Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

نمط الزناد الاندفاع التأكسدي والشتلات تسرب النمو تثبيط الاختبارات في تاليانا العربيدوبسي

Published: May 21, 2019 doi: 10.3791/59437
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Queen's University

Summary

تصف هذه الورقة طريقتين لتحديد الاستجابات الدفاعية في أرابيدوبسي ثاليانا بعد التعرض للمناضد المناعية: انفجار الأكسدة العابرة، وتثبيط نمو الشتلات.

Abstract

وقد تطورت النباتات نظام المناعة قوية لإدراك مسببات الأمراض والحماية من المرض. تصف هذه الورقة اختبارين يمكن استخدامهما لقياس قوة التنشيط المناعي في أرابيدوبسي ثاليانا بعد العلاج بجزيئات الإثارة. المقدمة أولاً هي طريقة لالتقاط الاندفاع التأكسدي السريع والديناميكي، والتي يمكن رصدها باستخدام الفحص القائم على الإنارة. الثاني هو طريقة تصف كيفية قياس تثبيط المناعة الناجمة عن نمو الشتلات. هذه البروتوكولات سريعة وموثوق بها، لا تتطلب التدريب المتخصص أو المعدات، وتستخدم على نطاق واسع لفهم الأساس الوراثي للمناعة النباتية.

Introduction

لإدراك وحماية ضد مسببات الأمراض، تطورت النباتات مستقبلات التعرف على نمط الغشاء المرتبطة (PRRs) التي تكشف عن الجزيئات الميكروبية المحفوظة خارج الخلية المعروفة باسم الأنماط الجزيئية المرتبطة بالميكروبات (MAMPs)1. ربط MAMPs إلى PRRs cognate الخاص بهم يبدأ البروتين kinase بوساطة إشارات المناعة مما أدى إلى مقاومة الأمراض واسعة الطيف2. واحدة من الاستجابات الأولى بعد تفعيل PRR هو الفوسفور وتنشيط غشاء البلازما المتكاملة انفجار الجهاز التنفسي OXIDASE التجانس (RBOH) البروتينات التي تحفز إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلي خارج الخلية (ROS)3 , 4.ROS تلعب دورا هاما في إنشاء مقاومة المرض، والعمل على حد سواء كرسل الثانوية لنشر إشارات المناعة وكذلك العوامل المضادة للميكروبات المباشرة5. ووصفت الملاحظة الأولى لانفجار الأكسدة المناعة باستخدام درنات البطاطا من السيرة الذاتية. وقد تم تقييم إنتاج ROS في العديد من الأنواع النباتية باستخدام أقراص ورقة7، والخلايا تعليق الثقافات8، وprotoplasts6. وصف هنا هو طريقة بسيطة لـ "إنتاج روس" الذي يُشغّل بالنمط في أقراص أوراق من أرابيدوبس ثاليانا (أرابيدوبسي).

استجابة لتصور MAMP، والبروتينات RBOH المنشطة تحفز إنتاج الجذور superoxide (O2-)، جذور الهيدروكسيل (•OH)، والأكسجين singlet (1 O2)التي يتم تحويلها إلى بيروكسيد الهيدروجين (H2O 2)في الفضاء خارج الخلية9. H2O2 يمكن قياسها كميا ً بواسطة اللوميلومينسين القائم على الإنارة في وجود البيروكسيداز الفجل عامل المؤكسدة (HRP)10. HRP أكسدة H2O2 توليد أيون هيدروكسيد (OH-) وغاز الأكسجين (O2)التي تتفاعل مع luminol لإنتاج وسيطة غير مستقرة التي تطلق فوتون من الضوء10. ويمكن قياس انبعاث الفوتون كمياً كوحدات ضوئية نسبية (RLUs) باستخدام قارئ لوحة صغيرة أو صور قادرة على الكشف عن الإنارة، التي أصبحت قطعاً قياسية من المعدات في معظم المختبرات الجزيئية. من خلال قياس الضوء الناتج على مدى فترة 40-60 دقيقة، يمكن الكشف عن انفجار الأكسدة عابرة في وقت مبكر 2-5 دقائق بعد العلاج المنتقد، وبلغت ذروتها في 10-20 دقيقة، والعودة إلى مستويات القاعدية بعد ~ 60 دقيقة11. يمكن استخدام الضوء التراكمي المنتج على مدى هذا الوقت بالطبع كمقياس للقوة المناعية المقابلة لتنشيط البروتينات RBOH12. مريح، هذا الاختبار لا يتطلب معدات متخصصة أو إعداد عينة مرهقة.

بلغت ذروتها بعد وقت قصير من الكشف MAMP، ويعتبر انفجار الأكسدةاستجابة المناعة في وقت مبكر، جنبا إلى جنب مع تفعيل MAPK وإنتاج الإيثيلين 5. وتشمل الاستجابات المناعية في وقت لاحق إعادة برمجة النسخ، وإغلاق stomatal، وترسب الكالوز2،5. التعرض لفترات طويلة لMAMPs ينشط باستمرار إشارات المناعة بنشاط مكلفة مما أدى إلى تثبيط نمو النبات، مما يدل على المفاضلة بين التنمية والحصانة13. يستخدم على نطاق واسع تثبيط نمو الشتلات التي تسببها نمط (SGI) لتقييم الناتج المناعي في Arabidopsis وكان جزءا لا يتجزأ من تحديد العديد من المكونات الرئيسية للإشارات المناعية بما في ذلك PRRs14،15 ،16. لذلك، تقدم هذه الورقة بالإضافة إلى ذلك بحثاً عن SGI التي يتم تشغيلها على النمط في أرابيدوبسي،حيث يتم زراعة الشتلات في لوحات متعددة الآبار تحتوي على وسائل إعلام قياسية أو وسائل إعلام مُستكملة بمُرّخ مناعي لمدة 8-12 يومًا ثم تزن باستخدام مقياس تحليلي.

