تخفيض حجم العمليات الجراحية لدراسة قياس النمط الجنيني

Summary

هنا ، نقوم بوصف طريقه للحد من حجم الاجنه الزبرده دون تعطيل العمليات التنموية الطبيعية. تمكن هذه التقنية من دراسة قياس النمط ومتانة النمو ضد تغيير الحجم.

Abstract

في العملية التنموية ، تظهر الاجنه قدره رائعه علي مطابقه نمط أجسامهم مع حجم أجسامهم. يتم الحفاظ علي نسبه الجسم حتى في الاجنه التي هي أكبر أو أصغر ، في حدود معينه. وعلي الرغم من ان ظاهره التحجيم هذه قد اجتذبت الاهتمام لأكثر من قرن ، فان فهم أليات الاساسيه كان محدودا ، ويعزي ذلك جزئيا إلى عدم وجود وصف كمي لديناميات النمو في الاجنه ذات الاحجام المختلفة. للتغلب علي هذا القيد ، قمنا بتطوير تقنيه جديده للحد جراحيا من حجم الاجنه الزكية ، والتي لها مزايا كبيره للتصوير الحي في الجسم. ونحن نثبت انه بعد الازاله المتوازنة للخلايا والصفار في مرحله الخلايا البدائية في خطوات منفصلة ، يمكن للجنين ان يتعافى بسرعة في ظل الظروف المناسبة ويتطور إلى أجنه أصغر حجما ولكنها طبيعيه. وبما ان هذه التقنية لا تتطلب معدات خاصه ، فانها قابله للتكيف بسهوله ، ويمكن استخدامها لدراسة مجموعه واسعه من مشاكل التحجيم ، بما في ذلك متانة الزخرفة بوساطة مورفجين.

Introduction

وقد عرف العلماء منذ فتره طويلة ان الاجنه لديها قدره ملحوظة علي تشكيل نسب الجسم ثابته علي الرغم من ان حجم الجنين يمكن ان تختلف اختلافا كبيرا في ظل الظروف الطبيعية والتجريبية^1,2,3. وعلي الرغم من عقود من الدراسات النظرية والتجريبية ، فان هذا المتانة لتغيير الحجم ، الذي يطلق عليه التحجيم ، وألياته الاساسيه لا تزال غير معروفه في العديد من الانسجه والأعضاء. من أجل التقاط مباشره ديناميات النظام النامية ، انشانا تقنيه الحد من حجم استنساخه وبسيطه في الزرد⁴، والتي لديها ميزه كبيره في الحية في التصوير⁵.

وقد عملت zebrafish كنموذج فقاري الحيوانية لدراسة تخصصات متعددة من علم الاحياء ، بما في ذلك البيولوجيا التنموية. علي وجه الخصوص ، الزرد مثاليه لفي الجسم الحية التصوير⁶ لان 1) يمكن المضي قدما في التنمية عاده خارج الام وقذيفة البيض ، و 2) الاجنه شفافة. الاضافه إلى ذلك ، يمكن ان تحمل الاجنه بعض درجات الحرارة والتقلبات البيئية ، والتي تسمح لهم بالدراسة في الظروف المختبرية. أيضا ، بالاضافه إلى التقليدية الجينات التعبير عن الاضطراب من قبل مورفينو والحقن mrna^7،8، التطورات الاخيره في تقنيه crispr/كاس 9 جعلت الوراثة العكسية في الزرد كفاءه عاليه⁹. وعلاوة علي ذلك ، يمكن تطبيق العديد من التقنيات الكلاسيكية في علم الاجنه ، مثل زرع الخلايا أو جراحه الانسجه^4،10،11.

تم تطوير تقنيات الحد من حجم في الأصل في البرمائيات وغيرها من الكائنات غير فقاري¹². علي سبيل المثال ، في xenopus لفيس، نموذج آخر فقاري الحيوانية الشعبية ، والميل علي طول محور الحيوانية النباتية في مرحله البدائية يمكن ان تنتج حجم الاجنه المخفضة^12،13. ومع ذلك ، في ايدينا يؤدي هذا النهج خطوه واحده في الاجنه البطنية أو البطينية في zebrafish ، من المفترض لان المحددات الظهرية موزعه بشكل غير متساو ولا يمكن للمرء ان يعرف توطينها من المورفولوجية من الاجنه. هنا نظهر تقنيه تقطيع بديله من خطوتين للزبرافين التي تنتج عاده الاجنه النامية ولكن أصغر. مع هذه التقنية ، يتم أزاله الخلايا أولا من قطب الحيوانية ، وهي منطقه من الخلايا الساذجة التي تفتقر إلى نشاط المنظم. لتحقيق التوازن بين كميه صفار البيض والخلايا ، وهو أمر مهم ل epiboly واللاحقة النشاه ، ثم يتم أزاله صفار البيض. هنا ، ونحن بالتفصيل هذا البروتوكول وتقديم مثالين من الثوابت حجم في تشكيل نمط ؛ الجسيده تشكيل والبطنية أنبوب العصبية زخرفه. الاضافه إلى التصوير الكمي ، استخدمنا تقنيه تخفيض الحجم لدراسة كيفيه تاثر احجام الأنابيب العصبية والعصبية في حجم الاجنه المخفضة.

