Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

भ्रूणीय पैटर्न स्केलिंग के अध्ययन के लिए Zebrafish के सर्जिकल आकार में कमी

Published: May 3, 2019 doi: 10.3791/59434
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Systems Biology, Harvard Medical School

Summary

यहाँ, हम सामान्य विकासात्मक प्रक्रियाओं को बाधित किए बिना zebrafish भ्रूणों के आकार को कम करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं । इस तकनीक पैटर्न स्केलिंग और आकार परिवर्तन के खिलाफ विकास की मजबूती के अध्ययन में सक्षम बनाता है ।

Abstract

विकास की प्रक्रिया में, भ्रूण एक उल्लेखनीय करने के लिए उनके शरीर के आकार के लिए उनकी बॉडी पैटर्न मैच की क्षमता का प्रदर्शन; उनके शरीर का अनुपात भी भ्रूण है कि बड़े या छोटे हैं, कुछ सीमाओं के भीतर में बनाए रखा है । हालांकि स्केलिंग की इस घटना ने एक सदी से अधिक के लिए ध्यान आकर्षित किया है, अंतर्निहित तंत्र को समझना सीमित किया गया है, जो विभिन्न आकारों के भ्रूण में विकासात्मक गतिशीलता के मात्रात्मक विवरण की कमी के कारण है । इस सीमा को दूर करने के लिए, हम एक नई तकनीक शल्य चिकित्सा zebrafish भ्रूण है, जो vivo में लाइव इमेजिंग के लिए महान लाभ है के आकार को कम करने के लिए विकसित की है । हम प्रदर्शित करते है कि अलग कदम में ब्लास्टुला चरण में कोशिकाओं और जर्दी के संतुलित हटाने के बाद, भ्रूण जल्दी से सही परिस्थितियों में ठीक हो सकता है और छोटे लेकिन अंयथा सामांय भ्रूण में विकसित । चूंकि इस तकनीक विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है, यह आसानी से अनुकूलनीय है, और स्केलिंग समस्याओं की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, मोर्फोजेन मध्यस्थता patterning की मजबूती सहित.

Introduction

वैज्ञानिकों ने लंबे समय से जाना जाता है कि भ्रूण एक उल्लेखनीय करने के लिए लगातार शरीर के अनुपात फार्म की क्षमता है, हालांकि भ्रूण आकार दोनों प्राकृतिक और प्रयोगात्मक स्थितियों के तहत बहुत भिंन हो सकते है1,2,3। दशकों के सैद्धांतिक और प्रयोगात्मक अध्ययन के बावजूद, आकार भिन्नता के लिए इस मजबूती, स्केलिंग कहा जाता है, और इसके अंतर्निहित तंत्र कई ऊतकों और अंगों में अनजान रहते हैं. आदेश में सीधे विकासशील प्रणाली की गतिशीलता पर कब्जा करने के लिए, हम zebrafish4, जो में वीवो लाइव इमेजिंग5में महान लाभ है में एक reproducible और सरल आकार में कमी तकनीक की स्थापना की ।

Zebrafish विकास जीवविज्ञान सहित जीव विज्ञान के कई विषयों का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श कशेरुकी जानवर के रूप में कार्य किया है । विशेष रूप से, zebrafish के लिए आदर्श है vivo में लाइव इमेजिंग6 क्योंकि 1) विकास सामांय रूप से मां और अंडा खोल के बाहर आगे बढ़ सकते हैं, और 2) भ्रूण पारदर्शी हैं । इसके अलावा, भ्रूण कुछ तापमान और पर्यावरण के उतार-चढ़ाव का सामना कर सकते हैं, जो उन्हें प्रयोगशाला की स्थितियों में अध्ययन करने की अनुमति देता है । इसके अलावा, पारंपरिक जीन अभिव्यक्ति क्षोभ द्वारा morpholino और mrna इंजेक्शन7,8, crispr/Cas9 प्रौद्योगिकी में हाल ही में अग्रिमों के अतिरिक्त zebrafish में रिवर्स जेनेटिक्स अत्यधिक कुशल9बना दिया है । इसके अलावा, भ्रूणविज्ञान में कई शास्त्रीय तकनीक, जैसे कोशिका प्रत्यारोपण या ऊतक सर्जरी के रूप में4,10,11लागू किया जा सकता है ।

आकार में कमी तकनीक मूल रूप से एम्फीबियन और अन्य गैर कशेरुकी जानवरों में विकसित किए गए थे12. उदाहरण के लिए, एक अन्य लोकप्रिय कशेरुकी प्राणी मॉडल, जैनोपस लेवेसिस में, ब्लास्टुला अवस्था में पशु-वनस्पति अक्ष के साथ द्विभाजन आकार-कम भ्रूण12,13का उत्पादन कर सकता है । हालांकि, हमारे हाथ में यह एक कदम दृष्टिकोण के परिणाम में dorsalized या ventralized के भ्रूणों zebrafish, संभवतः क्योंकि पृष्ठीय निर्धारकों असमान वितरित कर रहे है और एक भ्रूण के आकारिकी से अपने स्थानीयकरण नहीं पता कर सकते हैं । यहां हम zebrafish के लिए एक वैकल्पिक दो कदम काट तकनीक है कि सामांय रूप से विकसित करने पर छोटे भ्रूण का उत्पादन प्रदर्शन । इस तकनीक के साथ, कोशिकाओं पहले पशु ध्रुव, आयोजक गतिविधि में कमी भोली कोशिकाओं के एक क्षेत्र से हटा रहे हैं । जर्दी और कोशिकाओं की मात्रा को संतुलित करने के लिए, जो एपीबोलिय और बाद की संरचनाजनन के लिए महत्वपूर्ण है, जर्दी को फिर निकाल दिया जाता है । यहाँ, हम इस प्रोटोकॉल विस्तार और पैटर्न गठन में आकार अपरिरूपता के दो उदाहरण प्रदान करते हैं; कायखंड गठन और अधर तंत्रिका ट्यूब patterning. मात्रात्मक इमेजिंग के साथ संयुक्त, हम आकार में कमी तकनीक का उपयोग कैसे somites और तंत्रिका ट्यूब के आकार कम भ्रूण में प्रभावित कर रहे है की जांच करने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी मछली से संबंधित प्रक्रियाओं हार्वर्ड मेडिकल स्कूल में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के अनुमोदन के साथ किया गया ।