ولبيان كيفية استخدام اختباري ROS وSGI لرصد الإشارات التي يتم التوسط فيها بوساطة PRR، تم اختيار ثلاثة أنماط جينية تمثل نواتج مناعية مختلفة: (1) انضمام نوع عربيدوبسي البري كولومبيا (Col-0)، (2) bak1-5 السلبي المهيمن متحولة فيها متعددة الوظائف PRR المشارك مستقبلات BRASSINOSTEROID غير حساسة 1-المرتبطة KINASE 1 (BAK1) غير وظيفية في إشارات المناعة17،18،و (3) cpk28-1 متحولة متنحية، والتي تفتقر إلى البروتين التنظيمي الذي يعتمد على الكالسيوم KINASE 28 (CPK28) ويعرض الاستجابات المناعية المرتفعة19،20. يتم تقديم الاختبارات ROS وSGI استجابة لepitope الببتيد elf18 المنتجة صناعيا من عامل استطالة البكتيرية تو (EF-Tu)، المعترف بها في Arabidopsis من قبل مستقبلات EF-Tu PRR (EFR)15. ويمكن استخدام هذه البروتوكولات مع المحفزات المناعية الأخرى مثل بروتين الحركة البكتيرية فلانيلين14 أو البروتينات النباتية الذاتية (AtPeps)16، ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن استجابة النبات تختلف اعتمادا على 21. ويمكن استخدام الاختبارات التي أجرتها ROS وSGI معاً من أجل التقييم السريع والكمي للاستجابات المبكرة والمتأخرة التي يتم الاستجابة بوساطة PRR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الكشف عن انفجار ROS في أقراص أوراق أرابيدوبسي بعد استثارة المناعة

  1. نمو المصنع وصيانته.
    1. لمزامنة الإنبات، يتم تقسيم بذور أرابيدوبوبس إلى الدرجة المتوسطة عن طريق تعليق حوالي 50 بذور في 1 مل من أجار معقم بنسبة 0.1% [ث/v] وتخزينها عند درجة حرارة 4 درجة مئوية (بدون ضوء) لمدة 3-4 أيام.
      ملاحظة: تقسيم عنصر تحكم خلفية نوع البرية (على سبيل المثال، Col-0) والأنماط الجينية مع نواتج المناعة العالية والمنخفضة (على سبيل المثال، cpk28-1 وbak1-5 على التوالي) لتكون بمثابة عناصر تحكم داخلية.
    2. زرع البذور على التربة وتنبت في ظل الظروف القياسية قصيرة اليوم (22 درجة مئوية، 10 ساعة ضوء، 150 ملي / م2/ ق كثافة الضوء، والرطوبة النسبية 65-70٪).
    3. بعد حوالي 7 أيام، استخدم ملقط لزرع الشتلات الفردية إلى الأواني الجديدة، مفصولة بما لا يقل عن 4 سم للسماح بتطوير روزيت كامل. زرع 6-12 شتلات لكل نوع جيني والعودة إلى الظروف القياسية لوقت قصير. المياه بانتظام وتخصيب النباتات (1 غرام / لتر من 20-20-20 الأسمدة كل أسبوعين).
  2. جمع أقراص ورقة في لوحات 96 جيدا لاسترداد بين عشية وضحاها.
    1. في 4-5 أسابيع بعد الإنبات (الشكل1A)،استخدم لكمة خزعة حادة 4 مم لإزالة قرص ورقة واحدة لكل مصنع، وتجنب منتصف الوريد والحرص على الحد من الجرح (الشكل1B). ضع أقراص الأوراق في لوحة غير مستخدمة بمقياس الإنارة 96 بئراً تحتوي على 100 درجة مئوية من ddH2O مع الجانب adaxial التي تواجه صعوداً لمنع الجفاف22 (الشكل1C). إذا تم تقييم الإثارة المتعددة، قم بإزالة قرص ورقة واحدة من نفس الورقة لكل علاج.
      ملاحظة: أوراق العينة التي تم توسيعها بشكل كامل، من الثالث إلى الخامس من أعلى الوردة، وتقريبانفس الحجم والعمر للحد من التباين. إذا كان ذلك ممكنا، وقطع أقراص ورقة في النصف باستخدام شفرة الحلاقة قبل الانتعاش بين عشية وضحاها، وهذا يزيد من المساحة السطحية تتعرض للحل الإثارة23.
    2. استرداد بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة لمنع تداخل ROS التي تنتجها الجرح أثناء جمع القرص ورقة. تغطية لوحات مع غطاء لمنع التبخر.
  3. إجراء العلاج المنتقد وقياس إنتاج ROS.
    1. برنامج قارئ لوحة قبل إضافة حل رد الفعل، وهذا سوف يقلل من الوقت بين بدء انفجار ROS والقياسات الأولى المسجلة. استخدام برنامج تجاري مناسب لقارئ اللوحة. في حالتنا (راجع جدول المحتويات)،انقر فوق إعدادات، وحدد خرطوشة LUM96 ونوع القراءة الحركية. انقر فوق الفئة ناحية القراءة واسحب لتحديد مجموعة فرعية من الآبار أو اللوحة بأكملها المراد قراءتها. ضمن علامة التبويب PMT والبصريات، قم بتعيين وقت التكامل إلى 1000 مللي ثانية ضمن علامة التبويب التوقيت، قم بتعيين إجمالي وقت التشغيل إلى 40-60 دقيقة والفاصل الزمني إلى 2 دقيقة.
    2. إزالة الماء من كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات.
      ملاحظة: لا ثقب أقراص ورقة، لأن هذا قد يسبب الإجهاد الجرح ويؤدي إلى المزيد من المخرجات ROS متغير.
    3. إعداد حل رد فعل يحتوي على 100 ميكرومتر لومينول، 10 ميكروغرام / مل HRP، والتركيز المطلوب من الإثارة (على سبيل المثال: elf18 في 1 nM، 10 nM، 100 nM، أو 1000 nM) في ddH2O معقمة باستخدام 10 مل من الحل للوحة واحدة 96 جيدا.
      ملاحظة: حل الببتيدات اللوفيلية في H2O المعقمة في أنابيب منخفضة الربط لجعل مخزون 10 mM، فلاش تجميد في السائل N2،وتخزينها في -80 درجة مئوية. عندما تكون جاهزة للاستخدام، تمييع الأسهم في H2O المعقمة لتوليد مخزون عامل 100 درجة مئوية وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
    4. استخدام ماصة متعددة القنوات لتوزيع 100 ميكرولتر من خليط التفاعل لكل بئر، إضافة إلى الحل لجميع أقراص ورقة من نفس المعاملة في نفس الوقت22. تضمين رد فعل التحكم (لا مُستثير) لكل نمط جيني لتقييم مستويات ROS القاعدية في غياب الإثارة. قياس الانبعاثات الخفيفة على الفور لجميع الأطوال الموجية في الطيف المرئي باستخدام قارئ لوحة صغيرة.
      ملاحظة: إعداد وتطبيق حل رد الفعل تحت ضوء منخفض، كما luminol وHRP هي الكواشف الحساسة للضوء. احتفظ بالكواشف على الجليد أو عند -20 درجة مئوية ما لم تكن في الاستخدام.
    5. قياس انبعاث الضوء مع 1000 مللي ثانية وقت التكامل في فترات 2 دقيقة على مدى فترة 40-60 دقيقة في قارئ لوحة صغيرة من أجل التقاط انفجار الأكسدة الديناميكية (الشكل1D).
      ملاحظة: استخدم وقت تكامل أطول لتحسين حساسية الفحص11، مع التأكد من أن جميع العينات في لوحة 96 بئر يمكن قياسها ضمن فاصل زمني واحد.
  4. تفسير البيانات.
    1. لكل نمط جيني، استخدم تطبيق جدول بيانات لحساب متوسط عدد الفوتون والخطأ القياسي في كل نقطة زمنية، وعرض إنتاج ROS كدالة وقت باستخدام رسم مبعثر.
      Equation 1
      حيث t = كل نقطة زمنية
    2. بدلاً من ذلك، قم بتصنيف الفوتون لكل قرص ورقة وعرض متوسط هذه القيم لكل نمط جيني باستخدام رسم بياني شريطي مع أشرطة خطأ قياسية أو مربع وقطعة خفق.
      Equation 2