Protocol

وقد نفذت جميع الإجراءات المتعلقة بالأسماك بموافقه اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الماشية في كليه الطب بجامعه هارفارد.

1. أداه والتحضير الكاشف

1. جعل حلقه الأسلاك لتقطيع الاجنه
   1. خذ 20 سم من أسلاك الفولاذ المقاوم للصدا التي هي قاسيه وغير قابله للتاكل مع قطر 40 μm. حلقه السلك من خلال إلى الزجاج الشعرية (1.0 مم القطر الخارجي ، 0.5 مم القطر الداخلي ، لا خيوط) ، مما يجعل حلقه صغيره في الأعلى (طول حلقه هو 1.0 مم)
   2. وضع قطره صغيره من طلاء الأظافر واضحة علي غيض من الزجاج الشعرية بين حلقه الأسلاك لعقد في مكان. دع الجافة. تاكد من عدم الحصول علي اي طلاء الأظافر علي جزء حلقه ، لأنها قد تضر الاجنه.
   3. نعلق الشعرية الزجاج مع حلقه علي عود خشبيه (9 "عيدان الخيزران المتاح مكسوره في نصف) باستخدام الشريط المختبر. ترك حوالي 2.5 سم من الزجاج الشعرية تمتد خارج عود ، بحيث الجزء عود من الاداه لا تراجع في الماء. اضبط هذا الطول علي التفضيل.
2. بدلا من ذلك ، اصنع ابره زجاجيه لتقطيع الاجنه
   1. قرصه واحده من نهاية الزجاج الماصة باستور مع ملقط ، في حين عقد الجانب الآخر مع اليد. سخني الجزء الرفيع من الماصة فوق مصباح الروح أو موقد Bunsen.
   2. اسحب الماصة الزجاجية باليد. الماصة المثالية كقطر حوالي 30 ميكرومتر ومنحني لطيف (نصف قطر الانحناء = حوالي 5 مم). يتم الحصول علي القطر المناسب وانحناء مع الممارسة وبعض الفرص.
3. اعداد السليلوز الميثيل
   1. يستخدم ميثيل السليلوز للاحتفاظ بالاجنه اثناء التقطيع. جعل 2 ٪ محلول السليلوز ميثيل في الحل 1/3x الرنين (116 mM NaCl ، 2.9 mM KCl ، 1.8 mM CaCl₂، و 5 مم 4-(2-هيدروكسي ايثيل) حمض -1-بيبيرازينيثانيسولفونيك (hepes ؛ pH 7.2)). يهز مسحوق السليلوز الميثيل في 1/3x الحل الرنين في 4 درجه مئوية بين عشيه وضحيها.
   2. اختياريا ، أضافه ~ 1.5 mL الفينول الأحمر (0.5 ٪ في محلول الأسهم DPBS) إلى 10 مل 2 ٪ محلول ميثيل السليلوز ، حتى الأحمر ، لجعل الحل مرئيا. يهز حتى يصبح اللون موحده.

