Summary
Bu yazıda bağışıklık elicitors maruz aşağıdaki Arabidopsis thaliana savunma tepkiler miktarının için iki yöntem açıklanmaktadır: geçici oksidatif patlama ve fide büyüme inhibisyonu.
Abstract
Bitkiler, patojenleri algılamak ve hastalığa karşı korumak için sağlam bir bağışıklık sistemi geliştirmiştir. Bu yazıda elicitor molekülleri ile tedavi sonrasında Arabidopsis thaliana bağışıklık aktivasyonunun gücünü ölçmek için kullanılabilecek iki asder açıklanmaktadır. İlk sunulan bir luminol tabanlı tahlil kullanılarak izlenebilir hızla indüklenen ve dinamik oksidatif patlama, yakalamak için bir yöntemdir. İkinci sundu fide büyüme bağışıklık kaynaklı inhibisyonu ölçmek için nasıl açıklayan bir yöntemdir. Bu protokoller hızlı ve güvenilirdir, özel eğitim veya ekipman gerektirmez ve bitki dokunulmazlığının genetik temelini anlamak için yaygın olarak kullanılır.
Introduction
Patojenlere karşı tespit etmek ve savunmak için, bitkiler mikroorganizma ilişkili moleküler desenler (MAMPs)1olarak bilinen hücrenin dışında bulunan mikrobiyal molekülleri algılayan membran bağlı desen tanıma reseptörleri (prrs) gelişti. MAMPs 'ın bilat PRRs 'larına bağlanması, geniş spektrumlu hastalık direnci2' ye neden olan protein kinaz aracılı bağışıklık sinyallerini başlatır. PRR aktivasyonunun ardından en erken yanıtlardan biri, ekstraselüler reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimini katalizleştiren entegre plazma membranı solunum PATLAMASı OKSIDAZ HOMOLOG (RBOH) proteinlerinin fosforilasyon ve aktivasyonu olduğunu3 , 4. Ros bağışıklık sinyalizasyon yanı sıra doğrudan antimikrobiyal ajanlar5yaymak için ikincil haberciler olarak hareket, hastalık direnci kurulması önemli bir rol oynamaktadır. Bağışıklık-elicited oksidatif patlama ilk gözlem CV patates yumrular kullanılarak tanımlanmıştır. Rishiri Phytophthora Mildiyö aşı takip6. ROS üretimi, yaprak diskler7, hücre süspansiyon kültürleri8ve protoplastlar6kullanarak çeşitli bitki türlerinde değerlendirildi. Burada açıklanan Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) yaprak DISKLER desen tetiklenen Ros üretimi için basit bir yöntemdir.
Mamp algı bir yanıt olarak, aktif rboh proteinleri superoksit radikallerin üretimini katalizler (o2-), hidroksil radikaller (• Oh), ve atlet oksijen (1o2) hidrojen peroksit dönüştürülür (H2o 2) ekstrellüler uzayda9. H2O2 oksitleyici ajanın varlığında luminol tabanlı kemiluminesans ile NICELIK olabilir (HRP)10. HRP oksitler H2O2 üreten bir HIDROKSIT iyon (Oh−) ve oksijen gazı (O2) hangi ışık bir foton bültenleri kararsız bir ara üretmek için luminol ile reaksiyon10. Foton emisyonu bağıl ışık üniteleri (RLUs) olarak, en moleküler laboratuvarlarda standart ekipman parçaları haline gelen Luminesans algılayabilen bir Mikroplaka Okuyucu veya görüntü kullanarak nicelik olabilir. 40-60 dakikalık bir Aralık üzerinde üretilen ışığı ölçerek, geçici bir oksidatif patlama, elicitor tedavisinden sonra 2-5 dakika kadar erken, 10-20 dakika içinde peaking ve ~ 60 dakika11' den sonra bazal seviyelere dönerek tespit edilebilir. Bu zaman kursunda üretilen birikimli ışık, RBOH proteinlerinin aktivasyonuna karşılık gelen bağışıklık gücünün bir ölçüsü olarak kullanılabilir12. Uygun, bu tahlil özel ekipman veya hantal numune hazırlama gerektirmez.
MAMP algılama kısa bir süre sonra peaking, oksidatif patlama erken bağışıklık yanıtı olarak kabul edilir, MAPK aktivasyon ve etilen üretimi ile birlikte5. Daha sonra bağışıklık tepkiler transkripsiyonel yeniden programlama, evcikli kapatma ve kallose biriktirme2,5içerir. MAMPs 'a uzun süreli maruz kalma, bitki büyümesinin inhibisyonu ile sonuçlanan, kalkınma ve bağışıklık13arasında bir ticaret-off göstergesidir. Desen-tetiklenen fide büyüme inhibisyonu (SGI) yaygın Arabidopsis bağışıklık çıkışı değerlendirmek için kullanılan ve prrs dahil bağışıklık sinyalizasyon birkaç anahtar bileşenlerinin tanımlanması için ayrılmaz olmuştur14,15 ,16. Bu nedenle, bu kağıt Ayrıca model için bir tahlil sunuyor- Arabidopsisiçinde SGI tetikleyen, fidanlar çok iyi plakalar standart medya veya medya 8-12 gün için bir bağışıklık elicitor ile tamamlayıcı içeren yetiştirilen ve daha sonra tartılır analitik bir ölçek kullanarak.