2. تسرب النمو تسرب

  1. تعقيم البذور وزرع على لوحات Murashige وSkoog (MS).
    1. إعداد نصف قوة معقمة (0.5x) MS المتوسطة (2.16 غرام / لتر) تحتوي على 0.8٪ أجار [ث / v]. صب وسائل الإعلام في لوحات (90 × 15 ملم) في غطاء محرك السيارة تدفق laminar.
    2. تعقيم ما يقرب من 100 البذور في أنبوب microcentrifuge عن طريق الغسيل مع 1 مل من الإيثانول 70٪ لمدة 2 دقيقة وإزالة عن طريق الطموح. يُضاف 1 مل من التبييض بنسبة 40% والصخور برفق لمدة 17 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة التبييض عن طريق الطموح وغسل ثلاث مرات في 1 مل من الماء المعقم لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدم بروتوكول تعقيم بذور غاز الكلور24.
    3. زرع ما يقرب من 100 بذور لكل النمط الجيني على لوحات أجار MS باستخدام ماصة وختم مع شريط micropore في غطاء محرك السيارة تدفق laminar.
      ملاحظة: تجنب وضع البذور على مقربة من ذلك لأن هذا سيجعل زرع الشتلات صعبة في وقت لاحق.
    4. تصنيف البذور عن طريق وضع لوحات في 4 درجة مئوية (لا ضوء) لمدة 3-4 أيام لمزامنة الإنبات (الشكل2A).
  2. زرع الشتلات في لوحات 48 جيدا تحتوي على الببتيدات المناعية.
    1. بعد التقسيم الطبقي، نقل لوحات إلى الضوء في ظل ظروف قصيرة اليوم (22 درجة مئوية، 10 ساعة ضوء، 150 ملي / م2/ ق كثافة الضوء، و 65-70٪ الرطوبة النسبية) لمدة 3-4 أيام للسماح الإنبات.
    2. في غطاء محرك السيارة تدفق laminar، وإعداد تخفيف الببتيد المنضفي (0 nM، 1 nM، 10 nM، 100 nM، و 1000 nM) في وسائل الإعلام السائلة 0.5x MS المعقمة التي تحتوي على 1٪ السكروز [ث / الخامس]، وذلك باستخدام 25 مل من MS لكل لوحة 48 جيدا. إعداد لوحات عن طريق الأنابيب 500 درجة مئوية من MS السائل المتوسطة أو MS المتوسطة التي تحتوي على الببتيدات في بئر. إذا كان متوفراً، استخدم جهاز تكرار لإعداد اللوحة لتسريع العملية.
      ملاحظة: لكل النمط الجيني، تنمو الشتلات في مرض التصلب العصبي المتعدد دون مُستثير لحساب أي اختلافات متأصلة في نمو الشتلات.
    3. باستخدام ملقط معقمة زرع بعناية شتلة واحدة إلى كل بئر من نفس الحجم والعمر، وضمان عدم وجود ضرر للشتلات أو الكسر إلى الجذر وأن يتم غمر الجذر في وسائل الإعلام. لكل نمط جيني، زرع ما لا يقل عن 6-8 شتلات في كل تخفيف الببتيد (الشكل2B).
      ملاحظة: الشتلات زرع في 4 أيام بعد الإنبات، والجذور القصيرة هي أسهل للتلاعب، والشتلات القديمة قد تسفر عن نتائج أقل الأمثل.
    4. ختم لوحات مع شريط micropore والعودة إلى الضوء في ظل ظروف اليوم القصير القياسية (22 درجة مئوية، 10 ساعة ضوء، 150 م/ م2/ ق كثافة الضوء، والرطوبة النسبية 65-70٪). السماح للشتلات أن تنمو لمدة 8-12 يوما.
  3. تحديد تثبيط النمو في المئة.
    1. إزالة الشتلات بعناية من لوحات 48 جيدا وتجف عن طريق التخميد على منشفة ورقية. وزن الشتلات على مقياس تحليلي وقيم قياسية. إذا كان متوفرًا، استخدم مقياسًا تحليليًا مجهزًا بخرج USB لتسجيل قيم وزن جديدة في جدول بيانات. قبل وزن الشتلات، التقاط صورة لعرض بصريا تثبيط النمو (الشكل2C).
    2. تحديد نسبة تثبيط النمو من الشتلات المعالجة بـ elicitor مقارنة بالشتلات المزروعة في مرض التصلب العصبي المتعدد فقط (الشكل2D)على النحو التالي:
      Equation 3
    3. رسم البيانات باستخدام رسم بياني شريطي مع أشرطة الخطأ القياسية أو استخدام مربع ومؤامرة شعيرات لعرض أفضل التباين بين التجريبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

