Summary
在这里, 我们描述了一种在不破坏正常发育过程的情况下减小斑马鱼胚胎大小的方法。这种技术可以研究模式缩放和针对大小变化的开发鲁棒性。
Abstract
在发育过程中, 胚胎表现出显著的能力, 使他们的身体模式与他们的身体大小相匹配;即使在较大或较小的胚胎中, 它们的身体比例也保持在一定范围内。虽然这种规模现象在一个多世纪以来引起了人们的注意, 但对其基本机制的了解有限, 部分原因是缺乏对不同大小胚胎发育动态的定量描述。为了克服这一限制, 我们开发了一种新的技术, 通过手术缩小斑马鱼胚胎的大小, 这对活体成像有很大的优势。我们证明, 在囊胚阶段分别平衡切除细胞和蛋黄后, 胚胎可以在合适的条件下迅速恢复, 发育成较小但原本正常的胚胎。由于这种技术不需要特殊的设备, 它很容易适应, 并可用于研究广泛的缩放问题, 包括形态原介导的模式的鲁棒性。
Introduction
科学家们早就知道, 胚胎有一个显着的能力, 形成恒定的身体比例, 虽然胚胎大小可以很大的差异, 在自然和实验条件下1, 2,3。尽管几十年的理论和实验研究, 这种鲁棒性的大小变化, 称为缩放, 其潜在的机制仍然是未知的许多组织和器官。为了直接捕捉开发系统的动力学, 我们在斑马鱼4中建立了一种可重复、简单的尺寸缩小技术, 在活体成像5中具有很大的优势。
斑马鱼曾作为脊椎动物的模型, 研究生物学的多个学科, 包括发育生物学。特别是, 斑马鱼是体内活体成像的理想选择,因为 1) 发育可以在母亲和蛋壳之外正常进行, 2) 胚胎是透明的。此外, 胚胎还能承受一定的温度和环境波动, 从而能够在实验室条件下进行研究。此外, 除了常规基因表达摄动的吗啡和 mrna 注射7,8, 最近的进展 crispr/cas9 技术使反向遗传学在斑马鱼高效9。此外, 胚胎学中的许多经典技术, 如细胞移植或组织手术, 可以应用4,10,11。
减少大小的技术最初是在两栖动物和其他非脊椎动物中开发的.例如, 在另一种流行的脊椎动物模型月子劳维斯, 在囊胚阶段沿着动物-植物轴进行混合, 可以产生大小减少的胚胎 12,13.然而, 在我们手中, 这种一步的方法会导致斑马鱼的背化或腹形胚胎, 大概是因为背侧决定因素分布不均, 人们无法从胚胎的形态中知道它们的定位。在这里, 我们演示了另一种两步切碎技术的斑马鱼, 产生正常发育, 但较小的胚胎。有了这一技术, 细胞首先从动物极点中取出, 这是一个缺乏组织者活动的天真细胞区域。为了平衡蛋黄和细胞的数量, 蛋黄被去除, 这对上皮和随后的形态发生很重要。在这里, 我们详细介绍了这个协议, 并给出了模式形成中大小不变性的两个例子;体细胞形成和腹侧神经管模式。结合定量成像, 我们利用尺寸缩小技术, 考察了体细胞和神经管的大小在减少胚胎大小方面的影响。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有与鱼类有关的程序都是在哈佛医学院动物护理和使用机构委员会 (IACUC) 的批准下进行的。
1. 工具和试剂制备
-
做一个钢丝圈来切割胚胎
- 取20厘米的不锈钢丝, 它坚硬且无腐蚀性, 直径为40μm。将电线循环到玻璃毛细管中 (外径 1.0 mm, 内径 0.5 mm, 无长丝), 使顶部有一个小循环 (环路长度为 1.0 mm)
- 在钢丝圈之间的玻璃毛细管尖端放一点透明的指甲油, 将其固定到位。让它干。一定不要在环路部分涂上指甲油, 因为它可能会损害胚胎。
- 用实验室胶带将玻璃毛细管与环路连接在木制筷子上 (9 "竹一次性筷子被撕成两半)。离开约2.5 厘米的玻璃毛细管延伸到筷子以外, 使筷子部分的工具不会浸入水中。将此长度调整为首选项。
-
或者, 做一个玻璃针切割胚胎
- 用钳子夹住玻璃巴斯德移液器的一端, 同时用手握住另一端。在精神灯或本森燃烧器上加热移液器的薄部分。
- 手拉玻璃移液器。理想的移液器直径约为30微米和曲线柔和 (曲率半径 = 约5毫米)。通过实践和一定的机会, 得到了合适的直径和曲率。
-
准备甲基纤维素
- 甲基纤维素用于在切碎时保持胚胎。在半环质溶液中制备2% 的甲基纤维素溶液 (116 Mm Ncl、2.9 mM KCl、1.8 mm CaCl2和 5 mm 4-(2-羟乙基)-1-吡嗪-乙酰磺酸 (HIPES; ph 7.2))。在4°c 下隔夜摇晃甲基纤维素粉。
