Summary
本文介绍了两种在暴露于免疫诱导剂后量化阿拉伯拟南芥的防御反应的方法:瞬时氧化性爆裂和对幼苗生长的抑制。
Abstract
植物已经进化出一个强大的免疫系统来感知病原体和防止疾病。本文介绍了两种检测,可用于测量在利用诱导分子治疗后,在阿拉伯拟南芥中免疫活化的强度。首先提出一种捕获快速诱导和动态氧化爆发的方法,可以使用基于发光醇的测定进行监测。第二种方法是描述如何测量免疫诱导的对幼苗生长的抑制。这些协议快速可靠,不需要专门的培训或设备,并广泛用于了解植物免疫的遗传基础。
Introduction
为了感知和防御病原体,植物已经进化出膜结合模式识别受体(PRRs),用于检测细胞外的保存微生物分子,称为微生物相关分子模式(MAMPs)1。MAMP与其共性PR的结合启动蛋白激酶介导的免疫信号,导致广谱抗病2。PRR激活后最早的反应之一是整体血浆膜的磷化和活化,这种蛋白质可催化细胞外活性氧物种(ROS)3的产生。,4.ROS在建立抗病性方面起着重要作用,既充当二次信使传播免疫信号,又直接传播抗菌剂5。首次观察到免疫诱导氧化性爆裂被描述使用马铃薯块茎cv.Rishiri后,植物磷酸菌接种6。ROS生产已评估在几个植物物种使用叶盘7,细胞悬浮培养8,和前顶器6。这里描述的是一个简单的方法,用于在阿拉伯拉多普西斯(阿拉伯)的叶盘中对模式触发的ROS进行化法。
作为对MAMP感知的一种反应,活性RBOH蛋白催化超氧化物基(O2-),羟基基(+OH)和单氧(1 O 2)的产生,这些基液被转化为过氧化氢(H2O)2)在细胞外空间9。H2O2可在氧化剂马萝卜过氧化物酶 (HRP)10的情况下通过基于发光的化学致发光进行量化。HRP氧化H2 O2产生氢氧化电(OH+)和氧气(O2),与发光醇发生反应,产生不稳定的中间体,释放出光10的光子。光子发射可以使用能够检测发光的微板读取器或成像器量化为相对光单位 (RLU),这些发光已成为大多数分子实验室的标准设备。通过测量在40-60分钟间隔内产生的光,在引出器处理后2-5分钟可以检测到瞬时氧化爆裂,在10-20分钟达到峰值,在+60分钟11后恢复到基础水平。这段时间内产生的累积光可用作与RBOH蛋白12激活对应的免疫强度的测量。方便的是,这种检测不需要专门的设备或繁琐的样品制备。
在MAMP检测后不久达到峰值,氧化性爆裂被认为是早期免疫反应,以及MAPK激活和乙烯生产5。后来的免疫反应包括转录重编程、口腔闭合和钙素沉积2,5。长期接触MAMP持续激活高能量昂贵的免疫信号,导致植物生长的抑制,表明在发育和免疫13之间的权衡。模式触发的幼苗生长抑制(SGI)被广泛用于评估阿拉伯的免疫输出,并且对于识别免疫信号的几个关键成分,包括PRRs 14,15 ,16.因此,本文还提出了在阿拉伯兰多普西的模式触发SGI的测定,即幼苗生长在含有标准介质或介质的多孔板中,并辅以免疫诱导器8-12天,然后称重使用分析量表。
为了演示如何使用ROS和SGI检测来监测PRR介导的信号,选择了三种基因型,表示不同的免疫输出:(1)野生型阿拉伯拟南芥加入哥伦比亚(Col-0),(2)占主导地位的负bak1-5 突变体,其中多功能PRR共受体BRASINSININININININININ1-ASSOCIATED KINASE 1(BAK1)在免疫信号17、18和(3)隐性cpk28-1突变体中不起作用,缺乏调节蛋白钙-依赖蛋白KINASE 28 (CPK28) 和显示增强的免疫触发反应19,20。ROS和SGI检测是针对细菌伸长因子Tu(EF-Tu)的合成生产的精灵18肽表位提出的,该表在阿拉伯兰多普西被PRR EF-Tu RECEPTOR(EFR)15所识别。这些协议可用于其他免疫诱导剂,如细菌活性蛋白鞭孢蛋白14或内源植物诱导蛋白(AtPeps)16,然而,应该注意,植物反应能力因引出者21。ROS 和 SGI 测定可用于快速定量评估早期和晚期 PRR 介导反应。
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Protocol
1. 免疫诱导后在阿拉伯拉多普西叶盘中检测ROS爆裂
- 工厂生长和维护。
- 为了同步发芽,分层阿拉伯种子,将大约50个种子悬浮在1mL无菌0.1%琼脂[w/v]中,并在4°C(无光)下储存3-4天。
注: 分层野生类型背景控制(例如,Col-0)和具有高和低免疫输出的基因型(例如,cpk28-1和bak1-5)作为内部控制。 - 在土壤中播种,在标准短日条件下(22 °C、10 小时光、150 mE/m2/s 光强度和 65-70% 相对湿度)发芽。