متحولة cpk28-119،25 وbak1-517،تم استخدام18 النباتات لإظهار النتائج المتوقعة للأنماط الجينية مع استجابات المناعة العالية والمنخفضة، على التوالي، في انفجار الأكسدة وSGI الاختبارات نسبة إلى عنصر تحكم خلفية من النوع البري (Col-0). لتقييم الآثار التي تعتمد على الجرعة، تم استخدام سلسلة تخفيف الببتيد 10 أضعاف (1-1000 nM) من elf18. وكما هو متوقع، فإن خطوط فقدان الوظائف cpk28-1 كان لها ارتفاع تراكمي (الشكل3A)والمتوسط (الشكل3B)وانفجار ROS مقارنة بـ Col-0، في حين أن bak1-5 عرض انخفاض إنتاج ROS بتركيزات تتراوح بين 10 nM و 1000 مليون نسمة (الشكل3). ويمكن تمييز الاختلافات المتوقعة في SGI بين جميع الأنماط الجينية التي نمت في 100 nM و 1000 nM elf18 (الشكل4A)،والتي يمكن أيضا أن يلاحظ بصريا في 1000 nM elf18 العلاج (الشكل4B). سمة من إشارات المناعة العالية، cpk28-1 المسوخ كانت أصغر بشكل ملحوظ من Col-0 عندما نمت في 1000 nM elf18، في حين أظهرت bak1-5 المسوخ تثبيط النمو ضعيفة بالنسبة لCol-0 بسبب تعطيل الكشف MAMP.

Figure 1
الشكل 1 اللامينول القائم على الأكسدة انفجار التأكسد بعد الحث المناعي في أرابيدوبسي. (أ) زراعة النباتات على التربة في ظروف قصيرة لمدة 4-5 أسابيع. (ب) استخدام لكمة خزعة 4 مم لجمع أقراص الأوراق من كل مصنع واسترداد بين عشية وضحاها في ddH2O. (C) إضافة حل رد فعل (100 ميكرومتر لومينول، 10 ميكروغرام / مل HRP، والتركيز المطلوب من المزيل) وقياس انبعاث الضوء أكثر من 40-60 دقيقة، في فترات 2 دقيقة مع وقت التكامل من 1000 مللي ثانية (D) تحديد متوسط عدد الفوتون لكل النمط الجيني بالنسبة إلى Col-0 (يظهر باللون الأخضر)، ومراقبة ROS عالية مثل cpk28-1 (كما هو موضح في الأرجواني)، ومراقبة ROS منخفضة مثل bak1-5 (كما هو موضح في البرتقالي). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 تسرب نمو الشتلات الناجم عن الشتلات في أرابيدوبوبس. (أ) زرع الشتلات على أجار MS وتنمو لمدة 3-4 أيام في ظل ظروف قصيرة اليوم القياسية. (ب) شتلات زرع إلى 48 جيدا لوحات تحتوي على MS المتوسطة أو MS تحتوي على تركيزات مختلفة من elf18. (ج) بعد 8-12 يوما، تقييم بصريا حجم الشتلات ومن ثم قياس الوزن الجديد باستخدام مقياس تحليلي لتحديد تثبيط النمو في المئة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 انفجار الأكسدة التي يسببها elf18 الممثل في ثلاثة أنماط جينية أرابيدوبسي. تم التعامل مع النباتات التي عمرها أربعة أسابيع مع سلسلة تخفيف من elf18 (0 nM 'وهمية'، 1 nM، 10 nM، 100 nM، و 1000 nM). يمثل Col-0 عنصر التحكم في الخلفية من النوع البري، حيث يمثل cpk28-1 وbak1-5 الأنماط الظاهرية لـ ROS العالية والمنخفضة، على التوالي. (أ) مجموع عدد الفوتونات الممثلة كوحداتضوئية نسبية بعد معالجة elf18 (n =6 أقراص أوراق من نباتات مستقلة). يتم تمثيل الاختلافات الإحصائية بأحرف صغيرة وتم حسابها باستخدام ANOVA في اتجاه واحد مع اختبارالفرق الكبير الصادق الذي أجراه توكى (p <0.05). (ب) متوسط عدد الفوتونات، ممثلة كوحدات ضوئية نسبية،أكثر من 40 دقيقة بعد العلاج elf18 (ن = 6 أقراص ورقة من النباتات المستقلة). تمثل أشرطة الخطأ خطأ قياسي للمتوسط. وتم الحصول على نتائج مماثلة في تجربتين من ثلاث تجارب. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4 ممثل elf18 الناجمة عن تثبيط نمو الشتلات في ثلاثة الأنماط الجينية العربي. نمت من النوع البري (Col-0) وcpk28-1 وbak1-5 الشتلات في سلسلة تخفيف 10 أضعاف (0-1000 nM) من elf18. (أ) تم حساب تثبيط النمو في المائة عن طريق مقارنة وزن الشتلات الفردية المزروعة في elf18 (n= 6 الشتلات الفردية) إلى متوسط وزن الشتلات من نفس النمط الجيني المزروع في مرض التصلب المتعدد فقط ('mock') (ن = 6 شتلات فردية) على مدى فترة 10 أيام. يتم تمثيل الاختلافات الإحصائية بأحرف صغيرة وتم حسابها باستخدام ANOVA في اتجاه واحد مع اختبارالاختلافات الهامة الصادقة لـ Tukey (p <0.05). (ب) مظاهرة مرئية من SGI في اثنين من الشتلات التمثيلية من Col-0، cpk28-1، وbak1-5 ردا على زيادة تركيزات elf18. وتم الحصول على نتائج مماثلة في ثلاث من أربع تجارب. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تصف هذه الورقة طريقتين لـ "الاستجابات المناعية التي يتم تشغيلها بالنمط" في "أرابيدوبسي"،وتقدم نُهجاً كمية لتقييم الناتج المناعي دون استخدام معدات متخصصة. في تركيبة، يمكن استخدام ROS وSGI التي يتم تشغيلها نمط لتقييم الاستجابات المبكرة والمتأخرة لتصور الميكروبات، على التوالي.