- (可选) 在10毫升2% 甲基纤维素溶液中添加 ~ 1.5 mL 苯酚红 (DPBS 库存溶液中的 0.5%), 直到红色, 使溶液可见。摇一摇, 直到颜色变得均匀。
2. 斑马鱼胚胎的制备, 用于缩小手术尺寸
-
收集胚胎
- 将一、两只雄性和一、一、两只雌性斑马鱼放在充满大量水的交配室中。使用塑料分隔器将男性和女性分开。使用 AB 线进行体细胞成像 (第4节) 和用于神经管成像的神经管模式 (nkx2.2: mem-gfp、dbx1b: gfp 或 Olig2: dsred)的转基因记者线。把他们留在房间里过夜。
请注意:成人的选择对于获得手术中存活良好的鸡蛋很重要。通常情况下, 年轻的健康雌性会产生健康的卵子。 - 第二天早上, 将房间转移到浅水中, 并将房间稍微倾斜。取下分隔线, 使鱼可以交配。
- 倒进茶过滤器中收集鸡蛋。用鸡蛋水将鸡蛋放入培养皿中 (20x 鸡蛋水、6克速份海盐、1.5 克 CaSO4和 1 lh2o;使用在 1x)。为了更好地进行分期, 产卵后立即收集鸡蛋。将胚胎放置在28.5°c 的孵化器中。
- 如有必要, 在遵循共同协议7,8 的1-4 个细胞阶段注射吗啡、mrna 等.注入用于荧光膜标签的 mRNA (mem-mCherry、Mem-mbfp1或mem-mitrine) 用于神经管成像 (第5节)。
- 将一、两只雄性和一、一、两只雌性斑马鱼放在充满大量水的交配室中。使用塑料分隔器将男性和女性分开。使用 AB 线进行体细胞成像 (第4节) 和用于神经管成像的神经管模式 (nkx2.2: mem-gfp、dbx1b: gfp 或 Olig2: dsred)的转基因记者线。把他们留在房间里过夜。
-
使用原酶进行 dechorionate
- 在128细胞至256个细胞阶段, 将健康的胚胎转移到一个35毫米的玻璃盘子里, 里面装满了鸡蛋水。从盘子里取出尽可能多的鸡蛋水。
- 加入1毫升的 20 mgl 原化酶。通过移动盘子轻轻旋转胚胎, 并将溶液上下轻轻移液, 以帮助使用玻璃移液器进行旋转。
- 当脉络膜开始失去弹性 (通常在添加原酶后 1-4, 取决于鸡蛋和水的数量), 添加尽可能多的鸡蛋水, 以稀释原酶。用钳子轻轻触摸绒毛膜, 评估弹性损失;绒毛膜应保持凹痕, 而不是立即反弹回来。用玻璃移液器将鸡蛋用鸡蛋水转移到另一道菜中 (此时, 大部分绒毛膜没有破裂)。
- 或者, 轻轻地将盘子中的胚胎倒入一个装有蛋水的400毫升玻璃烧杯上, 而不会将胚胎暴露在空气中。然后, 让胚胎完全沉淀。倾斜烧杯, 让胚胎掉落到一边。使用玻璃移液器收集这些胚胎, 并转移到一个新的35毫米玻璃盘子充满了半林格的溶液。
- 等待几分钟, 直到大多数绒脉络完全失去弹性。通过轻轻移液鸡蛋, 从胚胎中取出剩余的绒布。取出受损的胚胎, 在28.5°c 的孵化器中孵育胚胎。
3. 手术尺寸的减少和恢复
- 准备一个干净的35毫米玻璃盘。使用塑料铲子在较大的盘子底部中心附近传播约0.5 毫升的2% 甲基纤维素 (在半 x 林格的溶液中, 用苯酚红色帮助可视化)。将甲基纤维素均匀地分布到约0.5 毫米的厚度。
- 将大约30毫升的林格溶液倒在盘子的一侧, 并允许扩散到菜的其他部分, 覆盖甲基纤维素。
- 在2% 的甲基纤维素上, 在256细胞-1k 细胞阶段放置脱孔胚胎。调整胚胎在侧面的方向, 使细胞和蛋黄都能显示出来。(图 1)
- 用钢丝圈 (或玻璃针) 切割垂直于动物-植物轴的方式, 从动物极点附近的囊虫中切割出大约 30%-40% 的细胞 (图 1, 顶部面板)。取出细胞后, 轻轻点击两端在一起, 以帮助剩余的细胞坚持回来。几分钟内, 当胚胎开始愈合时, 死细胞应该会脱落。
- 在植物杆附近的蛋黄上做一个小伤口, 而不是 "切碎" 蛋黄 (图 1中间面板)。用安装的金属丝划痕卵泡膜, 将蛋黄缠绕在一起。受伤后, 蛋黄会渗出几分钟, 然后伤口就会愈合 (图1底部面板)。
- 当蛋黄停止渗出时, 在同一道盘中使用甲基纤维素外的管道将胚胎移动, 以便更好地恢复。
- 对所有胚胎重复步骤 3.4-3.6。在胚胎恢复的过程中, 让盘子稳定30分钟。
-