ROS ve SGı 'nin PRR-aracılı sinyalizasyon izlemek için nasıl kullanıldığını göstermek için, farklı bağışıklık çıkışlarını temsil eden üç genotip seçilmiştir: (1) vahşi tip Arabidopsis üyeliği Columbia (col-0), (2) dominant-negatif BaK1-5 mutant içinde çok fonksiyonlu PRR Co-reseptör brassinosteroıd duyarsız 1-ilişkili kinase 1 (BAK1) bağışıklık sinyalizasyon fonksiyonel olmayan17,18, ve (3) resessive cpk28-1 mutant, hangi yoksun Düzenleyici protein kalsiyum bağımlı protein kinaz 28 (CPK28) ve görüntüler artmış bağışıklık tetiklenen tepkiler19,20. Ros ve SGI tanılar, PRR EF-tu reseptör (EFR)15ile Arabidopsis 'te tanınan, bakteri uzaması Factor tu (EF-tu) ' ın sentetik olarak üretilen elf18 peptid epitopu yanıtı ile sunulmuştur. Bu protokoller bakteriyel motilite protein flagellin14 veya endojen bitki Elicitor proteinleri (AtPeps)16gibi diğer immün elicitors ile kullanılabilir, ancak, bu bitki yanıt bağlı olarak farklılık unutulmamalıdır 21. ROS ve SGı desteği, erken ve geç PRR aracılı yanıtların hızlı ve nicel değerlendirilmesi için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bağışıklık özelliğini takiben Arabidopsis yaprak DISKLERINDE Ros patlaması algılanması
- Bitki büyüme ve bakım.
- Çimlenme senkronize etmek için, yaklaşık 50 tohumları askıya alarak Arabidopsis tohumları tabakalaşmak steril 0,1% agar [w/v] ve mağaza 4 °c (ışık yok) içinde 3-4 gün için 1 ml.
Not: bir vahşi tür arka plan denetimi (örneğin, col-0) ve yüksek ve düşük bağışıklık çıkışları (örneğin, cpk28-1 ve BaK1-5, sırasıyla) ile genotipler iç denetimler olarak hizmet vermek için stratify. - Toprak üzerinde tohum ekmek ve standart kısa gün koşulları altında çimlenme (22 °C, 10 h ışık, 150 mE/m2/s ışık yoğunluğu, ve 65-70% bağıl nem).
- Yaklaşık 7 gün sonra, tam rozet gelişimine izin vermek için en az 4 cm ayrılmış yeni tencere, bireysel fide nakli için forseps kullanın. Organ nakli 6-12, genottipe göre fide ve standart kısa gün koşullarına döner. Düzenli olarak su ve gübreleme bitkiler (1 g/L 20-20-20 gübre her 2 hafta).
- Çimlenme senkronize etmek için, yaklaşık 50 tohumları askıya alarak Arabidopsis tohumları tabakalaşmak steril 0,1% agar [w/v] ve mağaza 4 °c (ışık yok) içinde 3-4 gün için 1 ml.
- Gece kurtarma için 96-Well plakaları yaprak diskleri toplayın.
- 4-5 hafta sonrası çimlenme (Şekil 1a), bitki başına bir yaprak disk kaldırmak için keskin bir 4 mm biyopsi Punch kullanın, orta damar kaçınarak ve daralan sınırlamak için dikkatli olmak (Şekil 1B). Bir kullanılmayan 96-Well Luminometre plaka içeren 100 μL DDH2O, eksene yan yukarı bakacak şekilde, kurutan22 (Şekil 1C) önlemek için yaprak diskleri yerleştirin. Birden fazla elicitors değerlendiriyorsanız, her elicitor tedavi için aynı yaprak 1 yaprak disk çıkarın.
Not: örnek yaprakları tamamen genişledi, üçüncü beşinci rozet üst ve yaklaşık aynı boyut ve yaş değişkenlik sınırlamak için. Mümkünse, gece kurtarma öncesinde bir jilet kullanarak yarım yaprak diskleri kesme, bu elicitor çözüm23maruz yüzey alanı artar gibi. - Yaprak disk toplama sırasında yaralama tarafından üretilen Ros müdahalesi önlemek için oda sıcaklığında bir gecede kurtarın. Buharlaşma önlemek için bir kapak ile kapak plakaları.
- 4-5 hafta sonrası çimlenme (Şekil 1a), bitki başına bir yaprak disk kaldırmak için keskin bir 4 mm biyopsi Punch kullanın, orta damar kaçınarak ve daralan sınırlamak için dikkatli olmak (Şekil 1B). Bir kullanılmayan 96-Well Luminometre plaka içeren 100 μL DDH2O, eksene yan yukarı bakacak şekilde, kurutan22 (Şekil 1C) önlemek için yaprak diskleri yerleştirin. Birden fazla elicitors değerlendiriyorsanız, her elicitor tedavi için aynı yaprak 1 yaprak disk çıkarın.
- Performans ve ölçme ROS üretimini gerçekleştirin.
- Bu ROS patlama başlangıcı ve kaydedilen ilk ölçümler arasındaki süreyi azaltacaktır gibi reaksiyon çözümü eklemeden önce plaka okuyucu programı. Plaka okuyucusu için uygun bir ticari yazılım kullanın. Bizim durumumuzda ( Içindekiler tablosunabakın), Ayarlar'ı tıklatın ve LUM96 Kartuşu ve Kinetic okuma türünü seçin. Okuma alanı kategorisini tıklatın ve kuyuların bir alt kümesini veya okunması gereken tüm plakası seçmek için sürükleyin. PMT ve optik sekmesinin altında, entegrasyon süresini 1.000 MS 'ye ayarlayın. zamanlama sekmesinin altında, toplam çalışma süresini 40-60 min ve Aralık 2 dakika olarak ayarlayın.