- 大约7天后,使用钳子将个别幼苗移植到新盆中,分离至少4厘米,以允许完全长花。按基因型移植6-12株幼苗,并恢复到标准的短日条件。定期给植物浇水和施肥(每2周1克/升20-20-20肥料)。
- 为了同步发芽,分层阿拉伯种子,将大约50个种子悬浮在1mL无菌0.1%琼脂[w/v]中,并在4°C(无光)下储存3-4天。
- 在 96 孔板中收集叶盘,以便进行过夜恢复。
- 在发芽后4-5周(图1A),使用锋利的4毫米活检冲头去除每株植物一个叶盘,避免中静脉,并小心限制伤人(图1B)。将叶盘放在未使用的 96 孔灯具板中,板内含有 100 μL ddH2O,并且轴向朝上,以防止干燥22(图 1C)。如果评估多个引子,从同一叶中取出1个叶盘,用于每次引子处理。
注:完全展开的样品叶,从玫瑰花饰顶部的第三至第五,以及大致相同的大小和年龄,以限制可变性。如果可能的话,在通宵恢复之前,用剃刀刀片将叶盘切成两半,因为这增加了暴露于诱导器溶液23的表面面积。 - 在室温下恢复过夜,以防止在叶盘收集过程中受伤产生的 ROS 干扰。盖上盖子,防止蒸发。
- 在发芽后4-5周(图1A),使用锋利的4毫米活检冲头去除每株植物一个叶盘,避免中静脉,并小心限制伤人(图1B)。将叶盘放在未使用的 96 孔灯具板中,板内含有 100 μL ddH2O,并且轴向朝上,以防止干燥22(图 1C)。如果评估多个引子,从同一叶中取出1个叶盘,用于每次引子处理。
- 执行引子处理并测量 ROS 生产。
- 在添加反应溶液之前对板片读取器进行编程,因为这将缩短 ROS 突发启动和记录的第一次测量之间的时间。使用适合板式读取器的商业软件。在我们的案例中(请参阅目录),单击"设置",然后选择LUM96墨盒和动态读取类型。单击"读取区域"类别并拖动以选择要读取的孔的子集或整个板。在PMT 和光学选项卡下,将集成时间设置为 1,000 ms。
- 使用多通道移液器从每口井中去除水。
注:请勿刺穿叶盘,因为这可能导致伤人应力,并导致更多可变 ROS 输出。 - 在无菌 ddH 2 O 中制备含有 100 μM luminol、10 μg/mL HRP 和所需引方浓度(例如:在 1 nM、10 nM、100 nM 或 1,000 nM) 中的无用 ddH2O 中使用 10 mL 溶液进行反应溶液。
注:将冻干肽溶解在低结合管中的无菌H2 O中,以制造10 mM库存,在液体N2中闪冻,并储存在-80°C。准备使用时,稀释无菌 H2O 中的库存,生成 100 μM 工作库存,并储存在 -20°C。 - 使用多通道移液器将100μL的反应混合物分到每口井中,同时将溶液添加到相同处理的所有叶盘22。包括每个基因型的控制反应(无诱导器),以评估在没有引因的情况下的基础ROS水平。使用微板读卡器立即测量可见光谱中所有波长的光发射。
注:在低光下制备和应用反应溶液,因为灯具和HRP是光敏试剂。除非使用,否则将试剂放在冰上或-20°C。 - 在微板读取器中,以 2 分钟间隔以 2 分钟间隔测量 1,000 ms 的光发射,以便捕获动态氧化爆裂(图 1D)。
注:使用更长的集成时间提高测定灵敏度11,同时确保96孔板中的所有样品都能在一个间隔内测量。
- 数据解释。
- 对于每种基因型,使用电子表格应用程序计算每个时间点的平均光子计数和标准误差,并使用散点图将 ROS 生产显示为时间函数。
地点 t = 每个时间点 - 或者,使用带有标准误差条或框和胡须图的条形图,对每个叶盘的光子计数求和,并显示每个基因型的平均值。
- 对于每种基因型,使用电子表格应用程序计算每个时间点的平均光子计数和标准误差,并使用散点图将 ROS 生产显示为时间函数。
2. 幼苗生长抑制测定
- 消毒种子,在村上和Skoog(MS)盘子上播种。
- 制备含有0.8%琼脂的无菌半强度(0.5倍)MS介质(2.16 g/L)。*将介质倒入层流罩中的板(90 x 15 mm)。
- 用1mL的70%乙醇洗涤2分钟,然后吸入,在微离心管中消毒约100个种子。加入1 mL的40%漂白剂,在室温下轻轻摇动17分钟。吸入时去除漂白剂,在1mL无菌水中洗涤3次,5分钟,在1mL无菌0.1%琼脂中重新悬浮。
注:或者,使用氯气种子灭菌协议24。 - 使用移液器在 MS 琼脂板上播种每个基因型约 100 个种子,并在层流罩中用微孔胶带密封。
注意:避免将种子放在靠近的地方,因为这将使移植幼苗以后变得困难。 - 将板置于4°C(无光)3-4天,以同步发芽(图2A)。
- 将幼苗移植到含有免疫诱导肽的48孔板中。