1. उपकरण और अभिकर्मक तैयारी

  1. एक तार पाश करने के लिए भ्रूण काटना
    1. ४० μm के एक व्यास के साथ कठोर और गैर संक्षारक है कि स्टेनलेस स्टील वायर के 20 सेमी ले लो । कांच केशिका में तार के माध्यम से पाश (१.० मिमी बाहरी व्यास, ०.५ मिमी भीतरी व्यास, कोई फिलामेंट), शीर्ष पर एक छोटा सा पाश बनाने (पाश लंबाई १.० मिमी है)
    2. तार पाश के बीच कांच केशिका की नोक पर स्पष्ट नेल पॉलिश की एक छोटी सी बूंद के लिए यह जगह में पकड़ रखो । सूखने दें । सुनिश्चित करें कि पाश भाग पर किसी भी नेल पॉलिश प्राप्त करने के लिए नहीं है, क्योंकि यह भ्रूण को नुकसान पहुंचा सकता है ।
    3. एक लकड़ी के चॉस्टिक पर पाश के साथ ग्लास केशिका संलग्न (9 "बांस डिस्पोजेबल चीनी कांटा आधे में टूट) प्रयोगशाला टेप का उपयोग कर. कांच की केशिका के बारे में २.५ सेमी छोड़, चॉपस्टिक से परे विस्तार, ताकि उपकरण के चॉस्टिक हिस्सा पानी में डुबकी नहीं है । वरीयता के लिए इस लंबाई समायोजित करें ।
  2. वैकल्पिक रूप से, भ्रूण को काटना एक गिलास सुई बनाओ
    1. कांच के एक सिरे को संदंश के साथ पाश्र पिपेट में पिंच करें, जबकि दूसरी ओर हाथ से पकड़े । पिपेट के पतले हिस्से को स्पिरिट लैंप या बुन्सेन बर्नर के ऊपर गर्म करें ।
    2. ग्लास पिपेट को हाथ से खींचो । लगभग 30 μm और सौम्य वक्र (वक्रता त्रिज्या = लगभग 5 मि. मी.) के व्यास के रूप में आदर्श पिपेट । उचित व्यास और वक्रता अभ्यास और कुछ मौका के साथ प्राप्त की है ।
  3. मिथाइल सेलुलोस तैयार करें
    1. मिथाइल सेलुलोस को काट के समय भ्रूण को धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है । 1/3x रिंगर सॉल्यूशन में 2% मिथाइल सेलुलोस सॉल्यूशन (११६ mM NaCl, २.९ mM KCl, १.८ mM CaCl2, और 5 एमएम 4-(2-हाइड्रोक्सियेथिल) ७.२ -1 1/3x घंटी के घोल में मिथाइल सेलुलोस पाउडर 4 ° c रात में हिला ।
    2. वैकल्पिक रूप से, जोड़ने ~ १.५ मिलीलीटर phenol लाल (DPBS स्टॉक समाधान में ०.५%) करने के लिए 10 मिलीलीटर 2% मिथाइल सेल्युलोज समाधान, लाल जब तक, समाधान को दृश्यमान बनाने के लिए. यह हिला जब तक रंग वर्दी बन जाता है ।