- Çok kanallı pipet kullanarak her bir kuyunun suyunu çıkarın.
Not: Bu yaralama stres neden olabilir ve daha fazla değişken Ros çıkışları sonucu gibi yaprak diskleri delinmeyin. - 100 μM luminol, 10 μg/mL HRP ve istenilen konsantrasyonu içeren bir reaksiyon çözeltisi hazırlayın (örneğin: 1 nM, 10 nM, 100 nM, veya 1.000 nM) steril ddH2O, 1 96-Well plaka Için 10 ml solüsyonu kullanarak.
Not: 10 mm 'lik bir stok, sıvı N2' de flaş dondurulması ve-80 °c ' de saklamak için düşük bağlayıcı tüplerde steril H2O 'da liyofilize peptidler çözülür. Kullanılmak üzere hazır olduğunda, steril H2O bir 100 μM çalışma stok ve mağaza-20 °c üretmek için stokları seyreltildi. - Her bir kuyu için reaksiyon karışımı 100 μL dağıtmak için çok kanallı bir pipet kullanın, aynı zamanda aynı tedavinin tüm yaprak diskler için çözüm ekleyerek22. Her bir genotip için bir kontrol reaksiyonu (hiçbir elicitor) dahil etme yokluğu bazal ROS düzeylerini değerlendirmek için. Bir Mikroplaka okuyucusu kullanarak görünür spektrumdaki tüm dalga boylarında ışık emisyonunu hemen ölçün.
Not: luminol ve HRP 'nin ışığa duyarlı reaktifler olduğu gibi, reaksiyon çözümünü düşük ışıkta hazırlayın ve uygulayın. Kullanımda olmadıkça reaktifleri buzda veya-20 °C ' de tutun. - Dinamik oksidatif patlaması (Şekil 1D) yakalamak için bir Mikroplaka okuyucuda 40-60 min aralığında bir 1.000 MS entegrasyon süresi ile ışık emisyonunu 2 dakika aralıklarla ölçün.
Not: test hassasiyeti11' i iyileştirmek için daha uzun bir entegrasyon süresi kullanın, 96-Well plakalı tüm numunelerin bir Aralık içinde ölçülmesini sağlayarak.
- Veri yorumu.
- Her genotip için, her zaman noktasında ortalama foton sayımı ve standart hatayı hesaplamak için bir elektronik tablo uygulaması kullanın ve bir dağılım çizimi kullanarak ROS üretimini zaman işlevi olarak görüntüleyin.
Nerede t = her zaman noktası - Alternatif olarak, her yaprak disk için foton sayar ve standart hata çubukları veya bir kutu ve bıyık çizimi ile bir çubuk grafik kullanarak her genotip için bu değerlerin ortalamasını mevcut.
- Her genotip için, her zaman noktasında ortalama foton sayımı ve standart hatayı hesaplamak için bir elektronik tablo uygulaması kullanın ve bir dağılım çizimi kullanarak ROS üretimini zaman işlevi olarak görüntüleyin.
2. fide büyüme Inhibisyonu assay
- , Tohumları sterilize ve Murashige ve Skoog (MS) plakaları üzerinde ekmek.
- Hazırlamak steril yarı mukavemet (0.5 x) MS Orta (2,16 g/L) içeren 0,8% agar [w/v]. Laminar akış kaputunda (90 x 15 mm) plakalara medya dökün.
- Sterilizasyon yaklaşık 100 tohum bir mikrosantrifüjlü tüp ile yıkayarak 1 mL 70% etanol 2 dakika ve aspirasyon ile çıkarın. Oda sıcaklığında 17 dakika için 1 mL 40% çamaşır suyu ve hafifçe kaya ekleyin. Aspirasyon ile çamaşır suyu çıkarın ve 5 dakika steril su 1 mL 'de üç kez yıkayın. 1 mL steril 0,1% agar içinde resuspend.
Not: Alternatif olarak, klor gazı tohumu sterilizasyon Protokolü24kullanın. - Bir laminar akış kaputu Micropore bant ile bir pipet ve mühür kullanarak MS agar plakaları üzerinde genotip başına yaklaşık 100 tohum Sow.
Not: Bu nakli fide daha sonra zor hale gelecek gibi yakın tohum yerleştirme kaçının. - 3-4 gün boyunca 4 °C ' de (ışık yok) tabak koyarak çekirdekleri dikerek tohumlama (Şekil 2a).
- 48 içine nakil fide-iyi plakalar bağışıklık elicitor peptidler içeren.
- Tabakalaşma sonrası, kısa gün koşullarında (22 °C, 10 h ışık, 150 mE/m2/s ışık yoğunluğu ve 65-70% bağıl nem) altında ışık için plakaları taşımak için 3-4 gün çimlenme izin.
- Bir laminar akış kaput, hazırlamak elicitor peptid seyreltme (0 Nm, 1 Nm, 10 Nm, 100 Nm, ve 1.000 Nm) steril 0.5 x MS sıvı medya içeren 1% sakaroz [w/v], kullanarak 25 ml MS her 48-kuyu plakası için. Pipetleme ile plakaları hazırlayın 500 μL MS sıvı orta veya MS orta içeren peptidler her iyi. Eğer varsa, işlemi hızlandırmak için plaka hazırlama için bir tekrarlama pipetör kullanın.