2. اعداد أجنه الزيبرافيش للحد من الحجم الجراحي

1. جمع الاجنه
   1. وضع واحد أو اثنين من الذكور وواحد أو اثنين من الإناث الزرد في غرفه التزاوج مليئه بالكثير من الماء. فصل الذكور والإناث باستخدام المفرق البلاستيكية. استخدام خط AB للتصوير الجسيده (القسم 4) وسطر مراسل المحورة وراثيا من زخرفه الأنبوب العصبي (nkx 2.2: mgfp ، dbx1b: gfp، أو Olig2: dsred) للتصوير الأنابيب العصبية. اتركهم في الغرفة بين عشيه وضحيها.
      ملاحظه: اختيار البالغين مهم للحصول علي البيض الذي البقاء علي قيد الحياة جراحه جيدا. عاده ، الإناث الأصحاء الشباب تنتج البيض صحية.
   2. في صباح اليوم التالي ، نقل الغرفة إلى المياه الضحلة ووضع الغرفة مع أماله طفيفه. أزاله المفرق حتى الأسماك يمكن ان تكون زميله.
   3. جمع البيض عن طريق سكب في مصفاه الشاي. نقل البيض إلى طبق بيتري مع ماء البيض (ل 20x بيضه المياه ، 6 غرام ملح البحر الفورية ، 1.5 g CaSO₄ و 1 L H₂O ؛ استخدام في 1x). لتحسين التدريج ، وجمع البيض الحق بعد التفريخ. ضعي الاجنه في حاضنه 28.5 درجه مئوية.
   4. إذا لزم الأمر ، حقن مورفينو ، mrna ، وما إلى ذلك ، في مراحل خليه 1-4 بعد بروتوكول مشترك^7،8. حقن mRNA لتسميه الغشاء الفلورسنت (م-mCherry ، mBFP1، أو ميم-mcitrine) للتصوير بالأنابيب العصبية (القسم 5).
2. ديتشوريوناتي باستخدام pronase
   1. حول الخلية 128 إلى 256-خليه المرحلة ، نقل الاجنه الصحية إلى طبق من الزجاج 35 ملم مليئه بمياه البيض. أزاله قدر الماء البيض قدر الإمكان من الطبق.
   2. أضافه 1 مل من 20 ملغ/مل pronase. حرك الاجنه برفق عن طريق تحريك الصفيحة وماصه المحلول برفق لاعلي ولأسفل للمساعدة في التقشير باستخدام ماصه زجاجيه.
   3. عندما تبدا المشيمة لإنقاص مرونة (عاده 1-4 دقيقه بعد أضافه pronase ، اعتمادا علي كميه من البيض والماء) ، أضافه الكثير من الماء البيض قدر الإمكان لتمييع pronase. تقييم فقدان مرونة عن طريق لمس المشيماء بلطف مع ملقط. يجب علي المشيماء عقد دنت دون ارتداد علي الفور إلى الوراء. نقل البيض إلى طبق آخر مع ماء البيض باستخدام ماصه الزجاج (في هذه المرحلة ، ومعظم الدعامات ليست مكسوره).
      1. بدلا من ذلك ، اسكب الاجنه برفق من الطبق في كوب زجاجي كبير 400 مل مملوء بماء البيض دون تعريض الاجنه للهواء. ثم ، دع الاجنه تستقر تماما. أماله الكاس للسماح الاجنه تسقط إلى جانب واحد. اجمع هذه الاجنه باستخدام ماصه زجاجيه وانقلها إلى طبق زجاجي جديد 35 ملم مليء بمحلول الرنين 1/3x.
   4. الانتظار لعده دقائق حتى يفقد معظم الدعامات مرونة تماما. أزاله المشيمة المتبقية من الاجنه عن طريق الأنابيب بلطف البيض. أزاله الاجنه التالفة واحتضان الاجنه في حاضنه 28.5 درجه مئوية.

3. تخفيض حجم الجراحية والانتعاش

1. اعداد واحد نظيفه 35 mm طبق الزجاج. انتشار حوالي 0.5 مل من 2 ٪ ميثيل السليلوز (في 1/3x الحل الرنين ، مع الفينول الأحمر للمساعدة في تصور) بالقرب من مركز الجزء السفلي من الطبق أكبر باستخدام ملعقة من البلاستيك. بشكل رقيق التساوي انتشار السليلوز الميثيل إلى سماكه حوالي 0.5 مم.
2. صب ما يقرب من 30 مل من محلول الرنين 1/3x إلى جانب الطبق والسماح للانتشار علي بقية الطبق ، وتغطي ميثيل السليلوز.
3. وضع الاجنه dechorionated في المرحلة 256-خليه-1k-الخلية علي 2 ٪ ميثيل السليلوز. ضبط اتجاه الاجنه علي الجانب لتصور كل من الخلايا وصفار البيض. (الشكل 1)
4. ختم ما يقرب من 30 ٪-40 ٪ من الخلايا من الأديم النخاعي بالقرب من قطب الحيوانية عن طريق قطع عمودي علي محور الحيوانية النباتية باستخدام حلقه الأسلاك (أو ابره الزجاج) (الشكل 1، لوحات العليا). بعد أزاله الخلايا ، انقر برفق علي الأطراف معا لمساعده الخلايا المتبقية علي التصاق مره أخرى. في غضون دقائق ، الخلايا الميتة يجب ان تقلع عندما يبدا الجنين في الشفاء.
5. جعل جرح صغير لصفار البيض بالقرب من القطب النباتي بدلا من "تقطيع" صفار البيض (الشكل 1 لوحات الأوسط). جرح الصفار عن طريق خداع غشاء البيضة مع الأسلاك التي شنت. سوف الصفار الخروج لبضع دقائق بعد أصابه ، ومن ثم سوف تلتئم الجرح (الشكل 1 لوحات القاع).
6. عندما يتوقف الصفار عن الخروج ، حرك الجنين باستخدام ماصه pipet-x خارج ميثيل السليلوز في نفس الطبق للسماح لهم بالتعافي بشكل أفضل.
7. كرر الخطوات 3-4-3.6 لجميع الاجنه. اترك الطبق مستقرا لمده 30 دقيقه بينما تتعافي الاجنه.
8. نقل الاجنه إلى طبق جديد مع حل الرنين 1/3x الطازجة ووضعها في 28.5 درجه مئوية حاضنه للسماح لهم للتعافي تماما.
   1. اختياري إذا كانت مرحله الاهتمام هي المرحلة المبكرة ، يمكن احتضان الاجنه عند 20 درجه مئوية بعد احتضانها عند 28.5 درجه مئوية حتى مرحله الدرع ، لضبط توقيت التجريب والتصوير.