الحد الرئيسي من التأكسد انفجار التبيّر هو التغير. لأسباب غير مفهومة تماماً، غالباً ما تختلف RLUs المطلقة بترتيب الحجم بين التجارب. ولأن التباين بين التجارب مرتفع، فمن المستحسن أن تشمل ضوابط مرجعية داخلية ذات مستويات عالية (علىسبيل المثال، cpk28-1)ومنخفضة (علىسبيل المثال، bak1-5)رشقات نارية تأكسدية بالإضافة إلى تحكم من النوع البري (علىسبيل المثال، Col-0). ومع ذلك، يمكن اتخاذ تدابير لزيادة قابلية التكرار بين التجارب. يجب أن تكون الظروف البيئية مثل درجة الحرارة والرطوبة والفترة الضوئية وكثافة الضوء متطابقة بين التكرارات. وينبغي أيضا مراعاة عمر النباتات وصحتها عند أخذ العينات. يمكن جمع أقراص ورقة من النباتات التي تتراوح أعمارهم بين 4 و 7 أسابيع نمت في ظل ظروف قصيرة اليوم (6-10 ساعات من الضوء). الحكايات، تم العثور على النتائج الأكثر اتساقا مع النباتات أقدم من 6 أسابيع بعد الإنبات ولكن ليس بعد المزهرة أو senescing. من المهم زراعة النباتات في غرف بيئية نظيفة بحيث لا تتعرض لآفات البيت الزجاجي الشائعة مثل العفن البودرة أو مضغ الحشرات. وبما أن الشتلات لـ SGI تزرع في وسائط التصلب المتعدد العقيمة، ولفترة أقصر، فإن التقلبات البيئية ليست مصدر قلق إلى حد كبير. ومع ذلك، يمكن أن يحدث التباين إذا تضررت الشتلات أثناء الزراعة، أو إذا كانت الشتلات المختارة للعلاجات المنضوية مختلفة الأحجام، أو إذا أصبحت وسائل الإعلام النمو ملوثة. من المستحسن إدراج الأنماط الجينية للتحكم في المراجع الداخلية الموضحة أعلاه في تجارب SGI أيضاً.

تركيز الإثارة هو اعتبار مهم آخر عند إجراء الاختبارات المناعية. وينظر إلى المنكب من قبل PRRs مما أدى إلى انفجار ROS سريعة وقوية بلغت ذروتها 10-20 دقيقة بعد العلاج المنتقد (الشكل2B). ومع ذلك، فإن حجم الانفجار يعتمد على كل من المندفع وكذلك النمط الجيني للنبات. ولذلك، يوصى بسلسلة من الجرعات، على النحو الوارد في الشكل 3 والشكل 4،من أجل تحديد تركيز مناسب للاستثارة. يمكن أيضا أن يكون نمط أثار ROS اختبار عن طريق تلقيح أقراص ورقة مع الميكروبات الحية23،26 أو مقتطفات الميكروبية26،27،28. على سبيل المثال، يمكن الكشف عن رشقات نارية ROS عابرة وتعتمد على الجرعة في أرابيدوبسي استجابة لpathovars الشرسة من Pseudomonas syringae،وبلغت ذروتها في 35-40 دقيقة وتصل إلى مستويات القاعدية حوالي 70 دقيقة بعد استثارة 23 , 29.ردا على البكتيريا الآفية29 أو الممرض الفطري P. الموبوءة30،31،يتم إنتاج ثاني تراكم أكثر وضوحا من ROS التي يمكن رصدها 6-10 ساعات بعد تلقيح. لأشد، مثل الكيتين الفطري32 أو الشيتوسان33، يمكن استخدام مؤشرات الإنارة أكثر حساسية ، مثل مشتق ة لومينول L-012 ، ومع ذلك ، فإن إشارة الخلفية المنتجة غالبا ً ما تكون أعلى32، 34.الأهم من ذلك، فإن النمط الإيكولوجي للمصنع سوف تملي أيضا استجابتها لمحدد المناقّم35،36. على سبيل المثال، في حين أن فلاجيلين البكتيرية قادرة على الحصول على استجابات مناعية في العديد من الأنماط الإيكولوجية أرابيدوبسيس بما في ذلك كول-0، فإن النمط الإيكولوجي Wassilewskija (Ws-0) يعبر عن متغير غير وظيفي من PRR FLAGELLIN-الاستشعار 2 (FLS2) وهو لذلك غير حساسة لflagellin14،37.