Not: her genotip Için, fide büyüme herhangi bir içsel farklar için hesaba elicitor olmadan MS fide büyümek. - Steril forseps kullanarak dikkatle aynı büyüklükte ve yaş her iyi bir fide nakli, orada tohum ya da köküne kırılma zarar ve kök medyada batık olduğunu sağlamak. Her genotip için, her peptit seyreltme içine en az 6-8 fide nakli (Şekil 2B).
Not: nakil fidanları 4 gün sonrası çimlenme, kısa kökleri manipüle etmek daha kolaydır, ve eski fide daha az optimum sonuçlar verebilir. - Micropore bant ile mühür plakaları ve standart kısa günlük koşullar altında ışığa geri hareket (22 °C, 10 h ışık, 150 mE/m2/s ışık yoğunluğu, ve 65-70% bağıl nem). Fidanların 8-12 gün boyunca büyümesine izin verin.
- Yüzde büyüme inhibisyonu belirleyin.
- Dikkatle 48 gelen fide kaldırmak-kuyu plakaları ve kağıt havlu üzerinde dabbing tarafından kuru. Fidanları analitik ölçekte ve kayıt değerlerine göre tartın. Varsa, bir elektronik tabloya taze ağırlık değerleri kaydetmek için USB çıkışı ile donatılmış bir analitik ölçek kullanın. Fide Tartmadan önce, büyüme inhibisyonu görsel olarak görüntülemek için bir fotoğraf çekin (Şekil 2C).
- Sadece MS 'de yetiştirilen fide ile karşılaştırıldığında elicitor işlenmiş fide yüzde büyüme inhibisyonu belirlemek (Şekil 2D) aşağıdaki gibi:
- Standart hata çubukları ile bir çubuk grafik kullanarak veya daha iyi görüntüleme inter-deneysel varyans bir kutu ve bıyık Plot kullanarak veri çizmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mutant cpk28-119,25 ve BaK1-517,18 bitkiler oksidatif patlama ve sgi, sırasıyla, yüksek ve düşük immün tepkiler ile genotipler için beklenen sonuçları göstermek için kullanıldı bir vahşi tür arka plan denetimi (col-0) göreli olarak diyor. Doz bağımlı etkileri değerlendirmek için, 10 kat peptid seyreltme serisi (1-1000 nM) elf18 kullanılmıştır. Beklendiği gibi, cpk28-1 fonksiyon kaybı hatları daha yüksek birikimli (Şekil 3A) ve ortalama (Şekil 3B) Ros patlaması col-0 ile karşılaştırıldığında, BaK1-5 , 10 Nm ve arasında konsantrasyonlarda Ros üretim azaltılmış görüntülenirken 1.000 nM (Şekil 3). SGı 'de beklenen farklılıklar 100 nM ve 1.000 nM elf18 (Şekil 4A) içinde yetiştirilen tüm genotipler arasında görülebilir ve bu da 1.000 Nm elf18 tedavisinde (Şekil 4b) görsel olarak görülebilir. Yüksek bağışıklık sinyalizasyon karakteristik, cpk28-1 mutantlar belirgin col-0 ne zaman 1.000 Nm elf18 yetiştirilen daha küçük, BaK1-5 mutantlar col-0 göreli olarak zayıf büyüme INHIBISYONU görüntülenirken mamp algılama kesintiye uğrattı.
Şekil 1 ' de. Arabidopsisbağışıklık indüksiyon aşağıdaki luminol tabanlı oksidatif patlama tahlil. (A) 4-5 hafta boyunca kısa gün koşullarında topraktaki bitkileri büyütün. (B) her bitkinin yaprak diskleri toplamak için 4 mm biyopsi Punch kullanın ve ddH2O. (C) reaksiyon solüsyonu (100 μM luminol, 10 μg/ml HRP, ve istenilen konsantrasyon) ekleme ve 2 dk aralıklarla 40-60 dk üzerinde ışık emisyonu ölçmek bir entegrasyon süresi ile 1.000 MS. (D) her genotip için, col-0 (yeşil renkte gösterilir), cpk28-1 (mor renkte gösterilir) gıbı yüksek Ros kontrolü ve BaK1-5 (turuncu renkte GÖSTERILIR) gibi düşük Ros kontrolü için Ortalama foton sayımlarını belirleyin. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2. Arabidopsisiçinde elicitor kaynaklı fide büyüme inhibisyonu tahlil. (A) MS agar üzerinde tohum Sow ve 3-4 gün boyunca standart kısa gün koşulları altında büyümek. (B) elf18 farklı konsantrasyonları içeren MS orta veya MS içeren 48-Well plakaları için nakil fide. (C) 8-12 gün sonra, görsel fide boyutunu değerlendirmek ve daha sonra yüzde büyüme inhibisyonu belirlemek için bir analitik ölçek kullanarak taze ağırlık ölçmek. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 ' ü. Üç Arabidopsis genotipinde temsilci elf18 kaynaklı oksidatif patlama. Dört haftalık bitkiler elf18 (0 nM ' Mock ', 1 nM, 10 nM, 100 nM ve 1.000 nM) bir seyreltme serisi ile tedavi edildi. Col-0, sırasıyla cpk28-1 ve BaK1-5 Ile yüksek ve düşük Ros fenotürlerini temsil eden vahşi tip arka plan kontrolünü temsil eder. (A) elf18 tedavi sonrasında bağıl ışık üniteleri olarak temsil edilen toplam foton sayımı (bağımsız bitkilerinn= 6 yaprak diskleri). İstatistiksel farklar küçük harflerle temsil edilir ve Post-Hoc Tukey 'in dürüst anlamlı fark testi ile tek yönlü ANOVA kullanılarak hesaplanmıştır (p< 0.05). (B) göreli ışık