用新鲜的半鱼林格溶液将胚胎转移到新的盘子中, 并将其放入28.5°c 的孵化器中, 使其完全恢复。
- (可选)如果感兴趣的阶段是早期体细胞阶段, 胚胎可以在28.5°c 孵育后在20°c 孵育到屏蔽阶段, 以调整实验和成像的时间。
4. 斑马鱼体细胞发生的活体成像
- 在100毫升的鸡蛋水中加入1克琼脂糖, 制备1% 琼脂糖溶液的100毫升, 加热至琼脂糖完全溶解。冷却5-10 至62-72°C 的温度。
-
准备用于成像的安装。
注:本指南是为与倒置广域显微镜一起使用而开发的。- 将1% 琼脂糖的 ~ 15 毫升倒在100毫米 X15 毫米塑料培养皿中。
- 轻轻地将背山 V1 模具模板5放在培养皿的底部。使用重量, 如15毫升管与水, 保持模具在底部。
请注意:在使用倒置显微镜时, 胚胎尽可能接近培养皿的底部。虽然胚胎是横向安装的体细胞成像, 这里使用背侧山 V15,因为它持有更好的胚胎在早期体细胞阶段。 - 让冷却, 直到琼脂糖完全凝固。用0.01% 的滴虫倒在 ~ 30 毫升的鸡蛋水中, 用钳子轻轻窥探, 小心去除霉菌。
-
安装胚胎进行体细胞成像
- 在半环的溶液 (或蛋水) 中制备1% 低熔融琼脂糖, 并将其保持在42°c。等待, 直到温度下降到42°C。
- 在解剖显微镜下, 每口井放置一个胚胎。在井中的低熔融琼脂约1μl 的移液器, 以微调井的大小, 以适应大小不同的单个胚胎的大小, 特别是在有和没有大小缩小的胚胎之间。
- 在低熔融琼脂糖凝固之前, 快速定位胚胎, 使胚胎完全侧向到盘子。安装胚胎后, 轻轻地将盖板滑放在琼脂糖安装中, 以将胚胎固定在适当的位置。这个方向对于长期的体细胞成像特别重要, 因为胚胎必须完全横向安装, 才能在后期清晰地成像所有的体细胞边界。
- 从安装区域沉入, 并操纵25毫米 x 25 毫米盖板玻璃, 使其与模具所做的方形缩进的方向偏移45度。在这个方向上滑动覆盖板在模具上, 直到每个角落都在模具的不同一侧休息。
请注意:虽然该协议适用于倒置显微镜, 但将盖板玻璃放置在模具顶部仍然很重要, 这样胚胎在转移到显微镜时不会移动。
-
成像体细胞的形成过程
- 将显微镜预热至 28°c, 安装在用泡沫板和机柜加热器建造的孵化器中。
- 将培养皿与安装的胚胎放在显微镜下的舞台上。找到安装在琼脂糖安装的左上角井的胚胎, 用较低的放大镜, 然后将目标切换到10倍。
- 设置图像采集。
请注意:本指令适用于明亮的领域。 - 找出光功率、曝光时间和冷凝器的条件, 以便可以清楚地看到的边界。使用 z 堆栈设置可设置所需的最低和最高成像平面。设置总时间和时间间隔。查找并登记所有安装的胚胎的 xy 位置, 以便同时对多个胚胎进行时间流逝。
- 使用斐济16测量 psm 和体细胞的长度。
5. 神经管图案成像
- 在100毫升的鸡蛋水中加入1克琼脂糖, 制备1% 琼脂糖溶液的100毫升, 加热至琼脂糖完全溶解。冷却5-10 至62-72°c。将滴原调整为0.01%。
-
准备用于成像的背安装。
注:本指南是为使用直立荧光显微镜而开发的。对于倒置显微镜, 需要覆盖底部的菜品, 步骤3中的安装方向被翻转。- 将 ~ 15 毫升的1% 琼脂糖倒在100毫米 x15 毫米塑料培养皿中。轻轻地将背山 V1 模具漂浮在琼脂糖表面, 以避免引入气泡。让冷却, 直到琼脂糖完全凝固。
- 小心地取出模具与钳子或剃须刀刀片。用0.01% 的滴虫盖满鸡蛋水, 盖上, 直到使用。
-
安装胚胎进行神经管成像。
- 允许转基因或注射荧光大小缩小和控制胚胎发育, 直到20-25 体细胞阶段 (受精后大约 18-22小时)。表示荧光膜标签 (mem-mCherry、 Mem-mbfp1或mem-mitrine) 的胚胎和神经管模式 (nkx2.2: mem-gfp 、Dbx1b:gfp 或 olig2: dsred)的转基因记者用于成像。
- 用0.01% 的滴虫工作溶液代替准备好的背安装中的鸡蛋水介质。在胚胎中轻轻的移液器被成像到背口的井。
- 操纵胚胎进入正确的方向, 使头部朝前方在坐骑和尾巴指向后方与背侧面向水面。
- 将胚胎定向到尾巴平躺, 而不是指向盘子底部。有时, 将尾巴的后部休息在安装井的侧窗台上是有帮助的, 以防止尾巴下沉, 并在不经意间成像后脑。对每个胚胎重复上述步骤。确保随着大小缩小的胚胎, 他们不会深入到井里进行成像。