ويمكن أيضا أن يلاحظ ROS المناعة الناجمة في أقراص ورقة من النباتات dicotyledonous الأخرى بما في ذلك براسيكا نابوس38، الطماطم39، نيكوتيانا بنتاماريانا22،40،41، و العديد من الأنواع سولاناسيوسالأخرى 41. وقد وضعت إضافية على أساس luminol ROS الكشف عن الاختبارات للنباتات باستخداممقتطفات الأنسجة10،وزراعة تعليق الخلية 8،42،وprotoplasts43،ومفيدة بشكل خاص في النظم حيث بروتوكولات القرص ورقة ليست فعالة42. على سبيل المثال، تم وصف رشقات نارية ROS الناجمة عن الإثارة باستخدام ثقافات تعليق الخلايا في الأرز42،44 والقمح45،46،فضلا عن الجمنازيوم أروكاريا أنغستفوليا 47 والطحلب فيسكومتريلا patens48. لم يتم استخدام SGI على نطاق واسع لقياس الإشارات المناعية. ومع ذلك، فقد ثبت تثبيط النمو استجابة للإثارة في N. benthamiana41 و B. napus38،49. وقد ثبت أيضا تثبيط النمو السريع في P. patens استجابة للكيتين الفطرية التي تحدث في غضون 2 دقيقة من التعرض، والتي يمكن ملاحظتها باستخدام التصوير الفاصل الزمني48.

مع التعديل، يمكن استخدام كل من SGI والاختبارات انفجار الأكسدة لشاشات عالية الإنتاجية لتحديد المنظمين المناعية. على سبيل المثال، يمكن زراعة السكان المتحولين من أرابيدوبسي على MS المتوسطة وغمرت مع المنافيين لتحديد المتحولين غير حساسة15،50،51،52،53. بدلا من ذلك، يمكن تقييم السكان المتحولين لROS التي أثارها المحفز، والتي تم تنفيذها بنجاح مع كل من الأقراص الورقية54 والشتلات كلها نمت على لوحات MS19. طريقة فحص مفيدة أخرى هي التعبير العابر للبروتينات في N. benthamiana لتحليل ROS قبل تطوير خطوط التعبير المفرط المعدلة وراثيا22،40،55. ومع ذلك، فإن التباين داخل التجريبية أعلى مما هو عليه في خطوط أرابيدوبسي مستقرة بسبب التعبير عن البروتين التفاضلي في N. benthamiana يترك22،على الرغم من أن هذا يمكن تخفيفه جزئيا عن طريق التسلل المرجعية الضوابط على نفس ورقة العينات التجريبية.

وباختصار، فإن الاندفاع التأكسدي الناجم عن المناعة والاختبارات SGI هي طرق سريعة وموثوق بها لتقييم الإشارات التي يتم التخلص منها بوساطة PRR في أرابيدوبوبس. ويمكن توسيع نطاق هذه الأساليب لتشمل أنظمة أخرى واستخدامها في الشاشات الواسعة النطاق للكشف عن منظمي المناعة الجديدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

اي.

Acknowledgments

يتم تمويل العمل في مختبرنا من خلال برنامج اكتشاف مجلس الموارد الطبيعية والبحوث الهندسية الكندية (NSERC)، والصندوق الكندي للابتكار جون ر. إيفانز زعيم، وجامعة الملكة. يتم دعم KS وIS من خلال منح دراسية للخريجين في أونتاريو جنبا إلى جنب والمنح الدراسية للخريجين في كندا NSERC لطلاب الماجستير (CGS-M).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20-20-20 Fertilizer Plant Prod 10529 Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth.
4 mm Biopsy Punch Medical Mart 232-33-34-P A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used.
48-Well Sterile Plates with Lid Sigma-Aldrich CLS3548
Analytical Scale with Draft Sheid VWR VWR-225AC Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal.
BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL) Sartorius 725240 Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary.
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) EZ Biolab cp7211 Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C.
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Horseradish Peroxidase Sigma-Aldrich P6782 Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light.
Luminol Sigma-Aldrich A8511 Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light.
Murisage and Skoog Basal Salts Cedarlane Labs MSP09-100LT Store at 4C.
Soil SunGrow Horticulture Sunshine Mix #1 Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots.
SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module Molecular Devices Must request a quote Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays.
Sucrose Sigma-Aldrich S0389-1KG Store at room temperature.
White Polystyrene 96-Well Plates Fisher Scientific 07-200-589