üniteleri olarak temsil edilen ortalama foton sayısı, elf18 tedavi sonrasında 40 dk. (bağımsız tesislerdenn= 6 yaprak disk). Hata çubukları ortalama standart hata temsil eder. Benzer sonuçlar üç deneyden ikisinde elde edildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4. Üç Arabidopsis Genotype temsilcisi elf18 kaynaklı fide büyüme inhibisyonu. Wild tipi (col-0), cpk28-1ve BaK1-5 fide, 10 kat seyreltme serisinde (0-1000 Nm) elf18 büyüdü. (A) yüzde büyüme inhibisyonu, elf18 (n= 6 bireysel fide) içinde yetiştirilen bireysel fide ağırlığının, sadece MS 'de yetiştirilen aynı genotipteki fide ortalama ağırlığına göre hesaplanır (' alay ') (n= 6 bireysel fide) 10 günlük bir süre boyunca. İstatistiksel farklar küçük harflerle temsil edilir ve Post-Hoc Tukey 'nin dürüst anlamlı farklar testi ile tek yönlü ANOVA kullanılarak hesaplanmıştır (p< 0.05). (B) col-0, cpk28-1 ve BaK1-5 ' in iki temsilci fide Içinde SGI 'nin görsel gösterimi elf18 konsantrasyonlarına tepki olarak. Dört deneyden üçü de benzer sonuçlar elde edildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda, Arabidopsis'te desen tetiklenen immün tepkiler vermek için iki yöntem açıklanmaktadır, özel ekipman kullanmadan bağışıklık çıkışını değerlendirmek için nicel yaklaşımlar sunar. Kombinasyon halinde, çoğaltma tetikleyen ROS ve SGı, sırasıyla mikrobe algısına erken ve geç yanıt değerlendirmek için kullanılabilir.
Oksidatif patlama tahlil büyük sınırlama değişkenlik olduğunu. Tamamen anlaşılmayan nedenlerle, mutlak RLUs 'Lar genellikle deneyler arasındaki büyüklük sırasına göre farklılık gösterir. Deneme arasındaki değişkenlik yüksek olduğu için, vahşi tip kontrol (örn. col-0) ek olarak yüksek (örn.cpk28-1) ve düşük (örn. BaK1-5) oksidatif patlamalar ile iç referans kontrolleri dahil edilmesi tavsiye edilir. Ancak, deneyler arasında yeniden üretilebilirliği artırmak için önlemler alınabilir. Sıcaklık, nem, fotoperiod ve ışık yoğunluğu gibi çevresel koşullar çoğaltır arasında aynıdır. Bitki yaş ve sağlık da örnekleme sırasında dikkate alınmalıdır. Yaprak diskler, kısa gün koşullar altında yetiştirilen 4 ve 7 hafta yaş arasında olan bitkilerin toplanabilir (6-10 saat ışık). Anecdotally, en tutarlı sonuçlar daha eski bitkiler ile bulundu 6 hafta sonrası çimlenme ama henüz çiçeklenme veya senescing. Onlar toz küf veya çiğneme böcekler gibi ortak Glasshouse zararlıları maruz değildir, böylece temiz çevre odalarında bitkiler büyümek önemlidir. SGı için fide steril MS medyada yetiştirilen beri, ve daha kısa bir süre için, çevresel dalgalanmalar büyük ölçüde bir endişe değildir. Ancak, tohumların nakli sırasında hasar görmesi durumunda varyasyon ortaya çıkabilir, Eğer atıklar için seçilmiş fidanlar farklı boyutlarda ise veya büyüme medyası kontamine olduğunda. Yukarıda açıklanan iç referans kontrolü genotiplerinin de SGı deneylerinde dahil edilmesi önerilir.
Bağışıklık asdası yürüttüğünün başka önemli bir önemi vardır. Elicitor, hızlı ve sağlam bir ROS patlamasına neden olan PRRs tarafından algılanır ve 10-20 dakika sonra (Şekil 2B). Ancak, patlama büyüklüğü hem elicitor hem de bitki Genotype bağlıdır. Bu nedenle, bir elicitor doz serisi, Şekil 3 ve Şekil 4' te sunulan, uygun bir elicitor konsantrasyonu belirlemek için tavsiye edilir. Desen tetiklenen Rosda canlı mikroplar ile yaprak diskler Birmanya tarafından tespit edilebilir23,26 veya mikrobiyal özler26,27,28. Örneğin, Arabidopsis 'Te Pseudomonas syringae'nin virlan patovarına yanıt olarak GEÇICI ve doza bağlı Ros patlamaları tespit edilebilir, 35-40 dakikada peaking ve yaklaşık 70 dakika sonra bazal seviyelere ulaşılması 23 , 29. avirlan bakterilere yanıt olarak29 veya mantar patojen P. Mildiyö30,31, daha belirgin bir Ros birikimi üretilmekte olup, 6-10 saat sonra takip edilebilir Aşı. Gibi zayıf elicitors için, mantar kitin32 veya kitosan33gibi, daha hassas Luminesans göstergeler kullanılabilir, gibi luminol türevi L-012, ancak, üretilen arka plan sinyali genellikle daha yüksek olan32, 34. önemlisi, bitki ekotipi da belirli elicitors35,36için tepki dikte edecektir. Örneğin, bakteriyel flagellin col-0 da dahil olmak üzere çeşitli Arabidopsis ecotypes içinde bağışıklık yanıtları eliciting yeteneğine sahip iken, wassilewskija (WS-0) ekotipi PRR flagellın-SENSING 2 (FLS2) işlevsel olmayan bir varyant ifade ve Bu nedenle flagellin14,37için duyarsız.