- 分层后,在短日条件下(22 °C、10 小时光、150 mE/m2/s 光强度和 65-70% 相对湿度)将板移到光下 3-4 天,以便发芽。
- 在层状流罩中,在含有1%蔗糖[w/v]的无菌0.5x MS液体介质中制备诱导肽稀释剂(0 nM、1 nM、10 nM、100 nM 和 1,000 nM),每个 48 孔板使用 25 mL 的 MS。通过每孔移液500μL的MS液体介质或含有肽的MS培养基来制备板。如果可用,请使用重复移液器进行板准备以加快该过程。
注:对于每种基因型,在MS中生长幼苗时,无需诱导,即可解释幼苗生长的任何固有差异。 - 使用无菌钳子小心地将一个幼苗移植到每个相同大小和年龄的井中,确保没有对幼苗造成损害或根部断裂,并且根部浸入介质中。对于每个基因型,将至少6-8个幼苗移植到每个肽稀释中(图2B)。
注:在发芽后4天移植幼苗,因为短根更容易操作,而较老的幼苗可能产生不太理想的结果。 - 密封板与微孔胶带,并在标准短日条件下(22 °C,10 小时光,150 mE/m2/s 光强度和 65-70% 相对湿度)移回光。让幼苗生长8-12天。
- 确定增长抑制百分比。
- 小心地从48孔板中取出幼苗,用纸巾擦干。在分析尺度上称重幼苗并记录值。如果可用,请使用配备 USB 输出的分析刻度在电子表格上记录新的权重值。在称量幼苗之前,拍摄照片以直观地显示生长抑制(图2C)。
- 确定经诱导处理的幼苗的生长抑制百分比,与仅 MS 中生长的幼苗相比(图 2D),如下所示:
- 使用带有标准误差条的条形图或使用框和胡须图绘制数据,以便更好地显示实验间方差。
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Representative Results
突变cpk28-119,25和bak1-517,18种植物分别用于证明在氧化性爆裂和SGI中具有高和低免疫反应的基因型的预期结果相对于野生型背景控制 (Col-0) 的测定。为了评估剂量依赖效应,使用了10倍肽稀释系列(1-1,1000 nM)的elf18。正如预期的那样,cpk28-1功能损耗线具有更高的累积(图3A)和平均 (图 3B) ROS 突发比 Col-0,而bak1-5显示在浓度在 10 nM 和1,000 nM (图 3)。在 SGI 中,在 100 nM 和 1,000 nM elf18(图 4A)中生长的所有基因型之间可以识别预期的差异,在 1,000 nM elf18 治疗中也可以目视观察到这些差异(图 4B)。cpk28-1突变体在1000 nM elf18中生长时明显小于Col-0,而bak1-5突变体由于MAMP检测中断,相对于Col-0表现出弱生长抑制。
图 1.在阿拉伯利多普西的免疫诱导后,基于Luminol的氧化性爆裂测定。(A) 在短日条件下在土壤上种植植物4-5周。(B) 使用 4 mm 活检冲床从每个工厂收集叶盘,并在 ddH2O. (C) 中加入反应溶液(100 μM 灯具、10 μg/mL HRP 和所需引子浓度)进行过夜回收,并测量 40-60 分钟以上的光发射,间隔 2 分钟集成时间为 1,000 ms. (D) 确定每个基因型相对于 Col-0 的平均光子计数(以绿色显示),高 ROS 控制(如cpk28-1(以紫色显示),以及低 ROS 控制(如bak1-5(以橙色显示)。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2.在阿拉伯拟南芥中,由幼苗生长抑制测定。(A) 在MS琼脂上播种幼苗,在标准短日条件下生长3-4天。(B) 将幼苗移植到含有MS培养基或MS的48孔板中,含有不同浓度的精灵18。(C) 8-12天后,目视评估幼苗大小,然后用分析量表测量新鲜体重,以确定生长抑制百分比。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3.代表精灵18诱导氧化性爆裂在三个阿拉伯突子基因型。四周大的植物用稀释系列精灵18(0 nM'mock'、1 nM、10 nM、100 nM 和 1,000 nM)进行处理。Col-0 表示野生型背景控制,cpk28-1和bak1-5分别表示高和低 ROS 表型。(A) 在elf18处理后,总光子计数表示为相对光单位(n=6来自独立植物的叶盘)。统计差异由小写字母表示,并使用单向方差分析与后图基的诚实显著差异测试(p<0.05) 进行计算。(B) 平均光子计数,表示为相对光单位,在elf18处理后超过40分钟(n=6来自独立植物的叶盘)。