4. التصوير الحي لمرض التصلب العصبي الوحشي

1. اعداد 100 مل من محلول اجنشا 1 ٪ عن طريق أضافه 1 غرام من اجنشا إلى 100 مل من الماء البيض ، والتدفئة حتى يتم حلها تماما الاغاروز. السماح لتبرد لمده 5-10 دقيقه إلى درجه حرارة 62-72 درجه مئوية.
2. اعداد جبل للتصوير.
   ملاحظه: تم تطوير هذا الدليل للاستخدام مع المجهر واسعه المجال المقلوب.
   1. صب ~ 15 مل من 1 ٪ اجنشا في إلى 100 مم × 15 مم البلاستيك طبق بيتري.
   2. ضع برفق قالب العفن V1 جبل الظهرية⁵ علي الجزء السفلي من طبق بتري. الحفاظ علي العفن في الجزء السفلي باستخدام الوزن ، مثل أنبوب 15 مل مع الماء.
      ملاحظه: وهذا هو الحال بحيث تكون الاجنه قريبه من أسفل طبق بيتري قدر الإمكان ، عند استخدام المجهر المقلوب. علي الرغم من ان يتم تركيب الاجنه أفقيا للتصوير الجسيده ، هنا يستخدم الظهرية جبل V1⁵ لأنه يحمل الاجنه أفضل في مراحل مبكرة الجسيده.
   3. دعوانا تبرد حتى يتم وطد تماما. صب في ~ 30 مل من الماء البيض مع 0.01 ٪ tricaine ، وأزاله العفن بعناية عن طريق المتطفلين بلطف قباله مع ملقط.
3. أجنه الجبل للتصوير المنوم
   1. اعداد 1 ٪ ذوبان منخفضه اجنشا في الحل 1/3x الرنين (أو البيض المياه) والاحتفاظ بها في 42 درجه مئوية. انتظر حتى تصل درجه الحرارة إلى 42 درجه مئوية.
   2. تحت مجهر التشريح ، ضع جنينا واحدا لكل بئر. ماصه ما يقرب من 1 μL من ذوبان منخفضه في البئر لضبط بدقه حجم البئر إلى حجم الاجنه الفردية التي تختلف في الحجم ، وخاصه بين الذين يعانون من وبدون خفض الحجم.
   3. توجيه الاجنه بسرعة قبل ان يتم تدعيم ذوبان منخفضه حتى الاجنه وجها أفقيا تماما إلى الطبق. بعد الاجنه المتصاعدة ، ضع برفق زلة الغطاء في الجبل الذي نشا لحمل الاجنه في مكانها. ويكتسي هذا التوجه اهميه خاصه بالنسبة للتصوير الطويل الأمد لتصوير الاجنه لأنه يجب ان يتم تركيبها أفقيا بالبالضبط لجميع الحدود التي يمكن ان تكون واضحة في مراحل لاحقه.
   4. الدمج بعيدا عن منطقه التركيب والتلاعب 25 مم × 25 مم غطاء الزجاج بحيث يتم أزاحه 45 درجه من اتجاه المسافة البادئة مربع التي ادلي بها العفن. الشريحة كوفيرسليب علي العفن في هذا الاتجاه حتى كل زاوية يستريح من جانب مختلف من العفن.
      ملاحظه: علي الرغم من ان هذا البروتوكول هو لمجهر مقلوب ، وضع الزجاج غطاء علي راس القالب لا تزال مهمة بحيث لا تتحرك الاجنه في حين نقل إلى المجهر.
4. عمليه تشكيل التصوير المنوم
   1. تسخين المجهر إلى 28 درجه مئوية في حاضنه بنيت مع لوحات foamcore وسخان مجلس الوزراء.
   2. ضع طبق بيتري مع الاجنه المثبتة علي مرحله المجهر. العثور علي الجنين التي شنت في اعلي اليسار جيدا من جبل اجبرز مع عدسه التكبير اقل ، ثم التبديل الهدف إلى 10x.
   3. اعداد اكتساب الصور.
      ملاحظه: هذا التعليم هو لحقل مشرق.
   4. العثور علي شروط للقوه الخفيفة ، والوقت التعرض ، والمكثف بحيث يمكن رؤية الحدود الجسيده بوضوح. باستخدام إعدادات المكدس z تعيين ادني واعلي مستوي التصوير المطلوب. تعيين إجمالي الوقت والفترة الزمنيه. العثور علي وتسجيل المواقع xy من جميع الاجنه التي شنت بحيث يمكن ان تكون الاجنه متعددة العمر في وقت واحد.
5. قياس أطوال PSM والجسيدات باستخدام فيجي¹⁶.