2. सर्जिकल आकार में कमी के लिए Zebrafish भ्रूण की तैयारी

  1. भ्रूण एकत्र
    1. एक या दो नर और एक या दो मादा जेब्राफिश को एक संभोग कक्ष में रखें जिसमें ढेर सारा पानी भरा हो । अलग पुरुषों और महिलाओं को एक प्लास्टिक विभाजक का उपयोग कर । का प्रयोग करें एबी लाइन के लिए कायखंड इमेजिंग (धारा 4) और एक ट्रांसजेनिक रिपोर्टर लाइन की न्यूरल ट्यूब patterning (nkx 2.2: mem-gfp, dbx1b: gfp, या Olig2: dsred) न्यूरल ट्यूब इमेजिंग के लिए. उन्हें रात भर चैंबर में छोड़ दें ।
      नोट: वयस्कों की पसंद अंडे कि सर्जरी जीवित रहने के लिए अच्छी तरह से प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है । आमतौर पर, युवा स्वस्थ महिलाओं के स्वस्थ अंडे का उत्पादन ।
    2. अगली सुबह, चैंबर उथले पानी में हस्तांतरण और थोड़ा झुकाव के साथ चैंबर जगह है । विभाजक निकालें ताकि मछली दोस्त कर सकते हैं ।
    3. एक चाय छलनी में डाल कर अंडे ले लीजिए । अंडा पानी के साथ एक पेट्री डिश (20x अंडा पानी, 6 ग्राम तत्काल समुद्री नमक, १.५ ग्राम CaSO4 और 1 एल एच2ओ के लिए, 1x पर उपयोग करें) में अंडे हस्तांतरण । बेहतर मंचन के लिए, अंडे सही spawning के बाद इकट्ठा । भ्रूणों को २८.५ ° ब् इनक्यूबेटर में रखें ।
    4. यदि आवश्यक हो, तो एक सामांय प्रोटोकॉल7,8निंनलिखित 1-4 कोशिका चरणों में, morpholino, mrna, आदि सुई । तंत्रिका ट्यूब इमेजिंग (धारा 5) के लिए फ्लोरोसेंट झिल्ली लेबल (mem-Mem, mem-mBFP1, या Mem-mcitrine) के लिए mrna सुई ।
  2. प्रोनेस का उपयोग करते हुए विचोरीयोनेट
    1. १२८ के आसपास-२५६ के लिए सेल-सेल स्टेज, एक ३५ mm गिलास अंडे के पानी से भरे पकवान को स्वस्थ भ्रूण हस्तांतरण । डिश से जितना हो सके अंडा पानी निकाल लें ।
    2. 20 मिलीग्राम/एमएल pronase के 1 मिलीलीटर जोड़ें । धीरे से चक्कर भ्रूण के आसपास थाली हिल और धीरे से समाधान पिपेट और नीचे एक गिलास पिपेट प्रयोग dechorionation मदद करने के लिए ।
    3. जब chorions लोच खोने के लिए शुरू (आमतौर पर 1-4 मिनट pronase के अलावा के बाद, अंडे और पानी की मात्रा पर निर्भर करता है), कम pronase के रूप में संभव के रूप में ज्यादा अंडा पानी जोड़ें । धीरे से forceps के साथ जरायु को छूने से लोच हानि का आकलन; जरायु तुरंत वापस शेख़ी बिना सेंध पकड़ चाहिए । एक गिलास पिपेट (इस बिंदु पर, ज्यादातर chorions टूट नहीं कर रहे हैं) का उपयोग कर अंडे के पानी के साथ एक और डिश के लिए अंडे हस्तांतरण ।
      1. वैकल्पिक रूप से, धीरे पकवान से एक बड़े ४०० मिलीलीटर गिलास बीकर हवा में भ्रूण उजागर बिना अंडे के पानी से भर में भ्रूण डालना । इसके बाद भ्रूणों को पूरी तरह से व्यवस्थित होने दें । बीकर झुकाव एक तरफ भ्रूण गिर जाने के लिए । एक गिलास पिपेट और एक नया ३५ mm गिलास 1/3x है ringer समाधान से भरा पकवान को हस्तांतरण का उपयोग कर इन भ्रूण लीजिए ।
    4. जब तक अधिकांश chorions लोच पूरी तरह से खो कई मिनट के लिए रुको । अंडे को धीरे से पीसे हुए भ्रूण से बचे हुए चोरीऑन्स को निकाल लें । क्षतिग्रस्त भ्रूण को हटा दें और भ्रूण को २८.५ ° c इनक्यूबेटर में सेबेट करें ।

3. सर्जिकल आकार में कमी और वसूली

  1. एक साफ ३५ mm ग्लास डिश तैयार करते हैं । लगभग ०.५ मिलीलीटर 2% मिथाइल सेलुलोस का प्रसार करें (1/3x घंटी के समाधान में, phenol लाल के साथ मदद करने के लिए कल्पना) एक प्लास्टिक spatula का उपयोग कर बड़ा पकवान के नीचे के केंद्र के पास । बारीकी से और समान रूप से लगभग ०.५ मिमी की मोटाई के लिए मिथाइल सेलुलोस फैल ।
  2. डिश के पक्ष में 1/3x घंटी के समाधान के लगभग 30 मिलीलीटर डालो और डिश के बाकी पर प्रसार करने की अनुमति, मिथाइल सेल्युलोज को कवर ।
  3. 2% मिथाइल सेल्युलोज पर २५६-सेल 1k-कोशिका चरण में dechorionated भ्रूणों प्लेस । दोनों कोशिकाओं और जर्दी कल्पना करने के लिए पक्ष पर भ्रूण के अभिविन्यास समायोजित करें । (चित्र 1)
  4. काटना लगभग 30%-पशु ध्रुव के पास से पशु-वनस्पति अक्ष तार पाश (या ग्लास सुई) का उपयोग कर (चित्रा 1, शीर्ष पैनलों) के लिए सीधा काटने से जानवर पोल के पास ब्लाकोडेर्म से कोशिकाओं के ४०% । कोशिकाओं को हटाने के बाद, धीरे शेष कोशिकाओं को वापस छड़ी मदद करने के लिए एक साथ समाप्त होता है नल. कुछ ही मिनटों में, जब भ्रूण ठीक होने लगता है तो मरे हुए कोशिकाएँ बंद कर देनी चाहिए ।
  5. "काटने" की जर्दी (चित्रा 1 मध्य पैनलों) के बजाय वनस्पति ध्रुव के पास जर्दी के लिए एक छोटे से घाव बनाओ । अंडे की झिल्ली को घुड़सवार तार से निकलाकर जर्दी को घाव कर देते हैं । पीतक घायल होने के बाद कुछ मिनटों के लिए बाहर रसना जाएगा, और फिर घाव चंगा होगा (चित्रा 1 नीचे पैनलों) ।
  6. जब जर्दी बाहर निकलना बंद हो जाता है, एक ही डिश में मिथाइल सेल्युलोस के बाहर एक पिपेट का उपयोग कर भ्रूण को स्थानांतरित करने के लिए उन्हें बेहतर ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं ।
  7. सभी भ्रूणों के लिए चरण 3.4-3.6 दोहराएं । 30 मिनट के लिए थाली स्थिर छोड़ दें, जबकि भ्रूण ठीक हो ।
  8. नए व्यंजन में भ्रूणों को एक नई डिश में स्थानांतरित करें और उन्हें पूरी तरह से ठीक होने के लिए २८.५ ° c इनक्यूबेटर में डाल दें ।
    1. वैकल्पिक अगर ब्याज की अवस्था जल्दी कायखंड चरण है, भ्रूण 20 डिग्री सेल्सियस पर २८.५ ° c ढाल चरण तक इंक्यूबेटेड होने के बाद, प्रयोग और इमेजिंग के लिए समय को समायोजित करने के लिए इंक्यूबेटेड किया जा सकता है ।