Bağışıklık kaynaklı Ros da Brassica türkcesi38, domates39, Nicotiana benthamiana22,40,41dahil olmak üzere diğer Monokotiledonlar bitkilerin yaprak diskler görülebilir ve diğer çeşitli solanaceous türler41. Ek luminol tabanlı Ros tespiti, doku özleri10, hücre süspansiyon kültürlerini8,42ve protoplastlar43kullanarak bitkiler için geliştirilmiştir ve özellikle sistemlerde yararlıdır nerede yaprak disk protokolleri etkili42değildir. Örneğin, elicitor kaynaklı Ros patlamaları pirinç42,44 ve buğday45,46, yanı sıra Açık tohumlular Araucaria angustifolia içinde hücre süspansiyon kültürler kullanılarak tanımlanmıştır 47 ve Moss Physcomitrella patens48. SGı bağışıklık sinyalizasyon ölçmek için geniş olarak kullanılmaz. Ancak, büyüme inhibisyonu yanıt olarak elicitors N. benthamiana41 ve B. türkcesi38,49gösterildi. Hızlı büyüme inhibisyonu da P. patens içinde oluşan mantar kitin yanıt olarak gösterilmiştir 2 maruz kalma dakika, hangi zaman atlamalı fotoğrafçılık kullanılarak görülebilir48.
Modifikasyon ile, hem SGI ve oksidatif patlama deneyleri yüksek verimlilik ekranları için bağışıklık regülatörleri belirlemek için kullanılabilir. Örneğin, Arabidopsis mutagenized nüfus MS Orta üzerinde yetiştirilen ve duyarsız mutantlar belirlemek için elicitors ile sular altında olabilir15,50,51,52,53. Alternatif olarak, mutagenized nüfusu elicitor tetikleyen ROS için değerlendirilebilir, hangi başarıyla hem yaprak diskler54 ve MS plakaları üzerinde yetiştirilen tüm fide ile yürütülen19. Başka bir yararlı tarama yöntemi, tranjenik ekspresyonu hatları22,40,55gelişimi öncesinde Ros analizi için N. benthamiana proteinlerin geçici ifadesidir. Ancak, intra-deneysel varyasyon istikrarlı Arabidopsis hatları N. benthamiana içinde diferansiyel protein ifadesi nedeniyle daha yüksektir22yaprakları, bu kısmen referans infiltrasyon tarafından hafifletilebilir rağmen Deneysel örnekleri aynı yaprak denetimleri.
Özetle, bağışıklık kaynaklı oksidatif patlama ve SGı desteği, Arabidopsis 'teki PRR-aracılı sinyalizasyon değerlendirmesi için hızlı ve güvenilir yöntemlerdir. Bu yöntemler diğer sistemlere uzatılabilir ve büyük ölçekli ekranlar için yeni bağışıklık regülatörleri ortaya çıkarmak için kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbiri.
Acknowledgments
Laboratuvarımızda çalışmak, Kanada 'nın doğal kaynaklar ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Discovery programı, Kanadalı Inovasyon Vakfı John R. Evans Leader 'ın Fonu ve Kraliçe 'nin Üniversitesi aracılığıyla finanse edilmektedir. KS ve yüksek lisans öğrencileri (CGS-M) için tandem Ontario Lisansüstü Bursları ve NSERC Kanada lisansüstü Burslar tarafından desteklenir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20-20-20 Fertilizer | Plant Prod | 10529 | Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth. |
| 4 mm Biopsy Punch | Medical Mart | 232-33-34-P | A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used. |
| 48-Well Sterile Plates with Lid | Sigma-Aldrich | CLS3548 | |
| Analytical Scale with Draft Sheid | VWR | VWR-225AC | Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal. |
| BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL) | Sartorius | 725240 | Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary. |
| elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | EZ Biolab | cp7211 | Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C. |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Horseradish Peroxidase | Sigma-Aldrich | P6782 | Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light. |
| Luminol | Sigma-Aldrich | A8511 | Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light. |
| Murisage and Skoog Basal Salts | Cedarlane Labs | MSP09-100LT | Store at 4C. |
| Soil | SunGrow Horticulture | Sunshine Mix #1 | Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots. |
| SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module | Molecular Devices | Must request a quote | Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-1KG | Store at room temperature. |
| White Polystyrene 96-Well Plates | Fisher Scientific | 07-200-589 |
References
- Couto, D. E., Zipfel, C. Regulation of pattern recognition receptor signalling in plants. Nature Reviews Immunology. 16, 537-552 (2016).
- Boller, T., Felix, G. A Renaissance of Elicitors: Perception of Microbe-Associated Molecular Patterns and Danger Signals by Pattern-Recognition Receptors. Annual Review of Plant Biology. 60, 379-406 (2009).
- Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. A burst of plant NADPH oxidases. Trends in Plant Science. 56 (8), 1472-1480 (2012).
- Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. Regulation of the NADPH Oxidase RBOHD during Plant Immunity. Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).
- Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition. Annual Review of Phytopathology. 55, 109-137 (2017).
- Doke, N. Involvement of superoxide anion generation in the hypersensitive response of potato tuber tissues to infection with an incompatible race of Phytophthora infestans and to the hyphal wall components. Physiological Plant Pathology. 23 (3), 345-357 (1983).
- Bindschedler, L. V., et al. Peroxidase-dependent apoplastic oxidative burst in Arabidopsis required for pathogen resistance. The Plant Journal. 47 (6), 851-863 (2006).
- Keppler, L. D. Active Oxygen Production During a Bacteria-Induced Hypersensitive Reaction in Tobacco Suspension Cells. Phytopathology. 110 (3), 759-763 (1989).
- Wrzaczek, M., Brosché, M., Kangasjärvi, J. ROS signaling loops - production, perception, regulation. Current Opinion in Plant Biology. 16 (5), 575-582 (2013).
- Warm, E., Laties, G. G. Quantification of hydrogen peroxide in plant extracts by the chemiluminescence reaction with luminol. Phytochemistry. 21 (4), 827-831 (1982).
- Trujillo, M. Analysis of the lmmunity-Related Oxidative Bursts by a Luminol-Based Assay. Methods in Molecular Biology. 1398, 323-329 (2016).
- Nühse, T. S., Bottrill, A. R., Jones, A. M. E., Peck, S. C. Quantitative phosphoproteomic analysis of plasma membrane proteins reveals regulatory mechanisms of plant innate immune responses. The Plant Journal. 51 (5), 931-940 (2007).
- Belkhadir, Y., Yang, L., Hetzel, J., Dangl, J. L., Chory, J. The growth-defense pivot: Crisis management in plants mediated by LRR-RK surface receptors. Trends in Biochemical Sciences. 39 (10), 447-456 (2014).
- Gómez-Gómez, L., Felix, G., Boller, T. A single locus determines sensitivity to bacterial flagellin in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 18 (3), 277-284 (1999).
- Zipfel, C., et al. Perception of the Bacterial PAMP EF-Tu by the Receptor EFR Restricts Agrobacterium-Mediated Transformation. Cell. 125 (4), 749-760 (2006).
- Krol, E., et al. Perception of the Arabidopsis danger signal peptide 1 involves the pattern recognition receptor AtPEPR1 and its close homologue AtPEPR2. Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 13471-13479 (2010).
- Schwessinger, B., et al. Phosphorylation-dependent differential regulation of plant growth, cell death, and innate immunity by the regulatory receptor-like kinase BAK1. PLoS Genetics. 7 (4), e1002046 (2011).
- Roux, M., et al. The Arabidopsis Leucine-Rich Repeat Receptor-Like Kinases BAK1/SERK3 and BKK1/SERK4 Are Required for Innate Immunity to Hemibiotrophic and Biotrophic Pathogens. The Plant Cell. 23 (6), 2440-2455 (2011).
- Monaghan, J., et al. The calcium-dependent protein kinase CPK28 buffers plant immunity and regulates BIK1 turnover. Cell Host and Microbe. 16 (5), 605-615 (2014).
- Wang, J., et al. A Regulatory Module Controlling Homeostasis of a Plant Immune Kinase. Molecular Cell. 69 (3), 493-504 (2018).
- Mott, G. A., et al. Genomic screens identify a new phytobacterial microbe-associated molecular pattern and the cognate Arabidopsis receptor-like kinase that mediates its immune elicitation. Genome Biology. 17, 98 (2016).
- Sang, Y., Macho, A. P. Analysis of PAMP-Triggered ROS Burst in Plant Immunity. Methods in Molecular Biology. 1578, 143-153 (2017).
- Smith, J. M., Heese, A. Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae. Plant Methods. 10 (1), 6 (2014).
- Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds. Journal of Visualized Experiments. 128, (2017).
- Matschi, S., Werner, S., Schulze, W. X., Legen, J., Hilger, H. H., Romeis, T. Function of calcium-dependent protein kinase CPK28 of Arabidopsis thaliana in plant stem elongation and vascular development. The Plant Journal. 73 (6), 883-896 (2013).
- Felix, G., Duran, J. D., Volko, S., Boller, T. Plants have a sensitive perception system for the most conserved domain of bacterial flagellin. The Plant Journal. 18 (3), 265-276 (2002).
- Kunze, G., Zipfel, C., Robatzek, S., Niehaus, K., Boller, T., Felix, G. The N Terminus of Bacterial Elongation Factor Tu Elicits Innate Immunity in Arabidopsis Plants. The Plant Cell. 16 (12), 3496-3507 (2004).
- Zipfel, C., et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Nature. 428 (6984), 764-767 (2004).
- Mur, L. A. J., Kenton, P., Draper, J. In planta measurements of oxidative bursts elicited by avirulent and virulent bacterial pathogens suggests that H2O2 is insufficient to elicit cell death in tobacco. Plant, Cell and Environment. 28 (4), 548-561 (2005).
- Kobayashi, M., et al. Calcium-dependent protein kinases regulate the production of reactive oxygen species by potato NADPH oxidase. The Plant Cell. 19 (3), 1065-1080 (2007).
- Yoshioka, H., et al. Induction of Plant gp91 phox Homolog by Fungal Cell Wall, Arachidonic Acid, and Salicylic Acid in Potato. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (6), 725-736 (2001).
- Klauser, D., Flury, P., Boller, T., Bartels, S. Several MAMPs, including chitin fragments, enhance AtPep-triggered oxidative burst independently of wounding. Plant Signaling and Behavior. 8 (9), e25346 (2013).
- El Gueddari, N. E., Rauchhaus, U., Moerschbacher, B. M., Deising, H. B. Developmentally regulated conversion of surface-exposed chitin to chitosan in cell walls of plant pathogenic fungi. New Phytologist. 156 (1), 103-112 (2002).
- Daiber, A., et al. Detection of superoxide and peroxynitrite in model systems and mitochondria by the luminol analogue L-012. Free Radical Research. 38 (3), 259-269 (2004).
- Bauer, Z., Gómez-Gómez, L., Boller, T., Felix, G. Sensitivity of Different Ecotypes and Mutants of Arabidopsis thaliana toward the Bacterial Elicitor Flagellin Correlates with the Presence of Receptor-binding Sites. Journal of Biological Chemistry. 276 (49), 45669-45676 (2001).
- Vetter, M. M., et al. Flagellin perception varies quantitatively in arabidopsis thaliana and its relatives. Molecular Biology and Evolution. 29 (6), 1655-1667 (2012).
- Chinchilla, D. The Arabidopsis Receptor Kinase FLS2 Binds flg22 and Determines the Specificity of Flagellin Perception. The Plant Cell. 18 (2), 465-476 (2006).
- Lloyd, S. R., Schoonbeek, H., Trick, M., Zipfel, C., Ridout, C. J. Methods to Study PAMP-Triggered Immunity in Brassica Species. Molecular Plant-Microbe Interactions. 27 (3), 286-295 (2014).
- Clarke, C., Vinatzer, B. Characterizing the Immune-Eliciting Activity of Putative Microbe-Associated Molecular Patterns in Tomato. Methods in Molecular Biology. 1578, 249-261 (2017).
- Gimenez-Ibanez, S., Hann, D. R., Chang, J. H., Segonzac, C., Boller, T., Rathjen, J. P. Differential Suppression of Nicotiana benthamiana Innate Immune Responses by Transiently Expressed Pseudomonas syringae Type III Effectors. Frontiers in Plant Science. 9, 688 (2018).
- Wei, Y., et al. The Ralstonia solanacearum csp22 peptide, but not flagellin-derived peptides, is perceived by plants from the Solanaceae family. Plant Biotechnology Journal. 16 (7), 1349-1362 (2018).
- Melcher, R. L. J., Moerschbacher, B. M. An improved microtiter plate assay to monitor the oxidative burst in monocot and dicot plant cell suspension cultures. Plant Methods. 12, 5 (2016).
- Perraki, A., et al. Phosphocode-dependent functional dichotomy of a common co-receptor in plant signalling. Nature. 561 (7722), 248-252 (2018).
- Yamaguchi, K., Kawasaki, T. Chitin-Triggered MAPK Activation and ROS Generation in Rice Suspension-Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 1578, 309-316 (2017).
- Ortmann, I., Conrath, U., Moerschbacher, B. M. Exopolysaccharides of Pantoea agglomerans have different priming and eliciting activities in suspension-cultured cells of monocots and dicots. FEBS Letters. 580 (18), 4491-4494 (2006).
- Ortmann, I., Sumowski, G., Bauknecht, H., Moerschbacher, B. M. Establishment of a reliable protocol for the quantification of an oxidative burst in suspension-cultured wheat cells upon elicitation. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (5), 227-232 (2004).
- Dos Santos, A. L. W., El Gueddari, N. E., Trombotto, S., Moerschbacher, B. M. Partially acetylated chitosan oligo- and polymers induce an oxidative burst in suspension cultured cells of the gymnosperm Araucaria angustifolia. Biomacromolecules. 9 (12), 3411-3415 (2008).
- Bressendorff, S., Rasmussen, M., Petersen, M., Mundy, J. Chitin-Induced Responses in the Moss Physcomitrella patens. Methods in Molecular Biology. , 317-324 (2017).
- Lloyd, S. R., Ridout, C. J., Schoonbeek, H. Methods to Quantify PAMP-Triggered Oxidative Burst, MAP Kinase Phosphorylation, Gene Expression, and Lignification in Brassicas. Methods in Molecular Biology. 1578, 325-335 (2017).
- Gómez-Gómez, L., Boller, T. FLS2: An LRR Receptor-like Kinase involved in the perception of the bacterial elicitor flagellin in Arabidopsis. Molecular Cell. 5 (6), 1003-1011 (2000).
- Li, J., et al. Specific ER quality control components required for biogenesis of the plant innate immune receptor EFR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15973-15978 (2009).
- Lu, X., et al. Uncoupling of sustained MAMP receptor signaling from early outputs in an Arabidopsis endoplasmic reticulum glucosidase II allele. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (52), 22522-22527 (2009).
- Nekrasov, V., et al. Control of the pattern-recognition receptor EFR by an ER protein complex in plant immunity. EMBO Journal. 28 (21), 3428-3438 (2009).
- Boutrot, F., et al. Direct transcriptional control of the Arabidopsis immune receptor FLS2 by the ethylene-dependent transcription factors EIN3 and EIL1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (32), 14502-14507 (2010).
- Kadota, Y., et al. Direct Regulation of the NADPH Oxidase RBOHD by the PRR-Associated Kinase BIK1 during Plant Immunity. Molecular Cell. 54 (1), 43-55 (2014).