误差条表示平均值的标准误差。三个实验中的两项也得出了类似的结果。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4.代表精灵18诱导幼苗生长抑制在三个阿拉伯拟南芥基因型。野生型(Col-0)、cpk28-1和bak1-5幼苗在精灵18的10倍稀释系列(0-1,000 nM)中生长。 (A) 通过比较在精灵18(n =6个个体幼苗)中生长的单个幼苗的重量与仅MS("模拟")(n=6个单独幼苗)中生长的同一基因型幼苗的平均重量,计算出生长抑制百分比在10天期间。统计差异由小写字母表示,并使用单向方差分析与后图基的诚实显著差异测试(p<0.05) 进行计算。(B)在Col-0、cpk28-1和bak1-5的两种代表性幼苗中视觉演示SGI,以响应精灵18浓度的增加。在四个实验中,有三项也取得了类似的结果。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
本文介绍了在阿拉伯拟南芥中检测模式触发免疫反应的两种方法,提供了定量方法,无需使用专用设备即可评估免疫输出。结合使用模式触发的ROS和SGI分别评估对微生物感知的早期和晚期反应。
氧化性爆裂测定的主要局限性是可变性。由于不完全理解的原因,绝对 RDO 在实验之间通常相差一个数量级。由于实验之间的可变性很高,因此建议除了野生型控制(例如Col-0)外,还应包括具有高(例如 cpk28-1)和低(例如 bak1-5)氧化突发的内部参考控制。然而,可以采取措施提高实验之间的可重复性。环境条件(如温度、湿度、光周期和光强度)在复制时应相同。取样时也应考虑植物的年龄和健康。叶盘可以从在短日条件下(6-10小时光)生长的4至7周年龄的植物中收集。传闻中,在发芽后超过6周的植物中发现了最一致的结果,但尚未开花或衰老。在清洁的环境室中种植植物非常重要,这样它们就不会接触到常见的温室害虫,如粉状霉菌或咀嚼昆虫。由于 SGI 的幼苗是在无菌 MS 培养基中生长的,而且时间较短,因此环境波动基本上不是问题。但是,如果幼苗在移植时受损,如果选择用于诱导处理的幼苗大小不同,或者如果生长介质受到污染,则可能发生变异。建议在SGI实验中也包括上述内参考控制基因型。
在进行免疫测定时,诱导浓度是另一个重要的考虑因素。PRR 可感知引热剂,导致引出器处理后 10-20 分钟快速且稳健的 ROS 爆裂峰值(图 2B)。然而,爆裂的幅度取决于引源和植物基因型。因此,建议使用引出剂剂量序列(如图3和图 4所示)以确定合适的引出剂浓度。模式触发的ROS也可以通过用活微生物23、26或微生物提取物26、27、28接种叶盘进行测定。例如,在阿拉伯经体中可以检测到瞬态和剂量依赖性ROS爆发,以响应伪多米诺的毒性病菌,在35-40分钟达到峰值,在引出后约70分钟达到基础水平23,29.为了应对病菌29或真菌病原体P.感染菌30,31,产生第二个更明显的ROS积累,可在6-10小时后监测接种。对于较弱的诱导剂,如真菌甲基丁32或甲酮33,可以使用更灵敏的发光指标,如灯具衍生物L-012,然而,产生的背景信号往往高于32,34.重要的是,植物生态型也将决定其对特定诱导器35、36的反应。例如,虽然细菌鞭革剂能够引起包括Col-0在内的几种阿拉伯生物生态型的免疫反应,但瓦西莱夫斯基哈(Ws-0)生态型表示PRR FLAGELLIN-Sensing 2 (FLS2)的非功能性变异,并且因此对弗拉格林14,37麻木不仁。
免疫诱导的ROS也可以观察到其他植物的叶盘,包括布拉西卡纳普斯38,番茄39,尼科蒂亚娜本塔米亚纳22,40,41和其他几个索兰类物种41。额外的基于发光醇的ROS检测检测已经开发用于使用组织提取物10,细胞悬浮培养基8,42和protoplast43的植物,在系统中特别有用其中叶盘协议无效42。例如,在水稻42、44和小麦45、46中,使用细胞悬浮物培养物,以及健身房阿劳卡里亚安古斯多利亚,就使用细胞悬浮物培养物来描述诱导性ROS爆发47和苔丝菲西菲特拉帕滕斯48.SGI没有被广泛地用于测量免疫信号。然而,对诱导者的反应的生长抑制已经表现出在N.本查米亚纳41和B.napus38,49。 在P.patens中,在接触2分钟内发生的真菌色丁的反应中也证明了快速生长抑制,这可以通过延时摄影48观察到。