4. Zebrafish सोमेटोजनन की लाइव इमेजिंग

  1. १०० मिलीलीटर अंडे का पानी, हीटिंग जब तक agarose पूरी तरह से भंग हो गया है 1 ग्राम agarose जोड़कर 1% agarose समाधान के १०० मिलीलीटर तैयार । 62-72 डिग्री सेल्सियस के एक तापमान के लिए 5-10 मिनट के लिए शांत करते हैं ।
  2. इमेजिंग के लिए एक माउंट तैयार करें ।
    नोट:     इस गाइड एक औंधा चौड़े क्षेत्र माइक्रोस्कोप के साथ प्रयोग के लिए विकसित किया गया था ।
    1. एक १०० मिमी x 15 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश के लिए में 1% agarose के ~ 15 मिलीलीटर डालना ।
    2. धीरे से पेट्री डिश के तल पर एक पृष्ठीय माउंट V1 मोल्ड टेंपलेट5 जगह है । एक वजन का उपयोग करके नीचे की ओर मोल्ड रखें, जैसे पानी के साथ 15 मिलीलीटर ट्यूब ।
      नोट: यह है तो भ्रूण के रूप में संभव के रूप में पेट्री डिश के नीचे के करीब हैं, जब एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर । हालांकि भ्रूण कायखंड इमेजिंग के लिए laterally बढ़ रहे हैं, यहां पृष्ठीय माउंट V15 प्रयोग किया जाता है क्योंकि यह जल्दी कायखंड चरणों में भ्रूण बेहतर रखती है ।
    3. जब तक agarose पूरी तरह से जम रहा है शांत चलो । में डालो ~ 30 ०.०१% tricaine के साथ अंडे के पानी के मिलीलीटर, और ध्यान से धीरे से संदंश के साथ बंद prying द्वारा मोल्ड हटा दें ।
  3. कायखंड इमेजिंग के लिए माउंट भ्रूण
    1. 1/3x घंटी के घोल (या अंडा पानी) में 1% कम पिघलने Agarose तैयार करें और इसे ४२ ° c पर रखें । तापमान ४२ डिग्री सेल्सियस के नीचे आने तक प्रतीक्षा करें ।
    2. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, एक अच्छी तरह से प्रति भ्रूण जगह है । Pipette लगभग 1 μL की कम पिघलने Agarose में अच्छी तरह से करने के लिए पतले आकार को समायोजित करने के लिए अच्छी तरह से व्यक्तिगत भ्रूण है कि आकार में बदलती हैं, विशेष रूप से उन लोगों के बीच के बीच और आकार में कमी के बिना ।
    3. जल्द ही कम पिघलने Agarose से पहले भ्रूण उंमुख तो भ्रूण पूरी तरह से पकवान को laterally चेहरा । बढ़ते भ्रूण के बाद, धीरे से जगह में भ्रूण पकड़ करने के लिए agarose माउंट में कवर पर्ची जगह है । अभिविंयास दीर्घकालिक कायखंड इमेजिंग के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि भ्रूण के लिए बिल्कुल laterally सभी कायखंड सीमाओं के लिए घुड़सवार को स्पष्ट रूप से बाद के चरणों में imaged होना है ।
    4. बढ़ते क्षेत्र से दूर submerge और एक 25 मिमी x 25 मिमी कवर गिलास हेरफेर कि यह ४५ डिग्री वर्ग मोल्ड द्वारा किए गए इंडेंट के उंमुखीकरण से ऑफसेट है । इस ओरिएंटेशन में मोल्ड पर coverslip स्लाइड जब तक प्रत्येक कोने मोल्ड के एक अलग पक्ष के आराम कर रहा है ।
      नोट: हालांकि इस प्रोटोकॉल एक औंधा खुर्दबीन के लिए है, मोल्ड के शीर्ष पर एक आवरण गिलास रखने अभी भी महत्वपूर्ण है कि भ्रूण कदम नहीं है, जबकि माइक्रोस्कोप को स्थानांतरित ।
  4. इमेजिंग सोमाइट रचना प्रक्रम
    1. Foamcore बोर्डों और एक कैबिनेट हीटर के साथ बनाया एक इनक्यूबेटर में 28 डिग्री सेल्सियस करने के लिए माइक्रोस्कोप prewarm ।
    2. पेट्री डिश को माइक्रोस्कोप के स्तर पर घुड़सवार भ्रूणों के साथ रखें । कम इज़ाफ़ा लेंस के साथ agarose माउंट के शीर्ष बाएं कुएं में घुड़सवार भ्रूण का पता लगाएं, तो 10x के उद्देश्य स्विच ।
    3. छवि अधिग्रहण सेट करें ।
      नोट: यह अनुदेश उज्ज्वल क्षेत्र के लिए है ।
    4. प्रकाश शक्ति, जोखिम समय, और कंडेनसर के लिए शर्तों का पता लगाएं ताकि कायखंड सीमा स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है । Z-स्टैक सेटिंग्स का उपयोग कर सबसे कम और उच्चतम वांछित इमेजिंग विमान सेट । कुल समय और समय अंतराल सेट करें । ढूँढें और सभी भ्रूण के xy पदों रजिस्टर इतने सारे भ्रूण घुड़सवार एक बार में imaged timelapse किया जा सकता है ।
  5. फिजी16का उपयोग करते हुए पीएसएम और सोमवासियों की लंबाई मापें ।