5. تصوير الأنبوب العصبي زخرفه

1. اعداد 100 مل من محلول اجنشا 1 ٪ عن طريق أضافه 1 غرام من اجنشا إلى 100 مل من الماء البيض ، والتدفئة حتى يتم حلها تماما الاغاروز. السماح لتبرد 5-10 دقيقه إلى 62-72 درجه مئوية. ضبط tricaine إلى 0.01 ٪.
2. اعداد جبل الظهرية للتصوير.
   ملاحظه: تم تطوير هذا الدليل للاستخدام مع المجهر مضان تستقيم. لمقلوب المجاهر المجهر الاطباق أسفل ضرورية وتصاعد التوجه في الخطوة 3 انقلبت.
   1. صب في ~ 15 مل من 1 ٪ اجنشا في إلى 100 مم × 15 مم البلاستيك طبق بيتري. تعويم برفق قالب V1 جبل الظهرية علي سطح اجنشا لتجنب إدخال فقاعات الهواء. دعوانا تبرد حتى يتم وطد تماما.
   2. أزاله العفن بعناية مع ملقط أو شفره الحلاقة. ملء الطبق مع ماء البيض مع 0.01 ٪ tricaine وغطاء حتى الاستخدام.
3. تحميل الاجنه لتصوير الأنابيب العصبية.
   1. السماح الوراثية أو حقن حجم الفلورسنت--خفض والسيطرة علي الاجنه لتطوير حتى المرحلة 20-25 الجسيده (تقريبا 18-22 h بعد الإخصاب). الاجنه التعبير عن التسمية غشاء الفلورسنت (م-mCherry، mBFP1، أو ميم-mcitrine) ومراسل المحورة وراثيا من زخرفه الأنبوب العصبي (nkx 2.2: mgfp، dbx1b: gfp، أو Olig2: dsred) تستخدم للتصوير.
   2. استبدال البيض المياه المتوسطة في جبل الظهرية المعدة مع 0.01 ٪ tricaine حل العمل. ماصه برفق في الاجنه لتكون في الآبار في الجبل الظهري.
   3. التعامل مع الاجنه في الاتجاه الصحيح بحيث يواجه الراس إلى الامام في الجبل والذيل لافتا نحو الخلف مع الجزء الظهري الذي يواجه نحو سطح الماء.
   4. توجيه الجنين بحيث الذيل هو الكذب شقه وليس أشار إلى أسفل نحو الجزء السفلي من الطبق. ومن المفيد في بعض الأحيان للراحة الجزء الخلفي من الذيل علي الحافة الجانبية للتركيب جيدا لمنع الذيل من الغرق والتصوير عن غير قصد الدماغ المؤخر. كرر لكل جنين. جعل معينه مع حجم الاجنه المخفضة التي لا تقع في عمق الآبار ليكون الذين يعانون من النقص.
   5. الدمج بعيدا عن منطقه التركيب والتلاعب 25 مم × 25 مم غطاء الزجاج بحيث يتم أزاحه 45 درجه من اتجاه المسافة البادئة مربع التي ادلي بها العفن. الشريحة كوفيرسليب علي العفن في هذا الاتجاه حتى كل زاوية يستريح من جانب مختلف من العفن.
   6. ببطء تدوير الغطاء حتى انه يسقط برفق إلى منطقه التصاعد. تاكد من ان الاجنه لا تزال مثبته في المواضع والاتجاات الصحيحة. إذا كان الكثير من الحركة الناجمة عن سقوط الغطاء ، وأزاله بلطف وتكرار تصاعد من الخطوة C.
4. صوره في 3-د الحبل الشوكي النامية.
   1. نقل الطبق الذي يحتوي علي الاجنه المثبتة إلى المجهر البؤري برفق. للتصوير الحي علي المدى الطويل ، تاكد من استخدام المجهر المحتضن. والا فان درجات الحرارة المنخفضة مقبوله.
   2. تحت أضاءه برايت فيلد ، انتقل إلى الجنين للصورة وتوسيط مجال الرؤية علي الموضع الامامي الخلفي المفضل. وللتمكين من اجراء مقارنه مفصله بين الاجنه ، يجب ان يكون هذا الوضع علي كل جنين متسقا.
   3. تعيين المعلمات التصوير لأثاره والتقاط اشاره من البروتينات الفلورية يجري imaged. يمكن ضبط المعلمات بالعين لإنشاء صوره مطلوبه علي العينة الاوليه. لتمكين تناسق القياس ، تطبيق هذه الإعدادات علي جميع الاجنه في مجموعه البيانات. إذا كانت العديد من المكدسات z مطلوبه تحسين إعدادات السرعة.
   4. باستخدام إعدادات المكدس z ، قم بتعيين المستوي الأدنى والأعلى للتصوير المطلوب. للحصول علي جوده الصورة المثلي في المكدس z ، قم بتعيين الدقة z إلى الأعلى الأمثل لاعداد الفتحة. يمكن إنشاء صور جيده مع 1 μm z-تباعد.
5. تحليل بيانات التصوير بأي طريقه مفضله.
   ملاحظه: في هذه الحالة ، تم اجراء تحليل مع البرامج النصية MATLAB المخصصة التي تمكن تجزئه بسيطه من الأجزاء العصبية من صوره والتقدير الكمي للاشاره التصوير.