- 从安装区域沉入水中, 并操纵25毫米 x 25 mm 的盖板玻璃, 使其与模具所做的方形缩进方向的方向偏移45°。在这个方向上滑动覆盖板在模具上, 直到每个角落都在模具的不同一侧休息。
- 慢慢旋转盖板玻璃, 直到它轻轻落在安装区域。检查, 以确保胚胎仍然安装在正确的位置和方向。如果覆盖玻璃的坠落造成了太多的运动, 轻轻取出并从步骤 C 重复安装。
-
三维图像发育中的脊髓。
- 轻轻地将含有安装胚胎的盘子输送到共聚焦显微镜上。对于长期的活体成像, 一定要使用孵化显微镜。否则, 低温是可以容忍的。
- 在明亮场照明下, 导航到胚胎图像, 并将视野集中在首选的前后位置。为了能够对胚胎进行详细比较, 每个胚胎上的这一位置必须是一致的。
- 设置成像参数, 以激发和捕获正在成像的荧光蛋白的信号。参数可以通过眼睛进行调整, 以便在初始样本上创建所需的图像。若要实现测量一致性, 请将这些设置应用于数据集中的所有胚胎。如果需要多个 z 堆栈, 请优化速度设置。
- 使用 z 堆栈设置, 设置所需的最低和最高成像平面。为了在 z 堆栈中获得最佳图像质量, 请将 z 分辨率设置为最佳光圈设置的最高分辨率。可以用 1μm z 间距生成良好的图像。
- 使用任何首选方法分析成像数据。
请注意:在这种情况下, 使用自定义 MATLAB 脚本进行分析, 从而能够对图像的神经部分进行简单的分割和对成像信号进行量化。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
蛋黄体积减少对正常形态很重要
正如最近在 Almuedo-castylo 等人 17中所描述的, 在不减少蛋黄体积的情况下, 可以减少胚胎的大小。为了与蛋黄体积减少和不减少, 我们执行了两步切碎 (包括囊胚和蛋黄) 和只切碎 (图 2和补充电影 1)。与对照 (仅 dechorionation) 相比, 两步切碎的胚胎在整个发育阶段显示出看似正常的整体形态 (大小差异除外) (见图 2中的顶部和中间面板)。另一方面, 仅有囊胚的胚胎表现出一种特殊的形态, 尤其是在早期阶段。在上皮化过程中, 胚胎有收缩和缩进的外观 (参见图 2中70% 的上皮的底部面板)。在接下来的微结构阶段, 发现中线结构在许多轴向水平上被压平 (即 DV 长度相对小于 ML 长度) (参见图 2中8和20体细胞的底部面板)。在后期, 与蛋黄相邻的身体结构, 如中脑和后脑, 以及第一 ~ 10个体细胞, 仍然表现出相对扁平的形状, 可能是由于相对较大的蛋黄的张力增加。
体细胞尺寸缩小, 减少胚胎
体细胞是在胚胎发生过程中短暂出现并产生椎骨和骨骼肌的节段结构。从前体中胚层 (PSM), 体细胞形成一个接一个从前后方向在一个周期的方式 (例如, 25分钟为斑马鱼, 2小时为小鼠) (图 3a)。我们对体细胞形成进行了时间间隔成像, 用于控制和切碎的胚胎, 并测量了大多数新形成的体细胞的大小 (图 3b)。在控制和切碎的胚胎中, 发现后期形成的体细胞大小比早期阶段的体细胞小。此外, 在整个体细胞形成阶段, 切碎的胚胎比控制胚胎的体细胞要小 (图 3c)。
随着尺寸的减小, 神经管高度降低
为了观察胚胎大小缩小对神经管大小的影响, 我们使用共聚焦成像系统 (图 4a,b), 在 20 hpf 对注射胚胎的记忆-樱桃胚胎进行了两步切碎技术, 并对其脊髓进行了成像。在此数据集中, 使用自定义图像分析代码手动测量, 将大小减小12.4 ±3.2% 后, 神经管高度降低了 12.4 (图 4c)。综合来看, 这些数据表明, 尺寸减小降低了神经管的高度。该技术可用于测量尺寸减小对神经模式的影响。