5. इमेजिंग की न्यूरल ट्यूब Patterning

  1. १०० मिलीलीटर अंडे का पानी, हीटिंग जब तक agarose पूरी तरह से भंग हो गया है 1 ग्राम agarose जोड़कर 1% agarose समाधान के १०० मिलीलीटर तैयार । 62-72 डिग्री सेल्सियस के लिए 5-10 मिनट के लिए शांत चलो । ०.०१% करने के लिए ट्राइकेन समायोजित करें ।
  2. इमेजिंग के लिए एक पृष्ठीय माउंट तैयार करें ।
    नोट:     इस गाइड एक ईमानदार प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ उपयोग के लिए विकसित की है । उल्टे माइक्रोस्कोप के लिए coverslip नीचे व्यंजन आवश्यक है और चरण 3 में उंमुखीकरण बढ़ते है फ़्लिप ।
    1. एक १०० मिमी x 15 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश के लिए में 1% agarose के ~ 15 मिलीलीटर में डालो । धीरे हवा बुलबुले शुरू से बचने के लिए agarose की सतह पर एक पृष्ठीय माउंट V1 मोल्ड नाव । जब तक agarose पूरी तरह से जम रहा है शांत चलो ।
    2. ध्यान से संदंश या एक उस्तरा ब्लेड के साथ मोल्ड निकालें । ०.०१% ट्राइकेन के साथ अंडा पानी के साथ पकवान भरें और उपयोग तक कवर ।
  3. न्यूरल ट्यूब इमेजिंग के लिए भ्रूणों माउंट ।
    1. ट्रांसजेनिक की अनुमति दें या प्रतिदीप्त आकार इंजेक्शन-कम और भ्रूण को नियंत्रित करने के लिए विकसित करने के लिए 20-25 कायखंड चरण (लगभग 18-22 h निषेचन के बाद). एक फ्लोरोसेंट झिल्ली लेबल (mem-Mem, Mem-mBFP1, या Mem -mcitrine) और ंयूरल ट्यूब patterning के एक ट्रांसजेनिक रिपोर्टर व्यक्त भ्रूण (nkx 2.2: mem-gfp, dbx1b: gfp, या Olig2: dsred) का उपयोग किया जाता है इमेजिंग के लिए ।
    2. ०.०१% tricaine समाधान के साथ तैयार पृष्ठीय माउंट में अंडा पानी मध्यम बदलें । धीरे से भ्रूण में पिपेट के लिए पृष्ठीय माउंट के कुओं में imaged हो ।
    3. भ्रूण को सही अभिविंयास में हेरफेर करना जैसे कि सिर को आगे का सामना करना पड़ रहा है और पूंछ पानी की सतह की ओर पृष्ठीय भाग के साथ पीछे की ओर इशारा कर रही है ।
    4. भ्रूण को इस तरह से ओरिएंट करें कि पूंछ सपाट पड़ी हो और डिश के नीचे की तरफ नीचे की ओर न नुकीला हो । यह कई बार बढ़ते कूप की ओर कगार पर पूंछ के पीछे के हिस्से को आराम करने के लिए मदद करने के लिए डूबने से पूंछ को रोकने और अनजाने में हिब्रेन इमेजिंग । प्रत्येक भ्रूण के लिए दोहराएं । आकार कम भ्रूण के साथ कुछ करना है कि वे गहराई से कुओं में गिर नहीं imaged हो ।
    5. बढ़ते क्षेत्र से दूर submerge और एक 25 मिमी x 25 मिमी कवर गिलास हेरफेर कि यह ४५ ° है मोल्ड द्वारा किए गए वर्ग इंडेंट के उंमुखीकरण से ऑफसेट । इस ओरिएंटेशन में मोल्ड पर coverslip स्लाइड जब तक प्रत्येक कोने मोल्ड के एक अलग पक्ष के आराम कर रहा है ।
    6. धीरे से आवरण को घुमाएगी जब तक यह धीरे बढ़ते क्षेत्र के लिए पर पड़ता है । जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि भ्रूण अभी भी सही स्थिति और झुकाव में बढ़ रहे हैं । यदि बहुत अधिक आंदोलन coverglass के गिरने के कारण होता है, धीरे से हटाने और कदम सी से बढ़ते ।
  4. 3 में छवि-डी विकसित रीढ़ की हड्डी ।
    1. धीरे से संनाभि माइक्रोस्कोप को घुड़सवार भ्रूण युक्त पकवान परिवहन । लंबे समय तक लाइव इमेजिंग के लिए, एक इनक्यूबिटेड माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें । अंयथा, कम तापमान सहनीय हैं ।
    2. ब्राइटफील्ड रोशनी के तहत, छवि के लिए भ्रूण के लिए नेविगेट और पसंदीदा पूर्वकाल-पश्च स्थिति पर देखने के क्षेत्र केंद्र । भ्रूण के बीच एक विस्तृत तुलना सक्षम करने के लिए, प्रत्येक भ्रूण पर इस स्थिति को सुसंगत होना चाहिए ।
    3. इमेजिंग मानकों को उत्तेजित और फ्लोरोसेंट प्रोटीन imaged किया जा रहा से संकेत पर कब्जा करने के लिए सेट करें । पैरामीटर्स प्रारंभिक नमूने पर एक वांछित छवि बनाने के लिए आंख से tuned किया जा सकता है । मापन संगतता सक्षम करने के लिए, इन सेटिंग्स को डेटासेट में सभी भ्रूणों पर लागू करें । यदि कई z-ढेर की गति के लिए सेटिंग्स का अनुकूलन की आवश्यकता है ।
    4. Z-स्टैक सेटिंग्स का उपयोग करना, सबसे कम और उच्चतम वांछित इमेजिंग विमान सेट । Z-स्टैक में इष्टतम छवि गुणवत्ता के लिए, z-रिज़ॉल्यूशन एपर्चर सेटिंग के लिए इष्टतम है जो उच्चतम करने के लिए सेट करें । अच्छी छवियों को 1 μm z-रिक्ति के साथ उत्पंन किया जा सकता है ।
  5. किसी भी पसंदीदा विधि द्वारा इमेजिंग डेटा का विश्लेषण करें ।
    नोट: इस मामले में, विश्लेषण कस्टम MATLAB लिपियों कि एक छवि और इमेजिंग संकेत की मात्रा के तंत्रिका भागों के सरल विभाजन को सक्षम करने के साथ किया गया था ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

जर्दी मात्रा में कमी सामांय आकारिकी के लिए महत्वपूर्ण है
जैसा कि हाल ही में Almuedo में वर्णित-Castillo एट अल.17, भ्रूण के आकार में कमी की जर्दी मात्रा को कम करने के बिना प्राप्त किया जा सकता है । के साथ और जर्दी मात्रा में कमी के बिना तुलना करने के लिए, हम दोनों दो कदम काट (दोनों ब्लास्टुला और जर्दी) और ब्लास्टुला-केवल काट प्रदर्शन (चित्रा 2 और पूरक फिल्म 1). दो कदम कटा भ्रूणों नियंत्रण की तुलना में प्रतीत होता है सामांय समग्र आकृति विज्ञान दिखाया (केवल dechorionation) भ्रूण, आकार के अंतर के अलावा अंय, विकास के चरणों में (शीर्ष और चित्रा 2में मध्य पैनलों देखें) । दूसरी ओर, ब्लास्टुला-केवल कटे हुए भ्रूणों ने एक विचित्र आकारिकी दिखाई, विशेषकर पहले के चरणों में । एपीबोली के दौरान, भ्रूण एक constricted और दांतेदार दिखाई था (७०% एपीबोली के लिए नीचे चित्र 2में पैनल देखें) । निंनलिखित कायखंड चरण में, मध्य रेखा संरचनाओं को चपटा पाया गया (यानी डीवी लंबाई एमएल लंबाई से अपेक्षाकृत कम है) कई अक्षीय स्तर पर (8 और 20 चित्रामें कायखंड के लिए नीचे पैनल देखें) । बाद के चरणों में, इस तरह के मध्य और मस्तिष्क के रूप में की जर्दी के निकट शरीर संरचनाओं, और पहले ~ 10 somites, अभी भी एक अपेक्षाकृत चपटा आकार दिखाया, संभवतः अपेक्षाकृत बड़ा पीतक से तनाव में वृद्धि के कारण.

Somite आकार कम करने के आकार में कमी भ्रूणों
सोमाइटीज खंडीय संरचनाएं होती हैं जो भ्रूणोत्पत्ति के दौरान संक्रामक रूप से दिखाई देती हैं और कशेरुक और कंकाल की मांसपेशी को जन्म देती हैं । प्रेमीनिटिक मध्यजनस्तर (पीएसएम) से, एक के बाद एक आवर्ती तरीके से एक के बाद एक (zebrafish के लिए 25 मिनट, चूहों के लिए 2 एच) (चित्र 3ए) । हम नियंत्रण और कटा भ्रूण दोनों के लिए कायखंड गठन की समय चूक इमेजिंग प्रदर्शन किया और सबसे नवगठित कायखंड के आकार मापा (चित्रा 3बी). नियंत्रण और कटे भ्रूण दोनों में, बाद के चरणों में बनने वाले सोमयों के आकार पहले की अवस्थाओं की तुलना में छोटे पाए गए । इसके अलावा, कायखंड गठन चरणों के दौरान, कटा भ्रूण नियंत्रण भ्रूण में लोगों की तुलना में छोटे कायखंड था (चित्रा 3सी).

