Summary
Denna uppsats beskriver två metoder för att kvantifiera försvars svar i Arabidopsis thaliana efter exponering för immunelicitors: den övergående oxidativ bristning, och hämning av plantan tillväxt.
Abstract
Växter har utvecklats ett robust immunförsvar att uppfatta patogener och skydda mot sjukdomar. Denna uppsats beskriver två analyser som kan användas för att mäta styrkan av immunförsvaret aktivering i Arabidopsis thaliana efter behandling med elicitor molekyler. Presenteras först är en metod för att fånga den snabbt inducerad och dynamisk oxidativ burst, som kan övervakas med hjälp av en luminol-baserad analys. Presenteras andra är en metod som beskriver hur man mäter immun-inducerad hämning av plantan tillväxt. Dessa protokoll är snabba och pålitliga, kräver inte specialiserad utbildning eller utrustning, och används i stor utsträckning för att förstå den genetiska grunden för växt immunitet.
Introduction
Att uppfatta och försvara sig mot patogener, växter har utvecklats membran-bundna mönsterigenkänning receptorer (PRRs) som upptäcker bevarade mikrobiella molekyler utanför cellen kallas Microbe-associerade molekylära mönster (MAMPs)1. Bindningen av mamps till deras besläktat PRRS initierar proteinkinas-medierad immun signalering vilket resulterar i bredspektrum sjukdoms resistens2. En av de tidigaste Svaren efter PRR aktiveringen är fosforylering och aktivering av integrerad plasmamembran respiratorisk BURST OXIDAS HOMOLOG (RBOH) proteiner som katalyserar produktionen av extracellulära reaktiva syreradikaler (ROS)3 , 4. ros spelar en viktig roll i att fastställa sjukdoms beständighet, agerar både som sekundära budbärare att propagera immun signalering samt direkta antimikrobiella medel5. Den första observationen av en immunsuppressiva oxidativ explosion beskrevs med hjälp av potatisknölar av CV. Rishiri efter Phytophthora infestans inympning6. ROS produktion har utvärderats i flera växtarter med hjälp av blad skivor7, cellsuspension kulturer8, och protoplasts6. Beskrivs här är en enkel metod för testmetoder mönster-utlöst ros produktion i blad skivor av Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).
Som ett svar på MAMP perception, aktiverade rboh proteiner katalysera produktionen av superoxid radikaler (O2-), hydroxylradikaler (• OH), och linne syre (1o2) som omvandlas till väteperoxid (H2o 2) i extracellulära rymden9. H2O2 kan kvantifieras med luminol-baserad chemiluminescens i närvaro av oxidationsmedlet pepparrot PEROXIDAS (HRP)10. HRP oxiderar H2O2 och genererar en HYDROXIDJON (Oh−) och syre gas (O2) som reagerar med luminol för att framställa en instabil intermediär som frigör en fotton av ljus10. Photon emission kan kvantifieras som relativ ljusenheter (RLUs) med hjälp av en mikroplattläsare eller Imager som kan detektera Luminescens, som har blivit standarddelar av utrustning i de flesta molekylära laboratorier. Genom att mäta ljuset som produceras under en 40-60-minuters intervall, en övergående oxidativ burst kan upptäckas så tidigt som 2-5 minuter efter elicitor behandling, topp på 10-20 minuter, och återvänder till basal nivåer efter ~ 60 minuter11. Det kumulativa ljus som produceras under denna tid kurs kan användas som ett mått på immunförsvaret som motsvarar aktiveringen av RBOH proteiner12. Bekvämt, denna analys kräver inte specialiserad utrustning eller besvärliga provberedning.
Peaking kort efter MAMP upptäckt, den oxidativa burst anses vara ett tidigt immunsvar, tillsammans med MAPK aktivering och etenproduktion5. Senare immunsvar inkluderar transkriptionell omprogrammering, stomatala stängning, och callose deposition2,5. Långvarig exponering för MAMPs aktiverar kontinuerligt energiskt kostsamma immun signalering resulterar i hämning av växternas tillväxt, tyder på en avvägningen mellan utveckling och immunitet13. Mönsterutlöst Groddplanta tillväxthämning (SGI) används ofta för att bedöma immun produktionen i Arabidopsis och har varit en integrerad del av identifieringen av flera viktiga komponenter i immun signalering inklusive PRRS14,15 ,16. Därför presenterar detta papper dessutom ett test för mönster-utlöst SGI i Arabidopsis, varvid plantor odlas i multi-well tallrikar som innehåller standardmedier eller media kompletteras med en immun elicitor för 8-12 dagar och sedan vägde med hjälp av en analytisk skala.