通过修改,SGI 和氧化突发测定可用于高通量屏幕,以识别免疫调节器。例如,阿拉伯的诱变种群可以在MS介质上生长,并大量使用诱导剂来识别不敏感的突变体15,50,51,52,53。或者,可以评估诱变种群的引源触发ROS,这已经成功地执行与叶盘54和整个幼苗生长在MS板19。另一种有用的筛选方法是在转基因过度表达线22、40、55之前,在N.benthamiana中暂时表达蛋白质进行ROS分析。然而,由于N.benthamiana叶22中的蛋白质表达差异,实验内变异高于稳定的阿拉伯蛋白酶系,尽管通过渗透参考可以部分缓解这一点对照与实验样品相同的叶子。
总之,免疫诱导的氧化爆裂和SGI测定是评估阿拉伯兰多普西的PRR介导信号的快速可靠的方法。这些方法可以扩展到其他系统,并用于大规模屏幕,以发现新的免疫调节器。
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Disclosures
没有。
Acknowledgments
我们实验室的工作由加拿大自然资源和工程研究委员会(NSERC)发现计划、加拿大创新基金会约翰·埃文斯领袖基金和皇后大学资助。KS 和 IS 由安大略省研究生奖学金和 NSERC 加拿大研究生奖学金(CGS-M)共同支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20-20-20 Fertilizer | Plant Prod | 10529 | Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth. |
| 4 mm Biopsy Punch | Medical Mart | 232-33-34-P | A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used. |
| 48-Well Sterile Plates with Lid | Sigma-Aldrich | CLS3548 | |
| Analytical Scale with Draft Sheid | VWR | VWR-225AC | Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal. |
| BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL) | Sartorius | 725240 | Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary. |
| elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | EZ Biolab | cp7211 | Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C. |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Horseradish Peroxidase | Sigma-Aldrich | P6782 | Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light. |
| Luminol | Sigma-Aldrich | A8511 | Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light. |
| Murisage and Skoog Basal Salts | Cedarlane Labs | MSP09-100LT | Store at 4C. |
| Soil | SunGrow Horticulture | Sunshine Mix #1 | Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots. |
| SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module | Molecular Devices | Must request a quote | Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-1KG | Store at room temperature. |
| White Polystyrene 96-Well Plates | Fisher Scientific | 07-200-589 |
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