न्यूरल ट्यूब हाइट्स आकार में कमी के बाद कम कर रहे हैं
ंयूरल ट्यूब आकार पर भ्रूण के आकार में कमी के प्रभाव को देखने के लिए, हम mem पर हमारे दो कदम काट तकनीक -mem इंजेक्शन भ्रूण और 20 एचपीएफ पर अपनी रीढ़ की हड्डी imaged हमारे संनाभि इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर (चित्रा 4ए, बी) । इस डेटासेट में, न्यूरल ट्यूब हाइट्स १२.४% ± ३.२% द्वारा आकार में कमी के बाद कम कर रहे थे, के रूप में मैंयुअल रूप से कस्टम छवि विश्लेषण कोड का उपयोग कर मापा (चित्रा 4सी) । एक साथ लिया, इन आंकड़ों से पता चलता है कि आकार में कमी ंयूरल ट्यूब ऊंचाई कम कर देता है । इस तकनीक का इस्तेमाल तंत्रिका नमूनों पर आकार में कमी के प्रभाव को मापने के लिए किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1 : आकार में कमी तकनीक। लगभग 30%-४०% कोशिकाओं के पशु ध्रुव (शीर्ष पैनलों) से काट रहे थे । जर्दी के आसपास झिल्ली ध्यान से घायल इतना है कि पीतक बाहर (मध्य पैनलों) oozed था । निम्नलिखित कुछ मिनटों के लिए, पीतक oozed और फिर दोनों blastoderm और जर्दी पर घावों को चंगा (नीचे पैनल) । स्केल पट्टी = २०० μm । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 : आकार में कमी के दो तरीकों के बीच तुलना । भ्रूण पर नियंत्रण (शीर्ष पैनलों, 24 एचपीएफ और 30 एचपीएफ के लिए शीर्ष भ्रूण), दो कदम काट के साथ आकार कम भ्रूण (ब्लास्टुला और जर्दी, मध्य पैनलों, 24 एचपीएफ और 30 एचपीएफ के लिए मध्य भ्रूण) और आकार कम भ्रूण के साथ ब्लास्टुला-केवल काट (नीचे पैनल, नीचे भ्रूण के लिए 24 एचपीएफ और 30 एचपीएफ) विकास चरणों के साथ तुलना कर रहे हैं । ध्यान दें कि ब्लास्टुला में केवल कटे हुए भ्रूण में, ब्लाकोडर्म की मात्रा जर्दी की तुलना में बहुत छोटी होती है (७०% epiboly) । एक परिणाम के रूप में, भ्रूण एक असंगत रूप से कायखंड चरणों में चपटा आकार है (यानी, डीवी अक्ष कोब्लास्टुला में एपी अक्ष की तुलना में अपेक्षाकृत कम है-केवल भ्रूण कटा, नियंत्रण या एक दो कदम एक कटा) की तुलना में । स्केल ba = २०० μm । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 : आकार में कमी कम कर देता है सोमयों की लंबाई । (क) सोमाइट रचना का योजनाबद्ध चित्रण । (ख) समय के साथ-साथ नियंत्रण और कटे भ्रूणों की उज्ज्वल क्षेत्र छवियां । पीले रंग के अरोहेड प्रत्येक सोमाइट अवस्था में सबसे नवगठित कायमाइट दर्शाते हैं । (ग) नियंत्रण तथा कटे भ्रूण दोनों के लिए समय के साथ-साथ सोमाइट की लंबाई (अग्र-पश्च अक्ष में) मापन । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4 : आकार में कमी ंयूरल ट्यूब की ऊंचाई कम कर देता है । (क-ख) सामांय आकार (A) और आकार कम (B) टीजी (ptch2: kaede) भ्रूण जो Mem-mem एमआरएनए के साथ एकल कोशिका चरण में इंजेक्शन थे के उदाहरण छवियां । स्केल पट्टी = 20 μm । (ग) तंत्रिकीय नली के प्रत्येक जेड-स्टैक में न्यूरल खंडीकरण से निष्कर्षण की जाती है । सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर औसत तंत्रिका ऊंचाई में मनाया जाता है जब मूल्यों की तुलना में एक अयुग्मित टी का उपयोग कर रहे है परीक्षण (पी = ०.०३९७) । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Supplemental Movie 1
पूरक मूवी 1: दो कदम काट के बीच तुलना ब्लास्टुला-केवल काट बनाम । शीर्ष पंक्ति = नियंत्रण भ्रूण, मध्य पंक्ति = आकार कम भ्रूण के साथ दो कदम काट, नीचे पंक्ति = आकार ब्लास्टुला केवल काट के साथ भ्रूण कम । फिल्में 12 ज. स्केल बार = 1 मिमी के लिए हर 3 मिनट लिया गया. कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ऐतिहासिक, कशेरुकी प्राणियों के बीच में, आकार में कमी मुख्य रूप से एम्फीबियन भ्रूण का उपयोग किया गया है, पशु के साथ भ्रूण bisecting द्वारा-वनस्पति अक्ष एक ब्लास्टुला स्टेज पर12. हालांकि, वहां मुख्य रूप से मेंढक और zebrafish भ्रूण के बीच दो मतभेद है जब हम भ्रूण द्विभाजित । सबसे पहले, जब zebrafish भ्रूण bisecting (ब्लास्टुला चरण) के सहिष्णु हो जाते हैं, आयोजक ब्लास्टुला मार्जिन के एक प्रतिबंधित क्षेत्र में स्थित है18,19,20,21। क्योंकि एक भ्रूण की आकृति विज्ञान से आयोजक की स्थिति नहीं बता सकता, बेतरतीब ढंग से पशु के साथ भ्रूण काटने-वनस्पति अक्ष dorsalized या ventralized भ्रूण पैदा करता है । दूसरा, मेंढक भ्रूणों के विपरीत, जेब्राफिश भ्रूणों को epiboly नामक प्रक्रिया के माध्यम से जाना जाता है, जहां कोशिकाएं एक अलग जर्दी के चारों ओर वनस्पति ध्रुव की ओर जाती हैं, जब तक कि यह पूरी तरह से कोशिकाओं से घिरा न हो । यदि ब्लाकस्तर के केवल एक भाग को हटा दिया जाता है, तो कम कोशिकाएं अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा की जर्दी को निगल जाती हैं, और इसके परिणामस्वरूप, आकारिकी के बाद अधिक्रम प्रभावित होता है । इसलिए, हम दो कदम काट जिसमें हम पशु ध्रुव के पास ब्लास्टुला काटना, आयोजक को काटने से बचने के लिए, और जर्दी झिल्ली घाव, जर्दी आकार कोरक के लिए आनुपातिक बनाने के लिए ।

दो कदम काट के अलावा, हम मध्यम जिसमें आकार में कमी सर्जरी किया जाता है पाया शल्य चिकित्सा के बाद भ्रूण की वसूली के लिए महत्वपूर्ण है । कई मीडिया में हम (अंडा पानी, अंडा पानी + Albumin, Danieau बफर, L15, L15 + FBS, 1/3x घंटी, 1x घंटी) की कोशिश की, केवल 1/ दूसरे मीडिया में भ्रूण घावों से उबरने में नाकाम रहे ।