图 1: 缩小尺寸的技术。大约 30%-40% 的细胞是从动物杆 (顶板) 中切割出来的。蛋黄周围的膜被小心地击伤, 所以蛋黄渗出 (中间板)。在接下来的几分钟里, 蛋黄渗出, 然后黑皮和蛋黄上的伤口都愈合了 (底板)。刻度杆 = 200μm。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 两种减小尺寸的方法进行比较.控制胚胎 (顶板、24 hpf 和 30 hpf 的顶部胚胎)、两步切碎 (blastula 和蛋黄、中间板、24 hpf 和 30 hpf 的中间胚胎) 的大小减少的胚胎 (底部的板, 胚胎底部的底部对 24 hpf 和 30 hpf) 沿发展阶段进行了比较。请注意, 在仅有囊胚的胚胎中, 与蛋黄 (70% 的 epiboly) 相比, 囊胚体积要小得多。因此, 胚胎在体细胞阶段的形状特别扁平 (即, 与仅被切碎的胚胎相比, DV 轴相对较 ap 轴短, 与对照或两步切碎的胚胎相比)。刻度 ba = 200 微米。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 缩小尺寸长的.(A) 体细胞形成的示意图。(B) 随着时间的推移, 控制和切割胚胎的明亮的现场图像。黄色箭头表示在每个体细胞阶段最新形成的体细胞。(C) 随着时间的推移, 对对照和切碎的胚胎进行体细胞长度 (前后轴) 测量。误差线表示标准偏差。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 尺寸减小可降低神经管的高度.(A-B)正常大小 (a) 和大小的示例图像减少了 (b) tg(ptch2:kaede) 在单个细胞阶段用 Mem-mcherry mrna 注射的胚胎. 刻度杆 = 20μm。(C) 从每个 z 堆栈中的神经管的手动分割中提取的神经管高度。使用未配对 t 检验 (p = 0.0397) 比较值时, 平均神经高度存在统计上的显著差异。请点击这里查看此图的较大版本.
补充电影 1: 两步切碎与只吹灰切的比较.顶排 = 控制胚胎, 中间行 = 大小减少胚胎与两步切碎, 底部行 = 大小减少胚胎与囊胚只切碎。电影每3分钟拍摄一次, 12小时. 刻度条 = 1 毫米. 请点击这里查看此视频。(右键单击下载.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
从历史上看, 在脊椎动物中, 大小缩小主要是使用两栖动物胚胎, 在第12条阶段沿动物-植物轴将胚胎一分为二.然而, 当我们将青蛙和斑马鱼胚胎一分为二时, 主要有两个区别。首先, 在斑马鱼胚胎耐受分分割 (囊胚阶段) 的阶段, 组织者位于脂肪边缘 18、19、20、21 的禁区内。因为不能从胚胎的形态中分辨出组织者的位置, 所以沿着动物-植物轴随机切割胚胎会产生背生或腹形胚胎。其次, 与青蛙胚胎不同的是, 斑马鱼胚胎经历了一个叫做表皮的过程, 在这个过程中, 细胞在分离的蛋黄周围向植物极点移动, 直到它被细胞完全包围。如果只去除一部分囊胚, 那么较少的细胞仍然会吞没体积相对较大的蛋黄, 因此, 在表观形成后, 形态会出现影响。因此, 我们采用两步切碎, 在动物杆附近切碎囊胚, 以避免切断组织者, 并缠绕蛋黄膜, 使蛋黄大小与囊胚成比例。
除了两步切碎, 我们发现进行缩小大小手术的培养基对于手术后胚胎的恢复至关重要。在我们尝试的几种培养基 (鸡蛋水, 鸡蛋水 + 白蛋白, 达尼约缓冲液, L15, L15 + FBS, 半环, 1x 林格), 只有半倍林格和1x 林格产生高存活率;在其他媒体上, 胚胎未能从伤口中恢复。
低存活率的一个重要的故障排除提示是使用健康和年轻的父母鱼的健康胚胎。我们注意到, 即使对照的非大小减少的胚胎显示几乎100% 的存活率, 当大小缩小, 来自老鱼的胚胎往往显示较低的存活率。另外, 请注意, 当尺寸减小与额外的扰动 (如吗啡注射) 相结合时, 存活率往往会降低。
这里描述的尺寸缩小技术的简单性使研究人员无需专门的设备或密集的培训就可以应用这种技术。此外, 由于减少的胚胎大小一直较小, 直到后期的发展阶段 (一旦他们开始进食, 他们的大小似乎赶上了控制鱼), 这种技术可以应用于研究许多组织和器官的结垢。因此, 这种技术可以将尺寸缩小和体内定量活体成像结合起来, 研究各种系统的缩放和尺寸控制。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
提交人声明没有竞争或经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了日本科学技术署 PRETO 方案 (JJPR11AA) 和国家卫生研究院赠款 (R01GM107733) 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm PYREX Petri dish | CORNING | 3160-60 | |