Representative Results

انخفاض حجم صفار البيض مهم لمورفولوجية الطبيعية
كما هو موضح مؤخرا في المويدو-كاستيلو وآخرون¹⁷، يمكن الحد من حجم الاجنه دون الحد من حجم صفار البيض. للمقارنة مع وبدون خفض حجم صفار البيض ، قمنا بكل من التقطيع علي خطوتين (كل من البدائية والصفار) والتقطيع البدائي فقط (الشكل 2 والفيلم التكميلي 1). وقد أظهرت الاجنه المقطعة من خطوتين الشكل العام الطبيعي بالمقارنة مع الاجنه التي تتحكم فيها (dechorionation فقط) ، بخلاف اختلاف الحجم ، طوال مراحل النمو (انظر ألواح العلوية والمتوسطة في الشكل 2). ومن ناحية أخرى ، أظهرت الاجنه المفرومة التي لا تظهر الا شكلا غريبا ، خاصه في المراحل المبكرة. خلال epiboly ، كان للجنين مظهر ضيق والمسافات البادئة (انظر لوحه أسفل ل 70 ٪ epiboly في الشكل 2). في المرحلة الجسيده التالية ، تم العثور علي هياكل الخط المتوسط لتكون بالأرض (اي طول DV هو أقصر نسبيا من طول ML) في العديد من المستويات المحورية (انظر لوحات أسفل ل 8 و 20 الجسيده في الشكل 2). في مراحل لاحقه ، وهياكل الجسم المجاورة لصفار البيض ، مثل منتصف والدماغ المؤخر ، والاولي ~ 10 somites ، لا تزال أظهرت شكل بالأرض نسبيا ، وربما بسبب زيادة التوتر من صفار أكبر نسبيا.

انخفاض حجم somite في حجم الاجنه المخفضة
الsomites هي الهياكل القطعية التي تظهر بشكل عابر اثناء الاجنه وتؤدي إلى فقرات وعضلات الهيكل العظمي. من الأديم الوسطي الاولي (PSM) ، تتشكل الجسيدات واحدا تلو الآخر من الاتجاه الامامي إلى الخلفي بطريقه دوريه (علي سبيل المثال 25 دقيقه للزبرفيه ، 2 ح للفئران) (الشكل 3ا). قمنا بالتصوير بالفواصل الزمنيه للتشكيل المنوم لكل من التحكم والاجنه المفرومة وقياس حجم معظم الجسيده التي تم تشكيلها حديثا (الشكل 3ب). في كل من السيطرة والاجنه المفرومة ، تم العثور علي احجام الجسيدات التي تم تشكيلها في مراحل لاحقه ان تكون أصغر بالمقارنة مع تلك من المراحل السابقة. كما ان الاجنه المفرومة كانت في جميع مراحل التشكيل الجسيده أصغر من تلك الموجودة في الاجنه المسيطرة (الشكل 3ج).

يتم تقليل ارتفاعات الأنبوب العصبي بعد تقليل الحجم
لرؤية تاثير الحد من حجم الجنين علي حجم الأنبوب العصبي ، قمنا بتنفيذ تقنيه التقطيع الخاصة بنا علي الاجنه التي تحقن بالذاكرة والتي تم حقنها بالحبال الشوكية في 20 hpf باستخدام نظام التصوير البؤري المركزي ( الشكل4ا ، ب). في هذه المجموعة من البيانات ، تم تخفيض ارتفاعات الأنبوب العصبي بعد تخفيض الحجم بنسبه 12.4% ± 3.2% ، كما تم قياسه يدويا باستخدام رمز تحليل الصورة المخصص (الشكل 4ج). ومعا ، تظهر هذه البيانات ان خفض الحجم يقلل من ارتفاع الأنبوب العصبي. ويمكن استخدام هذه التقنية لقياس اثار الحد من حجم علي زخرفه العصبية.

الشكل 1 : حجم تقنيه الحد. تقريبا 30%-40% من الخلايا كان قطعت من العمود حيوانيه (لوحات علويه). وجرح الغشاء المحيط بالصفار بعناية بحيث ان الصفار قد نفذ (ألواح الوسطي). وفي الدقائق القليلة التالية ، شفي صفار البيض ومن ثم تلتئم الجروح علي كل من الأديم البدائي والصفار (ألواح السفلية). شريط مقياس = 200 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2 : مقارنه بين طريقتين لخفض الحجم. الاجنه التحكم (اعلي اللوحات ، والاجنه العلوية ل 24 hpf و 30 hpf) ، وحجم الاجنه المخفضة مع التقطيع علي خطوتين (الكيسة والصفار ، وألواح الوسطي ، والاجنه المتوسطة ل 24 hpf و 30 hpf) وحجم الاجنه المخفضة مع التقطيع. ل 24 hpf و 30 hpf) يتم مقارنتها علي طول مراحل النمو. لاحظ انه في الاجنه المفرومة فقط ، يكون حجم الورم الارومي أصغر بكثير مقارنه بالصفار (في 70% epiboly). ونتيجة لذلك ، فان الجنين له شكل مسطح علي نحو غير متناسب في مراحل السمية (اي ان محور DV أقصر نسبيا مقارنه بمحور AP في الاجنه المفرومة فقط ، مقارنه بالتحكم أو بخطوتين مفرومين). مقياس ba = 200 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3 تخفيض الحجم: يقلل طول الsomites. (ا) الرسم التخطيطي للتشكيل الجسيده. (ب) الصور الميدانية الساطعة للسيطرة والاجنه المفرومة مع مرور الوقت. نصال الأصفر تشير إلى الأكثر حديثا شكلت الجسيده في كل مرحله الجسيده. (ج) طول somite (في المحور الامامي الخلفي) قياسات مع مرور الوقت لكل من السيطرة والاجنه المفرومة. تمثل أشرطه الخطا الانحراف المعياري. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4 : خفض حجم يقلل من ارتفاع الأنبوب العصبي. (الف-باء) أمثله علي الصور من الحجم العادي (A) والحجم المخفض (B) tg (ptch2: kaede) الاجنه التي تم حقنها في مرحله خليه واحده مع م-mcherry mrna. شريط مقياس = 20 μm. (ج) مرتفعات الأنبوب العصبي المستخرجة من التقسيم اليدوي للأنبوب العصبي في كل كومه z. لوحظت فروق ذات دلاله احصائيه في متوسط الارتفاع العصبي عند مقارنه القيم باستخدام اختبار t غير المقترن (p = 0.0397). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الفيلم التكميلي 1: مقارنه بين التقطيع بخطوتين مقابل التقطيع البدائي فقط. الصف العلوي = الاجنه التحكم ، الصف الأوسط = حجم الاجنه المخفضة مع اثنين من التقطيع خطوه ، الصف السفلي = حجم الاجنه المخفضة مع القطع البدائية فقط تقطيع. تم التقاط الأفلام كل 3 دقائق لمده 12 ساعة. شريط مقياس = 1 ملم. الرجاء الضغط هنا لمشاهده هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)

Discussion

تاريخيا ، من بين الفقاري الحيوانية ، تم اجراء تخفيض الحجم بشكل رئيسي باستخدام الاجنه البرمائية ، عن طريق إخراج الاجنه علي طول المحور النباتي للحيوانات في المرحلة البدائية¹². ومع ذلك ، هناك أساسا اثنين من الاختلافات بين الاجنه الضفدع والزبرافيش عندما كنا شطر الاجنه. أولا ، في المرحلة التي تصبح فيها الاجنه الزكية متسامحة مع الانشقاق (مرحله البدائية) ، يقع المنظم في منطقه محظوره من الهامش البدائي¹⁸،^19،20،21. لأنه لا يمكن للمرء ان يقول موقف المنظم من الشكل من الاجنه ، وقطع عشوائيا الجنين علي طول محور الحيوانية النباتية تنتج الاجنه البطنية أو التركيبية. ثانيا ، علي عكس الاجنه الضفدع ، تمر الاجنه الزبربيه من خلال عمليه تسمي epiboly ، حيث تتحرك الخلايا نحو القطب النباتي حول صفار مفصوله حتى انها محاطه تماما بالخلايا. إذا تمت أزاله جزء من الخلايا البدائية فقط ، يبقي عدد اقل من الزنزانات لابتلاع صفار من حجم أكبر نسبيا ، ونتيجة لذلك ، يظهر الشكل المتاثر بعد epiboly. ولذلك ، فاننا نوظف التقطيع بخطوتين والذي نقطع فيه القشرة البدائية بالقرب من قطب الحيوانية ، لتجنب قطع المنظم ، وجرح غشاء الصفار ، لجعل حجم صفار البيض يتناسب مع القشرة البدائية.

بالاضافه إلى التقطيع بخطوتين ، وجدنا الوسيط الذي يتم فيه اجراء عمليه تخفيض الحجم أمر بالغ الاهميه لاستعاده الاجنه بعد الجراحة. من بين وسائل الاعلام عده حاولنا (البيض المياه ، البيض المياه + الزلال ، دانييلا العازلة ، L15 ، L15 + المسدس ، 1/3x الرنين ، 1x الرنين) ، فقط 1/3x الرنين و 1x الرنين أسفرت عن معدلات البقاء علي قيد الحياة عاليه ؛ في وسائل الاعلام الأخرى ، أخفقت الاجنه في التعافي من الجروح.

تلميح هام لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها لانخفاض معدل البقاء علي قيد الحياة هو استخدام الاجنه الصحية من الأسماك الابويه الصحية والشباب. ولاحظنا انه حتى عندما تظهر الاجنه المخفضة غير الحجم بنسبه 100% تقريبا ، عند انخفاض الحجم ، تميل الاجنه من الأسماك القديمة إلى إظهار معدل بقاء اقل. أيضا ، لاحظ ان معدل البقاء علي قيد الحياة يميل إلى الانخفاض عندما يتم الجمع بين خفض حجم مع اضطرابات اضافيه ، مثل حقن مورفينو.

بساطه تقنيه خفض حجم وصفها هنا يسمح للباحثين لتطبيق هذه التقنية دون المعدات المتخصصة أو التدريب المكثف. وعلاوة علي ذلك ، نظرا لان حجم الاجنه المخفضة لا تزال أصغر حتى مراحل لاحقه من التنمية (بمجرد ان تبدا في الأكل ، وحجمها يبدو للحاق بالأسماك السيطرة) ، ويمكن تطبيق هذه التقنية لدراسة التوسع في العديد من الانسجه والأعضاء. ولذلك ، فان هذا الأسلوب يجعل من الممكن الجمع بين خفض حجم والكمية في الجسم الحية التصوير لدراسة التحجيم والتحكم في حجم مختلف النظم.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
60 mm PYREX Petri dish	CORNING	3160-60
Agarose	affymetrix	75817	For making a mount for live imaging
Agarose, low gelling temperature Type VII-A	SIGMA-ALDRICH	A0701-25G
CaCl2	EMD	CX0130-1	For 1/3 Ringer's solution
CaSO4			For egg water
Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1)	CORNING	2845-25
Disposable Spatula	VWR	80081-188
Foam board	ELMER'S	951300	For microscope incubator
Forcept (No 55)	FST	11255-20
Glass pipette	VWR	14673-043
HEPES	SIGMA Life Science	H4034	For 1/3 Ringer's solution
INCUKIT XL for Cabinet Incubators	INCUBATOR Warehouse.com		For microscope incubator
Instant sea salt	Instant Ocean	138510	For egg water
KCl	SIGMA-ALDRICH	P4504	For 1/3 Ringer's solution
Methyl cellulose	SIGMA-ALDRICH	M0387-100G
NaCl	SIGMA-ALDRICH	S7653	For 1/3 Ringer's solution
Petri dish	Falcon	351029	For making a mount for live imaging
Phenol red	SIGMA Life Science	P0290
Pipette pump	BEL-ART PRODUCTS	F37898
Pronase	EMD Millipore Corp	53702-250KU
Tricaine-S (MS222)	WESTERN CHEMICAL INC	NC0135573
Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires	Sandra		The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use.