कम उत्तरजीविता दर के लिए एक महत्वपूर्ण समस्या निवारण टिप स्वस्थ और युवा माता पिता मछली से स्वस्थ भ्रूण का उपयोग करने के लिए है । हम यह भी कहा कि जब नियंत्रण गैर आकार कम भ्रूण लगभग १००% जीवित रहने की दर, जब आकार कम दिखा, बड़े मछली से भ्रूण कम जीवित रहने की दर को दिखाने के लिए करते हैं । इसके अलावा, ध्यान दें कि जीवित रहने की दर कम करने के लिए जब आकार में कमी अतिरिक्त perturbations, जैसे morpholino इंजेक्शन के साथ संयुक्त है आदत है ।

आकार में कमी तकनीक यहां वर्णित की सादगी शोधकर्ताओं विशेष उपकरण या गहन प्रशिक्षण के बिना इस तकनीक को लागू करने के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, के बाद से आकार कम भ्रूण विकास के बाद के चरणों तक छोटे रहते है (एक बार वे खाना शुरू, उनके आकार को नियंत्रण मछली के साथ पकड़ने लगता है), इस तकनीक को कई ऊतकों और अंगों की स्केलिंग का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है । इसलिए, इस तकनीक यह आकार में कमी और विभिंन प्रणालियों के स्केलिंग और आकार नियंत्रण का अध्ययन करने के लिए vivo में लाइव इमेजिंग में मात्रात्मक गठबंधन करने के लिए संभव बनाता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों को कोई प्रतिस्पर्धा या वित्तीय हितों की घोषणा ।

Acknowledgments

इस काम को जापान विज्ञान और प्रौद्योगिकी एजेंसी (JPMJPR11AA) और एक राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थान (R01GM107733) के PRESTO कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
60 mm PYREX Petri dish CORNING  3160-60
Agarose affymetrix 75817 For making a mount for live imaging
Agarose, low gelling temperature Type VII-A SIGMA-ALDRICH A0701-25G
CaCl2 EMD CX0130-1 For 1/3 Ringer's solution
CaSO4 For egg water
Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1) CORNING 2845-25
Disposable Spatula VWR  80081-188
Foam board ELMER'S 951300 For microscope incubator
Forcept (No 55) FST 11255-20
Glass pipette VWR 14673-043
HEPES SIGMA Life Science H4034 For 1/3 Ringer's solution
INCUKIT XL for Cabinet Incubators INCUBATOR Warehouse.com For microscope incubator
Instant sea salt Instant Ocean 138510 For egg water
KCl SIGMA-ALDRICH P4504 For 1/3 Ringer's solution
Methyl cellulose SIGMA-ALDRICH M0387-100G
NaCl SIGMA-ALDRICH S7653 For 1/3 Ringer's solution
Petri dish Falcon 351029 For making a mount for live imaging
Phenol red SIGMA Life Science P0290
Pipette pump BEL-ART PRODUCTS F37898
Pronase EMD Millipore Corp 53702-250KU
Tricaine-S (MS222) WESTERN CHEMICAL INC NC0135573
Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires Sandra The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cooke, J. Scale of body pattern adjusts to available cell number in amphibian embryos. Nature. 290, 775-778 (1981).
  2. Driesch, H. Entwicklungsmechanische Studien: I. Der Werthe der beiden ersten Furchungszellen in der Echinogdermenentwicklung. Experimentelle Erzeugung von Theil- und Doppelbildungen. Zeitschrift fur wissenschaftliche Zoologie. , (1892).
  3. Morgan, T. H. Half embryos and whole embryos from one of the first two blastomeres. Anatomischer Anzeiger. 10, 623-638 (1895).
  4. Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145, (2018).
  5. Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
  6. Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments. (26), e1217 (2009).
  7. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
  8. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), e1113 (2009).
  9. Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
  10. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of Visualized Experiments. (29), e1394 (2009).
  11. Mizuno, T., Shinya, M., Takeda, H. Cell and tissue transplantation in zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, 15-28 (1999).
  12. Cooke, J. Control of somite number during morphogenesis of a vertebrate, Xenopus laevis. Nature. 254, 196-199 (1975).
  13. Inomata, H., Shibata, T., Haraguchi, T., Sasai, Y. Scaling of dorsal-ventral patterning by embryo size-dependent degradation of Spemann's organizer signals. Cell. 153, 1296-1311 (2013).
  14. Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454, 335-339 (2008).
  15. Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., Francois, P., Aulehla, A. Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding. Nature. 493, 101-105 (2013).
  16. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  17. Almuedo-Castillo, M., et al. Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signalling. Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).
  18. Koos, D. S., Ho, R. K. The nieuwkoid gene characterizes and mediates a Nieuwkoop-center-like activity in the zebrafish. Current Biology. 8, 1199-1206 (1998).
  19. Yamanaka, Y., et al. A novel homeobox gene, dharma, can induce the organizer in a non-cell-autonomous manner. Genes and Development. 12, 2345-2353 (1998).
  20. Jesuthasan, S., Stahle, U. Dynamic microtubules and specification of the zebrafish embryonic axis. Current Biology. 7, 31-42 (1997).
  21. Schier, A. F., Talbot, W. S. The zebrafish organizer. Current Opinion in Genetics and Development. 8, 464-471 (1998).

Tags

विकास जीवविज्ञान मुद्दा १४७ स्केलिंग आकार में कमी zebrafish भ्रूणविज्ञान patterning मजबूती विकास अंगोत्पत्ति
भ्रूणीय पैटर्न स्केलिंग के अध्ययन के लिए Zebrafish के सर्जिकल आकार में कमी
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ishimatsu, K., Cha, A., Collins, Z.… More

Ishimatsu, K., Cha, A., Collins, Z. M., Megason, S. G. Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling. J. Vis. Exp. (147), e59434, doi:10.3791/59434 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter