | 2845-25 | |
| Disposable Spatula | VWR | 80081-188 | |
| Foam board | ELMER'S | 951300 | For microscope incubator |
| Forcept (No 55) | FST | 11255-20 | |
| Glass pipette | VWR | 14673-043 | |
| HEPES | SIGMA Life Science | H4034 | For 1/3 Ringer's solution |
| INCUKIT XL for Cabinet Incubators | INCUBATOR Warehouse.com | For microscope incubator | |
| Instant sea salt | Instant Ocean | 138510 | For egg water |
| KCl | SIGMA-ALDRICH | P4504 | For 1/3 Ringer's solution |
| Methyl cellulose | SIGMA-ALDRICH | M0387-100G | |
| NaCl | SIGMA-ALDRICH | S7653 | For 1/3 Ringer's solution |
| Petri dish | Falcon | 351029 | For making a mount for live imaging |
| Phenol red | SIGMA Life Science | P0290 | |
| Pipette pump | BEL-ART PRODUCTS | F37898 | |
| Pronase | EMD Millipore Corp | 53702-250KU | |
| Tricaine-S (MS222) | WESTERN CHEMICAL INC | NC0135573 | |
| Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires | Sandra | The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use. |
References
- Cooke, J. Scale of body pattern adjusts to available cell number in amphibian embryos. Nature. 290, 775-778 (1981).
- Driesch, H. Entwicklungsmechanische Studien: I. Der Werthe der beiden ersten Furchungszellen in der Echinogdermenentwicklung. Experimentelle Erzeugung von Theil- und Doppelbildungen. Zeitschrift fur wissenschaftliche Zoologie. , (1892).
- Morgan, T. H. Half embryos and whole embryos from one of the first two blastomeres. Anatomischer Anzeiger. 10, 623-638 (1895).
- Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145, (2018).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments. (26), e1217 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), e1113 (2009).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of Visualized Experiments. (29), e1394 (2009).
- Mizuno, T., Shinya, M., Takeda, H. Cell and tissue transplantation in zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, 15-28 (1999).
- Cooke, J. Control of somite number during morphogenesis of a vertebrate, Xenopus laevis. Nature. 254, 196-199 (1975).
- Inomata, H., Shibata, T., Haraguchi, T., Sasai, Y. Scaling of dorsal-ventral patterning by embryo size-dependent degradation of Spemann's organizer signals. Cell. 153, 1296-1311 (2013).
- Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454, 335-339 (2008).
- Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., Francois, P., Aulehla, A. Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding. Nature. 493, 101-105 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Almuedo-Castillo, M., et al. Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signalling. Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).
- Koos, D. S., Ho, R. K. The nieuwkoid gene characterizes and mediates a Nieuwkoop-center-like activity in the zebrafish. Current Biology. 8, 1199-1206 (1998).
- Yamanaka, Y., et al. A novel homeobox gene, dharma, can induce the organizer in a non-cell-autonomous manner. Genes and Development. 12, 2345-2353 (1998).
- Jesuthasan, S., Stahle, U. Dynamic microtubules and specification of the zebrafish embryonic axis. Current Biology. 7, 31-42 (1997).
- Schier, A. F., Talbot, W. S. The zebrafish organizer. Current Opinion in Genetics and Development. 8, 464-471 (1998).