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Couto, D. E., Zipfel, C. Regulation of pattern recognition receptor signalling in plants. Nature Reviews Immunology. 16, 537-552 (2016).
  2. Boller, T., Felix, G. A Renaissance of Elicitors: Perception of Microbe-Associated Molecular Patterns and Danger Signals by Pattern-Recognition Receptors. Annual Review of Plant Biology. 60, 379-406 (2009).
  3. Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. A burst of plant NADPH oxidases. Trends in Plant Science. 56 (8), 1472-1480 (2012).
  4. Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. Regulation of the NADPH Oxidase RBOHD during Plant Immunity. Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).
  5. Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition. Annual Review of Phytopathology. 55, 109-137 (2017).
  6. Doke, N. Involvement of superoxide anion generation in the hypersensitive response of potato tuber tissues to infection with an incompatible race of Phytophthora infestans and to the hyphal wall components. Physiological Plant Pathology. 23 (3), 345-357 (1983).
  7. Bindschedler, L. V., et al. Peroxidase-dependent apoplastic oxidative burst in Arabidopsis required for pathogen resistance. The Plant Journal. 47 (6), 851-863 (2006).
  8. Keppler, L. D. Active Oxygen Production During a Bacteria-Induced Hypersensitive Reaction in Tobacco Suspension Cells. Phytopathology. 110 (3), 759-763 (1989).
  9. Wrzaczek, M., Brosché, M., Kangasjärvi, J. ROS signaling loops - production, perception, regulation. Current Opinion in Plant Biology. 16 (5), 575-582 (2013).
  10. Warm, E., Laties, G. G. Quantification of hydrogen peroxide in plant extracts by the chemiluminescence reaction with luminol. Phytochemistry. 21 (4), 827-831 (1982).
  11. Trujillo, M. Analysis of the lmmunity-Related Oxidative Bursts by a Luminol-Based Assay. Methods in Molecular Biology. 1398, 323-329 (2016).
  12. Nühse, T. S., Bottrill, A. R., Jones, A. M. E., Peck, S. C. Quantitative phosphoproteomic analysis of plasma membrane proteins reveals regulatory mechanisms of plant innate immune responses. The Plant Journal. 51 (5), 931-940 (2007).
  13. Belkhadir, Y., Yang, L., Hetzel, J., Dangl, J. L., Chory, J. The growth-defense pivot: Crisis management in plants mediated by LRR-RK surface receptors. Trends in Biochemical Sciences. 39 (10), 447-456 (2014).
  14. Gómez-Gómez, L., Felix, G., Boller, T. A single locus determines sensitivity to bacterial flagellin in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 18 (3), 277-284 (1999).
  15. Zipfel, C., et al. Perception of the Bacterial PAMP EF-Tu by the Receptor EFR Restricts Agrobacterium-Mediated Transformation. Cell. 125 (4), 749-760 (2006).
  16. Krol, E., et al. Perception of the Arabidopsis danger signal peptide 1 involves the pattern recognition receptor AtPEPR1 and its close homologue AtPEPR2. Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 13471-13479 (2010).
  17. Schwessinger, B., et al. Phosphorylation-dependent differential regulation of plant growth, cell death, and innate immunity by the regulatory receptor-like kinase BAK1. PLoS Genetics. 7 (4), e1002046 (2011).
  18. Roux, M., et al. The Arabidopsis Leucine-Rich Repeat Receptor-Like Kinases BAK1/SERK3 and BKK1/SERK4 Are Required for Innate Immunity to Hemibiotrophic and Biotrophic Pathogens. The Plant Cell. 23 (6), 2440-2455 (2011).
  19. Monaghan, J., et al. The calcium-dependent protein kinase CPK28 buffers plant immunity and regulates BIK1 turnover. Cell Host and Microbe. 16 (5), 605-615 (2014).
  20. Wang, J., et al. A Regulatory Module Controlling Homeostasis of a Plant Immune Kinase. Molecular Cell. 69 (3), 493-504 (2018).
  21. Mott, G. A., et al. Genomic screens identify a new phytobacterial microbe-associated molecular pattern and the cognate Arabidopsis receptor-like kinase that mediates its immune elicitation. Genome Biology. 17, 98 (2016).
  22. Sang, Y., Macho, A. P. Analysis of PAMP-Triggered ROS Burst in Plant Immunity. Methods in Molecular Biology. 1578, 143-153 (2017).
  23. Smith, J. M., Heese, A. Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae. Plant Methods. 10 (1), 6 (2014).
  24. Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds. Journal of Visualized Experiments. 128, (2017).
  25. Matschi, S., Werner, S., Schulze, W. X., Legen, J., Hilger, H. H., Romeis, T. Function of calcium-dependent protein kinase CPK28 of Arabidopsis thaliana in plant stem elongation and vascular development. The Plant Journal. 73 (6), 883-896 (2013).
  26. Felix, G., Duran, J. D., Volko, S., Boller, T. Plants have a sensitive perception system for the most conserved domain of bacterial flagellin. The Plant Journal. 18 (3), 265-276 (2002).
  27. Kunze, G., Zipfel, C., Robatzek, S., Niehaus, K., Boller, T., Felix, G. The N Terminus of Bacterial Elongation Factor Tu Elicits Innate Immunity in Arabidopsis Plants. The Plant Cell. 16 (12), 3496-3507 (2004).
  28. Zipfel, C., et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Nature. 428 (6984), 764-767 (2004).
  29. Mur, L. A. J., Kenton, P., Draper, J. In planta measurements of oxidative bursts elicited by avirulent and virulent bacterial pathogens suggests that H2O2 is insufficient to elicit cell death in tobacco. Plant, Cell and Environment. 28 (4), 548-561 (2005).
  30. Kobayashi, M., et al. Calcium-dependent protein kinases regulate the production of reactive oxygen species by potato NADPH oxidase. The Plant Cell. 19 (3), 1065-1080 (2007).
  31. Yoshioka, H., et al. Induction of Plant gp91 phox Homolog by Fungal Cell Wall, Arachidonic Acid, and Salicylic Acid in Potato. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (6), 725-736 (2001).