För att demonstrera hur ROS-och SGI-analyser kan användas för att övervaka PRR-medierad signalering valdes tre genotyper som representerar olika immun utgångar: (1) Wild Type Arabidopsis anslutning Columbia (Col-0), (2) den dominerande-negativa bak1-5 Mutant där multifunktionell PRR Co-receptor brassinosteroid okänslig 1-associerad Kinas 1 (BAK1) är icke-funktionell i immun signalering17,18, och (3) den recessiv cpk28-1 Mutant, som saknar den reglerande protein kalciumberoende proteinkinas 28 (CPK28) och visar förhöjda immunsuppressiva svar19,20. Analyser av ROS och SGI presenteras som svar på en syntetiskt producerad elf18 peptid epitop av bakteriell Elongation Factor tu (EF-TU), erkänd i Arabidopsis av PRR EF-tu-receptorn (EFR)15. Dessa protokoll kan användas med andra immunologiska elicitorer såsom bakteriell motilitet protein flagellin14 eller endogena växt Elixir proteiner (AtPeps)16, det bör dock noteras att anläggningens reaktionsförmåga varierar beroende på elicitor21. Tillsammans kan ROS-och SGI-analyser användas för snabb och kvantitativ bedömning av tidiga och sena PRR-medierade svar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. detektion av ROS burst i Arabidopsis löv skivor efter immunelicitation
- Växternas tillväxt och underhåll.
- För att synkronisera grobarheten, stratifiera Arabidopsis frön genom att skjuta upp cirka 50 frön i 1 mL steril 0,1% agar [w/v] och förvara vid 4 ° c (ingen ljus) för 3-4 dagar.
Notera: stratifiera en Wild typ bakgrundskontroll (till exempel, Col-0) och genotyper med höga och låga immun utgångar (till exempel cpk28-1 och bak1-5, respektive) att fungera som interna kontroller. - Så frön på marken och gro under standardkort-dag villkor (22 ° c, 10 h ljus, 150 mE/m2/s ljusintensitet, och 65-70% relativ luftfuktighet).
- Efter cirka 7 dagar, Använd pinpops för att transplantera enskilda plantor till nya krukor, separerade med minst 4 cm för att tillåta full rosett utveckling. Transplantation 6-12 plantor per genotyp och återgå till standardkort-dag villkor. Regelbundet vatten och gödsling växter (1 g/L av 20-20-20 gödselmedel varje 2 veckor).
- För att synkronisera grobarheten, stratifiera Arabidopsis frön genom att skjuta upp cirka 50 frön i 1 mL steril 0,1% agar [w/v] och förvara vid 4 ° c (ingen ljus) för 3-4 dagar.
- Samla löv skivor i 96-bra tallrikar för övernattning återhämtning.
- Vid 4-5 veckor efter grobarhet (figur 1a), Använd en skarp 4 mm biopsi Punch att ta bort en blad skiva per planta, undvika mitten av venen och vara noga med att begränsa skadade (figur 1b). Placera löv skivor i en oanvänd 96-och luminometerplatta som innehåller 100 μL ddH2O med den adaxiella sidan vänd uppåt för att förhindra uttorkning22 (figur 1c). Om du bedömer flera elicitors, ta bort 1 blad skiva från samma blad för varje elicitor behandling.
Anmärkning: prov blad som är helt expanderad, tredje till femte från toppen av rosetten, och ungefär samma storlek och ålder för att begränsa variationen. Om möjligt, skär löv skivor i hälften med hjälp av ett rakblad före natten återhämtning, eftersom detta ökar ytan utsätts för elicitor lösning23. - Återhämta sig över natten vid rumstemperatur för att förhindra interferens av ROS produceras av skadade under Leaf Disc samling. Täck plattor med lock för att förhindra avdunstning.
- Vid 4-5 veckor efter grobarhet (figur 1a), Använd en skarp 4 mm biopsi Punch att ta bort en blad skiva per planta, undvika mitten av venen och vara noga med att begränsa skadade (figur 1b). Placera löv skivor i en oanvänd 96-och luminometerplatta som innehåller 100 μL ddH2O med den adaxiella sidan vänd uppåt för att förhindra uttorkning22 (figur 1c). Om du bedömer flera elicitors, ta bort 1 blad skiva från samma blad för varje elicitor behandling.
- Utföra elicitor behandling och mäta ROS produktion.
- Program mera plattläsaren innan reaktions lösningen läggs till, eftersom detta kommer att minska tiden mellan initiering av ROS burst och de första mätningarna registreras. Använd en kommersiell programvara som är lämplig för plattläsaren. I vårt fall (se innehållsförteckning) klickar du på Inställningaroch väljer LUM96 patronen och den kinetiska Läs typen. Klicka på kategorin läsområde och dra för att välja en delmängd av brunnarna eller hela plattan som ska läsas. Under fliken betalning och optik anger du integreringstiden till 1 000 MS. under fliken timing anger du den totala körningstiden till 40-60 min och intervallet till 2 minuter.
- Ta bort vatten från varje brunn med hjälp av en flerkanalspipett.
Anmärkning: punktera inte löv skivor, eftersom detta kan orsaka skadade stress och resultera i mer variabla ROS utgångar. - Bered en reaktions lösning som innehåller 100 μM luminol, 10 μg/mL HRP, och önskad koncentration av elicitor (till exempel: elf18 vid 1 nM, 10 nM, 100 nM eller 1 000 nM) i sterilt ddH2O med 10 ml lösning för 1 96-bra plåt.
Anmärkning: Lös upp frystorkade peptider i sterila H2O i låglegerat rör för att göra en 10 mm stock, blixt frysning i flytande N2, och förvara vid-80 ° c. När du är klar att använda, späd lager i sterilt H2O för att generera en arbets lager på 100 μm och förvara vid-20 ° c. - Använd en flerkanalspipett för att fördela 100 μL av reaktionsblandningen i varje brunn och tillsätt lösningen på alla löv skivor med samma behandling samtidigt22. Inkludera en kontrollreaktion (ingen elicitor) för varje genotyp för att bedöma basal ROS nivåer i avsaknad av elicitation. Mät omedelbart ljusemission för alla våglängder i det synliga spektrumet med hjälp av en mikroplattläsare.
Anmärkning: Förbered och applicera reaktions lösningen under svagt ljus, eftersom luminol och HRP är ljuskänsliga reagenser. Förvara reagenser på is eller vid-20 ° c om de inte används. - Mät ljusemission med en 1 000 MS integration tid i 2 min intervall under en 40-60 min period i en mikrotiterplattor läsare för att fånga den dynamiska oxidativa burst (figur 1d).
Obs: Använd en längre integrations tid för att förbättra analysens känslighet11, och samtidigt säkerställa att alla prover i en 96-brunn plattan kan mätas inom ett intervall.
- Data tolkning.
- För varje genotyp ska du använda ett kalkylbladsprogram för att beräkna medelvärdet för fotonen och standardfelet vid varje tidpunkt, och Visa ROS-produktionen som en funktion av tiden med hjälp av ett spridningsdiagram.
Där t = varje tidspunkt - Alternativt, summera fotonen räknas för varje blad skiva och presentera medelvärdet av dessa värden för varje genotyp med hjälp av ett stapeldiagram med standardfel staplar eller en låda och morrhår Plot.
- För varje genotyp ska du använda ett kalkylbladsprogram för att beräkna medelvärdet för fotonen och standardfelet vid varje tidpunkt, och Visa ROS-produktionen som en funktion av tiden med hjälp av ett spridningsdiagram.
2. tillväxt hämning analys av Groddplanta
- Sterilisera frön och suggan på Murashige och Skoog (MS) tallrikar.
- Förbered steril halv styrka (0,5 x) MS medium (2,16 g/L) som innehåller 0,8% agar [w/v]. Häll media i tallrikar (90 x 15 mm) i ett laminärt flöde huva.
- Sterilisera cirka 100 frön i en microcentrifug tub genom tvättning med 1 mL 70% etanol i 2 min och ta bort genom aspiration. Tillsätt 1 mL 40% blekmedel och mjukt vagga i 17 minuter vid rumstemperatur. Ta bort blekmedel genom aspiration och tvätta tre gånger i 1 mL sterilt vatten i 5 min. Omsuspendera i 1 mL steril 0,1% agar.
Obs: Alternativt, Använd en klor gas utsäde sterilisering protokoll24. - Så cirka 100 frön per genotyp på MS-agar-plattor med hjälp av en pipett och tätning med micropore tejp i ett laminärt flöde huva.
Obs: Undvik att placera frön i närheten eftersom detta kommer att göra transplantation plantor svårt senare. - Stratifiera frön genom att placera plattorna vid 4 ° c (inget ljus) under 3-4 dagar för att synkronisera grobarheten (figur 2A).
- Transplantat plantor i 48-väl plattor som innehåller immun elicitor peptider.
- Efter stratifiering, flytta plattor till ljus under kort dag förhållanden (22 ° c, 10 h ljus, 150 mE/m2/s ljusintensitet, och 65-70% relativ luftfuktighet) för 3-4 dagar för att tillåta grobarhet.
- I en laminär Flow Hood, Förbered elicitor peptid utspädningar (0 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM och 1 000 nM) i sterila 0.5 x MS flytande media som innehåller 1% sackaros [w/v], med 25 mL MS för varje 48-brunn tallrik. Förbered plattorna genom att Pipettera 500 μL MS flytande medium eller MS medium innehållande peptider per brunn. Använd vid behov en REPEAT-multikanalspipettor för förberedelse av plattan för att påskynda processen.
Anmärkning: för varje genotyp, odla plantor i MS utan elicitor att redogöra för eventuella inneboende skillnader i Groddplanta tillväxt. - Med hjälp av sterila tånagel transplantera noggrant en fröplanta till varje brunn av samma storlek och ålder, se till att det inte finns någon skada på plantan eller brott mot roten och att roten är nedsänkt i media. För varje genotyp, transplantera minst 6-8 plantor i varje peptid utspädning (figur 2b).
Obs: transplantation plantor vid 4 dagar efter grobarheten, som korta rötter är lättare att manipulera, och äldre plantor kan ge mindre optimala resultat. - Tätnings plattor med micropore tejp och flytta tillbaka till ljus under standardkort-dag förhållanden (22 ° c, 10 h ljus, 150 mE/m2/s ljusintensitet, och 65-70% relativ luftfuktighet). Låt plantor att växa för 8-12 dagar.
- Bestäm procentuell tillväxthämning.
- Ta försiktigt bort plantor från 48-bra tallrikar och torka av badda på pappershandduk. Väg plantor på en analytisk skala och rekord värden. Om tillgängligt, Använd en analytisk skala utrustad med USB-utgång för att registrera färsk vikt värden på ett kalkylblad. Innan vägning plantor, ta ett foto för att visuellt Visa tillväxthämning (figur 2C).
- Bestäm procentuell tillväxthämning av elicitor-behandlade plantor jämfört med plantor odlade i MS endast (figur 2D) enligt följande:
- Rita data med hjälp av ett stapeldiagram med standardfel staplar eller använda en låda och morrhår Plot för att bättre Visa Inter-experimentell varians.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mutant cpk28-119,25 och bak1-517,18 växter användes för att demonstrera förväntade utfall för genotyper med högt och lågt immunsvar, respektive, i oxidativ burst och SGI analyser i förhållande till en Wild-Type bakgrundskontroll (Col-0). För att bedöma dosberoende effekter användes en 10-faldig peptid spädningsserie (1-1000 nM) elf18. Som väntat hade cpk28-1 förlust av funktion rader en högre kumulativ (figur 3a) och genomsnitt (figur 3b) ros brast jämfört med Col-0, medan bak1-5 visade minskad ros produktion vid koncentrationer mellan 10 nm och 1 000 nM (figur 3). Förväntade skillnader i SGI skulle kunna urskiljas mellan alla genotyper som odlas i 100 nM och 1 000 nM elf18 (figur 4a), som också kan observeras visuellt vid behandling med 1 000 Nm Elf18 (figur 4b). Kännetecknande för hög immun signalering, var cpk28-1 mutanter markant mindre än Col-0 när de odlas i 1 000 Nm elf18, medan bak1-5 mutanter visade svag tillväxthämning i förhållande till Col-0 på grund av störd MAMP upptäckt.
Figur 1. Luminol-baserat oxidativ burst-analys efter immun induktion i Arabidopsis. (A) odla växter på marken under korta dags förhållanden under 4-5 veckor. (B) Använd en 4 mm biopsi Punch att samla löv skivor från varje planta och återhämta sig över natten i ddH2O. (C) tillsätt reaktions lösning (100 μm luminol, 10 μg/ml HRP, och önskad koncentration av elicitor) och mäta ljus utsläpp över 40-60 min, i 2 min intervall med en integrations tid på 1 000 MS. (D) bestämma genomsnittliga fotonen räknas för varje genotyp i förhållande till Col-0 (visas i grönt), en hög ROS kontroll som cpk28-1 (visas i lila), och en låg ros kontroll som bak1-5 (visas i orange). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Elicitor-inducerad Groddplanta tillväxthämning i Arabidopsis. (A) så plantor på MS agar och växa för 3-4 dagar under standardkort-dag villkor. B) Transplantatplantor till 48-well-plattor som innehåller MS-medium eller MS som innehåller olika koncentrationer av elf18. (C) efter 8-12 dagar, visuellt bedöma fröplanta storlek och sedan mäta färsk vikt med hjälp av en analytisk skala för att bestämma procent tillväxthämning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Representativ elf18-inducerad oxidativ explosion i tre Arabidopsis genotyper. Fyra veckor gamla anläggningar behandlades med en spädningsserie av elf18 (0 nM "mock", 1 nM, 10 nM, 100 nM, och 1 000 nM). Col-0 representerar den Wild-typ bakgrundskontroll, med cpk28-1 och bak1-5 representerar hög och låg ros fenotyper, respektive. A) total fotons räkning som representeras av relativa ljusenheter efter elf18 behandling (n= 6 blad skivor från självständiga växter). Statistiska skillnader representeras av gemener och beräknades med hjälp av en enkelriktad ANOVA med en post-hoc Tukey ärlig signifikant skillnad test (p< 0,05). (B) Genomsnittlig fotons räkning, representerad som relativa ljusenheter, över 40 min efter elf18 behandling (n= 6 blad skivor från oberoende växter). Felstaplar representerar standardfel för medelvärdet. Liknande resultat erhölls i två av tre experiment. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Representativ elf18-inducerad tillväxt hämning av plantan i tre Arabidopsis genotyper. Wild-Type (Col-0), cpk28-1, och bak1-5 plantor odlades i en 10-faldig utspädning serie (0-1000 Nm) av elf18. (A) procentuell tillväxthämning beräknades genom en jämförelse av vikten av enskilda plantor som odlas i elf18 (n= 6 enskilda plantor) till den genomsnittliga vikten av plantor av samma genotyp som odlas i MS Only ("mock") (n= 6 enskilda plantor) under en 10-dagarsperiod. Statistiska skillnader representeras av gemener och beräknades med hjälp av en enkelriktad ANOVA med en post-hoc Tukey ärliga signifikanta skillnader test (p< 0,05). B visuell demonstration av SGI i två representativa plantor av Col-0, cpk28-1 och bak1-5 som svar på de ökande koncentrationerna av elf18. Liknande resultat erhölls i tre av fyra experiment. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna uppsats beskriver två metoder för testmetoder mönster-utlöst immunsvar i Arabidopsis, erbjuder kvantitativa metoder för att utvärdera immun produktionen utan användning av specialiserad utrustning. I kombination, mönster-utlöst ros och SGI kan användas för att bedöma tidiga och sena svar på mikrob perception, respektive.
Den största begränsningen av den oxidativa burst-analysen är variation. Av skäl som inte är helt klarlagda, absoluta RLUs skiljer sig ofta med en storleksordning mellan experiment. Eftersom mellan-experiment variation är hög, är det tillrådligt att inkludera interna referens kontroller med hög (t. ex., cpk28-1) och låg (t. ex. bak1-5) oxidativa skurar utöver en Wild-typkontroll (t. ex., Col-0). Åtgärder kan dock vidtas för att öka reproducerbarheten mellan experiment. Miljöförhållanden som temperatur, fuktighet, fotoperiod och ljusintensitet bör vara identiska mellan replikat. Växternas ålder och hälsa bör också beaktas vid provtagning. Löv skivor kan samlas in från växter som är mellan 4 och 7 veckors ålder odlas under korta dag förhållanden (6-10 timmar av ljus). Anekdotiskt, de mest konsekventa resultaten hittades med växter äldre än 6 veckor efter grobarhet men ännu inte blommande eller senescing. Det är viktigt att odla växter i rena miljökammare så att de inte utsätts för vanliga växthus skadegörare såsom mjöldagg eller tugg insekter. Eftersom plantor för SGI odlas i sterila MS media, och för en kortare tid, är miljö variationer i stort sett inte ett bekymmer. Emellertid, variation kan inträffa om plantor skadas medan transplantation, om plantor som valts för elicitor behandlingar är olika storlekar, eller om tillväxten Media blir förorenad. Det rekommenderas att inkludera den interna Referenskontroll genotyper som beskrivs ovan i SGI experiment också.
Elicitor koncentration är en annan viktig faktor vid genomförandet av immunanalyser. Elicitors uppfattas av PRRs resulterar i en snabb och robust ROS burst topp 10-20 minuter efter elicitor behandling (figur 2b). Omfattningen av burst är dock beroende av både elicitor och växt genotyp. Därför rekommenderas en elicitor-dosserie, som presenteras i figur 3 och figur 4, för att identifiera en lämplig elicitorkoncentration. Mönster-utlöst ros kan också analyseras med vaccinera blad skivor med levande mikrober23,26 eller mikrobiella extrakt26,27,28. Till exempel, övergående och dosberoende ros skurar kan detekteras i Arabidopsis som svar på virulent patovarer av Pseudomonas spruta, topp på 35-40 minuter och når basala nivåer cirka 70 minuter efter eliciteringsfas 23 , 29. som svar på Avirulenta bakterier29 eller svampen patogen P. infestans30,31, en andra mer uttalad ackumulering av ros produceras som kan övervakas 6-10 timmar efter Inympning. För svagare elicitors, såsom fungal Chitinen32 eller Chitosan33, mer känsliga självlysande indikatorer kan användas, såsom luminol derivatan L-012, men den bakgrunds signal som produceras är ofta högre32, 34. viktigt, anläggningen ekotyp kommer också diktera dess lyhördhet för specifika elicitors35,36. Till exempel, medan bakteriell flagellin kan framkalla immunsvar i flera Arabidopsis ekotyper inklusive Col-0, wassilewskija (WS-0) ekotyp uttrycker en icke-funktionell variant av PRR flagellin-SENSING 2 (FLS2) och är Därför okänslig för flagellin14,37.
Immun-inducerad ros kan också observeras i blad skivor av andra tvåhjärtbladiga växter inklusive Brassica napus38, tomat39, Nicotiana benthamiana22,40,41, och flera andra arter av familjen Solanacaceae41. Ytterligare luminol-baserade ros detekterings analyser har utvecklats för växter som använder vävnads extrakt10, cellsuspension kulturer8,42, och protoplasts43, och är särskilt användbara i system där Leaf Disc-protokollen inte är effektiva42. Till exempel, elicitor-inducerad ros skurar har beskrivits med hjälp av cellsuspension kulturer i ris42,44 och vete45,46, samt gymnosperm Araucaria angustifolia 47 och Moss Physcomitrella patens48. SGI har inte använts så brett för att mäta immun signalering. Emellertid, tillväxthämning som svar på elicitors har visats i N. bentamiana41 och B. napus38,49. Snabb tillväxthämning har också visats i P. patens som svar på svampchitin inträffar inom 2 minuter av exponering, som kan observeras med hjälp av Time-lapse fotografering48.
Med modifiering kan både SGI-och oxidativ burst-analyser användas för skärmar med högt dataflöde för att identifiera immun regulatorer. Till exempel kan mutageniserade populationer av Arabidopsis odlas på MS medium och översvämmas med elicitors att identifiera okänsliga mutanter15,50,51,52,53. Alternativt kan mutageniserade populationer bedömas för elicitor-utlöst ROS, som framgångsrikt har utförts med både blad-skivor54 och hela plantor som odlas på MS tallrikar19. En annan användbar screeningmetod är det övergående uttrycket av proteiner i N. benthamiana för ros analys före utvecklingen av transgena överuttryck linjer22,40,55. Emellertid, Intra-experimentell variation är högre än i stabila Arabidopsis linjer på grund av differential proteinuttryck i N. benthamiana blad22, även om detta kan delvis mildras genom att infiltrera referens kontroller på samma blad som experimentella prover.
Sammanfattnings, immuninducerad oxidativ burst och SGI-analyser är snabba och pålitliga metoder för att bedöma PRR-medierad signalering i Arabidopsis. Dessa metoder kan utökas till andra system och används för storskaliga skärmar för att avslöja nya immun regulatorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Arbetet i vårt labb finansieras genom naturresursernas och ingenjörs forskningens råd (NSERC) Discovery program, den kanadensiska Stiftelsen för innovation John R. Evans Leader ' s Fund, och Queen ' s University. KS och är stöds av tandem Ontario Graduate stipendier och NSERC Kanada Graduate stipendier för masterstudenter (CGS-M).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20-20-20 Fertilizer | Plant Prod | 10529 | Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth. |
| 4 mm Biopsy Punch | Medical Mart | 232-33-34-P | A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used. |
| 48-Well Sterile Plates with Lid | Sigma-Aldrich | CLS3548 | |
| Analytical Scale with Draft Sheid | VWR | VWR-225AC | Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal. |
| BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL) | Sartorius | 725240 | Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary. |
| elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | EZ Biolab | cp7211 | Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C. |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Horseradish Peroxidase | Sigma-Aldrich | P6782 | Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light. |
| Luminol | Sigma-Aldrich | A8511 | Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light. |
| Murisage and Skoog Basal Salts | Cedarlane Labs | MSP09-100LT | Store at 4C. |
| Soil | SunGrow Horticulture | Sunshine Mix #1 | Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots. |
| SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module | Molecular Devices | Must request a quote | Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-1KG | Store at room temperature. |
| White Polystyrene 96-Well Plates | Fisher Scientific | 07-200-589 |
References
- Couto, D. E., Zipfel, C. Regulation of pattern recognition receptor signalling in plants. Nature Reviews Immunology. 16, 537-552 (2016).
- Boller, T., Felix, G. A Renaissance of Elicitors: Perception of Microbe-Associated Molecular Patterns and Danger Signals by Pattern-Recognition Receptors. Annual Review of Plant Biology. 60, 379-406 (2009).
- Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. A burst of plant NADPH oxidases. Trends in Plant Science. 56 (8), 1472-1480 (2012).
- Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. Regulation of the NADPH Oxidase RBOHD during Plant Immunity. Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).
- Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition. Annual Review of Phytopathology. 55, 109-137 (2017).
- Doke, N. Involvement of superoxide anion generation in the hypersensitive response of potato tuber tissues to infection with an incompatible race of Phytophthora infestans and to the hyphal wall components. Physiological Plant Pathology. 23 (3), 345-357 (1983).
- Bindschedler, L. V., et al. Peroxidase-dependent apoplastic oxidative burst in Arabidopsis required for pathogen resistance. The Plant Journal. 47 (6), 851-863 (2006).
- Keppler, L. D. Active Oxygen Production During a Bacteria-Induced Hypersensitive Reaction in Tobacco Suspension Cells. Phytopathology. 110 (3), 759-763 (1989).
- Wrzaczek, M., Brosché, M., Kangasjärvi, J. ROS signaling loops - production, perception, regulation. Current Opinion in Plant Biology. 16 (5), 575-582 (2013).
- Warm, E., Laties, G. G. Quantification of hydrogen peroxide in plant extracts by the chemiluminescence reaction with luminol. Phytochemistry. 21 (4), 827-831 (1982).
- Trujillo, M. Analysis of the lmmunity-Related Oxidative Bursts by a Luminol-Based Assay. Methods in Molecular Biology. 1398, 323-329 (2016).
- Nühse, T. S., Bottrill, A. R., Jones, A. M. E., Peck, S. C. Quantitative phosphoproteomic analysis of plasma membrane proteins reveals regulatory mechanisms of plant innate immune responses. The Plant Journal. 51 (5), 931-940 (2007).
- Belkhadir, Y., Yang, L., Hetzel, J., Dangl, J. L., Chory, J. The growth-defense pivot: Crisis management in plants mediated by LRR-RK surface receptors. Trends in Biochemical Sciences. 39 (10), 447-456 (2014).
- Gómez-Gómez, L., Felix, G., Boller, T. A single locus determines sensitivity to bacterial flagellin in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 18 (3), 277-284 (1999).
- Zipfel, C., et al. Perception of the Bacterial PAMP EF-Tu by the Receptor EFR Restricts Agrobacterium-Mediated Transformation. Cell. 125 (4), 749-760 (2006).
- Krol, E., et al. Perception of the Arabidopsis danger signal peptide 1 involves the pattern recognition receptor AtPEPR1 and its close homologue AtPEPR2. Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 13471-13479 (2010).
- Schwessinger, B., et al. Phosphorylation-dependent differential regulation of plant growth, cell death, and innate immunity by the regulatory receptor-like kinase BAK1. PLoS Genetics. 7 (4), e1002046 (2011).
- Roux, M., et al. The Arabidopsis Leucine-Rich Repeat Receptor-Like Kinases BAK1/SERK3 and BKK1/SERK4 Are Required for Innate Immunity to Hemibiotrophic and Biotrophic Pathogens. The Plant Cell. 23 (6), 2440-2455 (2011).
- Monaghan, J., et al. The calcium-dependent protein kinase CPK28 buffers plant immunity and regulates BIK1 turnover. Cell Host and Microbe. 16 (5), 605-615 (2014).
- Wang, J., et al. A Regulatory Module Controlling Homeostasis of a Plant Immune Kinase. Molecular Cell. 69 (3), 493-504 (2018).
- Mott, G. A., et al. Genomic screens identify a new phytobacterial microbe-associated molecular pattern and the cognate Arabidopsis receptor-like kinase that mediates its immune elicitation. Genome Biology. 17, 98 (2016).
- Sang, Y., Macho, A. P. Analysis of PAMP-Triggered ROS Burst in Plant Immunity. Methods in Molecular Biology. 1578, 143-153 (2017).
- Smith, J. M., Heese, A. Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae. Plant Methods. 10 (1), 6 (2014).
- Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds. Journal of Visualized Experiments. 128, (2017).
- Matschi, S., Werner, S., Schulze, W. X., Legen, J., Hilger, H. H., Romeis, T. Function of calcium-dependent protein kinase CPK28 of Arabidopsis thaliana in plant stem elongation and vascular development. The Plant Journal. 73 (6), 883-896 (2013).
- Felix, G., Duran, J. D., Volko, S., Boller, T. Plants have a sensitive perception system for the most conserved domain of bacterial flagellin. The Plant Journal. 18 (3), 265-276 (2002).
- Kunze, G., Zipfel, C., Robatzek, S., Niehaus, K., Boller, T., Felix, G. The N Terminus of Bacterial Elongation Factor Tu Elicits Innate Immunity in Arabidopsis Plants. The Plant Cell. 16 (12), 3496-3507 (2004).
- Zipfel, C., et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Nature. 428 (6984), 764-767 (2004).
- Mur, L. A. J., Kenton, P., Draper, J. In planta measurements of oxidative bursts elicited by avirulent and virulent bacterial pathogens suggests that H2O2 is insufficient to elicit cell death in tobacco. Plant, Cell and Environment. 28 (4), 548-561 (2005).
- Kobayashi, M., et al. Calcium-dependent protein kinases regulate the production of reactive oxygen species by potato NADPH oxidase. The Plant Cell. 19 (3), 1065-1080 (2007).
- Yoshioka, H., et al. Induction of Plant gp91 phox Homolog by Fungal Cell Wall, Arachidonic Acid, and Salicylic Acid in Potato. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (6), 725-736 (2001).
- Klauser, D., Flury, P., Boller, T., Bartels, S. Several MAMPs, including chitin fragments, enhance AtPep-triggered oxidative burst independently of wounding. Plant Signaling and Behavior. 8 (9), e25346 (2013).
- El Gueddari, N. E., Rauchhaus, U., Moerschbacher, B. M., Deising, H. B. Developmentally regulated conversion of surface-exposed chitin to chitosan in cell walls of plant pathogenic fungi. New Phytologist. 156 (1), 103-112 (2002).
- Daiber, A., et al. Detection of superoxide and peroxynitrite in model systems and mitochondria by the luminol analogue L-012. Free Radical Research. 38 (3), 259-269 (2004).
- Bauer, Z., Gómez-Gómez, L., Boller, T., Felix, G. Sensitivity of Different Ecotypes and Mutants of Arabidopsis thaliana toward the Bacterial Elicitor Flagellin Correlates with the Presence of Receptor-binding Sites. Journal of Biological Chemistry. 276 (49), 45669-45676 (2001).
- Vetter, M. M., et al. Flagellin perception varies quantitatively in arabidopsis thaliana and its relatives. Molecular Biology and Evolution. 29 (6), 1655-1667 (2012).
- Chinchilla, D. The Arabidopsis Receptor Kinase FLS2 Binds flg22 and Determines the Specificity of Flagellin Perception. The Plant Cell. 18 (2), 465-476 (2006).
- Lloyd, S. R., Schoonbeek, H., Trick, M., Zipfel, C., Ridout, C. J. Methods to Study PAMP-Triggered Immunity in Brassica Species. Molecular Plant-Microbe Interactions. 27 (3), 286-295 (2014).
- Clarke, C., Vinatzer, B. Characterizing the Immune-Eliciting Activity of Putative Microbe-Associated Molecular Patterns in Tomato. Methods in Molecular Biology. 1578, 249-261 (2017).
- Gimenez-Ibanez, S., Hann, D. R., Chang, J. H., Segonzac, C., Boller, T., Rathjen, J. P. Differential Suppression of Nicotiana benthamiana Innate Immune Responses by Transiently Expressed Pseudomonas syringae Type III Effectors. Frontiers in Plant Science. 9, 688 (2018).
- Wei, Y., et al. The Ralstonia solanacearum csp22 peptide, but not flagellin-derived peptides, is perceived by plants from the Solanaceae family. Plant Biotechnology Journal. 16 (7), 1349-1362 (2018).
- Melcher, R. L. J., Moerschbacher, B. M. An improved microtiter plate assay to monitor the oxidative burst in monocot and dicot plant cell suspension cultures. Plant Methods. 12, 5 (2016).
- Perraki, A., et al. Phosphocode-dependent functional dichotomy of a common co-receptor in plant signalling. Nature. 561 (7722), 248-252 (2018).
- Yamaguchi, K., Kawasaki, T. Chitin-Triggered MAPK Activation and ROS Generation in Rice Suspension-Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 1578, 309-316 (2017).
- Ortmann, I., Conrath, U., Moerschbacher, B. M. Exopolysaccharides of Pantoea agglomerans have different priming and eliciting activities in suspension-cultured cells of monocots and dicots. FEBS Letters. 580 (18), 4491-4494 (2006).
- Ortmann, I., Sumowski, G., Bauknecht, H., Moerschbacher, B. M. Establishment of a reliable protocol for the quantification of an oxidative burst in suspension-cultured wheat cells upon elicitation. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (5), 227-232 (2004).
- Dos Santos, A. L. W., El Gueddari, N. E., Trombotto, S., Moerschbacher, B. M. Partially acetylated chitosan oligo- and polymers induce an oxidative burst in suspension cultured cells of the gymnosperm Araucaria angustifolia. Biomacromolecules. 9 (12), 3411-3415 (2008).
- Bressendorff, S., Rasmussen, M., Petersen, M., Mundy, J. Chitin-Induced Responses in the Moss Physcomitrella patens. Methods in Molecular Biology. , 317-324 (2017).
- Lloyd, S. R., Ridout, C. J., Schoonbeek, H. Methods to Quantify PAMP-Triggered Oxidative Burst, MAP Kinase Phosphorylation, Gene Expression, and Lignification in Brassicas. Methods in Molecular Biology. 1578, 325-335 (2017).
- Gómez-Gómez, L., Boller, T. FLS2: An LRR Receptor-like Kinase involved in the perception of the bacterial elicitor flagellin in Arabidopsis. Molecular Cell. 5 (6), 1003-1011 (2000).
- Li, J., et al. Specific ER quality control components required for biogenesis of the plant innate immune receptor EFR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15973-15978 (2009).
- Lu, X., et al. Uncoupling of sustained MAMP receptor signaling from early outputs in an Arabidopsis endoplasmic reticulum glucosidase II allele. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (52), 22522-22527 (2009).
- Nekrasov, V., et al. Control of the pattern-recognition receptor EFR by an ER protein complex in plant immunity. EMBO Journal. 28 (21), 3428-3438 (2009).
- Boutrot, F., et al. Direct transcriptional control of the Arabidopsis immune receptor FLS2 by the ethylene-dependent transcription factors EIN3 and EIL1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (32), 14502-14507 (2010).
- Kadota, Y., et al. Direct Regulation of the NADPH Oxidase RBOHD by the PRR-Associated Kinase BIK1 during Plant Immunity. Molecular Cell. 54 (1), 43-55 (2014).