| Agarose | affymetrix | 75817 | For making a mount for live imaging |
| Agarose, low gelling temperature Type VII-A | SIGMA-ALDRICH | A0701-25G | |
| CaCl2 | EMD | CX0130-1 | For 1/3 Ringer's solution |
| CaSO4 | For egg water | ||
| Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1) | CORNING | 2845-25 | |
| Disposable Spatula | VWR | 80081-188 | |
| Foam board | ELMER'S | 951300 | For microscope incubator |
| Forcept (No 55) | FST | 11255-20 | |
| Glass pipette | VWR | 14673-043 | |
| HEPES | SIGMA Life Science | H4034 | For 1/3 Ringer's solution |
| INCUKIT XL for Cabinet Incubators | INCUBATOR Warehouse.com | For microscope incubator | |
| Instant sea salt | Instant Ocean | 138510 | For egg water |
| KCl | SIGMA-ALDRICH | P4504 | For 1/3 Ringer's solution |
| Methyl cellulose | SIGMA-ALDRICH | M0387-100G | |
| NaCl | SIGMA-ALDRICH | S7653 | For 1/3 Ringer's solution |
| Petri dish | Falcon | 351029 | For making a mount for live imaging |
| Phenol red | SIGMA Life Science | P0290 | |
| Pipette pump | BEL-ART PRODUCTS | F37898 | |
| Pronase | EMD Millipore Corp | 53702-250KU | |
| Tricaine-S (MS222) | WESTERN CHEMICAL INC | NC0135573 | |
| Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires | Sandra | The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use. |
References
- Cooke, J. Scale of body pattern adjusts to available cell number in amphibian embryos. Nature. 290, 775-778 (1981).
- Driesch, H. Entwicklungsmechanische Studien: I. Der Werthe der beiden ersten Furchungszellen in der Echinogdermenentwicklung. Experimentelle Erzeugung von Theil- und Doppelbildungen. Zeitschrift fur wissenschaftliche Zoologie. , (1892).
- Morgan, T. H. Half embryos and whole embryos from one of the first two blastomeres. Anatomischer Anzeiger. 10, 623-638 (1895).
- Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145, (2018).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments. (26), e1217 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), e1113 (2009).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of Visualized Experiments. (29), e1394 (2009).
- Mizuno, T., Shinya, M., Takeda, H. Cell and tissue transplantation in zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, 15-28 (1999).
- Cooke, J. Control of somite number during morphogenesis of a vertebrate, Xenopus laevis. Nature. 254, 196-199 (1975).
- Inomata, H., Shibata, T., Haraguchi, T., Sasai, Y. Scaling of dorsal-ventral patterning by embryo size-dependent degradation of Spemann's organizer signals. Cell. 153, 1296-1311 (2013).
- Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454, 335-339 (2008).
- Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., Francois, P., Aulehla, A. Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding. Nature. 493, 101-105 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Almuedo-Castillo, M., et al. Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signalling. Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).
- Koos, D. S., Ho, R. K. The nieuwkoid gene characterizes and mediates a Nieuwkoop-center-like activity in the zebrafish. Current Biology. 8, 1199-1206 (1998).
- Yamanaka, Y., et al. A novel homeobox gene, dharma, can induce the organizer in a non-cell-autonomous manner. Genes and Development. 12, 2345-2353 (1998).
- Jesuthasan, S., Stahle, U. Dynamic microtubules and specification of the zebrafish embryonic axis. Current Biology. 7, 31-42 (1997).
- Schier, A. F., Talbot, W. S. The zebrafish organizer. Current Opinion in Genetics and Development. 8, 464-471 (1998).