  32. Klauser, D., Flury, P., Boller, T., Bartels, S. Several MAMPs, including chitin fragments, enhance AtPep-triggered oxidative burst independently of wounding. Plant Signaling and Behavior. 8 (9), e25346 (2013).
  33. El Gueddari, N. E., Rauchhaus, U., Moerschbacher, B. M., Deising, H. B. Developmentally regulated conversion of surface-exposed chitin to chitosan in cell walls of plant pathogenic fungi. New Phytologist. 156 (1), 103-112 (2002).
  34. Daiber, A., et al. Detection of superoxide and peroxynitrite in model systems and mitochondria by the luminol analogue L-012. Free Radical Research. 38 (3), 259-269 (2004).
  35. Bauer, Z., Gómez-Gómez, L., Boller, T., Felix, G. Sensitivity of Different Ecotypes and Mutants of Arabidopsis thaliana toward the Bacterial Elicitor Flagellin Correlates with the Presence of Receptor-binding Sites. Journal of Biological Chemistry. 276 (49), 45669-45676 (2001).
  36. Vetter, M. M., et al. Flagellin perception varies quantitatively in arabidopsis thaliana and its relatives. Molecular Biology and Evolution. 29 (6), 1655-1667 (2012).
  37. Chinchilla, D. The Arabidopsis Receptor Kinase FLS2 Binds flg22 and Determines the Specificity of Flagellin Perception. The Plant Cell. 18 (2), 465-476 (2006).
  38. Lloyd, S. R., Schoonbeek, H., Trick, M., Zipfel, C., Ridout, C. J. Methods to Study PAMP-Triggered Immunity in Brassica Species. Molecular Plant-Microbe Interactions. 27 (3), 286-295 (2014).
  39. Clarke, C., Vinatzer, B. Characterizing the Immune-Eliciting Activity of Putative Microbe-Associated Molecular Patterns in Tomato. Methods in Molecular Biology. 1578, 249-261 (2017).
  40. Gimenez-Ibanez, S., Hann, D. R., Chang, J. H., Segonzac, C., Boller, T., Rathjen, J. P. Differential Suppression of Nicotiana benthamiana Innate Immune Responses by Transiently Expressed Pseudomonas syringae Type III Effectors. Frontiers in Plant Science. 9, 688 (2018).
  41. Wei, Y., et al. The Ralstonia solanacearum csp22 peptide, but not flagellin-derived peptides, is perceived by plants from the Solanaceae family. Plant Biotechnology Journal. 16 (7), 1349-1362 (2018).
  42. Melcher, R. L. J., Moerschbacher, B. M. An improved microtiter plate assay to monitor the oxidative burst in monocot and dicot plant cell suspension cultures. Plant Methods. 12, 5 (2016).
  43. Perraki, A., et al. Phosphocode-dependent functional dichotomy of a common co-receptor in plant signalling. Nature. 561 (7722), 248-252 (2018).
  44. Yamaguchi, K., Kawasaki, T. Chitin-Triggered MAPK Activation and ROS Generation in Rice Suspension-Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 1578, 309-316 (2017).
  45. Ortmann, I., Conrath, U., Moerschbacher, B. M. Exopolysaccharides of Pantoea agglomerans have different priming and eliciting activities in suspension-cultured cells of monocots and dicots. FEBS Letters. 580 (18), 4491-4494 (2006).
  46. Ortmann, I., Sumowski, G., Bauknecht, H., Moerschbacher, B. M. Establishment of a reliable protocol for the quantification of an oxidative burst in suspension-cultured wheat cells upon elicitation. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (5), 227-232 (2004).
  47. Dos Santos, A. L. W., El Gueddari, N. E., Trombotto, S., Moerschbacher, B. M. Partially acetylated chitosan oligo- and polymers induce an oxidative burst in suspension cultured cells of the gymnosperm Araucaria angustifolia. Biomacromolecules. 9 (12), 3411-3415 (2008).
  48. Bressendorff, S., Rasmussen, M., Petersen, M., Mundy, J. Chitin-Induced Responses in the Moss Physcomitrella patens. Methods in Molecular Biology. , 317-324 (2017).
  49. Lloyd, S. R., Ridout, C. J., Schoonbeek, H. Methods to Quantify PAMP-Triggered Oxidative Burst, MAP Kinase Phosphorylation, Gene Expression, and Lignification in Brassicas. Methods in Molecular Biology. 1578, 325-335 (2017).
  50. Gómez-Gómez, L., Boller, T. FLS2: An LRR Receptor-like Kinase involved in the perception of the bacterial elicitor flagellin in Arabidopsis. Molecular Cell. 5 (6), 1003-1011 (2000).
  51. Li, J., et al. Specific ER quality control components required for biogenesis of the plant innate immune receptor EFR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15973-15978 (2009).
  52. Lu, X., et al. Uncoupling of sustained MAMP receptor signaling from early outputs in an Arabidopsis endoplasmic reticulum glucosidase II allele. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (52), 22522-22527 (2009).
  53. Nekrasov, V., et al. Control of the pattern-recognition receptor EFR by an ER protein complex in plant immunity. EMBO Journal. 28 (21), 3428-3438 (2009).
  54. Boutrot, F., et al. Direct transcriptional control of the Arabidopsis immune receptor FLS2 by the ethylene-dependent transcription factors EIN3 and EIL1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (32), 14502-14507 (2010).
  55. Kadota, Y., et al. Direct Regulation of the NADPH Oxidase RBOHD by the PRR-Associated Kinase BIK1 during Plant Immunity. Molecular Cell. 54 (1), 43-55 (2014).

Tags

التراجع العدد 147 مناعة النبات النمط الجزيئي المرتبط بالميكروبات مستقبلات التعرف على النمط أنواع الأكسجين التفاعلية تثبيط نمو الشتلات أرابيدوبسي ثاليانا
نمط الزناد الاندفاع التأكسدي والشتلات تسرب النمو تثبيط الاختبارات في <em>تاليانا العربيدوبسي</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bredow, M., Sementchoukova, I.,… More

Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., Monaghan, J. Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (147), e59437, doi:10.3791/59437 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter